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Parâmetros Metabólicos 
  
E Microcirculatórios 
  
Em Ratos Obesos 
  
Com Síndrome 
  
Metabólica Resumo 
  
Tese De Doutorado 
  
Alessandro Rodrigues Do Nascimento 
  
D E Concentrações 
  
Crescentes De 
  
Diferentes Ligantes 
  
Seletivos Dos 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
EFEITOS DA INIBIÇÃO DO SISTEMA NERVOSO SIMPÁTICO CENTRAL SOBRE OS

Fatores de risco cardiovascular e metabólico, incluindo hipertensão arterial, obesidade e intolerância à glicose, fazem parte da definição da Síndrome Metabólica (SM). Sabe-se, atualmente, que estes fatores de risco são acompanhados de uma hiperatividade do sistema nervoso simpático que pode desempenhar um papel importante na fisiopatologia dessas alterações. No presente estudo, investigamos os efeitos da modulação do sistema nervoso simpático sobre os parâmetros metabólicos e microvasculares de ratos submetidos à dieta rica em gordura (HFD) com suplementação de sal. Para isso, 50 ratos Wistar machos adultos receberam dieta normal (CON + VEI, n = 10) ou dieta hiperlipídica (HFD + VEI, n = 40) durante 20 semanas. Em seguida, o grupo HFD foi tratado com

Lista de Tabelas

Lista de Figuras

Introdução

Na última década, o crescimento epidêmico das doenças crônicas não transmissíveis, principalmente doenças cardiovasculares e diabetes mellitus do tipo 2 (DM2), pode ser atribuído ao aumento da exposição aos principais fatores de risco para essas doenças e às mudanças na pirâmide demográfica, com o aumento da longevidade da população [START_REF]Fisiopatologia da Síndrome Metabólica[END_REF]. Além disso, a maioria dos países em desenvolvimento passa por uma transição nutricional, acarretando no aumento expressivo da obesidade e das alterações cardiometabólicas que caracterizam a síndrome metabólica (SM).

Esta síndrome se tornou tão comum em países desenvolvidos e em desenvolvimento que hoje já é vista como uma patologia endêmica, com cerca de uma em cada cinco pessoas afetadas, sendo ela comum a ambos os sexos e todos os grupos étnicos, porém sua prevalência está relacionada à idade, com um pico entre pessoas de meia-idade e idosas (2). Sua prevalência é avaliada entre 20 a 25% da população geral, com comportamento crescente nas últimas décadas ( 3), e atingindo 42% dos indivíduos com idade superior a 60 anos (2).

Indivíduos com SM apresentam risco 2 a 3 vezes maior de morbi-mortalidade cardiovascular que indivíduos sem a síndrome (4). Em crianças e adolescentes a estimativa foi de 4,2%, sendo mais alta prevalência em meninos. Nos adolescentes com sobrepeso, calculado pela curva de percentil IMC/idade, esse número aumenta para 28,7% (5,6). No Brasil, há poucos estudos com amostras significativas da prevalência de SM. Contudo, um estudo realizado em Vitória (ES) com 380 adolescentes de 10 a 14 anos revelou prevalência total de 1,3% nessa população (7). No mundo, os dados de prevalência da SM são muito preocupantes, já que esta síndrome estabelece um prognóstico de diabetes e doenças cardiovasculares (4,8). Sendo assim, há um enorme apelo médico e socioeconômico para se identificar marcadores da SM que possam auxiliar no combate à progressão da atual epidemia.

Síndrome metabólica Definição e diagnóstico

A SM foi descrita pela primeira vez em 1988 por Reaven sob o nome de síndrome X (9). Ele a definiu como a combinação de intolerância à glicose e resistência à insulina (RI), dislipidemia e hipertensão arterial. Posteriormente, outros critérios, como a obesidade, foram adicionados a esta síndrome, que agora é mais conhecida como a SM. No entanto, em 1923 o médico sueco Eskil Kylin já havia observado uma tríade de alterações metabólicas em seus pacientes, composta pela hiperglicemia, hipertensão e hiperuricemia [START_REF] Batsis | Metabolic syndrome: from global epidemiology to individualized medicine[END_REF][START_REF] Eckel | The metabolic syndrome[END_REF][START_REF] Fodor | Le syndrome métobolique[END_REF]. Em 1989, a síndrome foi renomeada como "quarteto mortal" (obesidade, intolerância à glicose, hipertrigliceridemia e hipertensão) [START_REF] Kaplan | The deadly quartet. Upper-body obesity, glucose intolerance, hypertriglyceridemia, and hypertension[END_REF], e em 1992, esta foi novamente renomeada como "Síndrome da resistência à insulina" (8). Atualmente, o termo "síndrome metabólica" é o mais utilizado e tem sido empregado pela literatura especializada de forma ampla e rotineira, mesmo que sua definição ainda sofra variações.

A definição exata desta síndrome é tema de intenso debate no seio das comunidades médicas e científicas internacionais. Na verdade, existem várias definições desta síndrome, mas nenhuma delas apresenta um consenso, o que se tornou um problema de diagnóstico na prática clínica. Mesmo assim, o que é universalmente aceito, é que os pacientes com SM, independentemente da sua definição, apresentam um aumento muito significativo no risco de desenvolverem doenças cardiometabólicas como a insuficiência cardíaca e o DM2, os quais contribuem para a morbidade e mortalidade dessa síndrome [START_REF] Lakka | The metabolic syndrome and total and cardiovascular disease mortality in middle-aged men[END_REF][START_REF] Kahn | The metabolic syndrome: time for a critical appraisal. Joint statement from the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes[END_REF][START_REF] Aguilar-Salinas | The metabolic syndrome: a concept hard to define[END_REF].

Embora a SM tenha sido reconhecida em diferentes formas desde 1923, os componentes, a definição e a importância clínica são assuntos em debate até os nossos dias. Em 1998, a Organização Mundial da Saúde (OMS) desenvolveu a definição, sendo que a RI era pré-requisito absoluto para o diagnóstico, identificada por uma das seguintes alterações do metabolismo glicídico: glicemia de jejum alterada, alteração do teste de tolerância à glicose ou evidência de RI dado pelo índice de HOMA (produto de insulina de jejum e glicemia de jejum). Era também necessária a presença de 2 dos seguintes fatores de risco: obesidade, triglicerídeos = 150 mg/dL, HDL-colesterol < 35 mg/dL, índice de massa corpórea > 30 kg/m 2 ou relação cintura/quadril > 0,9 para homens e 0,85 para mulheres, uso de anti-hipertensivos ou níveis de pressão arterial = 140/90 mmHg, e excreção urinária de albumina > 20 mcg/min. A desvantagem dessa classificação é ser muito complexa para ser realizada [START_REF] Who | Definition, Diagnosis, and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus: Report of a WHO consultation[END_REF]. Tratamento de Adultos (NCEP-ATP III) desenvolveu uma nova definição de SM, na qual a glicemia não é considerada um fator imprescindível [START_REF] Heart | Executive summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III)[END_REF]. Essa definição foi revisada em 2005 e incluía 3 de 5 fatores de risco facilmente obtidos e, ainda hoje, esse critério é um dos mais utilizados. Tabela 1.1 

Fisiopatologia da Síndrome Metabólica

Não há consenso real sobre fatores desencadeantes da SM. A ocorrência de anormalidades no metabolismo da glicose e dos lipídeos ainda é a possível causa mais aceita. O primeiro órgão mais afetado é o músculo esquelético, que se torna resistente à ação da insulina, reduzindo o transporte e a utilização de glicose circulante. A glicose aumentada induz aumento da secreção de insulina. A hiperinsulinemia é provavelmente, uma das principais causas da DM2, hipertensão arterial e disfunção metabólica [START_REF] Saltiel | Series introduction: the molecular and physiological basis of insulin resistance: emerging implications for metabolic and cardiovascular diseases[END_REF].

A RI no músculo esquelético inicia uma alteração na utilização da glicose Arner e colaboradores sugeriram que a infusão de AGLs na veia porta provenientes da gordura visceral, ao entrar diretamente no fígado, poderia ser responsável pelos efeitos prejudiciais na ação da insulina (teoria portal) [START_REF] Arner | Not all fat is alike[END_REF]. Está documentado que o aumento dos AGLs pela infusão de uma emulsão lipídica conduz, no prazo de algumas horas, a uma insulinoresistência substancial [START_REF] Boden | Mechanisms of fatty acidinduced inhibition of glucose uptake[END_REF][START_REF] Lam | Free fatty acids increase basal hepatic glucose production and induce hepatic insulin resistance at different sites[END_REF][START_REF] Krebs | Free fatty acids inhibit the glucose-stimulated increase of intramuscular glucose-6-phosphate concentration in humans[END_REF]. Griffin e colaboradores examinaram os efeitos desta infusão e sugeriram que os AGLs interferem na sinalização da insulina ao nível da cascata da serina-quinase envolvendo a proteína cinase C, levando a defeitos na sinalização da insulina e no transporte de glicose [START_REF] Griffin | Free fatty acid-induced insulin resistance is associated with activation of protein kinase C theta and alterations in the insulin signaling cascade[END_REF].

Outro mecanismo possível refere-se às ações hemodinâmicas da insulina, que atua para aumentar o volume de distribuição de um compartimento [START_REF] Ellmerer | Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues[END_REF]. Em 2006, Ellmerer e colaboradores documentaram que a capacidade da insulina para melhorar a distribuição, e presumivelmente o próprio acesso da insulina no músculo esquelético, está severamente atenuada em modelo de cão obeso alimentado com gordura [START_REF] Ellmerer | Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake[END_REF].

No nível vascular, observa-se diminuição na vasodilatação dependente de endotélio após infusão de uma emulsão lipídica, com aumentos transitórios nos AGLs circulantes em voluntários saudáveis [START_REF] Dresner | Effects of free fatty acids on glucose transport and IRS-1-associated phosphatidylinositol 3-kinase activity[END_REF]. Há evidências de que os AGLs reduzem a biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) por inibição da atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e estimulação da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela NADPH oxidase [START_REF] Steinberg | Elevated circulating free fatty acid levels impair endothelium-dependent vasodilation[END_REF]. Portanto, os AGLs seriam potentes candidatos para mediar os efeitos da deposição de gordura no desenvolvimento da RI.

Aumento Do Estado Pró-Inflamatório E Pró-Trombótico

De acordo com trabalho publicado em 1998, alguns estímulos como a superalimentação, principalmente quando baseada em alimentos ricos em gorduras saturadas, e também influências ambientais, como estresse crônico, causariam um aumento na secreção de citocinas que favoreceriam o desenvolvimento da RI e o agrupamento de fatores de risco cardiovasculares associados com a SM [START_REF] Pickup | Is type II diabetes mellitus a disease of the innate immune system?[END_REF]. Também é sabido que defeitos na ação da insulina nos tecidos-alvo, tais como músculo, fígado e o tecido adiposo levam a um aumento do processo inflamatório crônico de baixa intensidade [START_REF] Yudkin | Adipose tissue, insulin action and vascular disease: inflammatory signals[END_REF].

Na obesidade, o acúmulo de tecido adiposo induz um estado pró-inflamatório e pró-trombótico caracterizado pela secreção de diversas citocinas pelos adipócitos, como a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) que, por sua vez, interferem na sinalização intracelular da insulina, comprometem a função endotelial e o metabolismo pós-prandial [START_REF] Pinkney | Adipose tissue as an endocrine and paracrine organ[END_REF][START_REF] Giorgino | Regional differences of insulin action in adipose tissue: insights from in vivo and in vitro studies[END_REF]. A expressão de receptores para TNF-α em obesos é duas vezes maior do que em não-obesos, e há forte correlação entre a densidade de receptores de TNF-α com o índice de massa corpórea e com a circunferência abdominal [START_REF] Kern | The expression of tumor necrosis factor in human adipose tissue. Regulation by obesity, weight loss, and relationship to lipoprotein lipase[END_REF]. Esta citocina aumenta a produção de endotelina 1 (ET-1) e de angiotensinogênio, semelhante à disfunção endotelial que pode ocorrer em obesos hipertensos [START_REF] Barroso | The adipose tissue in the genesis of hypertension and atherosclerotic cardiovascular disease. An emerging concept[END_REF], além de estimular a lipólise e inibir a lipogênese [START_REF] Desouza | Management of the insulin resistance syndrome[END_REF]. O TNF-α associa-se, ainda, à promoção da aterosclerose por alterar a estabilidade plaquetária e a permeabilidade do endotélio, além de ativar monócitos [START_REF] Mozaffarian | Dietary intake of trans fatty acids and systemic inflammation in women[END_REF].

Além disso, o adipócito é responsável por secretar proteínas quimiotáticas de monócitos-1, que induzem a atração de macrófagos. Os macrófagos são importantes na produção de citocinas, que infiltram o estroma do tecido adiposo abdominal, contribuindo para a exacerbação e perpetuação do processo inflamatório crônico [START_REF] Weisberg | Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue[END_REF]. A expressão de marcadores inflamatórios é mais acentuada na gordura visceral que na subcutânea, fator esse que parece interferir no impacto metabólico da adiposidade intraabdominal [START_REF] Giorgino | Regional differences of insulin action in adipose tissue: insights from in vivo and in vitro studies[END_REF][START_REF] Tsigos | Circulating tumor necrosis factor alpha concentrations are higher in abdominal versus peripheral obesity[END_REF][START_REF] Hermsdorff | Visceral, subcutaneous or intramuscular fat: where is the problem?[END_REF].

Estresse Oxidativo E Disfunção Endotelial

O termo estresse oxidativo (EO) corresponde ao evento resultante do desequilíbrio entre o sistema de defesa antioxidante e a geração de ROS ou de espécies reativas de nitrogênio (RNS). Tal desequilíbrio resulta na oxidação de importantes biomoléculas (lipídios, proteínas, carboidratos e DNA) geradas em um cenário de reações de óxido-redução, onde a oxidação implica em ganho de elétron e a redução, em perda [START_REF] Poli | 4-hydroxynonenal: a membrane lipid oxidation product of medicinal interest[END_REF][START_REF] Santos | Mechanisms and implications of reactive oxygen species generation during the unfolded protein response: roles of endoplasmic reticulum oxidoreductases, mitochondrial electron transport, and NADPH oxidase[END_REF]. As espécies reativas, também denominadas radicais livres, incluem:

peroxinitrito (ONOO -), hidroxil (•OH), superóxido (O 2 ¯•), peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 )
. Elas são geradas tanto por sistemas enzimáticos como não enzimáticos, têm sido implicadas não apenas em grande número de processos fisiológicos, mas também não fisiológicos durante a iniciação e progressão de doenças [START_REF] Aldini | Intervention strategies to inhibit protein carbonylation by lipoxidation-derived reactive carbonyls[END_REF].

As principais fontes geradoras de espécies reativas são as mitocôndrias (através da redução incompleta do O 2 ), macrófagos e neutrófilos, endotélio, epitélio, sistemas enzimáticos (mieloperoxidase; xantina oxidase, NADPH-oxidase, NADPH-citocromo P450 redutase, ciclo-oxigenase, NOS), reações com metal (Ferro e Cobre) via reação de Fenton e de Haber-Weiss, e reação não enzimática entre os radicais superóxido e NO resultando na geração de peroxinitrito, [START_REF] Touyz | Reactive oxygen species in vascular biology: implications in hypertension[END_REF]. Embora as espécies reativas sejam essenciais para uma variedade de mecanismos de defesa celular as ROS (e também as RNS) podem causar lesão oxidativa em biomoléculas (lipídios, proteínas, carboidratos e DNA) quando presentes em quantidade superior à sua neutralização mediada pelo sistema de defesa antioxidante [START_REF] Pacher | Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease[END_REF].

Na progressão da RI o comprometimento da ação da insulina também é associado diretamente ao EO. A concentração de insulina pode ser afetada pelo ferro existente na ferritina (Fe +++ ) que é capaz de gerar radical hidroxil, uma das mais importantes espécies reativas do O 2 . De fato, a alta concentração nos estoques de Fe +++ pode diminuir a extração hepática de insulina [START_REF] Ferrannini | Insulin resistance, iron, and the liver[END_REF] e também resultar na produção de

•OH que, viabiliza a lipoperoxidação [START_REF] Jehn | Serum ferritin and risk of the metabolic syndrome in U.S. adults[END_REF]. Além disso, tem sido mostrado que a insulina pode modificar-se estruturalmente pelo peroxinitrito via nitração da insulina, o que compromete a sua ligação com o receptor; e, consequentemente resulta em RI [START_REF] Chi | Effect of insulin nitration by peroxynitrite on its biological activity[END_REF].

Além da modificação estrutural da insulina, o peroxinitrito pode também nitrar o receptor de insulina, uma glicoproteína constituída por tirosina [START_REF] Pacher | Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease[END_REF]. A nitração da insulina também pode ocorrer porque condições de hiperglicemia induzem diminuição de tetrahidrobiopterina (BH4), que constitui elemento chave para a manutenção da integridade e função de proteínas compostas por tirosina, como é o caso da insulina, o que resulta em sua alteração estrutural seguida de disfunção [START_REF] Sobrevia | Dysfunction of the endothelial nitric oxide signalling pathway in diabetes and hyperglycaemia[END_REF].

A disfunção endotelial é outra manifestação da SM que está associada ao estresse oxidativo. Alguns componentes da SM, tais como baixos níveis de HDLcolesterol, aumento nos níveis de LDL, a hipertensão arterial e o aumento da oferta de ácidos graxos livres são fatores de risco independentes para o desenvolvimento de aterosclerose e estão associados com função anormal do endotélio vascular [START_REF] Fagan | The cardiovascular dysmetabolic syndrome[END_REF].

De fato, as espécies reativas podem induzir oxidação da fração LDL-colesterol uma das condições indutoras da formação de células espumosas. Além disso, as principais fontes formadoras de espécies reativas de oxigênio nos vasos sanguíneos são os complexos enzimáticos: NADPH-oxidases e da eNOS desacoplada. Já foram descritas elevações na atividade da NADPH-oxidase pela exposição à angiotensina II e ao TNF-α em cultura de células musculares lisas vasculares [START_REF] Griendling | NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease[END_REF]. Animais com RI apresentam níveis reduzidos de BH4, co-fator responsável pelo desacoplamento da eNOS nos vasos sanguíneos e produção aumentada de superóxido com consequente disfunção endotelial. Além disso, a administração oral de BH4 em ratos com resistência à insulina se mostrou capaz de reverter estas condições [START_REF] Shinozaki | Oral administration of tetrahydrobiopterin prevents endothelial dysfunction and vascular oxidative stress in the aortas of insulin-resistant rats[END_REF].

Outro fator relevante na disfunção endotelial corresponde ao fato de que portadores de hipertensão arterial apresentam elevação dos níveis de angiotensina-II.

Como já referido, a angiotensina-II pode aumentar a atividade da enzima NADPHoxidase e a concentração de ET-1, condições que resultam em geração de espécies reativas [START_REF] Bahia | The endothelium in the metabolic syndrome[END_REF]. O aumento de superóxido resulta em diminuição da disponibilidade de NO, fato que contribui para a vasoconstrição e aumento da resistência vascular periférica [START_REF] Gomes | Glucose levels observed in daily clinical practice induce endothelial dysfunction in the rabbit macro-and microcirculation[END_REF]. Estudos in vivo e in vitro também mostraram que o aumento da pressão intraluminal e do estresse de cisalhamento está associado ao aumento do estresse oxidativo [START_REF] Pacher | Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease[END_REF]. Além disso, o aumento do peroxinitrito tem sido demonstrado em vaso de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) [START_REF] Hong | Supplemention with tetrahydrobiopterin suppresses the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats[END_REF] e em modelo experimental de SM [START_REF] Kagota | Disturbances in nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate system in SHR/NDmcrcp rats, a model of metabolic syndrome[END_REF].

A presença de RI, secundária a um defeito sistêmico na via PI3-quinase, determina um defeito combinado no transporte de glicose e na vasodilatação dependente de endotélio mediados pela insulina. A ativação da via da MAP-quinase atua como fator estimulador do crescimento celular. Nos vasos sanguíneos, esta via medeia não somente o crescimento vascular, mas também a migração de células endoteliais, células musculares lisas e monócitos. Além disso, parece mediar a expressão de fatores prótrombóticos e pró-fibróticos [START_REF] Pessin | Signaling pathways in insulin action: molecular targets of insulin resistance[END_REF]. Consequentemente, os efeitos resultantes dessa ativação são pró-aterogênicos. Questiona-se se esta via teria também suas ações atenuadas pela presença de RI. Estudos de biópsia de músculo glúteo com medidas da ativação da PI3-quinase e MAP-quinase, antes e após infusão de insulina em controles magros, obesos sem DM2 e pacientes com DM2, não confirmam tal suposição [START_REF] Cusi | Insulin resistance differentially affects the PI 3-kinase-and MAP kinase-mediated signaling in human muscle[END_REF].

Esses dados demonstram, inclusive, que a RI e os defeitos associados à SM são dependentes de um defeito específico da via de sinalização da PI-3-quinase.

Alterações Microcirculatórias

Entre pacientes com diabetes, é bem estabelecido que o acometimento de pequenos e grandes vasos frequentemente coexiste. Isso tem sido amplamente documentado em grandes estudos observacionais, por exemplo, o estudo publicado por Pirart J., em 1977 (60) [START_REF] Berne | Fisiologia. Rio de Janeiro[END_REF][START_REF] Guyton | Blood pressure regulation: basic concepts[END_REF]. Sua distribuição varia de tecido para tecido, onde tecidos metabolicamente ativos apresentam alta densidade capilar, como o muscular cardíaco, ou esquelético [START_REF] Berne | Fisiologia. Rio de Janeiro[END_REF].

Uma segunda função importante da microcirculação é evitar grandes variações na pressão hidrostática ao nível dos capilares que podem causar distúrbios nas trocas entre tecido e capilares. Finalmente, é ao nível da microcirculação que ocorre uma queda substancial na pressão hidrostática. Assim, a microcirculação é extremamente importante na determinação da resistência periférica total [START_REF] Berne | Fisiologia. Rio de Janeiro[END_REF][START_REF] Schiffrin | Reactivity of small blood vessels in hypertension: relation with structural changes. State of the art lecture[END_REF][START_REF] Mulvany | Resistance vessel structure and the pathogenesis of hypertension[END_REF]. De acordo com a fisiopatologia da hipertensão arterial, alterações microvasculares na resistência de vasos em aproximadamente todos os órgãos, e em particular no músculo esquelético, podem contribuir consideravelmente para o aumento da resistência vascular periférica [START_REF] Bohlen | Localization of vascular resistance changes during hypertension[END_REF]. Duas hipóteses têm sido propostas para explicar esse aumento na resistência vascular. A primeira é a vasoconstrição causada pelo aumento da atividade do sistema nervoso simpático [START_REF] Iriuchijima | Sympathetic nervous activity in renal and DOC hypertensive rats[END_REF][START_REF] Judy | Sympathetic nerve activity: role in regulation of blood pressure in the spontaenously hypertensive rat[END_REF][START_REF] Serne | Capillary recruitment is impaired in essential hypertension and relates to insulin's metabolic and vascular actions[END_REF][START_REF] Feldstein | The complex interaction between overweight, hypertension, and sympathetic overactivity[END_REF] ou aumento da sensibilidade a agentes vasoativos [START_REF] Bohlen | Localization of vascular resistance changes during hypertension[END_REF]. A segunda é que o aumento crônico da pressão sanguínea causaria o remodelamento da estrutura do músculo liso vascular diminuindo a luz do vaso e o diâmetro interno das arteríolas [START_REF] Folkow | Physiological aspects of primary hypertension[END_REF]. Em 2010, um trabalho publicado pelo nosso grupo mostrou que a modulação do SNS a partir da utilização de drogas antihipertensivas de ação central é capaz de reverter as alterações microvasculares funcionais e estruturais presentes em ratos espontaneamente hipertensos [START_REF] Nascimento | Microvascular effects of centrally acting antihypertensive drugs in spontaneously hypertensive rats[END_REF].

Em ratos Zucker obesos, modelo animal de SM, a rarefação capilar do músculo esquelético parece não depender do aumento da pressão arterial. Isso levanta a possibilidade de que outros fatores associados à SM, talvez a RI, podem estar envolvidos redução progressiva da densidade capilar nestes animais [START_REF] Frisbee | Hypertension-independent microvascular rarefaction in the obese Zucker rat model of the metabolic syndrome[END_REF] [START_REF] Piatti | Relationship between endothelin-1 concentration and metabolic alterations typical of the insulin resistance syndrome[END_REF], sugerindo um possível mecanismo patogenético. A ET-1 mostrou-se capaz de inibir a sinalização de insulina via PI-3-quinase [START_REF] Piatti | Relationship between endothelin-1 concentration and metabolic alterations typical of the insulin resistance syndrome[END_REF]. A inibição crônica da ET-1 melhorou a vasodilatação dependente de endotélio em ratos hiperinsulinêmicos, mas não teve nenhum efeito em animais controles [START_REF] Verma | Effect of chronic endothelin blockade in hyperinsulinemic hypertensive rats[END_REF]. Por outro lado, níveis elevados de ET-1 inibem a sinalização da insulina e estimulam a NADPHoxidase endotelial a produzir adicional superóxido [START_REF] Bahia | The endothelium in the metabolic syndrome[END_REF].

Ativação Do Sistema Nervoso Simpático

Entre todos os mecanismos fisiopatogênicos, a elevação do tônus simpático é, sem dúvida, o mais evidente no hipertenso obeso. Também há evidências de que a noradrenalina plasmática se encontre elevada no curso de dietas hipercalóricas e que, por outro lado, esteja reduzida mediante restrição calórica [START_REF] Rocchini | Clonidine prevents insulin resistance and hypertension in obese dogs[END_REF].

Os principais fatores envolvidos tanto na hiperatividade simpática como na obesidade presente na SM não são totalmente reconhecidos, no entanto, o aumento da atividade do sistema nervoso simpático (SNS) por estimulação da secreção de insulina ocorre após ingestão calórica rica em carboidratos e gorduras, favorecendo o aumento dos níveis pressóricos, mediado pelos rins, coração e sistema vascular [START_REF] Landsberg | Role of the sympathetic adrenal system in the pathogenesis of the insulin resistance syndrome[END_REF]. É importante ressaltar que a insulina tem efeitos tanto no sistema nervoso central (SNC) quanto na terminação nervosa periférica, aumentando o tráfico de impulsos nervosos e a disponibilidade das catecolaminas na fenda sináptica [START_REF] Carvalheira | Cross-talk between the insulin and leptin signaling systems in rat hypothalamus[END_REF]. Além da hiperinsulinemia, a leptina, produzida no tecido gorduroso, tem sido relacionada a elevações do tônus simpático, além de promover retenção de sódio, aumento da pressão arterial e frequência cardíaca [START_REF] Hall | Obesity hypertension: role of leptin and sympathetic nervous system[END_REF].

Voltaremos mais adiante a este último tópico, que é a principal hipótese desta tese.

Tratamento da Síndrome Metabólica

O tratamento da SM consiste em medidas gerais não farmacológicas e terapia medicamentosa.

Terapia Não Medicamentosa

Mudanças no estilo de vida, como maior atividade física, restrição calórica, perda de peso, cessação do hábito de fumar e atenuação de atividades estressantes têm mostrado bons resultados [START_REF]Fisiopatologia da Síndrome Metabólica[END_REF], pois minimizam a RI, reduzindo assim muitos dos efeitos deletérios da SM. Como muitos dos indivíduos portadores da SM têm sobrepeso ou obesidade, a dieta deve visar primariamente à redução ponderal, o que por si só pode determinar uma melhora na sensibilidade à insulina, em alguns casos.

Experimentalmente, em modelos animais, foi demonstrado que uma dieta rica em gorduras poliinsaturadas induz RI, e no homem, indiretamente, este dado também foi observado [START_REF] Riccardi | Dietary treatment of the metabolic syndrome--the optimal diet[END_REF]. Indica-se, atualmente, uma menor ingestão de alimentos ricos em gorduras poliinsaturadas, preferindo, com moderação, aqueles ricos em gorduras monoinsaturadas [START_REF] Riccardi | Dietary treatment of the metabolic syndrome--the optimal diet[END_REF]. Alguma restrição na ingestão de carboidratos também é desejável, objetivando reduzir os níveis glicêmicos e, por conseguinte, a insulina e os triglicerídeos plasmáticos [START_REF] Reaven | Do high carbohydrate diets prevent the development or attenuate the manifestations (or both) of syndrome X? A viewpoint strongly against[END_REF]. Alimentos ricos em fibras e outras proteínas, com menor conteúdo glicídico são também indicados [START_REF] Riccardi | Dietary treatment of the metabolic syndrome--the optimal diet[END_REF].

A atividade física regular é uma intervenção eficaz na redução do peso corporal, alterando favoravelmente a composição corporal, especialmente em indivíduos com sobrepeso ou obesidade moderada (100, 101). A adiposidade abdominal é outro fator em que o exercício físico sabidamente atua de forma benéfica, reduzindo os níveis de gordura visceral (102)e periférica ( 103), e, consequentemente, diminuindo a RI (104, 105).

Terapia Medicamentosa

O tratamento medicamentoso dos componentes da SM deve ser considerado quando não há melhora destes apesar das mudanças de estilo de vida, para que haja diminuição da progressão das alterações e do risco de desenvolvimento de doença aterosclerótica. No entanto, até o presente momento não existe nenhuma droga específica recomendada para tratamento da SM. No entanto, as principais substâncias utilizadas no tratamento da SM visam melhorar a sensibilidade periférica à insulina e prevenir ou minimizar as complicações oriundas desta alteração metabólica primária e de todas as outras advindas dela (106). Quando os pacientes com hiperglicemia não respondem ou deixam de responder adequadamente às medidas não-medicamentosas, devem ser inseridos um ou mais agentes antidiabéticos, com a finalidade de controlar a glicemia e promover a queda da hemoglobina glicosilada (107). O tratamento medicamentoso da hipertensão arterial na SM tem como objetivo reduzir a morbidade e a mortalidade cardiovascular, além de prevenir o agravamento dos perfis lipídico e glicídico (105). Além disso, o uso das estatinas deve ser considerado como terapia prioritária no tratamento da dislipidemia da SM devido à existência de evidências robustas relacionando-as à redução da morbimortalidade cardiovascular [START_REF] Heart | Executive summary of the third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III)[END_REF]108).

Sistema Nervoso Simpático

Estrutura e Organização Anatômica

O sistema nervoso autônomo regula o funcionamento de vários órgãos e devido a sua complexidade, ele foi dividido em duas partes: o sistema nervoso simpático (SNS) e parassimpático (SNP). O SNS tem seu início nos centros bulbares, de onde partem as fibras pré-ganglionares que, em seguida, deixam o tronco cerebral e a medula espinhal.

Eles resultam em gânglios paravertebrais localizados de cada lado da medula espinhal ou da medula adrenal. A partir desses gânglios parte fibras pós-ganglionares simpáticas que liberam noradrenalina, neurotransmissor responsável pela ativação de receptores adrenérgicos. Poucas fibras simpáticas pós-ganglionares liberam dopamina ou acetilcolina (Figura 1.2) [START_REF] Guyton Ac | Tratado De Fisiologia Médica[END_REF]109). 

Síntese, Liberação e Degradação de Noradrenalina

A síntese de noradrenalina ocorre a partir da tirosina, um aminoácido fornecido pela dieta. A tirosina é incorporada na fibra pós-ganglinar por um transportador específico, e, em seguida hidroxilada a L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) pelas tirosina-hidroxilase (TH) e, posteriormente, convertida em dopamina por ação da dopa descarboxilase (DD). A dopamina é, então, transformada em noradrenalina, sob a ação catalítica da dopamina β-hidroxilase (DBH). A noradrenalina, logo que sintetizada, é concentrada nos grânulos de armazenamento e liberadas por exocitose para o espaço sináptico após a chegada do impulso nervoso (potencial de ação propagado ao longo da fibra) (Figura 1.4) (109).

Na medula adrenal (estimulada diretamente pela acetilcolina liberada das fibras esplâncnicas), a noradrenalina é metilada em adrenalina pela feniletanolamina Nmetiltransferase. Células cromafins da medula supra-renal são neurônios pósganglionares modificados que produzem noradrenalina e principalmente adrenalina (112).

A monoamina oxidase (MAO) e a catecol-O-metiltransferase (COMT) são enzimas responsáveis pela degradação das catecolaminas. A ação da MAO sobre a noradrenalina produz o ácido dihidroximandélico, e o produto da COMT é a normetanefrina (metanefrina para adrenalina). O metabólito final é o ácido 3-metoxi-4hidroxi mandélico ou ácido vanililmandélico (VMA). Uma estimativa do volume de catecolaminas produzido pode ser obtida pela determinação da quantidade destes metabólitos excretada na urina ao longo de 24 horas (metanefrinas totais e VMA) [START_REF] Guyton Ac | Tratado De Fisiologia Médica[END_REF]. 

Papel das catecolaminas

A noradrenalina é altamente conservada em vertebrados durante a evolução e exerce uma ampla gama de efeitos fisiológicos. A nível central, a noradrenalina é um neurotransmissor diretamente envolvido no equilíbrio do humor, na regulação do sono, na agressividade, no estado de alerta e vigília, exercendo também um controle central sobre o sistema endócrino [START_REF] Guyton Ac | Tratado De Fisiologia Médica[END_REF].

Em neurônios pós-ganglionares periféricos, a noradrenalina regula reflexos cardiovasculares e de gastos energéticos aos estímulos ambientais. A noradrenalina induz um perfil de respostas fisiológicas características de situações de estresse, em resposta à secreção de corticosteróides endógenos pelo córtex adrenal. A liberação de catecolaminas tem muitos efeitos cardiovasculares (aumento da frequência cardíaca e da pressão arterial) e metabólicos (utilização de glicose muscular e glicogenólise), que constituem geralmente uma reação inconsciente para se preparar para lutar ou fugir.

As catecolaminas não são apenas liberadas em situações de perigo, mas também em situações em que há variação das condições fisiológicas, como o exercício físico ou a mudança de postura. As catecolaminas, portanto, desempenham tanto o papel de neurotransmissor quanto de hormônio do estresse.

Os Receptores Adrenérgicos

Receptores α-adrenérgicos

Eles foram divididos em α 1 e α 2 de acordo com as suas diferentes coeficientes de afinidade1 frente a seus agonistas e antagonistas (Tabela 1.3). Os receptores α 1 -adrenérgicos são predominantemente pós-sinápticos enquanto que os receptores α 2 -adrenérgicos são pré-sinápticos. Em receptores adrenérgicos centrais, os receptores α 2-adrenérgicos predominam. Estas diferentes localizações explicam porque uma substância interagindo com receptores α-adrenérgicos tem efeitos diferentes dependendo do receptor que ela estimule ou bloqueie (114,115).

EFEITOS α1-ADRENÉRGICOS PERIFÉRICOS

• Vasos (aumento da PA e da resistência periférica)

• Bexiga (promove a micção)

• Intestino: contração dos músculos do esfíncter

• Músculo dilatador da íris (midríase)

• Coração: aumenta a força de contração (efeito inotrópico positivo)

• Fígado: glicogenólise (hiperglicemia)

EFEITOS α2-ADRENÉRGICOS PERIFÉRICOS

• Contração de certos músculos lisos vasculares (fibras não inervadas);

• Adipócitos: inibição da lipólise;

• Relaxamento da musculatura lisa intestinal (reduzindo a liberação de acetilcolina através da ação α-adrenérgica pré-sináptica);

• Diminuição da secreção de água e sal;

• Estimulação da agregação de plaquetas

• Diminuição da secreção de renina

• Redução da liberação de Nad (efeito pré-sináptico)

• Diminuição da secreção de insulina

EFEITOS α2-ADRENÉRGICOS CENTRAIS

• Sedação

• Redução do tônus simpático (PA baixa)

• Redução da secreção de algumas glândulas exócrinas, como as glândulas salivares, levando a xerostomia (boca seca).

Farmacologia dos Receptores α-Adrenérgicos

Ativação dos Receptores α-adrenérgicos

AGONISTAS α1 -ADRENÉRGICOS

Os agonistas α 1 -adrenérgicos têm sido utilizados principalmente como ferramentas farmacológicas. Eles são atualmente utilizados na terapêutica, principalmente como vasoconstritores locais (fenilefrina, metoxamina, e outros) (115). A existência de sítios de ligação específicos para as imidazolinas radiomarcadas foi demonstrada no cérebro e em vários tecidos periféricos (122, 123).

Dois sítios de ligação foram identificados e classificados em diferentes subgrupos (124):

• O tipo I 1 liga-se com igual afinidade à clonidina e ao idazoxan (antagonista dos receptores imidazolínicos e receptores α 2 -adrenérgicos) (125).

• O tipo I 2 , localizado principalmente nas mitocôndrias, está associado à MAO, sensível ao idazoxan, mas não à clonidina (126).

• O tipo I 3 está localizado no pâncreas, onde estimula a secreção de insulina (127).

O subtipo de receptor imidazolínico I 1 (RI • LNP 509: primeiro LNP publicado sem afinidade α 2 -adrenérgico detectável, capaz de reduzir a pressão arterial após injeção central, mas não é capaz de passar pela barreira hematoencefálica após injeções parenterais (134, 135).

• LNP 599 (Figura 1.5) e LNP 640: nenhuma afinidade α 2 -adrenérgico detectável, capaz de reduzir a pressão arterial após injeção central e periférica, tendo em vista a passagem pela barreira hematoencefálica (Figura 1.4).

• LNP 911: primeiro marcador mais seletivo do que o marcador de referência, a paraiodo-clonidina marcador radioativo (136).

• LNP 906: primeiro ligante de alta afinidade seletivo para o receptor I 1 e fotoativável, isto é, capaz de formar uma ligação covalente irreversível com o sítio de ligação, que é muito útil para estudos de identificação (137). 

Hiperatividade Simpática na Síndrome Metabólica

Ingestão Calórica E A Atividade Simpática

Atualmente, já é conhecido que o excesso de ingestão calórica seria um fator para aumento da atividade simpática e a pressão arterial [START_REF] Rocchini | Clonidine prevents insulin resistance and hypertension in obese dogs[END_REF]138), assim como o estresse psicossocial, por influenciar também no comportamento alimentar. Além disso, sabe-se que a obesidade é um fenômeno complexo, que envolve também a participação do sistema nervoso, mas nem todos os obesos têm hiperatividade simpática. Estudos em roedores e humanos têm mostrado que o jejum inibe o SNS (139). Em contraste, a ingestão em excesso aumenta a atividade do SNS (140). A ingestão de carboidratos e gordura (141), mas não de proteínas (142) estimula o SNS. O aparecimento das modificações do SNS induzidas pela alimentação parece preceder e desencadear alterações na atividade do SRAA [START_REF] Rocchini | Clonidine prevents insulin resistance and hypertension in obese dogs[END_REF]. Achados de estudos experimentais têm provido informações para os mecanismos pelos quais a obesidade e a RI ativam o sistema nervoso simpático e contribui para o risco de doença cardiovascular. Os resultados dos estudos indicam que a relação entre obesidade, RI e função simpática é complexa e perece ser modificada por fatores genéticos e ambientais (143).

A existência de uma associação entre o estado nutricional e a atividade do SNC é conhecida pela influência da ingestão sobre o SNS. Dentro deste contexto, como a maioria dos pacientes obesos também apresenta hiperinsulinemia, tem sido sugerido que a hiperatividade simpática poderia estar relacionada na regulação da insulina sobre o metabolismo glicídico de neurônios centrais (132). Além disso, sabe-se também que a insulina induz efeitos hemodinâmicos diretos, aumentando a pressão arterial através da retenção renal de sódio e, da volemia, mediada pelo SNS. Em pacientes com dislipidemia, a insulina está diretamente relacionada com os níveis de adrenalina [START_REF] Landsberg | Role of the sympathetic adrenal system in the pathogenesis of the insulin resistance syndrome[END_REF].

Ativação do Sistema Nervoso Simpático na Síndrome Metabólica

Nestes últimos 25 anos, estudos clínicos têm demonstrado que vários componentes da SM estão associados com "marcadores" diretos ou indiretos da hiperatividade simpática (144). Em pacientes obesos com hipertensão, existe uma taquicardia de repouso e um aumento significativo nos níveis de noradrenalina plasmática (145), sendo este também o caso de pacientes com RI. A redução da pressão arterial durante a perda de peso observada em pacientes obesos está associada com uma diminuição de noradrenalina plasmática (146).

FREQUÊNCIA CARDÍACA AUMENTADA

Tendo em vista que a frequência cardíaca é modulada pelo tônus simpático vagal, através da liberação de noradrenalina ou acetilcolina, os valores de repouso podem ser marcadores da atividade simpática. Os indivíduos com SM têm um aumento da frequência cardíaca (147) e existência de uma relação contínua entre a frequência cardíaca e a mortalidade cardiovascular já é conhecida (148).

NORADRENALINA PLASMÁTICA AUMENTADA

Em casos de hipertensão arterial os níveis de noradrenalina circulante estão aumentados (149). Existe também um aumento na liberação de noradrenalina renal em casos de obesidade, o que pode afetar a retenção de água, estimular o SRAA e, assim, aumentar a pressão sanguínea (149). 

REGULAÇÃO NEGATIVA DOS RECEPTORES ADRENÉRGICOS

A hiperatividade simpática pode desempenhar um papel na resposta adaptativa ao excesso de peso, aumentando a homeostase cardiovascular dependente da termogênese [START_REF] Landsberg | Role of the sympathetic adrenal system in the pathogenesis of the insulin resistance syndrome[END_REF], levando a dessensibilização dos receptores adrenérgicos no longo prazo. Este último estaria diretamente ligado à diminuição no efeito regulador da ativação simpática na sobrecarga calórica presente em casos de obesidade (156).

Embora a relação do SNS com o desenvolvimento de alterações cardiometabólicas da obesidade já esteja bem descrita, o presente trabalho está concentrado na patogênese da SM, a fim de estabelecer um nexo de causalidade entre a hiperatividade simpática e os vários elementos da SM, o que poderia ajudar a obter um modelo adequado para o estudo da SM (com algumas das suas formas, no mínimo) e proporcionar uma estratégia terapêutica eficaz.

Objetivos

Objetivo Geral

Investigar a participação do sistema nervoso simpático na fisiopatologia das alterações cardiovasculares e metabólicas da síndrome metabólica.

Objetivos Específicos

1) Desenvolver um modelo experimental de síndrome metabólica induzida por dieta hiperlipídica caracterizado pela presença de hiperatividade simpática.

2) Avaliar o efeito da modulação do sistema nervoso simpático em ratos obesos com síndrome metabólica sobre: 

Efeitos da modulação do sistema nervoso simpático em ratos com SM.

Ética no uso animal

Os procedimentos de manuseio e experimentação realizados no Laboratório de Investigação Cardiovascular da FIOCRUZ neste estudo foram previamente aprovados pelo comitê de ética no uso animal (CEUA) da Fundação Oswaldo Cruz -Fiocruz, sob o número LW-31/10, atendendo ao disposto na Lei 11794/08 sobre o uso científico de animais de laboratório.

Modelo animal e protocolo experimental

Foram utilizados ratos Wistar-Kyoto (WKY) machos, com seis semanas de idade, providos pelo centro de criação de animais de laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (CECAL/Fiocruz). Os animais foram mantidos em condições controladas de umidade (60±10%), temperatura (21±2°C) e luz (ciclo de 12 horas claro/escuro), com livre acesso a ração e água. Inicialmente, os ratos foram divididos em dois grupos experimentais: 1) animais alimentados com ração comercial padrão 2 (CON + VEI n=10); 2) animais tratados com dieta hiperlipídica (HFD n = 40) por 20 semanas. A dieta hiperlipídica (HFD) foi composta por 50% da ração comercial padrão, com adição de gordura animal (banha de porco), leite condensado, amido de milho e NaCl (157). A composição das dietas do grupo CON e do grupo HFD é apresentada na tabela 3.1.

2 Nuvilab -CR1, Nuvital Nutrientes Ltda, Colombo, Paraná -Brasil. 

Pesagem dos animais e ingestão de ração

A livre ingestão de ração e água foi permitida aos animais ao longo de todo o experimento. A massa corporal e a ingestão de comida foram aferidas antes e depois do tratamento através de balança digital com carga mínima de 25g (urano, UDI 10000/1, Brasil).

Avaliação hemodinâmica

Foram realizadas medidas indiretas da pressão arterial sistólica (PAS) e da FC nos animais conscientes, através de um sistema computadorizado de pletismografia caudal (BP-2000, Visitech blood pressure analysis system, USA) (Figura 3. 

Metabolismo glicídico

Ao final da 24ª semana de dieta, foi realizado um teste oral de tolerância à glicose (TOTG), onde alíquotas de sangue foram coletadas da ponta da cauda dos animais para análise dos níveis séricos de glicose (glicômetro, Accu-Chek, Roche) após 12 horas de jejum (momento 0) e nos tempos 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração de uma sobrecarga de glicose (2 g/kg, i.p.) (158).

Videomicroscopia intravital por fluorescência

Na manhã dos experimentos terminais, após 4 semanas de tratamento oral crônico, os animais foram anestesiados com a associação de pentobarbital sódico (70 

.

Quantificação da gordura retroperitoneal e epididimal

Após a morte dos animais, os depósitos de gordura visceral e epididimal foram dissecados e pesados em balança analítica com precisão de 0,01g (A&D, GR-200, Japan). Foi considerada visceral a gordura aderida à parede abdominal posterior, ao redor dos rins e na parte abdominal do ureter. A gordura abdominal localizada na porção inferior do abdome e conectada ao epidídimo foi considerada como gordura epididimal.

Análises histológicas

Amostras 

Diâmetro do cardiomiócito e deposição de colágeno

A análise morfométrica cardíaca foi realizada pela medida do diâmetro do cardiomiócito. As amostras foram coradas com hematoxilina e eosina e os cardiomiócitos visualizados através de um microscópio de fluorescência (Olympus BX50/WI, USA) acoplado a um sistema de câmera de vídeo digital (Optronics, Goleta, CA, USA). Foi utilizada uma objetiva de 40x e um aumento de 400x no monitor. A medida do diâmetro transverso dos cardiomiócitos foi realizada pelo software Saisam 

Análise estatística

Os dados são apresentados na forma de média ± erro padrão da média (EPM).

Todos os gráficos e as estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EUA). A normalidade da distribuição dos dados foi determinada através do teste de normalidade de Shapiro-Wilk. As variáveis morfológicas (peso, ganho de peso, peso das gorduras retroperitoneal e epididimal e % de gordura corporal), morfométricas (diâmetro do cardiomiócito e densidade capilar funcional e estrutural), perfil lipídico e perfil glicídico foram comparados entre os grupos por meio da analise de variância (ANOVA one-way) e o Post-Hoc de Bonferroni foi utilizado para localizar as diferenças quando p<0,05.

O papel dos ligantes seletivos dos receptores periféricos I1 das imidazolinas.

Modelo e protocolo experimental

Foram utilizadas células do tecido adiposo visceral de ratos WKY com 20 semanas de vida. Os animais foram mantidos em condições controladas de umidade ( 60± 10%), temperatura (21±2°C) e luz (ciclo de 12 horas claro/escuro), com livre acesso a ração e água.

Os animais foram sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico via i.p. para que fosse realizada a extração do tecido adiposo visceral através de incisão da região abdominal.

Bioensaio 1 (binding)

PREPARAÇÃO DAS FRAÇÕES MEMBRANARES

O tecido adiposo dos ratos foi macerado e centrifugado a 1000 rpm/min durante 5 minutos em tampão de lise Tris-Hepes gelado (Tris 5 mM de Hepes, pH 7,7, EDTA 0,5 mM, MgCl 2 0,5 mM e EGTA 0,5 mM) contendo inibidores de proteases (leupeptina a 10 µg/mL de inibidor de tripsina 1µg/mL benzamidina 5mg/mL).

As células foram então homogeneizadas e, em seguida, centrifugadas a 75000 g durante 20 min a 4° C (equipamento Beckman). O sedimento de membrana foi ressuspenso em tampão de lise de Tris-Hepes resfriado. As membranas foram, então, homogeneizadas. Em seguida, elas foram novamente ultracentrifugadas a 75000 g durante 20 minutos a 4° C. As membranas foram, então, homogeneizadas uma última vez antes de serem distribuídas em frascos e armazenadas a -80° C até utilização.

DOSAGEM DE PROTEÍNAS

A quantidade de proteína foi determinada pelo método de Bradford (164). Uma curva padrão (0 a 10µg) é feita com albumina de soro bovino como referência. 1 ml de reagente de Bradford (0,01% de azul de Coomassie G-250, 8,5% de ácido fosfórico, 4,75 % de etanol) é adicionado em 100µL de amostra da curva padrão, ou em amostra do ensaio. Após agitação e o surgimento da cor, a densidade óptica é medida com um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 595 nm. As concentrações de proteínas das amostras são derivadas dos valores obtidos a partir da curva padrão. 

Bioensaio 2 (lipólise)

Este procedimento, realizado a partir de amostras do tecido adiposo de ratos WKY, consistiu na preparação e ativação de adipócitos em um ensaio lipolítico controlado que permite a avaliação da função celular através da dosagem de glicerol.

CONSTITUINTES

o Soluções Tampão utilizadas: 1% albumina do soro bovino V (BSA).

Foram utilizados 200ml deste tampão por animal para fabricar os tampões seguintes.

• Tampão de lavagem Tampão nature + 500nM adenosina (Peso Molecular = 267 => 5mM = 1,33mg/ml => 8,5µl adenosina em 85ml de tampão nature)

Foram utilizados 85ml deste tampão por animal.

• Tampão de digestão Tampão de lavagem + 1mg/ml de colagenase tipo 1A Foram utilizados 5ml deste tampão por animal.

• Tampão de reação Tampão nature + 1U/ml adenosina desaminase (ADA), cerca de 3µl de solução estoque para 5ml) 4% BSA V É um tampão utilizado para inativar os resíduos da adenosina, permitindo assim a lipólise. A albumina utilizada é responsável pela captura dos AGLs.

o Ensaio farmacológico em adipócitos: Diferentes concentrações, em um intervalo de 10 -4 a 10 -9 M, dos fármacos utilizados foi realizado a partir de uma diluição em cascata de 1:10, em tampão nature.

Estas concentrações permitem a construção de uma curva de dose-resposta para o ensaio de lipólise.

o Forscolina em diferentes concentrações:

A forscolina ajuda a estimular a lipólise nos adipócitos. A concentração de forscolina utilizada é de 10 -4 a 10 -9 M e é também preparada em cascata através de diluição de 1:10 em tampão nature.

PREPARAÇÃO DOS ADIPÓCITOS

O tecido adiposo retirado dos animais é preservado em tampão de lavagem contendo adenosina, que impede a lipólise, atuando em seu receptor. Esta propriedade é explorada para evitar a drenagem do conteúdo de triglicérides dos adipócitos durante o preparo.

Para facilitar a digestão, o tecido é cortado em pequenos pedaços e colocado em tampão de digestão contendo colagenase. Esta enzima é capaz de quebrar as ligações de peptídeos de colágeno, que mantém o tecido. Assim, a ação desta enzima fará com que haja dissociação do tecido em adipócitos isolados. A preparação é colocada a 37° C, a temperatura de funcionamento ideal da enzima.

A suspensão é passada através de um filtro de 500 µm de reticulação que permite a passagem de adipócitos (máx. 150 µm de diâmetro), mas impede que o tecido não digerido passe. O produto da digestão foi centrifugado a 1200 g durante 4 min. Esta etapa de centrifugação é usada para separar os adipócitos das células pré-adipocitárias com base nas suas diferentes densidades. A preparação dos adipócitos é então lavada com tampão de lavagem para remover as impurezas e a colagenase.

A densidade celular da suspensão foi avaliada. Para isso, a suspensão foi diluída em azul de metileno; 6 µL desta suspensão é colocado em uma câmara de neubauer.

Todas as células são contadas ao longo de toda a superfície da lâmina. E assim, o número de células contidas nos 6 µL é conhecido e pode relacionar-se com a concentração da suspensão. A concentração da preparação de adipócitos é ajustada com tampão nature para se obtenha o número desejado de células nos espaços onde será realizado o bioensaio. Este tampão não contém qualquer tipo de adenosina, ao contrário do tampão de lavagem. De fato, a adenosina não é mais necessária porque a etapa seguinte será o bioensaio, onde a lipólise deixará de ser inibida.

ENSAIO LIPOLÍTICO

Os adipócitos preparados em concentrações conhecidas foram imediatamente transferidos para a placa de Elisa contendo o agente ativador de lipólise, um tampão de reação e o fármaco a ser analisado. Os adipócitos foram então incubados por 3 horas em uma estufa de cultura celular com 5% de CO 2 a 37° C, condição fisiológica ideal para realização do bioensaio.

Medida da função lipolítica: dosagem do glicerol

Durante a lipólise, glicerol e ácidos graxos são liberados da célula. Desta maneira, para determinar a função lipolítica dosamos o glicerol no meio extracelular.

No nosso caso, recuperamos o sobnadante do bioensaio para a determinação de glicerol, os adipócitos, pela sua densidade, flutuam na superfície.

Para tornar o glicerol um produto colorido, utilizamos um kit para um ensaio colorimétrico (Free Glycerol -FG0100, SIGMA). Este ensaio é realizado através de três reações em cadeia, que permitem a obtenção de um composto de cor cuja absorbância se dá a 540 nm, sendo proporcional à concentração de glicerol contido no teste.

DETERMINAÇÃO DA QUANTIDADE DE GLICEROL

Para determinar a quantidade de glicerol contido numa amostra, é necessário que o valor de absorbância correspondente esteja dentro da parte linear da curva de forscolina. Se a quantidade de glicerol na amostra não estiver incluído na região linear da curva (fora do intervalo), é necessário efetuar uma diluição adequada da amostra para que o valor de absorbância correspondente esteja dentro da curva linear.

Análise estatística

Todos os gráficos e as estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EUA). Os resultados são apresentados na forma de média ± erro padrão da média (EPM).

Desenvolvimento

de um modelo farmacológico da hiperatividade simpática em camundongos.

Modelo animal

Para este estudo, foram utilizados camundongos knockout (KO) ApoE -/-com 12 semanas de vida, importados pela Taconic Europe (Ejby, Dinamarca). Todos os animais foram mantidos no biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de Strasbourg, com ciclo claro/escuro de 12h/12h, sendo controlados os parâmetros ambientais (temperatura, umidade) e o acesso ad libitum à água e ração. O consumo de água, alimentos e alterações de peso dos animais foram monitorados durante toda a duração dos protocolos.

Protocolo experimental

Foram utilizados dois grupos de KO ApoE -/-, modelo experimental reconhecido para o estudo da aterogênese, tratados com desipramina na água de beber (DES, 10 mg/kg/dia, n = 10) ou com veículo (CON), durante 16 semanas, seguido de uma avaliação dos parâmetros hemodinâmicos antes e outra após o tratamento crônico. Vale ressaltar que a desipramina é um inibidor da recaptação da Nad no espaço sináptico, e outros neurotransmissores.

Avaliação hemodinâmica

Foram realizadas medidas indiretas da PAS e da FC nos animais conscientes a cada 4 semanas, através de um sistema computadorizado de pletismografia caudal (BP-2000, Visitech blood pressure analysis system, USA).

Análise da glicemia

Após o tratamento, os animais foram mantidos por 6 horas de jejun antes de serem anestesiados com injeção de pentobarbital sódico (70mg/kg, i.p.) que permitiu a análise dos níveis séricos de glicose através do sangue acessado pela cauda (glicômetro, Accu-Chek, Roche).

Dosagem das catecolaminas plasmáticas

Ainda com o animal anestesiado, foi realizada a punção cardíaca para coleta do volume máximo de sangue possível, o qual foi transferido para tubos de ensaio. Os tubos foram centrifugados a 15000 rpm por 15 minutos a 4°C para a dosagem das catecolaminas no plasma por HPLC.

É importante notar que o volume de sangue circulante é muito baixo, cerca de 2 ml num camundongo de 30g. É por esta razão que realizamos apenas a dosagem das catecolaminas.

Análise estatística

Todos os gráficos e as estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism GraphPad Software Inc. (San Diego, CA, EUA). Todos os dados são expressos como média ± erro padrão da média, com um intervalo de confiança de 95%. Utilizouse teste t de Student para fins de comparação entre os dois grupos experimentais. Os valores representam a média ± EPM de 10 animais.

Resultados

* p < 0,05; ** p < 0,01 vs. CON + VEI.

# p < 0,05 vs. HFD + VEI.

Metabolismo Glicídico

O metabolismo glicídico foi influenciado pela ingestão da dieta HFD. Na Os valores representam a média ± EPM de 10 animais.

* p < 0,05; ** p < 0,01 e ***p < 0,001 vs. CON + VEI.

# p < 0,05 e ## p < 0,01 vs. HFD + VEI.

Metabolismo Lipídico

Não foram observadas diferenças entre estes grupos controle no colesterol total e no LDL-c ( Os valores representam a média ± EPM de 10 animais.

* p < 0,05 vs. CON + VEI.

# p < 0,05 e ### p < 0,001 vs. HFD + VEI.

Parâmetros Microcirculatórios

DENSIDADE CAPILAR FUNCIONAL

Através da videomicroscopia intravital, foi possível a visualização da rede de capilares no tecido muscular esquelético e na pele da orelha. Apesar de uma aparente redução na densidade capilar funcional cutânea dos animais do grupo que ingeriu dieta HFD, HFD + VEI (19%, quando comparados ao grupo CON + VEI), nenhuma diferença estatisticamente significativa foi constatada na pele da orelha (p > 0,05) (Figura 4.5), onde, os grupos tratados com clonidina e LNP599 aumentaram o número de capilares espontaneamente perfundidos (296 ± 11 e 290 ± 12 capilares/mm 2 , respectivamente).

A rarefação capilar funcional foi constatada apenas no músculo grácil (cerca de 39 % quando comparados ao grupo CON + VEI, p < 0,001, Figura 4.5). Todos os grupos de tratamento foram capazes de reverter a rarefação capilar funcional presente no músculo grácil (229 ± 13, CLO; 255 ± 16, RIL e 241 ± 10 capilares/mm 2 , LNP) em relação ao grupo controle que recebeu dieta normal (253 ± 16 capilares/mm 2 , CON + VEI). 

Detecção e função dos receptores periféricos I1 das

imidazolinas.

Ensaios de competição (binding)

Os ensaios de competição no equilíbrio com período de incubação de 60 minutos permitiram a avaliação do grau de ligação específica de algumas drogas de interesse sobre os receptores I 1 -imidazolínicos. (rauwolscina e UK 14304) em células do tecido adiposo de ratos WKY.

Os valores representam a média ± EPM de 5 experimentos.

Desta vez, utilizando-se da concentração estabelecida no experimento anterior (10 -5 M do antagonista dos receptores α 2 -adrenérgicos, a rauwolscina), o ensaio de ligação específica com [ 125 I] PIC foi exposto a concentrações crescentes do ligante seletivo dos RI1, o LNP599 (Figura 4.9). Os resultados apresentados pela figura 4.8, apontam pela primeira vez, para a presença de RI1 em células do tecido adiposo de ratos. O gráfico aponta para uma alteração da curva de cerca de 20%, já, a partir da concentração de 10 -8 M de LNP599. Essa mesma alteração se torna evidente a partir de 10 -7 M de ligante frio, indicando alta afinidade do agonista, em escala nM. Os valores representam a média ± EPM de 5 experimentos.

Ensaio lipolítico

A taxa de lipólise em adipócitos não é muito elevada. Consequentemente, uma pequena quantidade de glicerol é liberada para o meio extracelular e, portanto, difícil de detectar. Por esta razão, a lipólise dos adipócitos é ativada quimicamente para que a quantidade de glicerol extracelular seja maior. Para fazer isso, usamos a forscolina, 

Glicemia de jejum

O tratamento crônico com desipramina reduziu significativamente a glicemia de jejum (8,9 ± 0,7 nmol/ml, p < 0,05) quando comparada com o grupo controle (11,5 ± 0,7 nmol/ml) ao final das 16 semanas (Figura 4.12). 

Discussão

Os resultados do presente estudo demonstraram que a modulação do sistema nervoso simpático, através do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central, é capaz de reverter alterações: i) hemodinâmicas (pressão arterial e frequência cardíaca; ii) metabólicas (glicídicas e lipídicas) e iii) microcirculatórias (rarefação capilar) presentes no modelo de SM baseado em dieta rica em lipídeos. Esses resultados constituem uma importante demonstração da importância do sistema nervoso simpático sobre as alterações metabólicas e cardiovasculares da SM.

MODELO DE SM BASEADO EM UM REGIME HFD

As dietas ricas em gordura são reconhecidas como um método para gerar um modelo válido de SM em animais (167), mesmo se dietas com diferentes composições de lipídeos descritas na literatura apresentem resultados diferentes em relação aos seus efeitos metabólicos. Em geral, os modelos de roedores de SM induzidos por dietas ricas em gordura são caracterizados por obesidade central, RI e alterações nos perfis de lipídeos no plasma (168, 169) e, portanto, essas dietas reproduzem as principais características da SM humana. Além disso, como a SM em humanos é em grande parte causada por fatores referentes ao estilo de vida, incluindo a ingestão calórica excessiva e inatividade física, o modelo animal que mais reflete essa situação é o modelo baseado em uma dieta HFD.

Os regimes hiperlipídicos são capazes de reproduzir este fenômeno em alguns roedores. A energia fornecida pelos lipídeos pode variar entre 20 e 60%. Esses lipídeos podem ser de origem animal: banha, gordura do leite, ou vegetal: óleo de coco, azeite de oliva. Estas dietas induzem: O presente estudo mostrou que uma dieta HFD em longo prazo pode expandir a adiposidade central em ratos WKY, como mostrado pelo aumento acentuado do armazenamento de gordura visceral e epididimal. A adiposidade visceral desempenha um papel chave no desenvolvimento da SM humana, e está associada a todos os critérios de SM independentemente da sensibilidade à insulina (170,171). Desta forma, o nosso modelo experimental de SM induzido por dieta reproduz as características principais da doença. Por outro lado, o peso corporal e a ingestão de alimentos total dos animais não foram diferentes entre os grupos controle (CON vs. HFD), no final do período experimental. Na verdade, o peso total do corpo ou ganho de peso nem sempre são correlacionados com a deposição de gordura central. Por exemplo, Bonomo e cols. mostraram que um pequeno aumento no peso corporal (cerca de 10%) é acompanhado por um aumento acentuado (2 vezes) na deposição de tecido adiposo central num modelo experimental murino de hipoprolactinemia materna no fim da lactação (172).

Noutro estudo, ratos WKY que receberam HFD durante sete semanas tinham peso corporal total e ganho de peso semelhante no final do tratamento, em comparação com os ratos que receberam uma dieta com baixo teor de gordura (173).

Demonstramos ainda que o aumento da deposição de gordura visceral foi acompanhado por hipertrigliceridemia, alteração dependente do consumo de gordura das dietas (174). Além disso, o aumento da ingestão de sal aumenta os níveis de AGLs no plasma, o que contribui para alterações no perfil lipídico dos animais (175). O aumento de AGLs e os elevados níveis circulantes de triglicerídios provavelmente participam também na indução da hiperglicemia, intolerância à glicose e RI nesses animais (175), que são características importantes da SM. Neste contexto, uma dieta rica em sal aumenta a sinalização da insulina e induz a RI em ratos Dahl sensíveis ao sal (176).

Algumas características adicionais e importantes do modelo experimental utilizado no presente estudo são as alterações cardiovasculares acompanhadas da estimulação do SNS. Na verdade, as elevações na pressão arterial e frequência cardíaca são achados consistentes em pacientes com SM (177) e constituem marcadores robustos de alto risco cardiovascular e da hiperatividade do SNS (178,179). Interessantemente, no presente estudo mostramos que os níveis plasmáticos de noradrenalina foram marcadamente elevados no grupo HFD, confirmando o envolvimento do aumento da atividade simpática no desenvolvimento da SM. Na verdade, vários componentes da SM são associados com marcadores diretos e indiretos da estimulação adrenérgica (144).

Além disso, o nosso modelo de SM com aumento da adiposidade visceral associada à hipertensão moderada sugere um papel das alterações metabólicas, incluindo dislipidemia e disglicemia, no desenvolvimento de hipertensão. Mesmo que nós não tenhamos usado uma dieta rica em sal, no presente estudo, o aumento crônico da ingestão de sal em nosso modelo experimental provavelmente também contribuiu para as elevações da pressão arterial. Os efeitos vasoconstritores de uma dieta de elevado teor de sal são, pelo menos em parte, independentes dos efeitos vasopressores diretos e hipertrofia vascular, que são uma consequência do aumento crônico da pressão arterial (180). Uma contribuição importante para a hipertensão em modelos animais sensíveis ao sal em seres humanos é a disfunção endotelial e, em particular, reatividade vascular, alterada devido ao aumento do estresse oxidativo e da consequente redução da biodisponibilidade do [181][182][183].

No grupo que recebeu dieta HFD, nossos resultados mostraram uma tendência ao aumento dos níveis plasmáticos de leptina, um elemento-chave no desenvolvimento da obesidade. A leptina, produto do gene ob, é um hormônio secretado por adipócitos e que age no SNC promovendo menor ingestão alimentar e incrementando o metabolismo energético, além de afetar eixos hipotalâmico-hipofisários e regular mecanismos neuroendócrinos (184). Em seres humanos obesos, quanto maior a quantidade de tecido adiposo, maiores os níveis de leptina circulantes (185). Esse achado é paradoxal, já que níveis elevados de leptina deveriam diminuir o apetite e aumentar o gasto energético.

Assim, de forma similar ao que ocorre em alguns indivíduos com DM2, em que os níveis de insulina estão aumentados, é provável a ocorrência de um aumento da resistência periférica à leptina em seres humanos com obesidade (186), que agiria sobre o hipotálamo aumentando a atividade simpática e favorecendo o surgimento da hipertensão arterial (187-189).

Igualmente, o desenvolvimento de disfunção endotelial na SM está envolvido na fisiopatologia da hipertensão arterial e desempenha um papel importante no dano microvascular, devido aos elevados níveis de glicose no plasma (182,190). Nessa direção, o presente estudo mostrou que o número de capilares espontaneamente perfundidos no músculo esquelético de ratos alimentados com uma HFD foi significativamente reduzido quando comparado com os animais controles (CON). Por outro lado, a densidade capilar da pele, um leito microvascular que não está diretamente envolvido na regulação da resistência vascular periférica, não foi alterada pela dieta.

Esta redução da densidade capilar funcional está também presente em ratos espontaneamente hipertensos e pode ser revertido pelo tratamento anti-hipertensivo crônico [START_REF] Nascimento | Microvascular effects of centrally acting antihypertensive drugs in spontaneously hypertensive rats[END_REF]159).

A escolha da pele se deu em virtude de sua ampla utilização em pesquisa clínica, na determinação da existência de rarefação e disfunção microvascular sistêmica, devido ao fácil acesso e caráter não-invasivo a este leito microvascular através de técnicas de vídeo-microscopia intravital e de fluxometria microvascular (191)(192)(193). Além disso, já foi demonstrado em humanos que as alterações microvasculares cutâneas, tais como a vasodilatação dependente de endotélio e o recrutamento capilar alterados, estão relacionadas com o aumento do risco cardiovascular, avaliado através do risco de desenvolvimento de doença coronariana (194).

Já o tecido muscular esquelético foi investigado em virtude de sua importante participação na determinação da resistência vascular periférica e no metabolismo periférico. O uso do músculo grácil ocorreu pelo extenso uso do mesmo em diversos trabalhos descritos na literatura (195)(196)(197) a fim de determinar a densidade microcirculatória e em função da facilidade de acesso ao mesmo para a visualização sob o microscópio.

As alterações funcionais da microcirculação, como o recrutamento capilar diminuído e a rarefação capilar, em resultado da perfusão reduzida do tecido podem contribuir para o desenvolvimento da hipertensão e da RI (191,198). Em um modelo genético de obesidade, ratos Zucker obesos, a RI muscular é acompanhada por respostas hemodinâmicas inadequadas à insulina, incluindo o recrutamento capilar reduzido (199). Na verdade, a insulina recruta capilares do músculo esquelético através de um mecanismo dependente de NO, e o aumento no recrutamento capilar pode contribuir para a utilização de glicose subsequente (200).

No músculo esquelético, em virtude da orientação dos capilares paralelos às fibras musculares, foi possível a realização de cortes histológicos em sentido transversal para a contagem dos capilares e das fibras musculares neste tecido. Assim, a relação entre o número de capilares por fibra em um determinado campo microscópico foi tida como sendo a densidade capilar estrutural (ou anatômica) deste leito vascular. Este parâmetro foi utilizado ao invés do número de capilares totais em um campo microscópico, já que este último está sujeito a variações relacionadas ao tamanho das fibras musculares observadas no campo, ou seja, fibras musculares grandes podem levar a uma diminuição artificial no número total de capilares que, não necessariamente, corresponde ao que realmente está ocorrendo no tecido.

No coração (ventrículo esquerdo), em virtude da orientação anisotrópica deste tecido, os cortes transversais realizados no mesmo não foram capazes de reproduzir uma orientação definida de capilares e fibras musculares. Assim, estes cortes produziam padrões de imagens com capilares orientados transversalmente e longitudinalmente ao eixo de corte, não permitindo uma comparação em relação a uma análise morfológica quantitativa de capilares e fibras musculares. Optamos então por utilizar o método orientator que permite a obtenção de seções aleatórias uniformemente isotrópicas, ou seja, seções que apresentam as mesmas características em todas as direções, já descrito na literatura (201). A relação entre a densidade de volume de capilares e a densidade de volume de fibras musculares neste tecido foi tomada como sendo o parâmetro de densidade capilar estrutural no ventrículo esquerdo. Novamente, este parâmetro foi preferido em relação à densidade de volume de capilares isoladamente, já que é bem conhecida a existência de hipertrofia das fibras cardíacas no ventrículo esquerdo em hipertensos, o que poderia resultar em variações na densidade capilar estrutural não relacionadas ao tratamento farmacológico.

Através dos resultados obtidos pela análise histológica das amostras do músculo grácil e do VE foi possível demonstrar que a dieta HFD induziu uma rarefação microvascular estrutural no músculo esquelético e miocárdio dos animais, o que está de acordo com os nossos estudos anteriores que mostraram esta mesma alteração em ratos espontaneamente hipertensos [START_REF] Nascimento | Microvascular effects of centrally acting antihypertensive drugs in spontaneously hypertensive rats[END_REF]159). Em contraste com a rarefação funcional, que representa o fechamento de capilares e arteríolas, a degeneração estrutural dos microvasos resulta da apoptose das células endoteliais, o que já foi demonstrado em vários modelos experimentais de hipertensão (202,203). A rarefação microvascular estrutural pode ter consequências fisiológicas importantes porque contribui para a elevação da resistência periférica total e afeta negativamente o aporte de oxigênio, de glicose e de insulina para os tecidos, o que contribui ainda mais para o desenvolvimento de RI e a intolerância à glicose [START_REF] Frisbee | Obesity, insulin resistance, and microvessel density[END_REF], independentemente das elevações na pressão arterial [START_REF] Frisbee | Hypertension-independent microvascular rarefaction in the obese Zucker rat model of the metabolic syndrome[END_REF].

Em nosso estudo, os animais alimentados com a dieta HFD desenvolveram um aumento significativo no diâmetro dos cardiomiócitos e na deposição de colágeno do VE. O remodelamento cardiovascular foi ainda confirmado por estudos anteriores em roedores (173). O tônus simpático aumentado, o que também foi identificado no nosso modelo experimental, contribui para o desenvolvimento de HVE concêntrica através de fatores hemodinâmicos, isto é, a pressão sanguínea elevada e o aumento da contractilidade cardíaca, em adição aos efeitos cardíacos hipertróficos diretos das catecolaminas (204).

Em resumo, foram caracterizadas as alterações funcionais e estruturais da microcirculação, bem como o remodelamento do VE, associados com componentes metabólicos e hemodinâmicos em um modelo de SM induzido por dieta. Tomados em conjunto, estes resultados se tornam relevantes no estudo da patologia humana e indicam que um aumento moderado na ingestão de sal associado a uma dieta rica em gordura pode levar não só a alterações cardiovasculares e metabólicas sistêmicas, mas também à rarefação microvascular e uma aceleração das lesões em órgãos-alvo.

ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL E SEUS EFEITOS SOBRE A SM

Os resultados do presente trabalho demonstraram que o tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central reverte as alterações microcirculatórias neste modelo de SM baseado em uma dieta HFD, além de trazer benefícios metabólicos que parecem ser particulares ao tipo de fármaco utilizado. Esses resultados constituem a primeira demonstração dos efeitos da inibição simpática central sobre alterações microvasculares da SM. Além disso, vale destacar que este estudo propõe a utilização de um ligante exógeno seletivo para o sítio de ligação específico das imidazolínas, uma molécula LNP que é composta por uma estrutura aminopirrolina, no tratamento da hiperatividade simpática presente neste modelo de SM.

No presente estudo, conforme esperado, foi visto que todas as drogas foram capazes de normalizar os níveis pressóricos dos animais obesos com SM quando comparados com o grupo controle (CON + VEI) que tiveram mantidos seus valores de pressão arterial ao fim do tratamento com veículo (água destilada) ao término das 4 semanas de tratamento. Este efeito foi, possivelmente, influenciado pela redução nos níveis plasmáticos de noradrenalina e adrenalina plasmáticas, ainda que, de maneira não esperada, o grupo tratado com clonidina tenha apresentado uma redução não significativa de noradrenalina plasmática. De acordo com dados da literatura, a clonidina apresenta uma maior ação periférica em relação às outras drogas devido à inibição do influxo simpático ao coração através da ativação de receptores α 2 présinápticos e I 1 -imidazolínicos responsáveis pela diminuição da liberação de noradrenalina nas fendas sinápticas (117,205,206). Contudo, um trabalho publicado em 1997 por Meana e cols. apontou também um efeito paradoxal da clonidina ao induzir a liberação de noradrenalina através de um mecanismo extra-cortical indireto.

Esse estudo demonstrou que a modulação indireta dos níveis de noradrenalina por drogas imidazolínicas é principalmente devido a uma atividade funcional dos RI 1 (206).

Outro efeito similar apresentado pelos diferentes tipos de tratamento pode ser observado na quantidade de ração ingerida, que foi diminuída ao final do tratamento, indicando uma possível alteração do comportamento alimentar desses animais. No entanto, este efeito não refletiu na redução do peso corporal dos grupos tratados com clonidina ou LNP599, mesmo que haja certa tendência, todavia, um efeito significativo foi visto apenas no grupo tratado com rilmenidina, o qual também apresentou uma redução significativa na quantidade de gordura visceral e epididimal. Os animais tratados com LNP599 também apresentaram uma redução na quantidade de gordura visceral. Uma diminuição no ganho de peso já foi também descrito em diferentes modelos de SM tratados com moxonidina, anti-hipertensivo de ação central de 2ª geração (207-209). Porém, esta diminuição não poderia, por si só, explicar os efeitos de inibidores centrais simpáticos como a moxonidina.

Apesar da semelhança em alguns dos resultados citados anteriormente, em relação às alterações metabólicas presentes neste modelo de SM e hiperatividade simpática, apenas os animais tratados com rilmenidina e LNP599 mostraram uma melhora na intolerância à glicose apresentada pelos animais do grupo controle que receberam veículo ou clonidina, além de promoverem uma aparente diminuição da RI, mesmo que os valores apresentados não sejam estatisticamente significativos. Nossos resultados estão de acordo com estudos que investigaram os efeitos de drogas mistas de segunda geração que atuam sobre os receptores α 2 -adrenérgicos e imidazolínicos do tipo 1, como a rilmenidina e a moxonidina, na tolerância à glicose, na sensibilidade à insulina e no metabolismo de lipídeos de seres humanos e em diferentes modelos de SM. Estes estudos concluíram, através da utilização de antagonistas, que a maioria dos efeitos metabólicos benéfico eram devidos à ação de fármacos sobre o RI 1 (207)(208)(209)(210)(211)(212)(213)(214).

Estes estudos fortalecem a hipótese de que estas drogas são eficazes na melhora da tolerância à glicose, e na dislipidemia. (211,221,222), em contraponto a um estudo realizado em 1999 por Elisaf e cols. que não detectou qualquer influência da moxonidina no perfil lipídico de pacientes hipertensos (223). Ernsberger e cols. demonstraram que a injeção de moxonidina na veia porta de ratos obesos resulta em diminuição da produção e secreção de triglicerídeos (213). Ainda nesse mesmo contexto, através de ensaios de ligação específica em preparações de membrana de hepatócitos de rato, foi possível mostrar a presença de um sítio de ligação I 1 em células do fígado (213). A diminuição nos níveis de lipídeos induzida por moxonidina pode ser relacionada, pelo menos em parte, a uma ação direta sobre o fígado, no entanto, nossos resultados não nos permitem extrapolar os mecanismos pelos quais os agonistas de segunda geração provocam uma diminuição nos níveis de lipídios plasmáticos, porém uma ação central adicional não pode ser descartada.

O tratamento com diferentes fármacos anti-hipertensivos promoveu modificações semelhantes na densidade microvascular dos animais com SM na pele e no músculo grácil. Foi visto que as drogas utilizadas aumentaram o número de capilares espontaneamente perfundidos em ambos os leitos. Esse efeito já foi demonstrado em ratos SHR tratados com anti-hipertensivos de ação central pelo nosso grupo em 2010 [START_REF] Nascimento | Microvascular effects of centrally acting antihypertensive drugs in spontaneously hypertensive rats[END_REF] e deve-se provavelmente à inibição simpática central e redução do tônus simpático para a periferia, resultando em vasodilatação ao nível de arteríolas e esfíncter précapilares e o consequente aumento no recrutamento capilar. Confirmando que este efeito periférico está ligado a modulação simpática central, outro estudo realizado em nosso laboratório demonstrou que a administração de rilmenidina ou clonidina diretamente no SNC promove dilatação da microcirculação mesentérica de SHR em doses que não induzem efeitos cardiovasculares quando administradas por via sistêmica (224). Apesar da semelhança dos resultados encontrados na densidade capilar funcional muscular e cutânea dos diferentes grupos de tratamento, o aumento da densidade capilar funcional cutânea apresentado por animais tratados com rilmenidina não foi significativo em relação ao grupo de animais controle com SM, ainda que uma possível tendência possa ser percebida. Além disso, mesmo a rilmenidina sendo uma droga da mesma classe farmacológica das imidazolinas, ainda cabem estudos para investigar uma possível influência intrínseca de sua estrutura molecular, tendo em vista esta ser a única oxazolina da classe estudada.

A análise histológica do músculo grácil e do VE, que permitiu constatar as alterações microcirculatórias estruturais do modelo de SM utilizado neste estudo, também evidenciou que a modulação do SNS com anti-hipertensivos de ação central é capaz de beneficiar esses mesmos parâmetros microvasculares através reversão da rarefação capilar estrutural em ambos os leitos vasculares. Essa reversão pode ser explicada pelo aumento do fluxo sanguíneo para o músculo esquelético, que antes se encontrava reduzido devido ao fechamento crônico de capilares, estado característico da hiperatividade simpática presente nesses animais, estimularia o crescimento de novos vasos através do aumento do estresse de cisalhamento na parede do vaso devido à vasodilatação causada pelos fármacos, aumentando a rede de capilares para uma maior perfusão no músculo grácil, tecido adaptado a uma baixa perfusão (225,226).

No presente estudo, comprovamos por análise histológica que a modulação do SNS é capaz de promover significativa diminuição no diâmetro dos cardiomiócitos, mesmo que o mesmo resultado não tenha sido visto sobre a deposição de colágeno. A literatura cita o efeito benéfico do tratamento com rilmenidina sobre a deposição de colágeno em ratos uni-nefrectomizados com hipertrofia do VE (227), ou após tratamento com a moxonidina, sobre o remodelamento vascular de SHR, onde ocorreu redução na deposição de colágeno e regressão na hipertrofia do VE (228). Além disso, um trabalho publicado por Stabile e cols. em 2011 confirmou que esses mesmos efeitos cardiovasculares adicionais são acompanhados pela "upregulation", ou seja, aumento do número de receptores imidazolínicos cardíacos, sugerindo assim, uma ação periférica direta (229).

Importância dos receptores imidazolínicos na função adipocitária

Para melhor compreender os mecanismos envolvidos no melhoramento da SM nos animais tratados com os compostos de segunda e terceira geração e quaisquer efeitos periféricos do nosso ligante, investigou-se a presença de receptores de membrana I 1 em adipócitos de ratos WKY. Assim, demonstramos a presença dos receptores I 1 em adipócitos do tecido adiposo de ratos, através da alteração da curva de ligação ([ 125 I] PIC) pelos derivados pirrolínicos, neste caso o LNP599. Este resultado sugere que as drogas imidazolínicas e derivados pirrolínicos podem ter efeitos periféricos ligados ao tecido adiposo. Finalmente, estudamos os efeitos de imidazolinas e dos derivados pirrolínicos sobre a lipólise nos adipócitos. Este estudo sugere que o efeito antilipolítico desses ligantes envolve os receptores I 1 .

Os ensaios de ligação específica realizados com [ 125 I] PIC, ligante de referência dos RI 1 em adipócitos, permitiram detectar uma ligação específica em membranas de adipócitos. A ligação nos adipócitos foi alterada na presença LNP599 sobre dois sítios de ligação, sendo um de alta afinidade (7,6 nM, 45% das ligações). Este resultado é comparável com os obtidos nos adipócitos anteriormente (8,9 nM, 59%) e em células PC12 (6,0 nM, 41% das ligações) (137). Este ensaio de ligação específica nos permite sugerir a presença de RI 1 em adipócitos como já foi observado por Mory e colaboradores em 1995 (129).

A lipólise é uma das principais funções dos adipócitos. Esta função é modulada pelos níveis celulares de AMPc, que é um regulador de vias de transdução dos receptores α 2 -adrenérgicos e I 1 -imidazolínicos (165). Desta maneira, para determinar o envolvimento dos RI 1 nesta função, testamos duas drogas distintas nos adipócitos de rato: o LNP599 e o UK14304. A utilização do UK14304 teve como objetivo, saber se o fato de agir sobre os dois tipos de receptores (α 2 -adrenérgicos e I 1 -imidazolínicos) conduziria a um efeito adicional. O que foi de certa forma confirmada, já que o efeito do LNP599 não acompanhou a mesma redução da concentração de glicerol a partir da dose de 10 -7 M. Embora os efeitos observados sejam baixos em intensidade, todas as moléculas tendem a reduzir a lipólise (10 a 20%). Estes resultados são preliminares e não são estatisticamente significativos. Por estas razões, a EC 50 não foi calculada. Deve notar-se que estes pequenos efeitos podem estar relacionados com a baixa intensidade dos efeitos observados sobre a adenilato-ciclase em ensaios de transdução celular com o AMPc (165).

Além disso, os receptores imidazolínicos do tipo I 1 e os receptores α 2adrenérgicos estão presentes na superfície dos adipócitos e apresentam, em ambos os casos, uma ligação negativa a adenilato-ciclase e, portanto, parecem estar envolvidos na regulação negativa da lipólise (165,230,231). Drogas que se ligam simultaneamente a ambos os receptores, tais como UK14304, presumivelmente tem um efeito adicional sobre a inibição da lipólise, como visto em nossos resultados.

Deve notar-se que alguns resultados obtidos no nosso laboratório, ainda não publicados, demonstram que os efeitos celulares dos ligantes seletivos dos RI 1 (LNP599) não parecem ser limitados ao efeito antilipolítico (232). Estes ligantes também agem de maneira dependente da dose na diferenciação dos pré-adipócitos em adipócitos e sobre a secreção de adiponectina em linhagens de adipócitos 3T3 (aumento da secreção e do conteúdo celular de adiponectina) (232). Os efeitos celulares observados com LNP599, lipólise, diferenciação celular e secreção de adiponectina podem ser potencialmente relacionados com os RI 1 : o A lipólise pode evidenciar a participação dos RI 1 através do acoplamento da adenilato ciclase (165,231).

o A diferenciação celular poderia ser modulada por ligantes da proteína SET, uma proteína envolvida na regulação do ciclo celular e processos de diferenciação (233). A proteína SET tem uma estrutura alongada e não globular, com peso aparente em torno de 39 kDa, o que está muito próximo das observações feitas para as proteínas de 40 e 42 kD que se ligam ao [ 125 I] LNP906 (233,234).

o Finalmente, a adiponectina é conhecida por ser modulada por AMPc e assim, pode estar relacionada com os RI 1 (235,236).

Ressaltamos então, que os efeitos benéficos do LNP599 observados sobre a SM podem ser potencialmente tanto o resultado dos efeitos locais (direto nos adipócitos) em diferentes alvos (proteína SET e/ou RI 1 ), mas também, podem estar relacionados com efeitos sobre os receptores I 1 centrais.

Modelo de hiperatividade simpática farmacológica em camundongos ApoE -/-

O presente estudo investigou o desenvolvimento da hiperatividade simpática em camundongos ApoE -/-a fim de colaborar com um projeto iniciado em 2010, no LNPCV, cujo principal objetivo é avaliar a participação do SNS no desenvolvimento das placas de ateroma sob o contexto, ou não, da SM. Assim como a SM, a aterosclerose é uma doença multifatorial complexa, cujo desenvolvimento segue uma cascata de eventos intimamente intricados. Esta doença apresenta fatores de risco semelhantes àqueles que envolvem a SM (obesidade, hipertensão arterial, hiperglicemia, dislipidemia, estado pró-inflamatório e pró-trombótico, além do estresse oxidativo). Na população, os indivíduos com quadro aterosclerótico que não apresentam SM são relativamente poucos, a maior parte da população tem um ou dois elementos da SM, em especial os descendentes de pacientes com SM (144). A etiologia da doença ainda não está claramente definida, mas sabe-se que a aterosclerose é uma doença inflamatória crônica das artérias de médio e grande calibre, caracterizada pelo acúmulo de lipídios no espaço subintimal, contidos em uma cápsula fibromuscular (237-239). Juntos, os lipídeos depositados e sua cápsula formam uma placa estenótica de maior ou menor importância na luz do vaso.

A apolipoproteína E (ApoE) é sintetizada principalmente pelo fígado, cérebro e também pelos monócitos e macrófagos nos vasos sanguíneos. Ela está envolvida no transporte de lipídeos no sangue para os tecidos de armazenamento periféricos e hepáticos. Ela participa da ligação dos resíduos de quilomícrons e VLDL nos seus receptores hepáticos (240) e, consequentemente, pode promover a liberação de colesterol dos tecidos periféricos para o fígado onde ele é excretado na bile (241). A ApoE apresenta igualmente um papel anti-aterosclerótico não lipídico, via efeitos antioxidantes, anti-proliferativo (linfócitos) e anti-inflamatórios (242,243).

A invalidação do gene ApoE para criar camundongos KO ApoE -/-favorece o desenvolvimento de hiperlipidemia a VLDL e aterosclerose sob dieta normal (244). A concentração de colesterol total destes animais atinge 11 mM (vs 1,6-2,8 mM) (244,245). Em oito semanas, os camundongos ApoE -/-exibem adesão de monócitos endotelial, um dos primeiros eventos celulares na aterogênese. Entre 10 e 30 semanas, as lesões contêm células espumosas e uma cápsula fibrosa entre 25 e 45 semanas (246). Contudo, em seres humanos, estudos epidemiológicos mostram uma associação entre o risco coronariano e a gravidade da hipertensão. De fato, esta relação segue uma curva em "J" ou em "U". Quando a pressão arterial é normalizada, a incidência de infarto agudo do miocárdio diminui, mas abaixo de certo valor da pressão arterial diastólica (PAD <70-80 mmHg), a relação é invertida. As artérias coronárias são perfundidas principalmente durante a diástole, e uma redução excessiva da pressão diastólica pode alterar significativamente a perfusão coronária e explicar o agravamento da cardiopatia isquêmica (250,251).

A desipramina provoca alguns efeitos secundários mediados pelos receptores serotoninérgicos, e neste estudo a ativação simpática induzida farmacologicamente foi responsável pela alteração do comportamento alimentar, no sentido de inibir a fome (primeira etapa do ato alimentar) ou de estimular a saciedade (última etapa da alimentação). Efeito parecido foi visto em pacientes com bulimia em 1990, quando

Mccann & Agras confirmaram a indicação do tratamento crônico com a desipramina em casos de distúrbios alimentares (252).

O envolvimento do SNS é mencionado com frequência em muitas patologias tais como câncer, doenças cardiovasculares ou, a própria, SM. Se a hipótese de uma hiperatividade basal em pacientes ainda necessita ser confirmada, o estresse psicossocial associado com o aumento da atividade nervosa simpática é uma realidade cotidiana para muitos indivíduos. Nesse sentido, nosso trabalho demonstra então, que a hiperatividade do SNS, através do excesso de catecolaminas, especialmente a noradrenalina, exacerba efeitos adrenérgicos na frequência cardíaca, sem interferir na pressão arterial, confirmando assim, a eficácia desta ferramenta farmacológica no estabelecimento de um modelo de aterosclerose com hiperatividade simpática. Desta maneira, para a continuação do presente estudo, torna-se necessário estudar os efeitos de inibição do SNS em modelos de hiperatividade simpática e aterosclerose. Nesse contexto, camundongos KO NET -/-(knockout para o transportador de noradrenalina) submetidos à dieta aterogênica são um modelo de aterosclerose e hiperatividade simpática que o laboratório já dispõe. Esses camundongos serão tratados inicialmente com reserpina, inibidor simpático central, para, desta forma, completar os dados do presente trabalho, em especial o estado da atividade simpática, e a influência da dieta HFD sobre catecolaminas nesta linhagem de camundongos. Além disso, seria particularmente interessante gerar um DKO ApoE -/-NET -/-e comparar o grau de lesão aterosclerótica em camundongos ApoE -/-NET +/+ .

Conclusões

De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que:

• Ratos submetidos à dieta rica em lipídeos por 20 semanas apresentam alterações metabólicas e microcirculatórias, características da síndrome metabólica, acompanhadas do aumento da atividade simpática.

• A modulação do sistema nervoso simpático de ratos com síndrome metabólica, através da utilização de anti-hipertensivos de ação central, principalmente os fármacos de segunda e terceira geração, contribui para a melhora dos perfis glicídicos e lipídicos, além do restabelecimento dos parâmetros microcirculatórios e do remodelamento cardíaco.

• A regulação da função adipocitária sofre influência direta da ativação dos receptores imidazolínicos do tipo I 1 locais, que podem estar diretamente ligados aos efeitos benéficos do tratamento crônico com anti-hipertensivos de segunda e terceira geração.

• A desipramina, é capaz, por si só, de desenvolver uma hiperatividade do sistema nervoso simpático em camundongos ApoE -/-.

Esse conjunto de dados sugere que, mesmo em modelo animal, distúrbios do sistema nervoso autônomo estão relacionados com o desenvolvimento e agravamento da síndrome metabólica. Além disso, podemos concluir que moduladores do sistema nervoso simpático proporcionam melhorias em diversos parâmetros metabólicos e microcirculatórios, tendo os receptores imidazolínicos como importante mediador desse efeito benéfico.

TABELA 1 . 1 :

 11 COMPONENTES DA SM SEGUNDO O NCEP-ATP III (2001) E (2005). .................... TABELA 1.2: CRITÉRIOS DE DIAGNÓSTICO PARA SM SEGUNDO À FEDERAÇÃO INTERNACIONAL DE DIABETES (IDF): ................................................................................. TABELA 1.3: DEFINIÇÃO DOS RECEPTORES Α-ADRENÉRGICOS SEGUNDO SEUS LIGANTES DE ALTA AFINIDADE. ............................................................................................................. TABELA 1.4: AFINIDADES DE DIFERENTES LIGANTES PARA RECEPTORES I 1 -IMIDAZOLÍNICOS E RECEPTORES Α 2 -ADRENÉRGICOS. .................................................... TABELA 3.1: COMPOSIÇÃO DAS DIETAS. ..................................................................................... TABELA 4.1: CARACTERIZAÇÃO DO MODELO DE SÍNDROME METABÓLICA BASEADA EM UMA DIETA HIPERLIPÍDICA DE 20 SEMANAS. .................................................................... TABELA 4.2: COMPOSIÇÃO CORPORAL, INGESTÃO ALIMENTAR E DEPÓSITOS DE GORDURA VISCERAL E EPIDIDIMAL APÓS 4 SEMANAS DE TRATAMENTO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL. ..................................................................................

FIGURA 1 . 1 :

 11 FIGURA 1.1: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA RAMIFICAÇÃO MICROVASCULAR (ADAPTADO DE GUYTON 2002). ............................................................................................ FIGURA 1.2: ESQUEMA FUNCIONAL DOS NEURÔNIOS PRÉ E PÓS-GANGLIONARES DOS SISTEMAS NERVOSO SIMPÁTICO E PARASSIMPÁTICO E SUA ORGANIZAÇÃO. ACH: ACETILCOLINA. NOR: NORADRENALINA............................................................................ FIGURA 1.3: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS VIAS AFERENTES, PRINCIPAIS ÁREAS DE INTEGRAÇÃO BULBAR E VIAS EFERENTES DO REFLEXO PRESSORRECEPTOR ARTERIAL. ................................................................................................................................ FIGURA 1.4: SÍNTESE, LIBERAÇÃO E RECAPTAÇÃO DE NORADRENALINA NAS SINAPSES NORADRENÉRGICAS. .............................................................................................................. FIGURA 1.5: ESTRUTURA QUÍMICA DA CLONIDINA, RILMENIDINA, MOXONIDINA E LNP599. ...................................................................................................................................... FIGURA 1.6: ANEL IMIDAZÓLICO. ................................................................................................. FIGURA 3.1: DIVISÃO DOS GRUPOS(N=10 ANIMAIS) E O PROTOCOLO EXPERIMENTAL. PA = PRESSÃO ARTERIAL, FC= FREQUÊNCIA CARDÍACA. ........................................................ FIGURA 3.2: SISTEMA PARA REGISTRO INDIRETO DA PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL EM RATOS. ....................................................................................................................................... FIGURA 3.3: IMAGENS REPRESENTATIVAS DA VIDEOMICROSCOPIA INTRAVITAL DA PELE E DO MÚSCULO GRÁCIL DE RATOS NORMOTENSOS WKY APÓS A ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE FLUORESCEÍNA-ISOTIOCIANATO (FITC) DEXTRAN INDICANDO OS CAPILARES. .............................................................................................................................. FIGURA 3.4: IMAGENS REPRESENTATIVAS DE FOTOMICROGRAFIAS ADQUIRIDAS UTILIZANDO MICROSCOPIA FLUORESCENTE CONFOCAL PARA AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DA DENSIDADE CAPILAR ESTRUTURAL COM LECTINA GRIFFONIA SIMPLICIFOLIA ACOPLADA À FITC-CONJUGADO. O ARRANJO ANATÔMICO DA REDE CAPILAR DO MÚSCULO ESQUELÉTICO EM SEÇÕES TRANSVERSAIS PODE SER OBSERVADO EM (A). NO VENTRÍCULO ESQUERDO, A DENSIDADE CAPILAR ESTRUTURAL FOI AVALIADA EM SEÇÕES OBTIDAS UTILIZANDO O MÉTODO "ORIENTATOR". AUMENTO 200X, BARRA = 100 ΜM (B). ................................................... FIGURA 4.1: PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA E FREQUÊNCIA CARDÍACA BASAL (BARRAS ABERTAS) E APÓS (BARRAS FECHADAS) TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL POR 28 DIAS. ...........................................................FIGURA 4.2: EFEITO DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE OS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE NORADRENALINA (A), ADRENALINA (B), DOPAMINA (C) E LEPTINA (D)......................................................................................... FIGURA 4.3: EFEITO DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE A GLICEMIA DE JEJUM (A), A INSULINA (B), ÁREA SOB A CURVA (AUC) DO TESTE ORAL DE TOLERÂNCIA A GLICOSE (C) E O HOMA-IR (D). .................. FIGURA 4.4: EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE O COLESTEROL TOTAL (A), HDL-C (COLESTEROL HDL, B), LDL-C (COLESTEROL LDL, C) E SOBRE OS TRIGLICERÍDEOS (D). ............................................... FIGURA 4.5: EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE A DENSIDADE CAPILAR FUNCIONAL NO MÚSCULO GRÁCIL E NA PELE DA ORELHA. ................................................................................................................... FIGURA 4.6: EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE A DENSIDADE CAPILAR ESTRUTURAL NO MÚSCULO GRÁCIL E NO VENTRÍCULO ESQUERDO. ...................................................................................................... FIGURA 4.7:EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ANTI-HIPERTENSIVOS DE AÇÃO CENTRAL SOBRE O DIÂMETRO DE CARDIOMIÓCITO E A DEPOSIÇÃO DE COLÁGENO NO VENTRÍCULO ESQUERDO. ...............................................................................................

  Em 1999, o Grupo Europeu para o Estudo da Resistência a Insulina modificou o critério da OMS, mas, da mesma forma, a RI era considerada pré-requisito absoluto, além de mais 3 critérios adicionais: obesidade, hipertensão arterial e dislipidemia. Aqui, o critério de obesidade era circunferência abdominal, enquanto o da OMS incluía a relação abdome/quadril ou o IMC. Sendo excluída desta classificação, a microalbuminúria. Em 2001, o Programa de Educação do Colesterol Nacional -III Painel de

Figura 1 . 1 :

 11 Figura 1.1: Representação esquemática da ramificação microvascular (adaptado de Guyton 2002).

Figura 1 . 2 :Figura 1 . 3 :

 1213 Figura 1.2: Esquema funcional dos neurônios pré e pós-ganglionares dos sistemas nervoso simpático e parassimpático e sua organização. Ach: acetilcolina. Nor: noradrenalina.

Figura 1 . 4 :

 14 Figura 1.4: Síntese, liberação e recaptação de noradrenalina nas sinapses noradrenérgicas.

Tabela 1 . 3 :

 13 Definição dos receptores α-adrenérgicos segundo seus ligantes de alta afinidade.Os receptores α-adrenérgicos 1 e 2 foram ainda subdivididos em A e B de acordo com o seu nível de afinidade para outros ligantes: a prazosina para os receptores α 2 -adrenérgicos (A, baixa afinidade e B, alta afinidade) (114).

  clonidina foi desenvolvida como um fármaco agonista α 2 , descongestionante da mucosa nasal (Figura 1.5). O efeito hipotensor dessa substância foi descoberto por acaso, durante o seu desenvolvimento nos anos 60. A clonidina reduz a pressão arterial através da redução do tônus simpático central e reduz a frequência cardíaca através da estimulação simultânea do tônus parassimpático. Ela age diretamente nos neurônios localizados na RVLM (116, 117). Contudo, a clonidina não impede o funcionamento do barorreflexo, permitindo a manutenção da pressão arterial, especialmente quando o paciente se desloca para posição em pé. Não é, portanto, um indutor de hipotensão ortostática (118). Seus efeitos colaterais são devido à estimulação de receptores centrais α-adrenérgicos, sedação, boca seca, depressão, além do potencial efeito rebote após a interrupção do tratamento prolongado devido ao aumento da atividade simpática (119).

Figura 1 . 5 :

 15 Figura 1.5: Estrutura química da clonidina, rilmenidina, moxonidina e LNP599.

Figura 1 . 6 :

 16 Figura 1.6: Anel imidazólico.

  MICRONEUROGRAFIAA medida direta da atividade simpática por microneurografia permitiu a confirmação da associação dos elementos da SM (hipertensão, obesidade, RI e diabetes) com um aumento de impulsos nervosos simpáticos ao nível do músculo esquelético (150). O aumento da atividade elétrica simpática não é necessariamente relacionado com a presença de hipertensão arterial. No entanto, está diretamente relacionada à sensibilidade à insulina (150). A hiperatividade simpática mensurada desta forma poderia ser um marcador precoce de SM em indivíduos suscetíveis, que ainda não desenvolveram uma forma clinicamente diagnosticável (144). Um estudo clínico realizado em pacientes com susceptibilidade ao desenvolvimento da SM demonstrou que existe um aumento significativo em impulsos nervosos simpáticos medidos por microneurografia do nervo peroneal, em comparação com indivíduos saudáveis (151). DISFUNÇÃO DO BARORREFLEXO O barorreflexo arterial exerce uma grande influência inibitória sobre as eferências simpáticas, que quando alterado promove um aumento da estimulação simpática. Grassi et al. haviam demonstrado que as perturbações do barorreflexo (152, 153), em casos de diabetes e hipertensão, estavam associadas com a obesidade visceral. Isto pode ser explicado pela perda da elasticidade arterial observada na SM. A capacidade de modular o diâmetro arterial e responder as alterações na hipertensão arterial está alterada. Outra explicação é baseada na ruptura do equilíbrio dinâmico existente entre substâncias vasodilatadoras (NO) e vasoconstritoras (ET-1). Na SM, o desequilíbrio entre NO e ET-1 favorece a vasoconstrição (154, 155).

oo

  A composição corporal; o O metabolismo glicídico e lipídico; o Os parâmetros hemodinâmicos; o A densidade capilar funcional e estrutural. 3) Avaliar o papel de ligantes I 1 seletivos sobre a função adipocitária de ratos. o Determinar a presença de receptores I 1 -imidazolínicos em adipócitos; o Investigar a participação dos ligantes I 1 seletivos na lipólise. 4) Desenvolver um modelo experimental de hiperatividade simpática em camundongos. Avaliar os parâmetros hemodinâmicos; o Realizar a quantificação das catecolaminas plasmáticas3. MetodologiaEste trabalho foi dividido em 3 partes, respeitando a ordem estabelecida anteriormente nos "Objetivos Específicos", sendo que a metodologia da caracterização do modelo de SM é comum aos 2 objetivos iniciais. É importante informar que devido o caráter de tese em co-tutela, a realização das partes 3.2 e 3.3, se deu no Laboratório de Neurobiologia e Farmacologia Cardiovascular, (LNPCV, Laboratoire de Neurobiologie et de Pharmacologie CardioVasculaire) da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Strasbourg, França, sob orientação do Prof. Dr. Pascal Bousquet.

Figura 3 . 1 :

 31 Figura 3.1: Divisão dos grupos(n=10 animais) e o protocolo experimental. PA = Pressão arterial, FC= Frequência cardíaca.

Figura 3 . 2 :

 32 Figura 3.2: Sistema para registro indireto da pressão arterial caudal em ratos.

  mg/kg) e fentanil (3 µg/kg) administrados por via i.p. Os ratos foram intubados através de traqueostomia com cânula de polietileno, imobilizados com brometo de pancurônio (1 mg/kg, i.v.) e artificialmente ventilados com ar ambiente através de um ventilador para animais de pequeno porte (Ugo Basile, model 7025, Biological Research Apparatus, Varese, Italy), com volume respiratório de 1,5 mL e frequência respiratória de 50 incursões/min. A veia jugular foi cateterizada para permitir a administração de drogas e marcadores fluorescentes para a microscopia intravital (159).

Figura 3 . 3 :

 33 Figura 3.3: Imagens representativas da videomicroscopia intravital da pele e do músculo grácil de ratos normotensos WKY após a administração intravenosa de fluoresceína-isotiocianato (FITC) dextran indicando os capilares. MG=Músculo Grácil; Aumento 100x, barra = 100 µm.

Figura 3 . 4 :

 34 Figura 3.4: Imagens representativas de fotomicrografias adquiridas utilizando microscopia fluorescente confocal para avaliação histológica da densidade capilar estrutural com lectina Griffonia simplicifolia acoplada à FITC-conjugado. O arranjo anatômico da rede capilar do músculo esquelético em seções transversais pode ser observado em (A). No ventrículo esquerdo, a densidade capilar estrutural foi avaliada em seções obtidas utilizando o método "orientator". Aumento 200x, barra = 100 µm (B).

  ENSAIO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA Experimentos de ligação específica com a [ 125 I] ParaIodoClonidina (PIC) foram todos realizados a 25° C. A reação de ligação da [ 125 I] PIC é inicializada a partir da incubação de 100 µl de membranas de células adipocitárias (50-100 mg) com 25 µl de radioligante (0,5 nM) e 25 µl de ligante frio (não marcado) para determinar a ligação não específica ( ver abaixo para a determinação das condições desta ligação) ou drogas que competem pelo mesmo sítio de ligação em um volume de reação final de 250 µl contendo um tampão ligação específica, Tris-HEPES resfriado, (5 mM de Tris pH 7,7, 0,5 mM de Hepes EDTA, 0,5 mM EGTA e 0,5 mM MgCl 2 ). A reação foi incubada durante 45 min (tempo necessário para atingir as condições de equilíbrio da ligação) e 25° C (165). A ligação específica de [ 125 I] PIC aumenta linearmente com a concentração de proteína variando de 8 mcg a 150 mcg, por isso mantivemos uma concentração média de 50 mcg para permanecer na linearidade da ligação específica (165). A incubação foi interrompida por filtração a vácuo em equipamento Brandel sobre filtros Whatman GF/B tratados com 0,03% de polietilenimina durante 3 horas a 4 ° C (um agente polimerisante capaz de reduzir a malha e manter a melhor filtração dos complexos formados). Os filtros foram então lavados três vezes com tampão de lavagem de Tris-HCl gelado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4) e, durante a noite, foram secos à temperatura ambiente. A quantidade de radioatividade retida no filtro foi contada diretamente em um contador γ Minaxi (Packard, Meridien CT). A ligação não específica foi determinada utilizando a PIC (100 mM) por ser um ligante dos mais puros e mais seletivos para os sítios de ligação específica da [ 3 H] clonidina ou do [ 3 H] idazoxan (166) em relação aos receptores α 1 e α 2 -adrenérgicos. A concentração utilizada foi determinada através de experiências piloto, que mostrou que a ligação residual obtida com a PIC é similar ao obtido com outros fármacos testados como a clonidina ou LNP911. Notamos também que todas as drogas alteram a curva no mesmo ponto, incluindo a PIC, o que significa que a PIC não interfere na ligação não específica. A ligação não específica obtida com 100 µM de PIC representa aproximadamente 50% da radioatividade total, quando 0,5 nM de [ 125 I] PIC foi utilizada (concentração correspondente à constante de afinidade (Kd), determinada em experiências de saturação prévias (165). Nos ensaios de competição, o mesmo protocolo foi usado com 0,5 nM de [ 125 I] PIC e concentrações crescentes de fármacos competidores (de 10 -3 a 10 -10 M).

Figura 4 . 1 :

 41 Figura 4.1: Pressão arterial sistólica e frequência cardíaca basal (barras abertas) e após (barras fechadas) tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central por 28 dias.

Figura 4 . 2 :

 42 Figura 4.2: Efeito do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre os níveis plasmáticos de noradrenalina (A), adrenalina (B), dopamina (C) e leptina (D).

Figura

  Figura 4.3 (A), observou-se um aumento de 16% na glicemia de jejum dos animais do

Figura 4 . 3 :

 43 Figura 4.3: Efeito do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre a glicemia de jejum (A), a insulina (B), Área sob a Curva (AUC) do teste oral de tolerância a glicose (C) e o HOMA-IR (D).

Figura 4 . 4 ,

 44 A e C). Todavia, a Figura 4.4 (B) demonstra que os níveis de HDL-c estavam aumentados no grupo HFD + VEI (74 ± 8 mg/dL) em relação ao grupo CON + VEI (51 ± 4 mg/dL). Os níveis de triglicerídeos dos animais HFD + VEI (55 ± 7 mg/dL) se apresentaram elevados ao final do tratamento, quando comparados com os animais do grupo CON + VEI (28 ± 4 mg/dL) (Figura 4.4, D). Nos grupos de tratamento, não foram observadas diferenças significativas nos valores de HDL-c e triglicerídeos (Figura 4.4, B e D). No entanto, os animais tratados com rilmenidina apresentaram uma redução do colesterol total (160 ± 5 mg/dL) e do LDL-c (109 ± 8 mg/dL) quando comparado com o grupo HFD + VEI (199 ± 8 e 137 ± 8 mg/dL, respectivamente) (Figura 4.4, A e C).

Figura 4 . 4 :

 44 Figura 4.4: Efeitos do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre o colesterol total (A), HDL-c (colesterol HDL, B), LDL-c (colesterol LDL, C) e sobre os triglicerídeos (D).

Figura 4 . 5 :

 45 Figura 4.5: Efeitos do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre a densidade capilar funcional no músculo grácil e na pele da orelha.Os valores representam a média ± EPM de 10 animais.

Figura 4 . 6 :

 46 Figura 4.6: Efeitos do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre a densidade capilar estrutural no músculo grácil e no ventrículo esquerdo.

Figura 4 . 7 :

 47 Figura 4.7:Efeitos do tratamento crônico com anti-hipertensivos de ação central sobre o diâmetro de cardiomiócito e a deposição de colágeno no ventrículo esquerdo.

A figura 4 .

 4 8 apresenta uma comparação da competição exercida por dois agonistas (ligantes frios) seletivos para os receptores α 2 -adrenérgicos em frações de membranares previamente marcadas com isótopo radioativo [ 125 I] PIC (ligante quente) que não apresenta especificidade, seja para o receptor α 2 -adrenérgico, ou I 1imidazolínico. Tanto a rauwolscina, quanto o UK 14304, foram capazes de deslocar cerca de 40% da ligação do ligante quente ao seu receptor, confirmando assim, a presença dos receptores α 2 -adrenérgicos em membranas celulares de adipócitos de ratos WKY.

Figura 4 . 8 :

 48 Figura 4.8: Ensaio de competição da [ 125 I] Paraiodoclonidina (PIC) na presença de concentrações crescentes de diferentes ligantes seletivos dos receptores α 2 -adrenérgicos

Figura 4 . 9 :

 49 Figura 4.9: Curva de competição da [ 125 I] Paraiodoclonidina (PIC) na presença de concentrações crescentes do agonista seletivo dos RI 1 (LNP599) em células do tecido adiposo de ratos WKY após bloqueio dos receptores α 2 -adrenérgicos.

Figura 4 . 10 :

 410 Figura 4.10: Ensaio lipolítico com forscolina em presença do UK 14304 ou LNP599 para avaliação da função adipocitária.

Figura 4 . 11 :

 411 Figura 4.11: Efeitos do tratamento crônico com desipramina (DES, barras fechadas) ou veículo (CON, barras abertas) sobre o peso corporal e a ingestão alimentar em camundongos ApoE -/-durante 16 semanas.Os valores representam a média ± EPM de 10 experimentos.

Figura 4 . 12 :

 412 Figura 4.12: Efeitos do tratamento crônico com desipramina (DES, barras fechadas) ou veículo (CON, barras abertas) sobre a glicemia de jejum em camundongos ApoE -/- durante 16 semanas.

Figura 4 . 13 :

 413 Figura 4.13: Efeitos do tratamento crônico com desipramina (barras fechadas) ou veículo (barras abertas) sobre a pressão arterial sistólica e frequência cardíaca em camundongos ApoE-/-durante 16 semanas.Os valores representam a média ± EPM de 10 experimentos.

Figura 4 . 14 :

 414 Figura 4.14: Efeitos do tratamento crônico com desipramina (DES) ou veículo (CON) sobre os níveis plasmáticos de noradrenalina (A), adrenalina (B) e dopamina (C) em camundongos ApoE -/-.Os valores representam a média ± EPM de 10 experimentos.

•

  Hipertensão arterial leve a moderada• A hiperglicemia moderada e a intolerância à glicose podem ocorrer no longo prazo.

O

  grupo tratado com clonidina não apresentou qualquer efeito benéfico sobre as alterações do metabolismo glicídico nestes animais hiperinsulinêmicos e resistentes à insulina, pelo contrário, a clonidina apresentou valores de glicemia de jejum maiores que o próprio grupo controle com SM. May e cols. confirmaram que o efeito hiperglicêmico depende tanto de mecanismos centrais como periféricos (215), sendo este último mediado por receptores α 2 -adrenérgicos pós-sinápticos localizados nas células β-pancreáticas via inibição da secreção de insulina (216). Em um estudo do LNPCV, Fellmann e cols. mostraram que a inibição do SNS era acompanhada pelo aumento a concentração plasmática de adiponectina, e sugeriram que ela desempenharia um papel fundamental nos efeitos metabólicos da hiperatividade simpática (217). A adiponectina é um hormônio peptídeo de 244 aminoácidos (30 kDa) secretado principalmente pelos adipócitos que aumenta a sensibilidade à insulina e reduz a intolerância à glicose através da oxidação dos AGLs no músculo esquelético e diminuição na gliconeogênese devido a uma diminuição do nível de expressão da fosfoenolpiruvato carboxiquinase e glicose-6-fosfatase e um aumento da oxidação dos AGLs no fígado (218-220). O perfil lipídico alterado do modelo de SM utilizado no presente estudo apresentou melhoras apenas após tratamento crônico com rilmenidina (diminuição do coletesrol total e do LDL-c), indicando que os agonistas seletivos dos RI 1 não teriam um efeito particular sobre o metabolismo de lipídeos. Não existem estudos que demonstrem os efeitos de drogas anti-hipertensivas de segunda geração sobre o LDL-c e o HDL-c em modelos de SM. No entanto, estudos em seres humanos mostraram que a rilmenidina ou a moxonidina conduzem a um aumento no colesterol HDL plasmático

Finalmente

  , os camundongos ApoE -/-desenvolvem o espectro completo de lesões observadas na aterogênese humana(246). Não há nenhum dado conhecido sobre o estado da atividade nervosa simpática de camundongos ApoE -/-. Provavelmente a atividade simpática desses animais sob uma dieta padrão é, dentro dos padrões estabelecidos atualmente, normal. E, inibindo a atividade de um sistema cujo funcionamento se encontra normal pode, por fim, ser ineficaz. Por isso, desenvolvemos um protocolo em que camundongos ApoE -/-alimentados com uma dieta normal são submetidos a um tratamento crônico com um antidepressivo tricíclico capaz de incrementar a concentração sináptica de Nad no SNC através da inibição desse neurotransmissor pela membrana pré-sináptica, a desipramina (119).Em camundongos ApoE -/-, nosso estudo demonstrou que a desipramina induz sinais claros de ativação simpática, como o aumento dos níveis plasmáticos de catecolaminas e o aumento significativo da frequência cardíaca, enquanto que a PAS não é alterada. Entretanto, a desipramina pode provocar outros efeitos como dessensibilização da adenilato ciclase e inibição dos receptores β-adrenérgicos e serotoninérgicos. A hiperatividade simpática avaliada pelo aumento das catecolaminas não pode ser associada com o aumento da pressão arterial e frequência cardíaca. Mas em outros casos, um aumento ou diminuição da PAS pode ser entendido com um marcador da estimulação simpática ou inibição. No entanto, os nossos resultados mostram que não existe uma correlação direta entre a pressão arterial e o aumento dos níveis de catecolaminas plasmáticas neste modelo de aterosclerose. A principal explicação está na complexidade dos mecanismos de regulação da pressão arterial (ver introdução) que se mostram, de certa forma, muito eficientes na correção dos valores pressóricos ao longo das 16 semanas de tratamento. Além disso, vale ressaltar que a desipramina é um fármaco de segurança conhecida e cujos efeitos colaterais não envolvem o aumento da pressão arterial em pacientes normotensos. Este fato se deve pela ativação dos mecanismos de retroalimentação negativa mediados pelos receptores α 2 -adrenérgicos pré-sinápticos que tendem a manter a homeostasia funcional (119). Este resultado é comumente encontrado na literatura, pelo menos em animais. Nenhum modelo de aterosclerose demonstrou um mecanismo causal entre a aterosclerose e a hipertensão (247). Citamos como exemplo dois estudos sobre a relação pressão arterial /aterosclerose: O NO é sintetizado a partir da L-arginina pelas enzimas NO sintases (incluindo as isoformas, NO sintase induzível e eNOS). O NO mantém o tônus vasodilatador vascular. • Nos camundongos ApoE -/-, Makaritisis et al. mostraram que o tratamento com um inibidor não-seletivo de NO sintase, o L-NAME, leva ao aparecimento de hipertensão, mas não piora aterosclerose (248). • Os camundongos duplo knockout (DKO) ApoE/eNOS desenvolvem hipertensão arterial e aterosclerose exacerbada em comparação ao ApoE. A normalização da pressão em camundongos DKO ApoE/eNOS não reduz os danos ateroscleróticos. Chen e colaboradores mostraram, assim, que a hipertensão não está envolvida neste modelo de aterosclerose (249).

  

  Tabela 1.1: Componentes da SM segundo o NCEP-ATP III (2001) e (2005).

	Tabela 1.2: Critérios de diagnóstico para SM segundo à Federação Internacional de
	Diabetes (IDF):			
	CRITÉRIO			DEFINIÇÃO
			Obesidade abdominal
			Homens
	Brancos de origem européia e negros	≥ 94 cm
			Mulheres
	Brancas de origem européia e negros	≥ 80 cm
	Triglicerídios			≥ 150 mg/dL ou em tratamento
			HDL-colesterol
	Componentes Homens		Níveis (2001)	≤ 40 mg/dL	Níveis (2005)
	Mulheres	Obesidade abdominal: Circunferência abdominal ≤ 50 mg/dL
	Homens		≥ 102 cm Pressão Arterial	≥102 cm
	Mulheres Sistólica		≥ 88 cm	≥ 88 cm ≥ 130 mmHg ou em tratamento
	Triglicerídios		≥ 150mg/dL		≥ 150mg/dL
			HDL-colesterol
	Homens		≤ 40 mg/dL		≤ 40 mg/dL
	Mulheres		≤ 50 mg/dL		≤ 50 mg/dL
	Pressão Arterial		≥ 130/85 mmHg	≥ 130/85 mmHg
	Glicemia de Jejum	≥ 110mg/dL		≥ 100mg/dL
	Pelas evidências da relação entre obesidade central e risco cardiovascular, em
	2005, a Federação Internacional de Diabetes (IDF) publicou novo critério de SM, que
	requer a presença de obesidade abdominal e não necessariamente de RI, além de dois ou
	mais critérios (19). A Tabela 1.2 mostra valores diferenciados para a circunferência
	abdominal nas diferentes etnias.	

Em 2005, em uma revisão dos critérios de SM, a American Heart Association e o National Heart, Lung and Blood Institute mantiveram o critério do NCEP-ATP III, porque esse critério é mais simples de ser aplicado e não enfatiza uma única etiologia para a SM, apenas reduz o ponto de corte da glicemia de 110 para 100 mg/dL. Contudo, a I Diretriz Brasileira para o Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica, de 2005, utiliza o critério da NCEP-ATP III de 2001. Diastólica ≥ 85 mmHg ou em tratamento Glicemia de Jejum ≥ 100 mg/dL ou em tratamento Estas definições foram criadas para facilitar o diagnóstico da SM na prática clínica, onde a avaliação da RI não é uma rotina fácil. No entanto, a medida da glicemia de jejum é muitas vezes o primeiro marcador de resistência insulínica e, portanto, diabetes do tipo 2 (fator de risco cardiovascular alto). A medida da glicemia de jejum em pacientes obesos permitiria então, identificar pacientes em risco. Outras doenças estão associadas com a SM como um estado pró-inflamatório e pró-trombótico, mas não podem ser facilmente medidas em clínica. É por isso que estas definições baseiam-se em critérios simples de fácil avaliação. Ao contrário da primeira definição da OMS, que não está centrada na homeostase da glicose, de fato, trata-se de anormalidades glicídicas da mesma maneira que os outros componentes da SM. Usando definições como a da NCEP ATP III ou IDF o diagnóstico de SM seria então facilitado, através de observações simples, não há padrões absolutos. Os médicos definem um diagnóstico de SM, quando há pelo menos três elementos da lista, além da obesidade abdominal obrigatória.

Ativação Do Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona

  

	humanos, a obesidade e a RI nos tecidos sensíveis à insulina, tais como o músculo gordura, o que é compatível com o envolvimento do tecido adiposo na secreção de
	esquelético, estão associadas com a diminuição da reatividade vascular e uma angiotensinogênio na gênese deste fenótipo (88).
	diminuição da insulina tecidual pelo recrutamento capilar (76, 77). Outras Além disso, a atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) características da SM são também reconhecidas por predispor a uma densidade também está aumentada nos estados de RI e no curso da aterosclerose. Os componentes microvascular reduzida, denominada como rarefação microvascular (78), que pode do SRAA estão expressos no tecido adiposo e no endotélio vascular, sugerindo que este contribuir para um aumento na resistência vascular periférica e resultar em redução da atue tanto de maneira endócrina quanto parácrina, contribuindo para a disfunção reserva funcional microvascular. Em conjunto, estes fatores irão limitar a troca de endotelial. A infusão de angiotensina II induz a RI em animais, causando dano à nutrientes para o tecido e aumentar as distâncias de difusão entre o compartimento sinalização de insulina por interferir com a interação entre o IRS-1 (receptor de insulina vascular e celular. Na DM2, diversos fatores podem contribuir para a disfunção 1) e a PI-3-quinase (89). Ao mesmo tempo, o bloqueio farmacológico do SRAA é microvascular, incluindo redução de vasodilatação dependente do endotélio (79, 80), capaz de melhorar a sensibilidade insulínica (90). Hall e colaboradores sugerem a redução do recrutamento capilar (81) e menor densidade capilar (82). Além disso, o participação de um fator mecânico, onde a massa de gordura visceral determinaria o aumento da glicosilação das proteínas da membrana das hemácias, causando rigidez, aumento da pressão intra-abdominal, cujos efeitos sobre os rins ativariam o SRAA e pode também aumentar a resistência na passagem através da microcirculação devido a uma perda da capacidade de deformabilidade destas células (83). Alterações contribuiriam para a elevação da pressão arterial presente na SM (91).
	concomitantes do glicocálice de superfície das células endoteliais também podem alterar Paralelamente, o aumento da angiotensina II também resulta em hiperatividade
	a função e a permeabilidade endotelial (84). de NADPH-oxidase, e incremento da produção de ET-1. A ET-1 é um importante
	peptídeo vasoconstritor secretado pelas células endoteliais em resposta à insulina e Embora os dados atuais suportem a relação entre a microcirculação e a SM, a outros agonistas. Níveis elevados de ET-1 são observados em indivíduos com RI e direção, em termos de causa e efeito, permanece incerta (85). O que está se tornando cada vez mais claro é que os mecanismos compartilhados iniciam e mantêm as naqueles com aterosclerose
	alterações em pequenos e grandes vasos sanguíneos de maneira similar. Eventos
	patológicos iniciais, principalmente alterações inflamatórias celulares, estão presentes
	tanto na macro e microcirculação.
	O gene do angiotensinogênio é detectado no tecido adiposo, apesar da expressão
	de seu RNA mensageiro (RNAm) não estar correlacionada com a adiposidade. O
	angiotensinogênio é o precursor da angiotensina I, que, após a conversão em
	angiotensina II, desempenha um papel fundamental na regulação da pressão arterial. A
	expressão do RNAm do angiotensinogênio é maior na gordura visceral (86, 87), o que
	explica parcialmente a relação entre hipertensão arterial sistêmica e obesidade na SM.
	Camundongos com superexpressão seletiva angiotensinogênio no tecido adiposo, ou
	knockout (KO) para o angiotênsinogênio, com produção restrita ao tecido adiposo,
	desenvolvem obesidade e, especialmente, a hipertensão, após uma dieta rica em
	. Nos seres

  Afinidades de diferentes ligantes para receptores I 1 -imidazolínicos e receptores α 2 -adrenérgicos.

	COMPOSTO	AFINIDADE I 1	AFINIDADE α 2
	Clonidina	14,8	3,8
	Rilmenidina	83,6	180
	Moxonidina	77,8	75
	LNP509	540	-
	LNP599	8,1	-
	LNP906	0,97	-
	LNP911	0,2	-
	LNP640	0,5	-
	Quanto menor o Ki, maior é a afinidade do ligante pelo seu receptor. -:
	Afinidade não detectável (>10nM).		

Tabela 1.4:

4.1. Desenvolvimento de um modelo experimental de síndrome metabólica induzida por dieta hiperlipídica caracterizado pela presença de hiperatividade simpática.

  Caracterização do modelo de síndrome metabólica baseada em uma dieta hiperlipídica de 20 semanas.

	Tabela 4.1: CON	HFD
	Massa corporal (g)	402±14	385±6
	Ingestão (g/dia)	14±0,5	15±0,5
	PAS (mmHg) Antes de dar início ao tratamento farmacológico, realizamos a caracterização do 146±7 168±2* FC (bpm) 382±14 435±8* modelo de SM baseado em dieta hiperlipídica (157). Noradrenalina (pmol/ml) 3,5±0,6 8,2±0,4***
	Em primeiro lugar, observou-se que em animais do grupo HFD a pressão arterial Adrenalina (pmol/ml) 11,8±0,5 11,4±0,3
	sistólica e a frequência cardíaca aumentaram significativamente após 20 semanas de Gordura Visceral (g) 4,4±0,5 9,0±0,9*
	dieta HFD. Além disso, as catecolaminas plasmáticas, noradrenalina e adrenalina, foram Gordura Epididimal (g) 4,4±0,3 5,9±0,6*
	significativamente aumentadas no grupo HFD confirmando o envolvimento da atividade Glicemia de jejum (mg/dL) 108±3 122±3*
	simpática no desenvolvimento da SM (Tabela 4.1). Insulina (µIU/ml) 27,7±4,3	41,9±2,9*
	Colesterol total (mg/dL)	47±2,3	62±4,1*
	HDL colesterol (mg/dL)	29±8	34±3
	LDL colesterol (mg/dL)	11±2	18±2*
	Triglicerídeos (mg/dL)	30±6	50±6*
	DCF muscular	250±12	157±12***
	(capilar/mm 2 )		
	DCF cutânea	256±10	234±15
	(capilar/mm 2 )		
	DCE muscular	1,86±0,07	1,53±0,06**
	(capilar/fibra)		
	Este estudo também revelou que a dieta HFD induz a rarefação capilar estrutural
	no VE e no músculo esquelético de animais (Tabela 4.1).	

O consumo de alimentos e o peso final não foram afetados nos dois grupos, embora um aumento significativo na gordura visceral e epididimal tenham sido observados (Tabela 4.1). A dieta HFD também apresentou efeito sobre a glicose de jejum, colesterol total, LDL e triglicerídeos (Tabela 4.1). Além disso, o nosso modelo de SM induzido por este regime apresentou aumento da adiposidade visceral associado à hipertensão moderada sugerindo um papel das alterações metabólicas, incluindo dislipidemia e disglicemia no desenvolvimento de hipertensão.

Foi possível identificar uma rarefação capilar funcional no músculo esquelético do grupo HFD (Tabela 4.1). Em contraste, a densidade capilar funcional da pele, leito microvascular que não está diretamente envolvido na regulação da resistência vascular periférica, não foi alterado.

DCE cardíaca (Vv [capilar] /Vv [fibra] )

  

	4.2	
	0,24±0,024	0,16±0,006**
	PAS -Pressão Arterial Sistólica, HDL -High Density Lipids, LDL -Low Density
	Lipids, DCF -Densidade Capilar Funcional e DCE -Densidade Capilar Estrutural.
	Os valores representam a média ± EPM de 10 experimentos.
	* p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001 vs grupo controle (CON);

. Efeitos da modulação do sistema nervoso simpático em ratos com SM. Composição Corporal, Ingestão Alimentar e Depósitos de Gordura visceral e epididimal

  Composição Corporal, Ingestão Alimentar e Depósitos de Gordura visceral e epididimal após 4 semanas de tratamento com anti-hipertensivos de ação central.

	Tabela 4.2: CON	HFD	HFD	HFD	HFD
		+	+	+	+	+
		VEI	VEI	CLO	RIL	LNP
	Massa corporal (g)	445±13	453±13	422±16	400±8#	418±14
	A massa corporal e a ingestão alimentar dos animais foram monitoradas ao Ingestão (g/dia) 14±0,7 12±0,3 10±0,3#* 9,7±0,3#* 9,7±0,3#*
	longo das primeiras 20 semanas de dieta HFD, sendo que, para avaliação do efeito Gordura Visceral (g) 5,1±0,7 13,7±1,5* 10,0±1,9 7,2±0,6# 8,5±0,8#
	farmacológico, apenas os valores registrados antes e após o tratamento crônico foram Gordura Epididimal (g) 4,6±0,5 9,4±0,8* 6,4±1,3 5,0±0,6# 6,8±0,8
	levados em consideração. Os valores representam a média ± EPM de 10 experimentos.	
	Podemos observar na Tabela 4.2, que não foram observadas diferenças na massa * p <0,05 vs grupo controle (CON + VEI);
	corporal entre os grupos experimentais tratados com veículo. Ao final das 4 semanas de
	tratamento, verificou-se uma redução significativa na massa corporal do grupo tratado # p <0,05 vs grupo HFD (HFD + VEI).
	com rilmenidina (HFD + RIL) em comparação com o grupo controle que recebeu dieta
	HFD.					

Os animais que receberam doses diárias de anti-hipertensivos de ação central apresentaram uma redução significativa na quantidade diária de ração ingerida quando comparados aos grupos controles com (HFD + VEI), ou sem (CON + VEI) SM.

Em relação aos depósitos de gordura visceral e epididimal, o grupo controle alimentado com HFD apresentou aumento desses depósitos em relação ao grupo que recebeu dieta normal. Já, entre os grupos de tratamento, apenas o grupo tratado com clonidina não foi capaz de promover redução significativa dos depósitos de gordura visceral, vista nos grupos tratados com rilmenidina e LNP599, e epididimal, o qual foi reduzido, desta vez, apenas pelo grupo tratado com rilmenidina (Tabela 4.2).

Parâmetros Hemodinâmicos

As medidas da PAS e da FC foram realizadas através da pletismografia caudal ao final da 20ª semana de dieta e ao final da 4ª semana de tratamento farmacológico (24ª semana de dieta). Ao final do tratamento, conforme mostra a Figura 4.1, podemos observar que o consumo da dieta HFD aumentou significativamente a PAS (178 ± 2 mmHg) e a FC (412 ± 8 bpm) quando comparados ao grupo que recebeu dieta normal (138 ± 3 mmHg e 336 ± 5 bpm, respectivamente). Em relação aos grupos de animais tratados, observou-se redução significativa da PAS em todos os grupos (155 ± 4, CLO; 157 ± 4, RIL e 156 ± 4 mmHg, LNP) quando comparados ao grupo HFD+VEI. De forma similar, este comportamento foi observado com relação à FC dos animais tratados (361 ± 8, CLO; 365 ± 11, RIL e 374 ± 7 bpm, LNP) (Figura 4.1).

  4.3 (A), observou-se um aumento de 16% na glicemia de jejum dos animais do

	grupo HFD + VEI (100 ± 2 mg/dL) em relação ao grupo CON +VEI (86 ± 3 mg/dL). Os
	níveis glicêmicos foram mantidos elevados nos demais grupos de tratamento,
	considerando, porém, que apenas o grupo que recebeu clonidina tenha apresentado um
	aumento significativamente maior que o grupo CON +VEI (105 ± 5 mg/dL). Esses
	mesmos dois grupos (HFD + VEI e HFD + CLO) mantiveram elevados os níveis
	glicêmicos nos momentos 30, 60, 90 e 120 minutos após a sobrecarga de glicose,
	caracterizando uma alteração no metabolismo de glicose, confirmado através do cálculo
	da área sob a curva (AUC) apresentado na Figura 4.3 (C). De maneira interessante,
	quando avaliamos os resultados dos animais tratados com rilmenidina e LNP599,
	podemos perceber que eles apresentam uma redução significativa destas alterações
	(Figura 4.3, C).

A dieta HFD promoveu aumento dos níveis de insulina plasmática

(58 ± 4 

µIU/mL, HFD + VEI) em relação ao grupo que recebeu dieta normal (29 ± 5 µIU/mL, CON + VEI)

(Figura 4.3, B)

. No entanto, nenhuma redução significativa foi observada nos grupos tratados, ainda que, o grupo tratado com rilmenidina apresentou uma tendência (42 ± 3 µIU/mL) quando comparado com o grupo CON + VEI.

Ainda na Figura 4.3 (D), vemos que quando analisados os resultados do cálculo do HOMA-IR, os animais dos grupos HFD + VEI e HFD + CLO apresentaram valores significativamente superiores ao grupo CON + VEI. Este fato, aparentemente demonstra que a dieta HFD, por si só, é capaz de conduzir a uma resistência insulínica nesses animais. No entanto, os animais que foram tratados com rilmenidina ou LNP599 não apresentaram alterações significativas.

Inverso da constante de dissociação Kd, que representa a concentração que produz uma ocupação de 50% dos receptores.A afinidade expressa a capacidade de um ligante para se ligar a um receptor. Quanto mais forte ele liga-se, isto é, em concentrações baixas, maior a afinidade, ou seja, menor o Kd.

capaz de estimular a guanilato ciclase, levando assim, à ativação da lipólise. Esta etapa se faz ainda mais necessária, pois o foco desta parte do estudo é investigar o efeito antilipolítico de alguns fármacos. Portanto, precisamos obter resultados utilizáveis de forma significativa, trabalhando em níveis detectáveis de glicerol e assim, detectar o efeito de redução do glicerol.Através da dosagem de glicerol, o ensaio de lipólise mostrou que as células do tecido adiposo visceral de ratos WKY sofrem uma influência dose-dependente da ação de agonistas α 2 -adrenérgico, como o UK 14304 (%) (Figura 4.10, A). Além disso, foi possível confirmar, conforme demonstrado na Figura 4.10 (B), que a função celular desses adipócitos é igualmente reduzida por agonistas seletivos dos RI 1 .Estes resultados sugerem que o receptor I 1 , assim como o receptor α 2 , está ligado a uma regulação negativa da lipólise.

clonidina (HFD + CLO, 0,1 mg/kg), rilmenidina (HFD + RIL, 1 mg/kg), LNP599 (HFD + LNP, 10 mg/kg) ou veículo (HFD + VEI). A densidade capilar funcional (DCF) foi avaliada no músculo grácil (MG) e na pele da orelha através de videomicroscopia intravital e a densidade capilar estrutural (DCE) foi estudada no MG e no ventrículo esquerdo (VE) pela análise histoquímica. A pressão arterial sistólica (PAS) foi avaliada por fotopletismografia e as catecolaminas foram dosadas por meio de HPLC. Houve um aumento na PAS e frequência cardíaca (p <0,05) no grupo HFD + VEI comparado ao grupo CON + VEI. O grupo HFD+VEI também apresentou uma diminuição na DCF e na DCE do MG, em relação ao grupo HFD+VEI (153 ± 8 vs 253 ± 16 capilaries/mm 2 e 1,5 ± 0,08 vs 1,

Catecolaminas e Leptina Plasmática

De acordo com a Figura 4.2 (A e B), o grupo HFD + VEI mostrou um aumento significativo nos níveis plasmáticos de noradrenalina (344 ± 31 pg/mol) e adrenalina (89 ± 4 pg/mol) quando comparados com os valores encontrados no grupo CON + VEI (215 ± 16, noradrenalina; 61 ± 4 pg/mol, adrenalina). Todos os grupos de tratamento foram capazes de reduzir os níveis plasmáticos de adrenalina (68 ± 7,CLO;64 ± 8,RIL 

DENSIDADE CAPILAR ESTRUTURAL

Os valores apresentados na Figura 4.6 confirmam que animais do grupo HFD + VEI, que receberam dieta HFD, apresentaram rarefação capilar estrutural no músculo esquelético (1,5 ± 0,08 capilar/fibra) e no VE (0,18 ± 0,01 Vv [cap] /Vv [fib] ) quando comparados com os respectivos valores apresentados após a análise do grupo CON + VEI (1,8 ± 0,04 capilar/fibra e 0, 33 ± 0,01 Vv [cap] /Vv [fib] ) ao final dos experimentos.

A rarefação capilar estrutural do músculo esquelético de ratos com SM foi revertida após tratamento crônico com todos os tratamentos (1,9 ± 0,06, CLO; 2,8 ± 0,04, RIL e 1,7 ± 0,03 capilares/fibra, LNP). Entretanto, apenas o grupo tratado com rilmenidina apresentou um aumento significativo do número de capilares totais no VE (0,31 ± 0,01 Vv [cap] /Vv [fib] ) (Figura 4.6).