Як вже зазначалося вище, агрегати монометинових ціанінів, зв'язані з ДНК, утворюються внаслідок взаємодії вільного барвника зі вже зв'язаним з ДНК в мономерній формі. Крім того, з літератури відомо, що всі розглянуті в даній роботі монометини взаємодіють з ДНК відповідно до моделі напівінтеркаляції, яка передбачає таке зв'язування мономера барвника з ДНК, коли один з гетероциклічних залишків барвника розташований між парами нуклеотидних основ, тоді як інший фіксується в борозенці ДНК. Беручи до уваги наведені вище факти, структура агрегату монометинового ціаніну, утвореного за участі ДНК, уявляється наступним чином. Одна з молекул барвника, що входять до складу агрегату, зв'язана з ДНК через механізм напівінтеркаляції, тобто один з гетероциклічних залишків цієї молекули розташований між парами основ ДНК, в той час як інший залишок міститься в борозенці. Залишок, розташований в борозенці, може взаємодіяти з іншою молекулою барвника, і саме з ним, на нашу думку, взаємодіє один з гетероциклів вільного барвника. Тому значення кута між напрямком дипольного моменту переходу барвника та віссю трансляції (що лежить між 54,7о і 90о) має бути помітно меншим за 90о. Отриману шляхом молекулярного моделювання просторову структуру димерного агрегату ТО, утвореного на ДНК, подано на рис. 10.
Рис. 10. Просторова структура димера ТО (чорний колір), утвореного на ДНК (сірий колір), отримана за допомогою молекулярного моделювання методом молекулярної механіки AMBER та напівемпіричним методом PM3. Вигляд збоку (А) та згори (Б).
Сили, що утримують молекули барвника в агрегаті, – це, на нашу думку, (1) Ван-дер-Ваальсове притягання π-електронних хмаринок гетероциклів, (2) так звані гідрофобні взаємодії, і, крім того, (3) кулонівське притягання позитивно заряджених молекул барвника до негативно зарядженого цукрово-фосфатного кістяка ДНК. Ми вважаємо, що саме негативний заряд ДНК та "гідрофобні взаємодії" є причиною того, що надлишок вільних молекул барвника утворює агрегати саме зі зв'язаними з ДНК мономерами, а не з іншими вільними молекулами. Так, для барвника Cyan 13 утворення незв'язаних з ДНК агрегатів в присутності 910-6 M п.о. ДНК спостерігалось, починаючи з концентрації барвника 2,510-5 М (при співвідношенні близько 3 молекул барвника до 1 пари основ ДНК), тобто вже після того, як, на наш погляд, було вже зайнято більшість місць на ДНК, де вільна молекула барвника могла б утворити агрегат зі зв'язаним з ДНК мономером.
Слід зазначити, що короткохвильовий зсув максимумів спектрів поглинання агрегатів, утворених за участі ДНК, відносно максимуму мономерного спектра є більшим, ніж відповідний зсув у випадку агрегатів, утворених вільними барвниками. Для пояснення цього факту в межах припущення, що агрегати, утворені як на ДНК, так і в розчині, є димерами, проаналізовано вираз для величини розщеплення 2Mf12 енергетичних збуджених рівнів при утворенні димера [4]:
,
де – дипольний момент переходу окремої молекули, R12 – відстань між центрами диполів, а – кут між вектором дипольного моменту переходу молекули та віссю трансляції агрегату. Аналіз виразу показує, що збільшення розщеплення може бути пов'язано зі (1) збільшенням дипольного моменту переходу молекули при її взаємодії з ДНК, (2) зменшенням відстані між молекулами R12 при утворенні агрегату на ДНК порівняно з незв'язаним агрегатом чи (3) збільшенням кута .
Нами встановлено, що при зв'язуванні з ДНК дипольний момент переходу Cyan 13 практично не змінюється, а дипольний момент TO і Cyan 40 дещо зменшується. Збільшення кута мало імовірне, оскільки одна з молекул, з яких утворено агрегат, зв'язана з ДНК через механізм напівінтеркаляції, а інша розташована в борозенці (рис. 10). Причиною збільшення розщеплення може бути зменшення відстані між молекулами R12, оскільки взаємне відштовхування позитивних зарядів молекул барвника при утворенні агрегату на ДНК компенсується їх взаємодією з негативними зарядами цукрово-фосфатного кістяку ДНК. Величина розщеплення залежить від третього ступеню R12, тому для збільшення розщеплення вдвічі (що спостерігається, зокрема, для TO та Cyan 13) необхідне зменшення відстані лише в 1,26 раза. Проте не слід виключати також того, що на ДНК утворюються агрегати, які складаються з трьох чи більше молекул, що також призвело б до більшого розщеплення, ніж для димера.
Спектри флюоресценції агрегатів монометинових ціанінів, зв'язаних з ДНК, як і спектри агрегатів вільних барвників, характеризуються значним довгохвильовим зсувом відносно спектрів поглинання. Наявність такого великого Стоксового зсуву, на нашу думку, свідчить про те, що за час перебування у збудженому стані в агрегаті відбувається внутрішній процес (наприклад, утворення ексимеру), що спричиняє помітне зниження енергії збудженого стану.
Гомобіс- та гомотрисціанінові барвники: посилення процесів агрегації внаслідок ковалентного з'єднання хромофорів
Нами досліджено спектральні прояви агрегаційних процесів у водних розчинах та в присутності ДНК бісціанінового К-6 та трисціанінового К-Т барвників (рис. 1), що містять відповідно 2 та 3 барвники Cyan 40. Порівнявши їх спектральні властивості (рис. 11, 12) з властивостями барвника Cyan 40, можна зробити наступні висновки.
Об'єднання двох чи трьох хромофорів алкільним ланцюжком (лінкером), що практично не впливає на -електронні системи окремих хромофорів, значно посилює процеси агрегації цих барвників як у водному розчині, так і в присутності ДНК. Так, для водних розчинів К-6 та К-Т найменшої з досліджених концентрацій 10-6 М смуга поглинання агрегатів домінує в спектрі, тоді як мономерна смуга слабко проявляється у вигляді плеча (рис. 11). Ймовірно, причиною тому є те, що для біс- чи трисціаніну може мати місце утворення агрегату між хромофорами однієї молекули, що може відбуватись за як завгодно малої концентрації барвника. Можливо також, що для біс- та трисціанінових барвників посилюються процеси утворення агрегатів між різними молекулами за рахунок (1) більшого загального розміру молекули, що посилює так звані гідрофобні взаємодії, та (2) більшої загальної площі -електронних систем, що посилює Ван-дер-Ваальсові взаємодії.
Рис. 11. Спектри поглинання розчинів K-6 (1-3) та K-6 у присутності 610-5 M п.о. ДНК (1'-4'). Концентрації K-6: 10-6 M (1,1'); 10-5 M (2,2',3); 210-5 M (3'); 510-5 M (4'). Розчини в буфері (1,1',2,2',3',4') та етиловому спирті (3).
Рис. 12. Спектри флюоресценції (1-7) та збудження флюоресценції (1'-6') розчинів К-6 (1-5, 1'-4') та К-6 в присутності 610-5 M п.о. ДНК (6,7,5',6') у буфері. Концентрації K-6: 10-6 M (1,1',2,2',3,5',6); 10-5 M (3',4',4,5); 510-5 M (6',7). Довжини хвилі збудження флюоресценції: 400 нм (7), 408 нм (2,5), 425 нм (3), 452 нм (1,4,6). Довжини хвилі випромінювання флюоресценції: 482 нм (1',3',5') та 590 нм (2',4',6').
На відміну від Cyan 40, для К-6 та К-Т у спектрах поглинання спостерігаються дві смуги (близько 400-408 та 425 нм), зсунуті в короткохвильовий бік відносно мономерної (452 нм), які пов'язані, як нами показано, з поглинанням агрегатів. При цьому, якщо смуга при 425 нм, як і для Cyan 40, відповідає димерним агрегатам, то найбільш короткохвильова агрегатна смуга (як це описано для інших барвників в [3]) відповідає агрегатам вищого порядку, що не спостерігалось для Cyan 40. Ці агрегати утворюються за участі кількох молекул і складаються з трьох чи більше хромофорів.
Як і для барвника Cyan 40, агрегати К-6 та К-Т, як утворені у водному розчині, так і зв'язані з ДНК, мають "сендвічеву" структуру, що випливає з короткохвильового зсуву максимумів спектрів поглинання агрегатів відносно відповідних максимумів мономерних спектрів. Крім того, агрегати К-6 і К-Т, подібно до агрегатів Cyan 40, характеризуються надзвичайно великим, порівняно з мономерами, довгохвильовим зсувом спектрів флюоресценції (рис. 12). Тому можна припустити, що в збудженому стані агрегатів К-6 та К-Т відбуваються такі ж процеси, як і в агрегатах Cyan 40, які призводять до зниження енергії збудженого стану агрегату. Таке припущення є можливим, оскільки агрегати К-Т, К-6 і Cyan 40 утворені з однакових хромофорів і мають "сендвічеву" структуру.
J-Агрегати триметинціанінового барвника Cyan BiPr, утворені за участі нуклеїнових кислот
Нами також досліджені спектральні властивості триметинціанінового барвника Cyan iPr (рис. 1) у водному буфері та в присутності ДНК, а також у присутності полінуклеотидів poly(dA)-poly(dT) та poly(dG-dC)-poly(dG-dC).
В той час як у спектрах поглинання та флюоресценції вільного барвника проявляється в основному мономерна смуга (максимум спектра поглинання близько 542 нм), у спектрах Cyan iPr у присутності ДНК поряд з мономерною з'являється чітко виражена довгохвильова смуга поглинання, розташована близько 583 нм. Відносна інтенсивність цієї довгохвильової смуги також залежить від концентрації барвника, що свідчить про її агрегаційну природу. Довгохвильовий зсув смуги поглинання агрегатів відносно мономерної смуги свідчить про те, що агрегатна смуга відповідає J-агрегатам молекул Cyan iPr. Утворення незв'язаних з ДНК агрегатів за рахунок "виштовхування" молекул барвника в агрегати молекулами ДНК є малоймовірним, оскільки концентрація ДНК у розчині (610-5 M п.о.) є занизькою для цього і, крім того, гідратовані молекули ДНК та барвника є різноіменно зарядженими. Отже, присутність ДНК у водному розчині Cyan iPr призводить до утворення зв'язаних з ДНК J-агрегатів молекул барвника.