Magdalena Rakicka 
email: magdalena.rakicka@up.wroc.pl
  
Zbigniew Lazar 
  
Cécile Neuvéglise 
  
Tristan Rossignol 
  
Jean-Marc Nicaud 
  
Małgorzata Robak 
  

Produkcja kwasu cytrynowego z melasy z wykorzystaniem transformantów Yarrowia lipolytica

Wstęp

Kwas cytrynowy jest głównym kwasem organicznym produkowanym w skali przemysłowej na drodze mikrobiologicznej. Jego światowa produkcja sięga 1,6 mln tonrocznie [Berovic i Legisa, 2007], a głównym producentem są grzyby strzępkowe Aspergillus niger [Pazoukii in., 2000]. Alternatywną metodą biosyntezy tego kwasu może być proces z użyciem drożdży Yarrowia lipolytica, które odznaczają się wysokimi naturalnymi zdolnościami do produkcji tego metabolitu [Klassoni in.,1989]. Wykorzystanie drożdży w porównaniu z metodą tradycyjną zapewnia zwiększoną szybkość produkcji [Moresii in.,1994], a także umożliwia wykorzystanie szerszej gamy surowców, zwłaszcza tłuszczowych [Crolla i Kennedy, 2001].

Drożdże Y. lipolytica są obecnie jednym z lepiej poznanych i scharakteryzowanych gatunków drożdży. Posiadają zdolność do wzrostu na szerokiej gamie substratów, tj. monosacharydach (glukoza, fruktoza), białkach, krótkołańcuchowych kwasach organicznych, glicerolu, kwasach tłuszczowych, tłuszczach czy alkanach [Barth i Gaillardin, 1997;[START_REF] Papanikolaou | Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol[END_REF]. Dzikie szczepy nie mają jednak możliwości metabolizowania sacharozy. W praktyce oznacza to, że węglowodanowe produkty odpadowe tj. melasa, nie mogą być utylizowane przy użyciu tego gatunku drożdży [Wojtatowiczi in., 1997]. W związku z tym prowadzone są badania mające na celu skonstruowanie szczepów o poszerzonych zdolnościach biotechnologicznych. W procesach tych badacze wykorzystują mutagenizację UV [Wojtatowicz i in., 1991], hybrydyzację na drodze fuzji protoplastów czy ekspresję genów innych mikroorganizmów, w celu umożliwienia utylizacji sacharozy [Lazari in., 2011].

Celem niniejszej pracy była ocena wzrostu i produkcji kwasu cytrynowego z melasy przez transformantyY. lipolytica posiadające dwie kopie genu inwertazy z Saccharomyces cerevisiae, wprowadzone pod dwoma rożnymi promotorami.

Materiały i metody

Mikroorganizm

W badaniach wykorzystano modyfikowany genetycznie szczep drożdży Y. lipolytica A18, posiadający w swoim genomie kasetę do ekspresji heterologicznej inwertazy (SUC2) z drożdży S. cerevisiae oraz wykazujący auksotrofię uracylową [Walczak i Robak, 2009]. Gen SUC2 znajduje się pod kontrolą indukcyjnego promotora XPR2. W szczep A18 wprowadzono dodatkową kopię kasety do ekspresji inwertazy, znajdującą się pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego TEF [Lazar i in., 2013]. Trzy z powstałych w ten sposób transformantów: A10, A14, A18M, zawierające po 2 kopie genu SUC2 i nie wykazujące auksotrofii uracylowej, wykorzystano do badań nad produkcją kwasu cytrynowego z melasy.

Substrat

W badaniach zastosowano melasę buraczaną (Südzucker Polska S.A., Strzelin) o zawartości sacharozy 45%.

Warunki prowadzenia hodowli

Inokulum prowadzono w 300 mL kolbach stożkowych zawierających 30 mL podłoża (skład [g/L]: glukoza-50; ekstrakt drożdżowy -3; ekstrakt słodowy -3; Bactopepton-5; woda destylowana 1 L), na wstrząsarce rotacyjnej przez 24 godziny przy obrotach 150 rpm, w temperaturze 30°C.

Hodowle wstrząsane prowadzono w 300 mL kolbach stożkowych zawierających 30 mL podłoża produkcyjnego o składzie (g/L): sacharoza -50; NH 4 Cl -1,5; KH 2 PO 4 -0,7; MgSO 4 x 7H 2 O -1;ekstrakt drożdżowy -0,3; tiamina -3x10 -6 , uracyl -20 mg (dla szczepu A18), woda wodociągowa 1L, na wstrząsarce rotacyjnej przez 72 godziny przy obrotach 150 rpm w temp. 30°C. Inokulum stanowiło 10% objętości podłoża. Do analizy pobierano 5 ml hodowli po 48 i 72 godzinach, które odwirowywano (10 min., 5000 rpm). Hodowle prowadzono w trzech powtórzeniach.

Hodowle bioreaktorowe prowadzono w bioreaktorze Biostat B-Plus (Sartorius, Niemcy) w podłożu produkcyjnym zawierającym (g/L): sacharozę lub melasę -100 i 297, NH 4 Cl -1,5; ekstrakt drożdżowy -0,3; KH 2 PO 4 -0,7; MgSO 4 x7H 2 O -1; tiamina 3x10 -6 ; uracyl -20 mg (dla szczepu A18). Proces prowadzono w objętości całkowitej 2 litrów, przy szybkości przepływu powietrza 0,2 vvm, szybkości obrotowej mieszadła 800 rpm, w temperaturze 30°C. W czasie procesu pH 6,8 utrzymywano automatycznie za pomocą 40% roztworu NaOH. Inokulum stanowiło 10% objętości podłoża. Hodowle prowadzono w dwóch powtórzeniach.

Metody analityczne

Biomasę oznaczano metodą wagową. Stężenie sacharozy, glukozy, fruktozy i kwasu cytrynowego oznaczano metodą HPLC (UltiMate 3000, Dionex-Thermo Fisher Scientific, UK) na kolumnie Aminex HPX87H (Biorad) połączonej z detektorami UV (λ = 210 nm) i RI, w temperaturze 35°C, przy szybkości przepływu fazy ciekłej (0,01 N kwasu siarkowego) przez kolumnę równej 0,6 mL/min. Aktywność zewnątrzkomórkową inwertazy oznaczono w płynach pohodowlanych uprzednio dializowanych przez 24 godziny w 2 mL porcjach wobec buforu octanowego o pH 5. Aktywność inwertazy oznaczano wobec 0,1 M sacharozy jako substratu. Powstające cukry redukujące (glukozę i fruktozę) oznaczano w reakcji z DNS.

Jednostka aktywności enzymatycznej (U) -została zdefiniowana jako ilość enzymu, która powoduje uwolnienie 1 µmola cukru redukującego na minutę w warunkach reakcji [Lazar i in., 2011].

Wyniki

Produkcja kwasu cytrynowego z sacharozy w hodowlach wstrząsanych

W pracy oceniano zdolność genetycznie modyfikowanych szczepów drożdży Y. lipolytica A10, A14, A18M, z dwoma kopiami genu inwertazy (SUC2) do wzrostu i produkcji kwasu cytrynowego z melasy. Kontrolą dla wszystkich procesów były hodowle w podłożu z sacharozą z udziałem szczepu A18, zawierającego jedną kopię genu inwertazy.

W celu wyboru najefektywniejszego producenta kwasu cytrynowego przeprowadzono hodowle wstrząsane trzech wybranych trans formantów w podłożu z sacharozą. Po 72 h hodowli szczepu kontrolnego, A18, stężenie biomasy i kwasu cytrynowego wynosiło odpowiednio 9 g/L i 27,2 g/L. Testowane szczepy nie wykazywały znaczących różnic w produkcji biomasy i kwasu cytrynowego w stosunku do szczepu kontrolnego A18 (Tab. 1). Badane transformanty cechowała jednak wyższa aktywność zewnątrzkomórkowa inwertazy w porównaniu ze szczepem kontrolnym, przy czym najwyższą wartość tej aktywności (40 U/mL) stwierdzono dla szczepu A18M. Warto zauważyć, że po 72 godzinach hodowli była ona czterokrotnie wyższa niż aktywność inwertazy dla szczepu kontrolnego (Rys.1).

Rys. 1 Aktywność zewnątrzkomórkowa inwertazy transformantów Y. lipolytica podczas hodowli wstrząsanej w podłożu z sacharozą.

Produkcja kwasu cytrynowego z sacharozy i melasy w okresowych hodowlach bioreaktorowych

W okresowych hodowlach bioreaktorowych porównano proces biosyntezy kwasu cytrynowego z melasy przez szczep A18M, cechujący się najwyższą aktywnością inwertazy, ze szczepem wyjściowym A18. Kontrolą dla tych procesów były hodowle okresowe prowadzone w podłożu z sacharozą. Szczep A18, z jedną kopią inwertazy, w procesie trwającym 166godzin osiągnął wydajność biomasy 11 g/L i wyprodukował 20 g/L kwasu cytrynowego ze 100 g/L sacharozy (Rys. 2A, B) . Wydajność i objętościowa szybkość produkcji kwasu cytrynowego wynosiły odpowiednio 0,21 g/g i 0,1 g/L/h (Tab. 2). Proces hydrolizy sacharozy był powolny, dopiero w 70 godzinie hodowli odnotowano całkowity brak tego substratu (Rys. 2C).

Rys. 2 Produkcja biomasy (A) i kwasu cytrynowego (B), oraz zużycie sacharozy (C), glukozy (D) i fruktozy(E) podczas bioreaktorowych hodowli okresowych prowadzonych w podłożu z sacharozą i melasą transformantów Y. lipolytica. Natomiast zużycie glukozy i fruktozy uwolnionych z sacharozy odbywało się sukcesywnie (Rys. 2D, E). Drożdże w pierwszej kolejności metabolizowały glukozę i dopiero po jej wyczerpaniu ze środowiska hodowlanego metabolizowały fruktozę, jako źródła węgla i energii. Cukier ten jednak został wykorzystany tylko częściowo i pozostał w brzeczce hodowlanej (20 g/L).

Szczep A18M w hodowli bioreaktorowej w podłożu z sacharozą wyprodukował 17 g/L biomasy i 56 g/L kwasu cytrynowego, z wydajnością i objętościową szybkością produkcji równą odpowiednio 0,56 g/g i 0,4 g/L/h (Rys. 2A, B; Tab. 2). Proces prowadzono przez 146 godzin, sacharoza zhydrolizowana została już po 48 godzinach. Ilość resztkowej fruktozy w brzeczce hodowlanej wyniosła 6 g/L (Rys. 2C,D,E). W kolejnym etapie badań wykorzystano melasę buraczaną do produkcji kwasu cytrynowego. Procesy bioreaktorowe z wykorzystaniem tego surowca odpadowego cechowały się ponad dwukrotnie krótszym czasem hodowli, wyższą wydajnością biomasy i zwiększoną produkcją kwasu cytrynowego. Szczep kontrolny w czasie 68 godzin tworzył 22 g/L biomasy i 42 g/L kwasu cytrynowego, z wydajnością produkcji tego metabolitu równą 0,42 g/g. Objętościowa szybkość produkcji kwasu cytrynowego wynosiła 0,6 g/L/h (Rys. 2; Tab. 2). Szczep ten hydrolizował sacharozę do 48 godziny, a oba produkty jej rozpadu, glukoza i fruktoza, zostały wykorzystane w całości (Rys. 2C, D, E). W przypadku szczepu A18M proces uległ skróceniu do 64 godzin, biomasa wynosiła 36 g/L. Ilość wyprodukowanego kwasu cytrynowego kształtowała się na poziomie 52 g/L. Wydajność i objętościowa szybkość produkcji kwasu cytrynowego wynosiły odpowiednio 0,48 g/g i 0,8 g/L/h (Tab. 2).Cukry proste -glukoza i fruktoza były metabolizowane przez drożdże jednocześnie w trakcie trwania procesu (Rys. 2D, E).

Aktywność zewnątrzkomórkowa inwertazy szczepu A18M podczas hodowli z sacharozą była najwyższa. Na końcu procesu osiągnęła wartość 104 U/mL. Natomiast szczep kontrolny, A18, wykazywał pięciokrotnie niższą aktywność zewnątrzkomórkową inwertazy w hodowli z czystym substratem (Rys. 3A). W procesie, w którym wykorzystano melasę, jako źródło węgla szczep z dwoma kopiami inwertazy, cechował się wyższą aktywnością inwertazy zewnątrzkomórkowej niż szczep kontrolny, nie przekroczyła ona jednak wartości 30 U/mL (Rys. 3B).

Dyskusja wyników

Zastosowanie melasy jako źródła węgla w przeprowadzonych badaniach spowodowało znaczne skrócenie czasu procesu w porównaniu z użyciem czystej sacharozy. Proces z melasą w podłożu dla transformanta A18M, z dwoma kopiami inwertazy, skrócił się o połowę. Drożdże A18M produkowały podobną ilość kwasu cytrynowego z obu substratów -melasy i sacharozy, z porównywalną wydajnością.

Rys. 3 Porównanie aktywności zewnątrzkomórkowej inwertazy w podłożu z sacharozą (A) i melasą (B) w bioreaktorowych hodowlach okresowych transformantów Y. lipolytica.. Prosimy cytować jako: Inż. Ap. Chem. 2015, 54, 3, 111-113 Nr 3/2015 INŻYNIERIA I APARATURA CHEMICZNA str. 113

Jednakże w podłożu z melasą objętościowa szybkość produkcji kwasu cytrynowego wzrosła aż dwukrotnie, do wartości 0,8g/L/h. Jest to jedna z najwyższych wartości produktywności opisana dla procesów z wykorzystaniem drożdży Y. lipolytica [Lazar i in., 2011]. Zatem użycie szczepu z dwiema kopiami inwertazy sprawdza się idealnie w produkcji kwasu cytrynowego z melasy i znacznie skraca czas procesu.

Transformant A18M w hodowli z sacharozą produkował kwas cytrynowy z wydajnością i objętościową szybkością pordukcji równą odpowiednio 0,56 g/g i 0,4 g/L/h. Rezultaty te są podobne do otrzymanych w badaniach Lazara i in., [2011], gdzie testowano 7 transformantów SUC+ drożdży Y. lipolytica pod kątem jednoczesnej produkcji kwasu cytrynowego i inwertazy z sacharozy w okresowej hodowli bioreaktorowej. Najwyższe stężenie kwasu cytrynowego odnotowano dla szczepu SUC + Y. lipolytica A-101 -B56-5. Wynosiło ono 46,2 g/L z wydajnością 0,55 g/g i objętościową szybkością produkcji równą 0,63 g/L/h. Wyższe stężenie kwasu cytrynowego (140 g/L) odnotowali Försteri in., [2007] dla szczepu SUC + Y. lipolytica H222-S4 T5 w hodowli półokresowej z zasilaniem sacharozą.

Z kolei użycie glicerolu jako substratu pozwoliło uzyskać wyższe stężenie tego metabolitu. W badaniach Rywińskiej i in., [2010] szczep Y. lipolytica A-101 w hodowli okresowej produkował 66-80 g/L kwasu z wydajnością (0.40-0.53 g/g). Produkcja kwasu cytrynowego z glukozy w hodowlach okresowych dla innych szczepów Y. lipolytica kształtowała się na niższym poziomie (41 g/L) [Moelleri in., 2007].

W niniejszej pracy zaobserwowano istotną różnicę w utylizacji glukozy i fruktozy, w zależności od rodzaju źródła węgla w podłożu. W podłożu z melasą, glukoza i fruktoza ulegały praktycznie w całości przekształceniu w biomasę i metabolity. Odmienną sytuację odnotowano dla podłoża z sacharozą. Drożdże preferowały do wzrostu i produkcji cytrynianu glukozę, a następnie fruktozę. Podobne obserwacje odnotowali Wojtatowicz i in., [1997].

Aktywność zewnątrzkomórkowa inwertazy była znacznie niższa w hodowli, w której substratem była właśnie melasa. Spowodowane jest to najprawdopodobniej obecnością w podłożu komponentów wpływających hamująco na aktywność enzymatyczną inwertazy. Drożdże piekarskie produkują inwertazę w podłożu z sacharozą w ilości 1900 U na litr podłoża [START_REF] Ul-Haq | Characterization of a Saccharomyces cerevisiae mutant with enhanced production of b-Dfructofuranosidase[END_REF]. Aktywność enzymatyczna odnotowana w prezentowanej pracy (30 000÷107000U/L) jest wyższa od aktywności inwertazy szczepów dzikichi zbliżona do szczepów modyfikowanych genetycznie (58 000 U/L) [START_REF] Ul-Haq | Characterization of a Saccharomyces cerevisiae mutant with enhanced production of b-Dfructofuranosidase[END_REF].

Wnioski

Dynamika wzrostu transformata Y. lipolytica A18M, z dwiema kopiami genu inwertazy oraz efektywność produkcji kwasu cytrynowego w podłożu z melasą były satysfakcjonujące.

Objętościowa szybkość produkcji kwasu cytrynowego w podłożu z melasą była dwukrotnie wyższa niż w hodowli z czystym substratem.

Uzyskany szczep A18M stanowi dobry punkt wyjściowy do dalszych badań nad optymalizacją procesu, mających na celu zwiększenie efektywności biosyntezy kwasu cytrynowego i inwertazy z tanich i odpadowych surowców pochodzących z innych gałęzi przemysłu.

  

  Tab. 1. Produkcja biomasy i kwasu cytrynowego przez transformantyYarrowia lipolytica w hodowli wstrząsanej w podłożu z sacharozą.

	Szczep	Biomasa, [g/L]	Kwas cytrynowy, [g/L]
	A18 kontrola	8,6±0,4	26,1±1,1
	A10	8,1±1,0	25,9±1,0
	A14	8,2±0,5	25,2±0,8
	A18M	8,6±0,5	26,5±0,5

  Tab. 2. Parametry produkcji kwasu cytrynowego z sacharozy i melasy transformantów Y. lipolytica w bioreaktorowych hodowlach okresowych.

	Szczep	Źródło węgla	Czas, [h]	YCA, [g/g]	QCA, [g/L/h]
	A18	Sacharoza	166	0,21	0,1
	A18M	Sacharoza	146	0,56	0,4
	A18	Melasa	68	0,42	0,6
	A18M	Melasa	64	0,48	0,8