Визначення концентрації речовини в розчині слід проводити в такій послідовності:
— вибір світлофільтра;
— вибір кювети;
— побудова калібрувального графіка для даної речовини;
— вимірювання оптичної густини досліджуваного розчину та визначення концентрації речовини в розчині.
Вибір світлофільтра. Наявність у колориметрі вузла світлофільтрів і набору кювет дає змогу підібрати таку їх комбінацію, за якої похибка у визначенні концентрації буде найменшою.
Вибір світлофільтрів проводять так. У кювету наливають розчин і визначають його оптичну густину при всіх наявних світлофільтрах. За одержаними даними будують криву залежності оптичної густини розчину (вісь ординат) від довжини хвилі (вісь абсцис), що відповідає максимуму коефіцієнта пропускання світлофільтрів, і відмічають ділянку кривої, де оптична густина має максимальне значення. Світлофільтр для роботи вибирають такий, щоб довжина хвилі, яка відповідає максимуму його коефіцієнта пропускання, припадала на відмічену ділянку спектральної кривої досліджуваного розчину.
Вибір кювети. Відносна похибка визначення концентрації речовини в розчині залежить від того, на якій ділянці шкали колориметра виконують роботу. Вона є найменшою, коли значення оптичної густини розчину дорівнює ~ 0,4. Тому під час роботи на колориметрі рекомендується шляхом відповідного вибору кювет працювати поблизу цього значення оптичної густини.
Попередній вибір кювет проводять візуально, відповідно до інтенсивності забарвлення розчину. Якщо розчин інтенсивно забарвлений, слід користуватися кюветами з малою робочою довжиною і навпаки.
У заздалегідь підібрану кювету наливають розчин і вимірюють його оптичну густину. Значення оптичної густини розчину має становити 0,3—0,5, у разі одержання інших значень беруть кювету з більшою робочою довжиною, якщо D  0,5.
Побудова калібрувального графіка для даної речовини.Для побудови калібрувального графіка готують низку розчинів досліджуваної речовини з відомими концентраціями. Забарвлені стандартні розчини повинні бути виготовлені за тих самих умов, що й забарвлені розчини досліджуваної речовини. За допомогою фотоелектроколориметра вимірюють оптичну густину всіх розчинів і будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис значення молярної концентрації розчину, а на осі ординат — відповідні їм значення оптичної густини.
Калібрувальний графік будують окремо для кожної досліджуваної речовини. Слід зазначити, що навіть для забарвленого розчину тієї самої речовини, але приготовленого з іншим реактивом, значення оптичної густини може бути іншим, оскільки зміниться молярний коефіцієнт поглинання e. У разі заміни кювети також потрібно будувати інший калібрувальний графік, оскільки оптична густина змінюється зі зміною товщини шару розчину I, крізь який проходить пучок світла.
Визначення концентрації речовини. Для визначення концентрації речовини готують її забарвлений розчин і вимірюють його оптичну густину. У деяких випадках, зокрема під час визначення вмісту амоніаку за допомогою реактиву Несслера, зазначають час, що минув від приготування забарвленого розчину до початку вимірювань. Потім за калібрувальним графіком знаходять концентрацію, що відповідає виміряному значенню оптичної густини. Іноді для визначення концентрації досліджуваної речовини користуються таблицею, яку складають за даними калібрувального графіка, або рівнянням калібрувального графіка.
Під час проведення несерійних аналізів концентрацію досліджуваної речовини можна визначити шляхом порівняння оптичних густин стандартного й досліджуваного розчинів. З цією метою у дві колби вносять однакові об'єми зазначених розчинів. До них добавляють однакові кількості реагентів і вимірюють оптичну густину одержаних забарвлених розчинів. Під час вимірювання оптичної густини в обох випадках застосовують однаково приготовлені розчини порівняння ("нульові" розчини).
Вміст досліджуваної речовини в пробі обчислюють за формулою:
C1 = D1 C
D
де С і С1 — вміст речовини в стандартному й досліджуваному розчинах, мг/мл;
D і D1 — оптична густина стандартного і досліджуваного розчинів.
Концентрацію речовини можна обчислитити і за рівнянням калібрувального графіка, який пов'язує значення оптичної густини розчину із значенням її концентрації С рівнянням прямої лінії:
D = а + bС
де а — оптична густина розчину за нульової концентрації досліджуваної речовини, b — кутовий коефіцієнт, який дорівнює tgа (а — кут нахилу прямої). Коефіцієнти а і b розраховують методом найменших квадратів за експериментальними даними вимірювання оптичної густини розчинів. Після розрахунків параметрів а і b та їх інтервальних значень для визначення невідомої концентрації С виконують кілька вимірювань оптичної густини D, обчислюють середнє значення оптичної густини Dі і за рівнянням:
C = D1 - а
b
визначають значення концентрації С.