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Parafraseando Homero ''leve 
  
Sr José 
  
Luíz Buzzetti 
  
Sra Eldenir 
  
Maciel Buzzetti 
  
Rodrigo Estendo 
  
Maciel Buzzetti 
  
Leticia Caroline Maciel 
  
Marcelo Girotto 
  
Agradeço Aos Professores 
  
Johny P Monteiro 
  
Eduardo Radovanovic 
  
Eduardo Ariel Ponzio 
  
Nayara Mendes 
  
Maiara Taniguchi 
  
Bento Cabral 
  
Jean Halison 
  
Vicente Kupfer 
  
Mateus Siraque 
  
Sheila Predabon 
  
Estendo 
  
Agradecimento Aos Pesquisadores 
  
Serge Cosnier 
  
Allan Le Goff 
  
Michael Holzinger 
  
Fabien E Giroud 
  
Meus Estendo 
  
Votos 
  
Deborah Brazzolotto 
  
Anastasiia Berezovska 
  
Ilaria Sorrentino 
  
Xiaohong Chen 
  
Por 
  
Alexandre Avincola 
  
Cristiane Chaves 
  
Michele Silva 
  
Pablo Garcia Da Costa 
  
André Araujo 
  
Marcos Paulo 
  
Déborah Santos 
  
Anderson Schiavoni 
  
Diogo Scheller 
  
Maycon Ferrari 
  
Luan Negretti 
  
Caio Toná 
  
Machado 
  
  
  
Keywords: Microfluidic, Concentration Gradient, SPR Biosensors, Electrosynthesis, Redox Mediator, Bioanode, Enzymatic Biofuel Cell

The technological development is moving towards the miniaturization, not only for economic interests, but also in views of portability and sustainability, as well as logistics. In this context, this work presents advances in the generation of laboratory systems for generating calibration curves through microfluidic devices with applicability in surface plasmon resonance biosensors (SPR), as well as enhancements in the generation of electric currents in biofuel cells (BFCs) for in vivo implementation.

Microfluidic concentration gradient generator devices are interesting automation tools in replacing an operator during a calibration curve construction step, avoiding experimental errors, especially in the handling of low concentrations. A nonlinear concentration gradient generator device with two flow inputs was developed, being one input for the concentrated solution of the analyte and another for the diluent -with five output solutions with different concentrations. The microchannels structure, as well as the design for mixing different concentrations were constructed based on the mathematical method analogous to electrical circuit systems generation calculus. The device concentrations of the output solutions were characterized by fluorescence spectroscopy and UV-Vis, which demonstrated the ability to generate a sigmoidal concentration gradient profile. The microfluidic device (δ-2x5-Y) was coupled to an SPR optical biosensing system based on a gold thin film nanohole arrangement to generate and explore the plasmonic effect. Optical measurements were performed by image acquisition method monitoring the transmitted light through the nanohole arrangements. The integrated system was able to generate a five-point calibration curve, which was used to quantify the concentration of bovine serum albumin (BSA) in a sample with a pseudo-unknown concentration (concentration of 160 µg mL-1). The concentration determined by the integrated system was 138 µg mL-1. This result was also validated by fluorescence spectroscopy that showed a statistically equivalent concentration of 154,8 ± 16,6 µg mL -1 . Aiming to enchance the enzyme catalyses in a biofuel cell to redox mediators, carbon nanotubes (MWCNTs) were electrosynthesized in situ in aqueous medium.

Pyrene electrosynthesis products, 1,6 and 1,8-pyrenequinone, after being characterised electrochemically and structurally by 1H NMR, were able to generate catalytic current densities of 8.51 mA cm-2 when present in a bioanode for glucose oxidation by flavin adenine dinucleotide-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH). This catalytic current density was higher than the redox mediator 1,4-naftoquinone normally used in similar systems which generated a catalytic current density of 3.30 mA cm-2. Finally, the bioanode with the redox mediators presented maximum catalyst capacity to 100 mmol L-1 and a loss of stability of 76.4% after 100 consecutive cycles.

RESUMO

O desenvolvimento tecnológico caminha para a miniaturização de algumas tecnologias, não apenas por interesses econômicos, mas também pela portabilidade e sustentabilidade, assim como logístico e operacional. Neste contexto este trabalho apresenta avanços na produção de sistemas laboratoriais para geração de curvas de calibrações automáticas por meio de dispositivos microfluídicos com aplicabilidade em biossensores baseados em ressonância de plasmon de superfície (SPR), bem como a maximização na geração de correntes elétricas em biocélulas a combustível (BFCs) com objetivo de implantação in vivo.

Dispositivos microfluídicos geradores de gradiente de concentração são ferramentas de automatização atraentes na substituição de um operador na preparação de curvas de calibração, eliminando erros experimentais, sobretudo na manipulação de baixas concentrações. Nesse trabalho foi desenvolvido um dispositivo gerador de gradiente de concentração não linear com duas entradas de fluxo, sendo uma para a solução concentrada do analito e outra para o diluente, e 5 saídas de soluções com diferentes concentrações (δ-2x5-Y). A arquitetura dos microcanais, assim como o design para mistura de fluxos na geração de correntes de diferentes concentrações, foram construídos com base em cálculos matemáticos análogos a sistemas de circuitos elétricos. As concentrações de analitos nas soluções de saída do dispositivo foram caracterizadas por técnicas como espectroscopia de fluorescência e UV-Vis, as quais demostraram a capacidade em gerar um gradiente de concentração com perfil sigmoidal. O dispositivo microfluídico δ-2x5-Y foi acoplado a um sistema de biossensoriamento óptico SPR baseado em um conjunto de arranjos de nanoburacos confeccionados em um filme fino de ouro para detecção e quantificação de uma biomolécula. As medidas ópticas foram realizadas através da captação de imagens de luz transmitida pelos arranjos de nanoburacos conforme estes foram expostos aos fluxos de saída. O sistema integrado foi capaz de gerar uma curva de calibração de 5 pontos a qual foi usada para quantificar paralelamente a concentração de albumina do soro bovino (BSA) em uma amostra com concentração pseudodesconhecida (160 µg mL -1 ). A concentração determinada pelo sistema integrado foi de 138 µg mL -1 . Esse resultado ainda foi validado por espectroscopia de fluorescência que mostrou uma concentração estatisticamente igual de 154,8 ± 16,6 µg mL -1 , para a mesma amostra. Para a maximização de catálises enzimáticas em biocélulas a combustível enzimáticas foram eletrossintetizados in situ sobre nanotubos de carbono (MWCNTs) em meio aquoso precursores de mediadores redox. Com destaque para os produtos da eletrossintese do pireno, 1,6 e 1,8-pirenodiona que, após caracterizados eletroquimicamente e estruturalmente por RMN 1 H, foram capazes de gerar uma densidade de corrente catalítica de 8,51 mA cm -2 , quando presentes em um bioânodo para oxidação da glicose a partir da enzima dinucleótido de flavina adenina-dependente glicose desidrogenase (FAD-GDH). Essa densidade de corrente catalítica foi superior ao mediador redox 1,4naftoquinona normalmente utilizado em sistemas similares, a qual gerou uma densidade de corrente catalítica de 3,30 mA cm -2 . Por fim, o bioânodo apresentou capacidade máxima de catálise a 100 mmol L -1 e uma perda de estabilidade de 76,4% após 100 ciclos consecutivos.

Palavras-chave: Microfluídica, Gradiente de Concentração, Biossensores SPR, Eletrossintese, Mediador Redox, Bioânodo, Biocélula a Combustível Enzimática. 

ÍNDICE DE FIGURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

INTRODUÇÃO

Um dos grandes interesses científicos é o desenvolvimento de tecnologias portáteis, de fácil operação e eficientes ao que se propõe executar. Dispositivos miniaturizados de sensoriamento, sobretudo em análises clínicas, como biossensores ou dispositivos geradores de eletricidade, como biocélulas a combustível são exemplos de tecnologias que se evidenciaram nas últimas décadas devido as suas significativas contribuições sociais e econômicas.

Em particular, sistemas capazes de construir curvas de calibrações automáticas, como dispositivos microfluídicos geradores de gradientes de concentração, são de grande interesse pois dispensam a manipulação por um operador. Isso elimina erros experimentais associados aos procedimentos usuais e dispensa recalibrações recorrentes, quando atribuído uma modelagem matemática ao sistema. Microfluídica é a ciência da manipulação de fluidos na escala volumétrica entre 10 -9 a 10 -18 L em canais com dimensões micrométricas que compõem um dispositivo microfluídico 1 .

Com o controle dos fenômenos associados ao transporte de fluidos em dimensões pequenas, os dispositivos microfluídicos são úteis na criação de sistemas miniaturizados, construção de gradientes de concentração, reatores, entre outras configurações com variadas aplicações práticas 2 . As vantagens em associar os dispositivos microfluídicos a um segundo sistema laboratorial são o baixo consumo de reagentes e a baixa produção de rejeitos, possibilidade de automatização e baixo custo de fabricação 1,3 . Eles são especialmente atraentes quando aplicados em sistemas de biossensoriamento, tal como biossensores baseados em ressonância de plasmon de superfície (SPR), pois podem agregar ao sistema não apenas a capacidade de detecção, mas também de quantificação de bioespécies.

Biossensores SPR são dispositivos capazes de monitorar eventos bioquímicos na interface condutor/dielétrico com alta sensibilidade por meio do fenômeno de ressonância de plasmon de superfície 4 . A variação do índice de refração na interface, a qual pode ser desencadeada pela imobilização de uma espécie orgânica tal como um antígeno biológico, ocasiona mudanças ópticas relacionadas com o efeito SPR e que são passíveis de monitoramento. Dessa forma, a associação desse sistema óptico de detecção com sistemas microfluídicos geradores de gradiente de concentração pode tornar o dispositivo integrado uma opção bastante atraente para detecção e quantificação de espécies úteis no prognóstico de doenças como câncer e Alzheimer, por exemplo 5 .

Em alinhamento aos dispositivos supracitados encontram-se as biocélulas a combustível. Elas são sistemas capazes de converter energia química de uma espécie química ou biológica em energia elétrica 6 . As biocélulas a combustível, em específico as biocélulas a combustível enzimáticas, são objetos de desenvolvimentos para a geração de energia na alimentação de pequenos dispositivos, como marcapassos, bombas de insulina, neurotransmissores, lentes de contatos elétricas, entre outros dispositivos para a implantação in vivo, com a intenção de dispensar a substituição das fontes de energia (baterias/pilhas) após o período de vida útil 

PARTE I -DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO GERADOR DE GRADIENTE DE CONCENTRAÇÃO BIOMOLECULAR APLICÁVEL A BIOSSENSORES SPR

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

O desenvolvimento de um dispositivo capaz de gerar um gradiente de concentração eficiente e reprodutível exige uma compreensão mínima em comportamento mecânico-fluídico, bem como em processos de transferência de massa e quantidade de movimento envolvidos em sistemas binários.

Logo, se faz necessário a apresentação de conceitos matemáticos gerais de fenômenos de transporte, e também dos parâmetros normalmente reportados para a caracterização dos tipos de escoamentos envolvidos em um determinado sistema microfluídico.

Fenômenos de Transporte

Inicialmente, a primeira consideração importante a ser apresentada é a generalização a um comportamento específico da matéria como um ponto de características definidas. Guardadas as infinidades de partículas existentes, a simplificação facilita a quantificação de fenômenos associados aos transportes de massa, energia e quantidade de movimento dessas partículas [START_REF] Westwater | The Mathematics of Diffusion[END_REF] . Esta conjectura é chamada de hipótese do contínuo. A hipótese assume um meio material como uma distribuição contínua e tridimensional [START_REF] Maurício Gobbi | Introdução a Mecânica dos Fluídos e aos Fenômenos de Transportes[END_REF] . O principal objetivo é a definição das propriedades dos fluidos como massa específica, velocidade, temperatura, concentração, entre outros.

A segunda consideração a ser assumida é de que qualquer transporte envolvendo matéria ocorre somente devido a uma diferença de potencial desenvolvido entre dois instantes, sendo esse potencial gerado naturalmente ou por um agente externo. Em fluidos, esse potencial pode ser desenvolvido por meio de uma diferença de concentração, tensão de cisalhamento, diferença de temperatura, pressão, entre outros 1 . Todos esses fenômenos são englobados nas descrições matemáticas de transferências de energia, quantidade de movimento e de massa 2 .

Os fenômenos de transferência são descritos por equações constitutivas e equações de conservação. As equações constitutivas não são propriamente leis fundamentais, mas sim provenientes de equações empíricas que portam unicamente como princípio a segunda lei da termodinâmica, ou seja, associam-se propriedades moleculares às propriedades macroscópicas por meio da hipótese do contínuo. Enquanto que as equações de conservação são consideradas leis fundamentais capazes de descrever a evolução temporal das variáveis envolvidas nos fenômenos de transferência [START_REF] Westwater | The Mathematics of Diffusion[END_REF][START_REF] Maurício Gobbi | Introdução a Mecânica dos Fluídos e aos Fenômenos de Transportes[END_REF][START_REF] Bird | Phenomena Second Edition о Macroscopic Microscopic[END_REF] .

Cada fenômeno de transferência pode ser associado a uma equação constitutiva específica. A equação ou lei constitutiva para a quantidade de movimento foi atribuída a partir de experimentos de Newton que estabeleceram relação entre uma taxa de deformação a uma tensão tangencial aplicada.

Enquanto que a lei constitutiva para o transporte de energia ou calor, Lei de Fourier, relaciona o gradiente de temperatura ao fluxo de calor por condução. E por fim, a Lei de Fick, que em transferência de massa relaciona o gradiente de concentração espacial de uma espécie contida em um fluido com a taxa do mesmo soluto no espaço [START_REF] Westwater | The Mathematics of Diffusion[END_REF][START_REF] Maurício Gobbi | Introdução a Mecânica dos Fluídos e aos Fenômenos de Transportes[END_REF][START_REF] Bird | Phenomena Second Edition о Macroscopic Microscopic[END_REF] . As Equações 1, 2 e 3 expressam as equações constitutivas para transportes de quantidade de movimento, energia/calor e massa, respectivamente.

𝑇 = [ -𝑝 + 2 3 𝜌𝜈 ( 𝛻𝑣)] 𝐼 + 2𝜌𝜈𝐷 Equação 1 𝑞 = -𝜌𝑐 𝑝 𝛼𝛻𝑇 Equação 2 𝑗 = -𝜌 𝐷 𝐴𝐵 𝛻 𝐶 𝐴 Equação 3
Os termos representados nas equações 1 -3 são:

Ivetor fluxo específico de massa (kgA m -2 s -1 );

ρmassa específica (kg m -1 );

DABdifusividade molecular do soluto A no solvente B (m 2 s -1 );

∇CAvetor gradiente da concentração do soluto A (kgA kg -1 m -1 ); qvetor fluxo difusivo específico de calor (J m -2 s -1 );

Cpcalor específico a pressão constante (J kg -1 K -1 );

αdifusividade térmica (m 2 s -1 );

∇Tvetor gradiente de temperatura (K m -1 );

Ttensor de tensões (Pa);

νviscosidade cinemática (m 2 s -1 );

∇vdivergente da velocidade (s -1 ); Dtensor taxa de deformação (s -1 ).

As equações constitutivas para transferência de quantidade de movimento, energia e massa são práticas nas resoluções de muitos problemas, no entanto, alguns destes problemas demandam a inserção de grandezas intensivas como espaço e tempo. Para a descrição dos fenômenos de transferência no espaço e tempo se torna prático a aplicação de equações diferenciais parciais. Para a resolução diferencial parcial dos fenômenos de transporte é necessário assumir que o escoamento é incompressível, ou seja, sem deformação volumétrica (∆𝑉 = 0), e que a massa específica de cada partícula permanece constante em função do tempo. Como consequência apresenta-se a equação de Navier-Stokes para descrição da conservação da quantidade de movimento no espaço e tempo.

Enquanto que a equação de conservação de energia foi desenvolvida a partir da Lei de Fourier e para a transferência de massa a partir da Lei de Fick. As equações 4, 5 e 6 descrevem as resoluções diferenciais parciais dos fenômenos de transporte respectivamente como descritos [START_REF] Holmes | Confined Fluid Flow: Microfluidics and Capillarity[END_REF][START_REF] Sinton | Pressure Drop in Rectangular Microchannels as Compared With Theory Based on Arbitrary Cross[END_REF] . Com base nas soluções dos fenômenos em conjunto é possível estimar com uma margem considerável de veracidade, dados como pressão, velocidade e variação de concentração de um sistema sob condições de contorno. Efetivamente, as equações supracitadas são o suporte matemático de grande parte dos softwares utilizados para a realização de simulações computacionais das mais variadas complexidades. Em contextos mais simples, como uma mistura binária entre dois fluidos unidos por um combiner * , Chen et al. [START_REF] Chen | A novel macromodel based on krylov subspace projection method for micromixers with serpentine channels[END_REF] fizeram uso do software COMSOL Multiphysics ® para acompanhar cada instante do desenvolvimento de mistura ao longo de um caminho [START_REF] Chen | A novel macromodel based on krylov subspace projection method for micromixers with serpentine channels[END_REF] . As equações * Combiner: Termo dirigido para a secção de um sistema microfluídico responsável pela conexão entre duas linhas anteriormente não conectadas.

𝜌

constitutivas e conservativas não são apenas eficientes em estimar a pressão, volume e concentração das espécies ao fim de uma mistura, mas também obter leituras espaciais e temporais a cada ponto do arranjo [START_REF] Chen | Numerical and experimental investigation on micromixers with serpentine microchannels[END_REF][START_REF]Mixing Characteristic of T-type micrfluidic mixers[END_REF] . De maneira análoga, muitos trabalhos utilizam das simulações para o desenvolvimento de micromisturadores antes de aplicações experimentais, desta maneira são poupados materiais, bem como tempo de pesquisa [START_REF] Chen | Numerical and experimental investigation on micromixers with serpentine microchannels[END_REF][START_REF] Shamloo | Analyzing mixing quality in a curved centrifugal micromixer through numerical simulation[END_REF][START_REF] Sahu | numerical and experimental investigations of mixing fluids in microchannel[END_REF][START_REF] Nguyen | Micromixers -A review[END_REF] .

Tipos de Escoamentos e o Número de Reynolds

As descrições matemáticas anteriormente citadas descrevem os fenômenos de transferência, no entanto, não são normalmente utilizadas para classificar o regime de escoamento. Identificar qual o escoamento rege um sistema é de fundamental importância para a associação dos diferentes fenômenos observados. Neste cenário, o número de Reynolds (Re) apresenta-se como o indicador mais reportado na literatura para a classificação de tipos de escoamentos fluídicos [START_REF] Bird | Phenomena Second Edition о Macroscopic Microscopic[END_REF]20,[START_REF] Soleymani | Pressure drop in micro T-mixers[END_REF][START_REF] Squires | Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale[END_REF][START_REF] Liu | Two-fluid mixing in a microchannel[END_REF] • Escoamento laminar com ondulações mínimas, 𝑅 𝑒 < 20;

• Escoamento laminar com ondulações pronunciadas, 20 < 𝑅 𝑒 < 2000;

• Escoamento turbulento, 𝑅 𝑒 > 2000.

O número de Reynolds relaciona a razão entre as forças inerciais e forças viscosas.

Particularmente em sistemas microfluídicos, onde as escalas são consideravelmente pequenas, normalmente o fluxo é laminar governado predominantemente por forças viscosas [START_REF] Addae-Mensah | Fundamentals of Microfluidics Devices[END_REF][START_REF] Zhu | Passive and active droplet generation with microfluidics: a review[END_REF][START_REF] Finlayson | Mixing of Liquids in Microfluidic Devices How to measure the quality of mixing[END_REF][START_REF] Suh | A review on mixing in microfluidics[END_REF] . Não por coincidência a Equação 7 (Lei de Hagen-Poiseuille) é idêntica à Lei de Ohm (𝑉 = 𝐼 𝑅) aplicada a sistemas elétricos 32 . Logo, a equação pode ser reescrita de forma análoga à Lei de Ohm:

Sistemas

𝛥𝑝 = 𝑄𝑅 𝐻 Equação 8
Onde Δp é equivalente a V, RH equivalente a R e Q equivalente a I. A Equação 8 surge como uma das ferramentas mais úteis para o estudo de sistemas microfluídicos, sobretudo na descrição de processos de diluição em série [START_REF] Zhu | Passive and active droplet generation with microfluidics: a review[END_REF][START_REF] Shi | Rapid and steady concentration gradient generation platform for an antimicrobial susceptibility test[END_REF][START_REF] Vasilakis | Novel modular pressure and flow rate balanced microfluidic serial dilution networks on printed circuit boards: Designs, Simulations and Fabrication[END_REF][START_REF] Toh | Engineering microfluidic concentration gradient generators for biological applications[END_REF] .

Modelo Matemático para Construção de um Sistema de Diluição em Série

Neste instante faz-se necessário uma explanação de como pode ser aplicado de maneira eficiente a Lei de Hagen-Poiseuille na construção de sistemas geradores de gradiente de concentração a partir de diluições em série.

A analogia a sistemas elétricos torna mais intuitiva a interpretação de um sistema microfluídico [START_REF] Cornish | Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section[END_REF] , de maneira que para uma secção de um canal retangular, a resistência hidráulica assume a Equação 12 [START_REF] Sinton | Pressure Drop in Rectangular Microchannels as Compared With Theory Based on Arbitrary Cross[END_REF]32,[START_REF] Vasilakis | Novel modular pressure and flow rate balanced microfluidic serial dilution networks on printed circuit boards: Designs, Simulations and Fabrication[END_REF][START_REF] Cornish | Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section[END_REF][START_REF] Sørensen | Label-free monitoring of diffusion in microfluidics[END_REF] . A Figura 1 resume a analogia entre um sistema microfluídico genérico de escoamento de acordo com Hagen-Poiseuille em relação a sistemas elétricos. A primeira vista, a simplicidade de um sistema microfluídico de N etapas de diluição em série pode induzir a uma interpretação equivocada das concentrações ao final do processo de diluição. A formação do gradiente de concentração pode ser melhor compreendida observando um esquema genérico (Figura 2) de um sistema splitter (quadrado verde) e um sistema combiner (quadrado azul). A divisão dos fluxos inlets A e B (QA e QB) nos splitters é dependente das resistências hidráulicas dos canais que os cercam, são eles α, β e γ [START_REF] Zhu | Passive and active droplet generation with microfluidics: a review[END_REF][START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF] ) 𝐶 𝐵. Equação 17

A manipulação das concentrações resultantes também é possível não apenas alterando as resistências hidráulicas dos canais (alterando L, w ou h), mas também aplicando QA ≠ QB por meio de bombas de injeção independentes. Com essa abordagem, um sistema de N etapas de diluição em série pode ser construído para formar qualquer padrão de diluição apenas operando a razão volumétrica de divisão nos splitters e de mistura nos combiners [START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF] . Alguns sistemas de N etapas de diluição em série são classificados de acordo com a razão volumétrica de mistura:

• 10-fold log, razão volumétrica de mistura de 9:1 (10 -1 , 10 -2 , ..., 10 -N+1 , 10 -N ) [START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF][START_REF] Hattori | Generation of arbitrary monotonic concentration profiles by a serial dilution microfluidic network composed of microchannels with a high fluidic-resistance ratio<[END_REF] ;

• 2-fold log, razão volumétrica de mistura de 1:1 (2 -1 , 2 -2 , ..., 2 -N+1 , 2 -N ) [START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF][START_REF] Hattori | Generation of arbitrary monotonic concentration profiles by a serial dilution microfluidic network composed of microchannels with a high fluidic-resistance ratio<[END_REF] ;

• linear, razão altera a cada etapa de diluição, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, ... 1:N {( N/N +1), (N -1)/(N +1) ... 2 / (N+1), 1 / (N + 1)} [START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF][START_REF] Walker | A linear dilution microfluidic device for cytotoxicity assays[END_REF][START_REF] Lee | 2-Layer Based Microfluidic Concentration Generator By Hybrid Serial and Volumetric Dilutions[END_REF] ;

• Gaussiana 40 , entre outros [START_REF] Lee | Generalized serial dilution module for monotonic and arbitrary microfluidic gradient generators[END_REF][START_REF] Jacobson | Microfluidic devices for electrokinetically driven parallel and serial mixing[END_REF][START_REF] Jiang | A miniaturized, parallel, serially diluted immunoassay for analyzing multiple antigens[END_REF][START_REF] Qilong | Generation of Linear and Parabolic Concentration Gradients by Using a Christmas Tree-Shaped Microfluidic Network[END_REF]3,[START_REF] Lee | Microfluidic concentration-on-demand combinatorial dilutions[END_REF] .

As plataformas geradoras de gradiente de concentração possuem as mais variadas aplicações práticas. Guoxia et al. 3 A proposta de entrega dos solutos (cobre, benzeno, metilbenzeno, nitrobenzeno e clorobenzeno) é simples e exige pequenos comprimentos de misturas. No entanto, isso não afasta a complexidade da malha microfluídica para geração de um gradiente de concentração, sobretudo um gradiente linear (Figura 3D). Sistemas que propõe a manipulação de moléculas com baixos coeficientes de difusão ou alta massa molecular, como, por exemplo, biomoléculas, somam mais complexidade no controle de formação do gradiente de maneira reprodutível e eficiente. Neste contexto, faz-se necessário compreender quais são os processos de misturas adequados e indicados para uma mistura binária na montagem de um sistema 1 .

Identificação do Tipo do Processo de Mistura em Sistemas Binários

Um dispositivo gerador de gradiente de concentração ideal deveria ser capaz de reproduzir sempre o mesmo gradiente de concentração para qualquer espécie química de maneira confiável. No entanto, os processos são complexos, bem como a variedade de espécies químicas com características distintas é extensa. Contudo, se Lx é suficientemente grande ou Q é lento o suficiente para completa mistura de um soluto x (Dx) antes de alcançar um splitter, ou seja, se a combinação de dois fluidos alcançar a homogeneidade antes da subdivisão, é esperado que qualquer soluto com D ≥ Dx também seja completamente misturado em Lx, abrangendo assim um grupo de solutos compatíveis ao gerador de gradiente de concentração que reproduzirá o mesmo gradiente final.

São muitos trabalhos reportados na literatura que descrevem os mecanismos de misturas por difusão para geração de gradiente de concentração [START_REF] Lin | T cell chemotaxis in a simple microfluidic device[END_REF][START_REF] Irimia | Universal microfluidic gradient generator[END_REF][START_REF] Lee | Electrokinetic concentration gradient generation using a convergingdiverging microchannel[END_REF][START_REF] Walker | Microenvironment design considerations for cellular scale studies[END_REF][START_REF] Stone | Engineering Flows in Small Devices[END_REF] . No entanto, os processos difusivos são demasiadamente lentos e muitas vezes demandam grandes comprimentos de mistura L. Como Q e L são inversamente proporcionais (Equação 7), muitas vezes o pesquisador deve decidir priorizar entre o tempo de geração do gradiente ou a redução do dispositivo. A superação desse impasse pode ser resolvido pela substituição de longas linhas de canais por micromisturadores [START_REF] Nguyen | Micromixers -A review[END_REF][START_REF] Hessel | Micromixers -A review on passive and active mixing principles[END_REF] ou submeter o escoamento a uma condição turbulenta [START_REF] You | PDMS-based turbulent microfluidic mixer[END_REF] .

O desenvolvimento de micromisturadores eficientes sem dúvidas tornou-se uma das principais linhas de pesquisa em microfluídica. Micromisturadores são arranjos geométricos confeccionados para gerar uma mistura de dois fluidos de maneira rápida e eficiente [START_REF] Cai | A review on micromixers[END_REF] . Ao considerar eliminar a necessidade de grandes linhas de canais, espera-se otimizar não apenas o tempo de geração do gradiente de concentração automatizado, mas também reduzir significativamente as dimensões dos dispositivos. No entanto, a proposta de aplicação de um novo micromisturador é complexa e muitas vezes a confecção de dispositivos por técnicas tradicionais é impraticável devido aos detalhes, como obstáculos aos fluidos [START_REF] Alam | Mixing performance of a planar micromixer with circular obstructions in a curved microchannel[END_REF][START_REF] Wang | Mixing enhancement of a passive microfluidic mixer containing triangle baffle[END_REF] , sobreposição em níveis tridimensionais [START_REF] Hossain | Mixing performance of a serpentine micromixer with non-aligned inputs[END_REF] , espirais 60 e vórtex 61 , grades de relevo e algumas geometrias singulares dos canais [START_REF] Clark | Mixing enhancement in serpentine micromixers with a nonrectangular cross-section[END_REF][START_REF] Javaid | Analysis of passive mixing in a serpentine microchannel with sinusoidal side walls[END_REF] . Entretanto, o advento da tecnologia de impressão 3D se apresenta para superação de tais inconvenientes. A literatura reporta a utilização de dispositivos microfluídicos confeccionados a partir de moldes impressos por impressoras 3D, mas ainda é uma tecnologia em inserção nos grupos de pesquisas e sistemas mais complexos foram pouco desenvolvidos [START_REF] Gong | High density 3D printed microfluidic valves, pumps, and multiplexers[END_REF][START_REF] Amin | 3D-printed microfluidic devices[END_REF][START_REF] Duong | Simple and low-cost production of hybrid 3D-printed microfluidic devices[END_REF] .

A segunda opção para melhorar os efeitos de mistura sem comprometer demasiadamente o tamanho dos dispositivos é por meio da manipulação da taxa de injeção Q. A primeira vista, submeter o escoamento a um processo turbulento, que por consequência acelera a mistura entre dois fluidos, pode parecer uma opção viável. Porém, a pressão gerada ao aplicar uma alta vazão sob os microcanais pode comprometer a selagem ou a estrutura do dispositivo e gerar vazamentos. Outra consequência a ser considerada é a resistência em suportar altas pressões por parte de microrganismos e células, também estudados como analitos [START_REF] Wolfram | Perspectives in flow-based microfluidic gradient generators for characterizing bacterial chemotaxis[END_REF][START_REF] Walker | Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator[END_REF] . Uma alternativa pode ser a dosagem controlada do aumento da taxa de injeção Q de maneira a gerar perturbações ao sistema, mas não a alcançar turbulências. Essa opção pode agregar uma componente convectiva ao processo de mistura puramente difusivo 1,[START_REF] Squires | Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale[END_REF][START_REF] Yildiz-Ozturk | Modelling coupled dynamics of diffusive-convective mass transfer in a microfluidic device and determination of hydrodynamic dispersion coefficient[END_REF] .

Enquanto o número de Reynolds relaciona a razão entre forças inerciais e forças viscosas para classificar o tipo de escoamento, a classificação do mecanismo de mistura em um sistema binário recorre da utilização do número de Peclet, (𝑃 𝑒 = 𝑈 𝐷 ℎ 𝐷 ) 2,[START_REF] Bird | Phenomena Second Edition о Macroscopic Microscopic[END_REF][START_REF] Squires | Microfluidics: Fluid physics at the nanoliter scale[END_REF] . O número de Peclet é um indicador adimensional da importância do processo convectivo frente ao processo difusivo em misturas. Baseado na magnitude do número de Pe, pode-se classificar o processo de mistura como:

• Puramente difusivo, 𝑃 𝑒 ≪ 1.

• Predominantemente convectivo, 𝑃 𝑒 ≫ 1.

O processo de mistura anteriormente descrito pela equação de conservação de transferência de massa obtida a partir da Lei de Fick (Equação 6) abrange somente o processo de mistura por difusão. Se um sistema possuir 𝑃 𝑒 ≫ 1, é necessário realizar a adição de um termo à equação referente ao processo de mistura convectivo 36,[START_REF] Li | Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics[END_REF] . Logo, a equação de Fick em função dos fluxos mássicos dos compostos A e B, pode ser representada pela Equação 18, com o acréscimo dos fluxos mássicos convectivos [START_REF] Toh | Engineering microfluidic concentration gradient generators for biological applications[END_REF][START_REF] Wang | Concentration gradient generation methods based on microfluidic systems[END_REF] .

𝑁 𝐴𝑧 ⏟ 𝑓𝑙𝑢𝑥𝑜 𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜 = -𝑐𝐷 𝐴𝐵 𝜕𝑥 𝐴 𝜕𝑧 ⏟ 𝐷𝑖𝑓𝑢𝑠𝑖𝑣𝑜 + 𝑥 𝐴 (𝑁 𝐴𝑧 + 𝑁 𝐵𝑧 ) ⏟ 𝐶𝑜𝑛𝑣𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 Equação 18
A construção de gradientes de concentração por transferência de massa em fluidos binários por difusão-convecção tem sido reportado em configurações de N etapas de diluição em série, também muitas vezes citado como ''christmas tree'' [START_REF] Walker | Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator[END_REF][START_REF] Lin | Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration[END_REF][START_REF] Ruan | Fabrication of a micro fl uidic chip containing dam , weirs and gradient generator for studying cellular response to chemical modulation[END_REF] . Jeon Li et al. [START_REF] Li Jeon | Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device[END_REF] Para fins práticos, o dispositivo microfluídico de Jeon et al. [START_REF] Li Jeon | Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device[END_REF] é eficiente em gerar o gradiente de concentração e pode ser aplicado para os mais variados estudos. Contudo, a não caracterização matemática do perfil do gradiente, bem como a não demonstração da completa mistura dos solutos dentro das serpentinas são recorrentes em muitos trabalhos e podem ser melhores explorados para aplicações em outros sistemas que exigem melhores controles de reprodutibilidade [START_REF] Li Jeon | Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device[END_REF] .

Neste cenário, este trabalho propõe uma abordagem descritiva de um dispositivo gerador de gradiente de concentração, de maneira a utilizar condições de contornos definidas e obter um controle absoluto do sistema ao desenvolver uma modelagem que descreve e prevê o comportamento do dispositivo para outros solutos sem a necessidade de verificação. Uma das aplicabilidades de um dispositivo gerador de gradiente de concentração pode ser na aplicação em biossensores, mais especificamente em biossensores SPR baseados em arranjos de nanoburacos. Esses dispositivos possuem uma demanda na construção de sistemas capazes não apenas de detectar biomoléculas, mas também realizar a quantificação, sobre tudo para aplicação de prognóstico de doenças. A temática de biossensores SPR é abordada com mais detalhes na próxima secção.

Ressonância de Plasmons de Superfície (SPR)

O fenômeno de ressonância de plasmon de superfície foi relatado pioneiramente por Ritchie na década de 1950 [START_REF] Ritchie | Plasma Losses by Fast Electrons in Thin Films[END_REF] . No entanto, o assunto tomou evidência nos anos 90 após Liedeberg et al. [START_REF] Liedberg | Biosensing with surface plasmon resonance -how it all started[END_REF] apresentarem a sensibilidade do fenômeno SPR em monitorar eventos químicos na superfície da plataforma [START_REF] Singh | Surface plasmon resonance sensors: review[END_REF] . Para melhor compreensão da SPR os conceitos serão discutidos alicerçados a um modelo genérico.

Considere um material condutor, mais precisamente um metal de massa suficientemente grande para ser considerado bulk. Os elétrons livres da banda de condução do metal possuem oscilações que se estendem pelo corpo do metal, abrangendo tanto o interior quanto as superfícies, contudo, as oscilações na superfície não se estendem para foi do corpo do material [START_REF] Rider | Plasmas meet plasmonics: Everything old is new again[END_REF] . A oscilação no interior do metal é denominada plasma, note que o termo plasma é inserido no contexto de um condutor bulk. A frequência de oscilação do plasma é descrita por 𝜔 𝑝 = ( 𝑛 𝑒 2 𝑚 𝑒𝑓𝑓 ) 1/2 e relaciona a densidade de elétrons do metal n; massa específica meff e a carga do elétron e [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF]80 .

O plasma pode ser perturbado a partir de uma radiação eletromagnética sob condições específicas, o qual pode ser melhor interpretado com base na relação entre as frequências das radiação incidente (ω0) e a frequência do plasma (ωp) por meio da equação

𝜀 𝑚 ′ 𝜀 𝑑 = 1 -( 𝜔 𝑝 𝜔 0 ) 2 . Se 𝜔 𝑝 𝜔 0 > 1 ou ω0 <
ωp a parte real da permissividade elétrica é negativa, o que proporciona aos elétrons do metal uma oscilação em 180° foi de fase, causando a reflexão de parte da radiação e o acoplamento de uma componente da radiação com a dos elétrons, dando origem ao bulk-plasmon [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF]80 . Se

𝜔 𝑝 𝜔 0 < 1 ou ω0 >
ωp a parte real da constante dielétrica é positiva e a luz é então transmitida ou absorvida pelas bandas de transição internas do metal [START_REF] Li | Plasmon-enhanced optical sensors: A review[END_REF] . Essa observação justifica a transmissão de radiações na região do ultravioleta (UV) para os metais mais leves.

Se o metal citado anteriormente assume a forma de um filme fino, os elétrons livres da banda de condução do metal que oscilam na superfície podem ser acoplados com a radiação eletromagnética, que por sua vez gera como resultante densidades de cargas também oscilantes na interface metal/dielétrico, este fenômeno é chamado de plasmons de superfície (SPs) [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF]82 . Os SPs são considerados quasipartículas que para sua formação algumas condições físicas devem ser atendidas [START_REF] Neto | Relação de dispersão para os plásmon-poláritons de superfície em uma interface plana metal/dielétrico[END_REF] .

Por serem densidades de cargas oscilantes, os SPs possuem uma frequência ωsp (Equação 19) e um número de onda ksp (Equação 20). Essa observação indica que os elétrons oscilantes do plasma serão os mesmos a serem excitados a formar SPs em um filme fino e a formar bulk-plasmons em um corpo extenso (bulk). A diferença entre bulk-plasmons e SPs surge pelo fato dos plasmons no bulk se propagarem para o interior do material, enquanto que os SPs são confinados na interface metal/dielétrico de um filme fino [START_REF] Rider | Plasmas meet plasmonics: Everything old is new again[END_REF][START_REF] Li | Plasmon-enhanced optical sensors: A review[END_REF][START_REF] Liedberg | Principles of biosensing with an extended coupling matrix and surface plasmon resonance[END_REF] .

𝜔 𝑠𝑝 = 𝐶𝑘 𝑠𝑝 √( 1 𝜀 𝑚 ) ( 1 𝜀 𝑑 ) Equação 19 𝑘 𝑠𝑝 = 𝑘 0 √ 𝜀 𝑚 𝜀 𝑑 𝜀 𝑚 + 𝜀 𝑑 = 𝑘 𝑝 Equação 20
A Equação 20 expressa as condições necessárias para a geração dos SPs em um filme fino.

A primeira condição é que k0 = ksp. Logo, é necessário ocorrer um incremento Δkx do número de onda da radiação eletromagnética k0 de maneira a satisfazer a Equação 20 (Figura 5C) [START_REF] Otto | Theory of Plasmon Excitation in Thin Films by Electrons of Non-Normal Incidence[END_REF] . Uma maneira eficiente de obter o Δkx é por meio do uso de um prisma. A radiação propagante em um meio de índice Satisfazendo as condições físicas mencionadas para geração dos SPs em um filme fino, duas consequências de mesma origem são observadas. A primeira consequência é a propagação longitudinal da densidade de carga oscilante, o que é chamado de plasmon-polariton de superfície (SPPs) [START_REF] Rider | Plasmas meet plasmonics: Everything old is new again[END_REF][START_REF] Li | Plasmon-enhanced optical sensors: A review[END_REF]82 . Os SPPs do ponto de vista clássico podem ser considerados uma onda eletromagnética superficial que se propaga pela interface metal/dielétrico (Figura 5A) [START_REF] Olmon | Optical dielectric function of gold[END_REF][START_REF] Mayer | Localized Surface Plasmon Resonance Sensors[END_REF] . Enquanto que o conceito de SPR abrange apenas o acoplamento entre os elétrons da banda de condução do condutor e a radiação eletromagnética na interface sob condições supracitadas [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF] . Em adição, alguns trabalhos classificam a SPR de acordo com dois mecanismos de propagação dos SPs. Enquanto os SPPs são SPs que se propagam apenas, e somente pela interface, a ressonância de plasmons de superfície localizados (LSPR) define que os SPs são confinados em dimensões mínimas [START_REF] Rider | Plasmas meet plasmonics: Everything old is new again[END_REF][START_REF] Mayer | Localized Surface Plasmon Resonance Sensors[END_REF] , como, por exemplo em nanoestruturas metálicas [START_REF] Liedberg | Principles of biosensing with an extended coupling matrix and surface plasmon resonance[END_REF][START_REF] Huang | Localized surface plasmon resonance biosensor integrated with microfluidic chip[END_REF] . A Figura 5 resume de forma ilustrativa os fenômenos envolvidos na geração e propagação dos SPs.

A segunda consequência é a geração de um campo eletromagnético evanescente perpendicular à superfície de propagação dos SPs [START_REF] Liedberg | Principles of biosensing with an extended coupling matrix and surface plasmon resonance[END_REF] . A intensidade do campo diminui exponencialmente ao se afastar da superfície de propagação dos SPs 82 . O decaimento da intensidade do campo pode ser estimado pela Equação 21, onde E0 é o campo elétrico máximo em z = 0. Um sistema composto por ouro como condutor e de ar como dielétrico, o valor do comprimento de decaimento é cerca de (0,4 ± 0,1) λ para dentro do dielétrico [START_REF] Jung | Quantitative interpretation of the response of surface plasmon resonance sensors to adsorbed films[END_REF] . A Figura 5B ilustra o comportamento evanescente dos SPs ao se afastar da interface condutor/dielétrico [START_REF] Kretschmann | Reflection and Transmission of Light By a Rough Surface, Including Results for Surface-Plasmon Effects[END_REF] .

𝐸 𝑧 = 𝐸 0 𝑒 [- 𝜔 𝑐 ( -(𝜀 𝑑 2 ) 𝜀 𝑚 + 𝜀 𝑑 ) 1 2

𝑧]

Equação 21

A propagação dos SPPs no eixo x e a propagação do campo eletromagnético evanescente no eixo z podem ser estimadas como propriedades extensivas. O comprimento de propagação dos SPPs no eixo x, aqui referido como δsp [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF]80 , pode ser estimado pela Equação 22. Note que a propagação é estritamente dependente das permissividades elétricas dos componentes da interface e se extingue ao se afastar do ponto de origem (Figura 5B). A extinção acontece devido à absorção dos elétrons em ressonância plasmônica pelo metal. Um filme fino de prata irradiado por λ0 = 500 nm pode alcançar δsp.Ag = 20 µm no eixo x, por exemplo. O comprimento de propagação ou de penetração do campo eletromagnético evanescente no dielétrico δz pode ser estimada de acordo com a Equação 23 80 . Um filme fino de ouro em interface com água (dielétrico) irradiado por λ0 = 630 nm pode alcançar δz.água = 162 nm, por exemplo.

𝛿 𝑠𝑝 = 1 2𝑘 𝑠𝑝 ′′ = 𝑐 𝜔 ( 𝜀 𝑚 ′ + 𝜀 𝑑 𝜀 𝑚 ′ 𝜀 𝑑 ) 3/2 (𝜀 𝑚 ′ )² 𝜀 𝑚 ′′ Equação 22 𝛿 𝑧 = 𝑐 𝜔 = ( -𝜀 𝑑 ′ 𝜀 𝑚 + 𝜀 𝑑 ) 1/2 Equação 23
Para fins práticos, para a aplicação do fenômeno de SPR para biossensoriamento, por exemplo, a escolha do condutor é crítica. Normalmente são utilizados condutores metálicos como a prata, ouro, cobre e alumínio. Devido a relativa resistência a processos oxidativos e baixa reatividade é preferível a utilização do ouro.

Biossensores SPR Convencionais

A fundamentação sobre os SPs assume aplicação prática quando entendido que as características dos SPs são diretamente relacionadas a permissividade do dielétrico (εd), que por sua vez, possui relação com o índice de refração (RI) do dielétrico (nd) [START_REF] Singh | SPR Biosensors: Historical Perspectives and Current Challenges[END_REF] . Logo, a variação do RI na interface desencadeia uma série de mudanças na geração dos SPs que podem ser monitoradas a partir do controle da radiação emitida para geração dos SPs, bem como pela componente refletida [START_REF] Puiu | SPR imaging: Recent trends in developing nanodevices for detection and real-time monitoringof biomolecular events[END_REF] . Esse entendimento é o suporte de diversos dispositivos de sensoriamento biológico SPR desenvolvidos até então. Neste contexto, é válido esclarecer que em um mesmo sistema pode haver o surgimento de diferentes modos SPs ou modos plasmônicos. Os modos são uma referência a diferentes comprimentos de onda que satisfazem as condições físicas para se combinar com elétrons da banda de valência do metal e gerar SPs [START_REF] Barnes | Surface plasmon subwavelength optics[END_REF]80 .

Alicerçado nessa fundamentação, dois sistemas distintos desenvolvidos por Otto [START_REF] Otto | Theory of Plasmon Excitation in Thin Films by Electrons of Non-Normal Incidence[END_REF] 

SPR em Arranjos de Nanoburacos

Em contraste com as dificuldades experimentais supramencionadas para as configurações dos biossensores SPR pelas configurações de Kretschmann e Otto, surge-se como opção a utilização de nanoestruturas metálicas para geração de modos SPs, as quais exibem configurações experimentais mais simples. Em particular a configuração de biossensores baseados em arranjos de nanoburacos, que por ser parte deste trabalho, será discutida em detalhes frente a configurações como SPs em grades de relevo, superfícies com texturas ou nanopartículas de ouro, por exemplo.

Ao estudar o fenômeno de difração da luz incidida sobre uma superfície metálica contendo um orifício/buraco de diâmetro de sub-comprimento de onda, Bethe [START_REF] Bethe | Theory of Diffraction by Small Holes[END_REF] nos anos 40 concluiu que a transmissão da radiação seria mínima, e que a quantidade de luz transmitida diminuiria ao passo do aumento do λ0 da radiação incidida. Foi ainda proposto que a eficiência de transmissão respeitaria a equação 𝐸 𝑇 = 64 (𝑘𝑟) 4 27 𝜋 4 , onde r é o raio do buraco. No entanto, anos mais tarde Ebbesen [START_REF] Ebbesen | Extraordinary optical transmission through sub-wavelenght hole arrays[END_REF] demonstrou que uma abertura circular em um filme metálico opticamente denso apresenta uma transmissão luminosa não prevista pela teoria de Bethe. A radiação apresentou uma banda de transmissão com quantidade de luz maior que a esperada, em outras palavras, o fluxo de fótons por unidade de área transmitido foi maior que do fluxo de incidência (Figura 7). Para esse fenômeno foi atribuído o nome de Extraordinay Optical Trasmission (EOT) [START_REF] Martín-Moreno | Theory of extraordinary optical transmission through subwavelength hole arrays[END_REF] .

A hipótese mais aceita para explicar a EOT é que há um acoplamento da radiação incidente aos elétrons livres do metal em modos SPs, que por sua vez são tuneladas pelo buraco e re-irradiados na face anterior [START_REF] Degiron | Optical transmission properties of a single subwavelength aperture in a real metal[END_REF] . A justificativa apresentada por Ebbesen é que a teoria de Bethe é aplicável idealmente a aberturas ausentes de espessuras, diferente de buracos que possuem um caminho contínuo relativamente espesso, como em um filme fino. Desta maneira, o espectro de transmissão da luz através de um único buraco tem relação direta com a espessura do filme 98 . Figura 7. A) Esquema representativo do mecanismo de transmissão da luz extraordinária (EOT) de um orifício em um substrato metálico. B) Espectro de transmissão representativo de um único orifício em um substrato metálico.

No contexto de excitação dos elétrons da banda de condução do metal a formar modos SPs em nanoburacos, há necessidade de incrementar o momento ou número de onda da radiação incidente.

Logo, a formação dos modos SPs no buraco assume a condição ksp = k0 + G, sendo G o incremento do número de onda necessário para geração dos modos SPs em nanoburacos [START_REF] Genet | Light in tiny holes[END_REF] . O incremento G pode ser alcançado construindo uma matriz de buracos periodicamente ordenados. Ebbesen justifica que devido a associação de buracos periodicamente ordenados, a radiação é espalhada pelos buracos produzindo modos SPs incapazes de se propagarem como SPPs, dessa maneira o campo eletromagnético é intensificado e o incremento G alcançado, bem como na face anterior que reemite a radiação [START_REF] Garcia-Vidal | Light passing through subwavelength apertures[END_REF] .

Ao manipular a periodicidade da matriz de buracos, bem como o diâmetro e geometria, foi observado que é possível correlacionar a permissividade elétrica do metal e do dielétrico, e estimar o comprimento de onda máximo de transmissão (λmax) da EOT pela Equação 24, onde i e j são números inteiros dos coeficientes de difração relacionados a matriz de nanoburacos e P é a periodicidade [START_REF] Genet | Light in tiny holes[END_REF]100 .

𝜆 𝑚𝑎𝑥 = 𝑃 √𝑖 2 + 𝑗 2 √ 𝜀 𝑚 𝜀 𝑑 𝜀 𝑚 + 𝜀 𝑑 Equação 24
O uso de plataformas plasmônicas que utilizam matrizes ou arranjos de nanoburacos eliminam a complexidade de alinhamento óptico exigido em sensores SPR convencionais. A luz incidente nesse tipo de nanoestrutura é convertida diretamente em plasmons de superfície sem a necessidade de um prisma. Enquanto que o monitoramento dos eventos químicos/bioquímicos podem ser realizados com base na quantidade de radiação transmitida em um alinhamento colinear (ϴ = 0) da radiação incidente aos arranjos de nanoburacos 101 . A Figura 8 ilustra a formação dos SPs nos arranjos de nanoburacos e como se propagam o campo elétrico no eixo z. A utilização do fenômeno de SPR em arranjo de nanoburacos para o desenvolvimento de biossensores tem ganhado importância por se tratar de uma técnica bastante sensível e com a capacidade de integrar outros sistemas laboratoriais 101,104,105,106 . Porém, grande parte dos trabalhos normalmente apresentam a detecção de analitos e não a quantificação. A quantificação é uma dificuldade comum pois haveria a necessidade de realizar inúmeros processos de monitoramento sob a exposição de concentrações variadas do analito para elaboração de uma curva de calibração. No entanto, as ligações formadas sobre a superfície são, em sua maioria, irreversíveis, o que torna impraticável a reutilização do mesmo arranjo de nanoburaco para uma segunda análise. Diante deste cenário, a opção mais viável é a criação de uma plataforma plasmônica com múltiplos arranjos de nanoburacos, onde os arranjos sejam expostos paralelamente a concentrações diferentes de analitos, sendo possível então a correlação dos efeitos dos SPs e quantificar um analito.

OBJETIVOS

Objetivo Geral:

Desenvolver e caracterizar um dispositivo microfluídico gerador de gradiente de concentração definido e reprodutível para moléculas com alta massa molecular e/ou baixo coeficiente de difusão, bem como apresentar a aplicabilidade na quantificação de uma biomolécula por meio de biossensoriamento SPR baseado em arranjos de nanoburacos.

Objetivos Específicos:

▪ Confeccionar uma configuração para um sistema de diluição em série;

▪ Identificar pelo modelo matemático os coeficientes de concentração dos dispositivos propostos;

▪ Caracterizar experimentalmente a formação dos coeficientes de concentração dos dispositivos propostos;

▪ Caracterizar a formação dos coeficientes de concentração dos dispositivos propostos por simulações computacionais;

▪ Identificar efeitos no processo de diluição decorrentes das configurações das câmaras de mistura;

▪ Apresentar uma descrição matemática de reprodutibilidade de um dispositivo;

▪ Confeccionar uma plataforma biossensorial plasmônica para acoplamento ao dispositivo gerador de gradiente de concentração;

▪ Caracterizar a plataforma plasmônica;

▪ Aplicar o dispositivo microfluídico gerador de gradiente de concentração a plataforma plasmônica para um bioensaio de detecção. Figura 10. Esquema ilustrativo do processo de fabricação de um dispositivo microfluídico genérico em PDMS.

MATERIAIS E MÉTODOS

Caracterizações dos Coeficientes de Concentração

Os dispositivos em PDMS foram acoplados a lâminas de vidro para selagem e em um substrato de ouro para o dispositivo de biossensoriamento plasmônico. Uma bomba de seringa (Harvard Apparatus 11 Plus) foi utilizada para a injeção das soluções dos solutos estudados sob diferentes Q = 0,125 a 1,200 mL h -1 . As amostras das soluções dos solutos coletadas nos canais de saídas dos dispositivos foram quantificadas por técnicas apropriadas a cada soluto.

A verificação da formação do gradiente de concentração, bem como a completa homogeneidade ao longo da secção de um canal, foi verificada a partir de imagens obtidas utilizando um microscópio de fluorescência (TNI-06T-PL) com uma lente objetiva de ampliação de 4 x, sob injeção de fluoresceína (10 -3 mol L -1 , 331,3 g mol -1 , D = 5,0 E -10 m² s -1 ). As imagens registradas foram manipuladas no software ImageJ ® , as quais auxiliaram na discussão do comportamento do soluto, tanto nas câmaras de misturas (tipo T e Y ou, splitter e combiner) quanto na determinação dos coeficientes de concentração. A quantificação das concentrações das amostras do soluto albumina de soro bovino 21 (BSA, 300 µg mL -1 , 66 kDa; D = 5,9 E -11 m² s -1 ) coletadas nos canais de saídas dos dispositivos foram realizadas monitorando a emissão fluorescente da BSA no comprimento de onda de 350 nm em um espectrofluorímetro (Varian, Cary-Eclipse). Para a quantificação da concentração dos solutos azul de metileno (10 µg mL -1 , 319,8 g mol -1 , D = 8,3 E -10 m² s -1 ) e rosa de bengala (10 µg mL -1 , 973,7 g mol -1 ; D = 4,8 E -10 m² s -1 ), foram monitoradas as absorções máximas em 658 nm e 549 nm, respectivamente, por meio do espectrofotômetro UV-Vis (Ocean Optics, USB2000).

Simulação Computacional -COMSOL Multiphysics ®

As simulações computacionais são normalmente realizadas em softwares Computational Fluid Dynamics (CFD) por meio de métodos de elementos finitos e da teoria do contínuo, bem como estabelecido as condições de contorno programadas pelo usuário O reconhecimento biológico do analito BSA foi realizado após a preparação da superfície do biossensor para reconhecimento da BSA. A modificação bioquímica foi efetuada seguindo um procedimento amplamente reportado para a imobilização da BSA sobre a superfície de substratos de ouro 110,111 .

Inicialmente, foi injetado água milli-Q nos inlets A e B do dispositivo δ-2x5-Y sob QA = QB = 1,000 mL h -1 durante 30 min para purgar o sistema. Após 20 min de repouso 75 imagens dos arranjos de nanoburacos foram registradas. Seguidamente, ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA; 0,50 mmol L -1 ; 98 %, Sigma-Aldrich) em álcool etílico a QA = QB = 0,500 mL h -1 por 6h, e então uma mistura aquosa de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC; 0,1 mol. L -1 , 98 %, Sigma-Aldrich) e Nhidroxisuccinimida (NHS; 0,1 mol L -1 ; 98 %, Sigma-Aldrich) foram injetadas a QA = QB = 0,500 mL h -1 durante 4h. Para a detecção e quantificação da proteína foi injetado ao inlet A uma solução de BSA (300 µg mL -1 ) em tampão fosfato (PBS, pH 7,45; NaCl, 95,5%; KCl 99,0%; NaH2PO4, 98,0% e Na2HPO4, 99,0%; ambos Sigma-Aldrich), enquanto que no inlet B foi injetado somente PBS, ambos a QA = QB = 0,125 mL h -1 durante 40h. As saídas do dispositivo δ-2x5-Y, conectadas ao dispositivo ψ, passaram sobre os conjuntos de arranjos de #1 à #5 e foram utilizadas para obter a curva de calibração (concentrações conhecidas de solução padrão de BSA). No último conjunto de arranjos (#S) uma amostra de BSA pseudodesconhecida (160 µg mL -1 ) foi injetada a Qs = 0,125 mL h -1 por 40h. Por fim, todas imagens foram processadas utilizando o software ImageJ ® coletando a média de intensidade transmitida para cada arranjo de nanoburacos.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Modelo Matemático Aplicado a Sistemas Microfluídicos de Diluição em Série

A uniformidade e simetria nas dimensões dos canais por todo sistema podem induzir a uma interpretação simplista e equivocada dos coeficientes de diluição e do gradiente de concentração final.

A concentração resultante da junção de dois canais com concentrações distintas é definida pela razão entre os volumes dos dois fluidos (coeficientes de diluição), ou seja, a concentração final pode ser manipulada a conveniência apenas ao controlar as quantidades de volumes injetadas de cada fluido (vide seção 1.3). O recurso de empregar analogia à circuitos elétricos para estimar as concentrações finais de N etapas de diluição em série, se apresenta de maneira adequada para essa discussão. Como apresentado anteriormente, os parâmetros de corrente elétrica (I), tensão elétrica (V) e resistência elétrica (R) podem ser ressignificados como taxa de injeção volumétrica ou fluxo (Q), variação de pressão (ΔP) e resistência hidráulica (RH), respectivamente. Essa analogia permite o emprego também análogo da Lei Ohm, bem como as Leis de Kirchhoff, equações eficientes para estimar os coeficientes de misturas e as concentrações finais que ocorrem nas câmaras de misturas (Equações 13 -17).

A interpretação de um sistema genérico ( Figura 15. Perfil de uma curva sigmoidal logística observada ao estimar pelo método matemático os coeficientes de concentração em função do número de canais de saída.

Determinações Experimentais dos Coeficientes de Concentrações Gerados nos

Dispositivos Microfluídicos

O método matemático análogo a sistemas elétricos é eficiente na avaliação do perfil gerado em um sistema de diluição em série, ou mais precisamente, na estimativa dos coeficientes de concentração. Contudo, essa abordagem considera que os segmentos combiner/splitter (câmara de mistura) atuem de maneira ideal, bem como o comprimento do sistema de mistura L seja suficiente para completa homogeneização dos fluidos. Logo, se fez necessário o acompanhamento experimental da eficiência da câmara de mistura e do comprimento do sistema de mistura.

Inicialmente foram confeccionados sistemas de diluição com câmaras de misturas de designs Os dispositivos foram confeccionados em PDMS e a partir de uma bomba de seringa foi injetado solução aquosa de azul de metileno (10 µg mL -1 ; 319,8 g mol -1 ; D = 8,3 E -10 m² s -1 ) no inlet A e água mili-Q no inlet B a QA = QB = 1,000 mL h -1 . Alíquotas foram coletadas ao fim do processo de mistura de cada dispositivo e quantificadas suas respectivas absorções em um espectrofotômetro UV-Vis. A Figura 17 apresenta as concentrações percentuais vs. canal de saída para os três os dispositivos.

Como previsto pelo método matemático (Equações 13 -17), o perfil observado foi de uma curva sigmoidal logística, exceto para o sistema de uma etapa de diluição em série (2x3) que como esperado apresentou-se linear. Nota-se que se comparado as curvas do método matemático com as curvas obtidas experimentalmente, os resultados com câmara de mistura em T (vermelho) apresentaram maior afastamento dos valores estimados (preto), enquanto que as curvas de câmara em Y (azul) mostraramse estatisticamente melhor ajustadas aos coeficientes de concentração estimados. A câmara de mistura de design em T é a configuração mais reportada na literatura [START_REF] Lee | 2-Layer Based Microfluidic Concentration Generator By Hybrid Serial and Volumetric Dilutions[END_REF]112,113,114 .

No Com intuito de aplicar em uma plataforma plasmônica contendo arranjos de nanoburacos para aplicação biossensorial, uma nova configuração de gerador de concentração de 4 etapas de diluição em série foi construída de maneira a enquadrar as dimensões 2,5 x 2,5 cm da plataforma plasmônica.

A 100,0 100,0 100,0 ± 1,5 99,1 ± 0,3 99,6 ± 0,9

Quando injetado ao dispositivo os solutos fluoresceína (10 -3 mol L -1 ; 333,3 g mol -1 , D = 5,0 E -10 m² s -1 ), azul de metileno (10 µg mL -1 ; 319,8 g mol -1 ; D = 8,3 E -10 m² s -1 ) e D-(+)-glucose (0,1 g mL -1 ;

180,1 g mol -1 ; D = 4,8 E -10 m² s -1 ) a QA = QB = 1,000 mL h -1 , o gradiente de concentração mostrou-se reprodutível como pode ser observado na Figura 20 e na Tabela 1, apesar do evidente afastamento dos coeficientes estimados pelo método matemático. Os desvios aos valores matematicamente estimados não são consequências da ineficiência do processo de mistura dos solutos nas serpentinas.

A Figura 19C apresenta uma imagem obtida do microscópio de fluorescência quando o soluto fluoresceína foi aplicado ao dispositivo 2x6-QD. É possível observar a homogeneidade pela secção transversal de todos os canais, evidenciando que L = 25000 µm foi capaz de completar a mistura da fluoresceína a QA = QB = 1,000 mL h -1 . A hipótese mais provável pelos desvios experimentais aos valores matemáticos é a presença de irregularidades, imperfeições e até mesmo de pequenas obstruções geradas no processo de fabricação do dispositivo 2x6-QD em PDMS, que por consequência, influência nas razões volumétricas no combiner no proporcionando vazões e concentrações finais ao processo distintas. O dispositivo δ-2x5-Y foi submetido a análise do perfil de gradiente de concentração formado por quatro diferentes solutos sob taxas de injeção volumétricas variadas. A Figura 22A mostra uma imagem do gradiente de concentração obtido em um microscópio de fluorescência quando injetado o soluto fluoresceína 10 -3 mol L -1 e água mili-Q a QA = QB = 1,000 mL h -1 . É evidente a formação do gradiente de concentração entre os canais (Figura 22B), bem como a homogeneidade ao longo de toda secção dos cinco canais. O perfil sigmoidal logística assumido pela intensidade luminosa da fluoresceína nos canais é idêntico aos perfis de diluição observados quando o soluto rosa de bengala a 10 µg mL -1 (973,8 g mol -1 , D = 4,8 E -10 m² s -1 ) foi injetado com água mili-Q a QA = QB = 1,000 mL h -1 (Figura 22C) e azul de metileno a 10 µg mL -1 (Figura 22D). Para esse último soluto, foi ainda avaliado diferentes fluxos de injeção, sendo 0,800, 1,000 e 1,200 mL h -1 . Contudo, é importante registrar que há um melhor ajuste dos dados experimentais para o soluto azul de metileno quando o fluxo foi de 0,800 mL h -1 , um indicativo que a redução da taxa de injeção favorece a melhor mistura entre os fluidos concentrado e o diluente. A similaridade entre os gradientes de concentração formados para diferentes solutos sob diferentes condições assegura que cada soluto foi homogeneizado de maneira eficiente no comprimento L = 50000 µm, bem como o dispositivo δ-2x5-Y é capaz de reproduzir os mesmos coeficientes de concentração em situações onde a serpentina de mistura é suficiente para completa mistura do soluto. Outra observação importante é a convergência entre os coeficientes de concentração determinados pelo método matemático aos obtidos experimentalmente, uma indicação da eficiência do modelo matemático em estimar os coeficientes de concentração de sistemas de diluição em série. Capaz de gerar um gradiente de concentração reprodutível para os solutos fluoresceína, rosa de bengala e azul de metileno, o dispositivo δ-2x5-Y foi então submetido a injeção de uma solução de BSA (300 µg mL -1 ; 66 kDa; D = 5,9 E -11 m² s -1 ) e PBS a QA = QB = 0,125; 0,800 e 1,000 mL h -1 (Figura 23). Nota-se que sob QA = QB = 0,800 ou 1,000 mL h -1 o perfil demonstra um afastamento dos coeficientes de concentração estimados pelo método matemático. Esse afastamento é explicado pelo fato de a BSA ser uma proteína de massa molecular relativamente maior frente aos solutos anteriormente estudados, bem como possuir um coeficiente de difusão menor. Embora o processo de mistura seja intensificado pelo transporte convectivo, as taxas de injeção volumétricas não se mostraram suficiente. Essa limitação foi superada quando reduzida o fluxo de injeção volumétrica para QA = QB = 0,125 mL h -1 . Nota-se que a diminuição de Q fez com que o gradiente de concentração formado fosse estatisticamente idêntico aos coeficientes de concentração estimados pelo método matemático. 

-1 - -x5-Y BSA. -0.800 mL h -1 - -x5-Y BSA. -1.000 mL h -1 - -x5-Y
Figura 23. Gradientes de concentração obtidos experimentalmente para o dispositivo δ-2x5-Y sob injeção de uma solução de BSA (300 µg mL -1 ) em PBS a QA = QB = 0,125; 0,800 e 1,000 mL h -1 . Tabela 2. Coeficientes de concentração para o dispositivo δ-2x5-Y determinados pelo modelo matemático, simulação computacional e experimental para a BSA (0,125 mL h -1 ).

Simulação Computacional e Modelagem Matemática do

Canal de saída Modelo Matemático

Simul. COMSOL Multiphysics® BSA Experimental (0,125 mL h -1 ) 1 0,00 0,00 0,05 ± 0,08 2 0,16 0,18 0,13 ± 0,04 3 0,50 0,50 0,53 ± 0,08 4 0,84 0,83 0,83 ± 0,01 5 1,00 1,00 0,95 ± 0,05 Diante da convergência entre os dados matemático, experimental e simulado, podemos assumir uma modelagem para o dispositivo δ-2x5-Y. Por meio dos resultados experimentais obtidos dos coeficientes de diluição para o azul de metileno a QA = QB = 1,000 mL h -1 a 10 µg mL -1 , foi realizado um tratamento estatístico e uma curva de predição de dados com intervalo de confiança de reprodutibilidade de 95% foi produzida. A Figura 24B apresenta dois conjuntos de curvas (azul e verde) representativas da predição de dados. A curva em vermelho representa os dados experimentais dos coeficientes de diluição para o azul de metileno supramencionado (Figura 22D); a curva verde demarca a região de predição de dados referente a um novo experimento a ser realizado para o azul de metileno, em outras palavras, a curva representa a probabilidade de um novo experimento com o soluto azul de metileno aplicado ao dispositivo δ-2x5-Y em reproduzir o mesmo conjunto de dados; enquanto que a curva azul delimita a região em que um único dado (x ou y) introduzido a função que descreve a curva (sigmoidal logística com seus respectivos parâmetros k e x0) possui em reproduzir os coeficientes de concentração ou canal de saída para o dispositivo δ-2x5-Y.

Essa abordagem permite assegurar que o emprego de um novo soluto dentro das condições de contorno, como a suficiência em misturar em L = 50000 µm, reproduzirá os mesmos coeficientes de concentração. Esse resultado é valoroso para fins práticos, pois dispensaria a necessidade de recalibrações recorrentes, permitindo ao usuário apenas a função de operar a injeção e compreender a modelagem do dispositivo. Figura 25. Imagem de microscopia eletrônica de varredura da plataforma plasmônica de biossensoriamento SPR baseado em arranjos de nanoburacos. A) Enquadramento de seis arranjos. B) Magnificação de um arranjo. C) Nanoburacos circulares.

Propriedade Óptica da Plataforma Plasmônica Baseada em Arranjos de Nanoburacos e Sensibilidade

A excitação dos modos SPs ocorrem em ambos os lados da superfície do condutor fino [START_REF] Singh | Surface plasmon resonance sensors: review[END_REF] . A proposta mais aceita é que a radiação eletromagnética responsável pela excitação dos modos SPs é acoplada e confinada nos nanoburacos sendo reemitidas na face anterior, conhecido como fenômeno de transmissão da luz extraordinária [START_REF] Ebbesen | Extraordinary optical transmission through sub-wavelenght hole arrays[END_REF][START_REF] Degiron | Optical transmission properties of a single subwavelength aperture in a real metal[END_REF] . O comprimento de onda da EOT derivado dos modos SPs pode ser manipulado controlando a periodicidade e a geometria dos buracos 100 . A Equação 24 expressa a relação para estimativa do λmax de EOT de um modo SP, onde P é a periodicidade entre os nanoburacos, i e j são integrais do modo plasmônico, εm e εd são as constantes dielétricas do condutor e do dielétrico, respectivamente [START_REF] Martín-Moreno | Theory of extraordinary optical transmission through subwavelength hole arrays[END_REF] .

A Figura 26A expõe os espectros de transmissão da EOT de todos os arranjos de nanoburacos em água (n = 1,3327, 25 °C) quando incidido uma luz branca. Como anteriormente discutido, o confinamento dos modos SPs evanescentes perpendiculares a superfície são sensíveis a variações da constante dielétrica [START_REF] Genet | Light in tiny holes[END_REF]115 Figura 26. A) espectro de transmissão dos arranjos de nanoburacos quando incidido luz branca. B) Deslocamento red shift da banda EOT de um arranjo sob variação de índice de refração e sua respectiva sensibilidade.

Biossensor SPR por Aquisição de Imagens

A detecção de uma molécula causadora de mudanças no RI na superfície de um arranjo de nanoburacos é praticável pelo red shift da EOT, no entanto, a coleta da EOT em um detector de um UV-Vis convencional permite o alinhamento de um arranjo de nanoburacos por vez, o que impede o processo de monitoramento de vários arranjos simultaneamente para a criação de uma curva de calibração. Isso inviabiliza a possibilidade da quantificação do soluto. Outro fator importante é a fonte de emissão responsável pela excitação dos modos SPs. Uma fonte policromática convencional geralmente emite menos intensidade luminosa nos comprimentos de ondas excitantes dos modos SPs e geralmente possuem menor estabilidade luminosa. Esses inconvenientes são superados quando utilizado um sistema de emissão controlada de uma fonte monocromática adequada e uma captação da EOT por uma câmera CCD. Esse dispositivo é capaz de enquadrar e coletar a intensidade de EOT de múltiplos arranjos de nanoburacos simultaneamente a partir da manipulação de um conjunto de lentes objetivas adequadas, bem como monitorar online a variação das intensidades da EOT individualmente (Figura 13). Isso torna o sistema mais sensível devido a quantidade de dados coletados 103,116 .

Para a quantificação da BSA os conjuntos de arranjos #1 a #S foram condicionados a reconhecer a proteína pela formação das camadas de MUA/EDC-NHS. A Figura 27A expõe as variações das intensidades relativas de EOT coletadas na câmera CCD ao passo de cada modificação superficial. É possível perceber um aumento da intensidade de EOT em relação a água (normalizado em 0%) de ≈ 23 % para todos conjuntos. Esse aumento é justificado pelo fato das bandas de EOT 23). A Figura 28B apresenta as curvas do gradiente de concentração para a BSA quantificadas por espetroscopia de fluorescência (na ausência da plataforma plasmônica, dispositivo ψ) e a variação de intensidade EOT normalizadas obtida pelo método de aquisição de imagens do bioensaio (na presença da plataforma plasmônica, dispositivo δ-2x5-Y + dispositivo ψ).

A reprodutibilidade do gradiente de concentração da BSA pelo dispositivo δ-2x5-Y pode ser verificada no biossensor SPR pelo método de aquisição de imagens. É importante destacar que os parâmetros k e x0 para as curvas do bioensaio e por espectroscopia de fluorescência são similares (Figura 28B). Ao construir uma curva de intensidade normalizada (aquisição de imagem) vs.

Concentração normalizada (espectroscopia de fluorescência) foi observado uma relação linear (R² = 0,9921), ou seja, foi construída uma relação para determinação da concentração de BSA de maneira direta a partir da variação de intensidade de EOT obtida pelo biossensor SPR de arranjos de nanoburacos pelo método de aquisição de imagem (Figura 28C). A quantificação da amostra de BSA pseudodesconhecida (160 µg mL -1 ) causou uma diminuição de intensidade de -11,4 ± 1,3 %, o equivalente a uma redução de |0,46| da intensidade normalizada EOT, também equivalente a 0,46 de concentração. Como a concentração de construção da curva de calibração experimental foi de 300 ug mL -1 , a concentração quantificada pelo biossensor SPR baseado em arranjos de nanoburacos associado a curva de calibração experimental foi de 138 ug mL -1 . Figura 28. A) Variação da intensidade normalizada de EOT em relação a água para cada conjunto de arranho expostos ao gradiente de concentração da BSA. B) Correlação entre as curvas sigmoidal logística observadas experimentalmente e pelo biossensor SPR pelo método de aquisição de imagens.

Ao fim da biodetecção da BSA as amostras percorridas pelo sistema microfluídico foram recolhidas, incluindo a amostra de BSA pseudodesconhecida, e quantificadas em espectrofluorímetro para validação dos coeficientes de concentração determinados pelo método de aquisição de imagens.

A Figura 29A correlaciona as concentrações determinadas pela banda de emissão fluorescente da BSA e a relativa variação de EOT pelo método de aquisição de imagens. O perfil analisado da BSA quantificada por fluorescência mostrou-se equivalente ao detectado pelo método de aquisição de imagens validando a detecção observada pelo biossensor SPR baseado em arranjos de nanoburacos.

Em adição, a validação da amostra de BSA pseudodesconhecida apresentou a concentração de 154,8

± 16,6 µg mL -1 , convalidando a concentração de BSA pseudodesconhecida com 160 µg mL -1 , bem como a quantificada pelo método de aquisição de imagem com 138 µg mL -1 . Guardados os erros experimentais relacionados a quantificação por duas técnicas diferentes, há concordância entre os resultados que asseguram a capacidade do dispositivo δ-2x5-Y em formar um gradiente de concentração definido e reprodutível, tal como a possível aplicação em sistemas laboratoriais diversos. Figura 29. Coeficiente de concentração observados pelas amostras do gradiente de concentração após a biodetecção da BSA pelo biossensor SPR e os coeficientes de concentração a partir da intensidade normalizada de EOT no ensaio de biodetecção da BSA.

Por fim, os coeficientes de concentração de validação da BSA após o ensaio de aquisição de imagem foram plotados junto a curva de modelagem estatística do dispositivo δ-2x5-Y (Figura 29B).

Nota-se que nos pontos em vermelho referente aos coeficientes de concentração da BSA satisfizeram a predição de dados (Figura 24B). Esse resultado valida a condição de utilizar a modelagem estatística para aplicação de um soluto diferente ao que foi utilizado.

PARTE II -ELETROSSINTESE DE MEDIADORES REDOX SOBRE MWCNTS PARA BIOÂNODOS EM BIOCÉLULAS A

COMBUSTÍVEL ENZIMÁTICA.

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

O crescimento populacional associado a inserção progressiva de produtos eletroeletrônicos no mercado, impulsionados por mídias e políticas de consumo, posicionam a temática "geração de energia" como uma discussão imprescindível, não apenas na abordagem social e de qualidade de vida, A segunda subclasse de biocélulas a combustível são as EFCs que, como material de pesquisa deste trabalho será realizado uma explanação mais detalhada e completa sobre as principais características e estratégias para obtenção de melhores rendimentos catalíticos.

mas

Biocélulas a Combustível Enzimáticas (EFCs)

Como citado anteriormente, biocélulas a combustível enzimáticas fazem parte de uma subclasse de BFCs que empregam enzimas como biocatalisadores 6 . O conceito de EFCs foi primeiramente descrito em 1964 140 e, então, muitas composições de EFCs emergiram com potenciais e aplicações variadas. As EFCs consistem em um arranjo de dois eletrodos separados por um eletrólito, assim como as células a combustível convencionais. O ânodo, renomeado de bioânodo, é responsável pela oxidação de um combustível a partir de enzimas oxidantes apropriadas devidamente imobilizadas sobre a superfície de um eletrodo. Enquanto que o biocátodo utiliza dos elétrons gerados no bioânodo para reduzir, a partir de enzimas redutoras, uma espécie química ou bioquímica 7 . A Figura 30 ilustra a composição de uma EFC com seus respectivos componentes. Embora seja atrativo selecionar o combustível com maior capacidade energética, na prática deve ser levado em conta a capacidade do sistema em converter toda a energia química em eletricidade. A oxidação completa da glicose a formar dióxido de carbono e água fornece 24 elétrons.

No entanto, a oxidação da glicose por enzimas como glicose oxidase ou nicotinamida adenina dinucleotídeo-dependente glicose desidrogenase (NAD-GDH), catalisam apenas 2 elétrons, o que pode ser considerado uma ineficiência técnica. Uma estratégia para aproveitar toda capacidade eletrônica de um combustível é por meio da montagem ou combinação de diferentes enzimas que catalisam sequencialmente os produtos de uma catálise anterior. Apesar da dificuldade em caracterizar a origem do CO2 produzido, já que o CO2 também é produto de reações intermediárias, Shuai Xu e Shelley D.

Minteer afirmam ter catalisado completamente a glicose em CO2 e água a partir de um sistema de seis enzimas em ''série'' 145 . A Figura 32 apresenta a EFC desenvolvida, bem como um esquema representativo do processo de oxidação da glicose e seus subprodutos. Os dois produtos seguem mecanismos paralelos que por meio das enzimas PQQ-dependente álcool desidrogenase, PPQ-dependente aldeído desidrogenase e oxalato oxidase, ambas extraídas de Gluconobacter sp., são finalmente oxidadas a CO2. Por fim, os autores relataram obter uma densidade de corrente anódica de 31,5 ± 6,5 µA cm -2 , uma corrente equivalente a 44 vezes a corrente anódica obtida apenas com as duas primeiras etapas, ou seja, a oxidação da glicose e gluconato. A caracterização do produto final foi realizado por RMN [START_REF] Sinton | Pressure Drop in Rectangular Microchannels as Compared With Theory Based on Arbitrary Cross[END_REF] C expondo apenas o deslocamento químico para o CO2 145 .

A estratégia de utilizar um sistema de múltiplos catalisadores é interessante, no entanto, é demasiadamente complexo construir de forma eficiente um bioânodo. Deve-se levar em conta as diferentes estabilidades estruturais e químicas de cada enzima, que uma vez afetadas comprometem todo o desempenho em cadeia. Outro inconveniente é a disposição espacial, uma grande variedade de enzimas implica em menor quantidade de espécime por unidade de área, comprometendo a quantidade de combustível catalisado. Por fim, cada enzima catalisadora possui também condições ótimas de pH e temperatura, e em um grupo de enzimas nunca será possível obter a condição ideal de todos os catalisadores 7 .

A escolha de um combustível demanda muita atenção técnica devido as condições supramencionadas. No entanto, a determinação de um combustível passa pela escolha de um catalisador, que por sua vez apresentam suas próprias características e estratégias próprias para melhorar o desempenho catalítico.

Enzimas em EFCs

Uma das principais características das EFCs é a utilização de enzimas como biocatalisadores.

Enzimas são grupos ou substâncias orgânicas que possuem a função de catalisar determinadas reações metabólicas em organismos vivos 146,147 . As enzimas possuem estruturas tridimensionais complexas que são fundamentais na habilidade de reconhecer um substrato. Além disso, as enzimas são frágeis à variações bruscas de pH e temperatura, e podem sofrer desnaturação † † da estrutura proteica e consequentemente perda da capacidade de atuar como um catalisador 148 .

Normalmente as enzimas são classificadas em grupos de acordo com as suas funções bioquímicas: I) Oxirredutases, realizam catálises de processos redox; II) Transferases, são espécies que auxiliam na transferência de grupos funcionais entre moléculas; III) Hidrolases, são enzimas que hidrolisam grupos; IV) Liases, são enzimas que quebram ligações químicas, geralmente eliminando água e CO2; V) Isomerases, mudam a conformação de isômeros e VI) Ligases, catalisam a formação de ligações entre duas moléculas 146 . Como as enzimas oxirredutases são as únicas capazes de catalisar diretamente a transferência de elétrons entre duas espécies, são os catalisadores comumente utilizados em EFCs, por esse motivo é o único grupo de enzimas a ser abordado neste trabalho. A Tabela 5 apresenta uma lista de enzimas oxirredutases utilizadas em EFCs como catalisadores anódicos e catódicos Cofatores são componentes não proteicos ligados física ou quimicamente a enzima e possuem a função de aceitar os elétrons na catálise enzimática 7 . Como são fundamentais para na geração da corrente elétrica em EFCs, é importante localizar na estrutura da enzima a posição do cofator para melhor eficiência na captura dos elétrons. A literatura reporta três posições mais recorrentes. O cofator pode ser uma espécie não fixa a estrutura enzimática, chamado de I) centro ativo difusivo; o cofator pode ser fixo e o II) centro ativo periférico da estrutura da enzima e o cofator pode ser fixo e o III) centro ativo interno 6 . A Figura 33A ilustra a posição dos cofatores na estrutura da enzima. As duas primeiras posições supracitadas para um cofator permitem a direta transferência de elétrons (DET) entre a enzima e o eletrodo, enquanto que quando o cofator está localizado fixamente distante da região periférica da enzima (III), geralmente > 15 Å de distância do limite estrutural da enzima, o mecanismo de transferência de elétrons deve ser mediado (MET) 6,149 , a Figura 33B ilustra o mecanismo de transferência de elétrons para cada estrutura enzimática. Figura 33. A) Representação ilustrativa da localização de cofatores em estruturas de enzimas catalisadoras. B) Esquema do mecanismo de transferência eletrônica direta (DET) e mediado (MET) realizado pelas enzimas sob diferentes localizações dos cofatores.

O mecanismo de transferência direta de elétrons entre o centro ativo da enzima para o eletrodo favorece a quantidade de corrente elétrica gerada devido a não necessidade de espécies para intermediar a transferência. No entanto, a eficiência da taxa de transferência eletrônica diminui uma ordem de grandeza a cada aumento de ≈ 2,3 Å de distância do sitio ativo da enzima para com o eletrodo, necessitando de um mediador redox a partir de distâncias > 15 Å 150 . Logo, grande parte das enzimas somente são eficientes em EFCs pelo mecanismo MET na presença de um mediador redox (MR) 7,151 .

Mediadores redox são moléculas de baixo peso molecular com excelente cinética de transferência eletrônica, doando e recebendo elétrons entre o sítio ativo da enzima e o eletrodo 152 . Para exercer de forma eficaz esta função, os MRs devem possuir alguns predicados. Primeiramente, o MR deve possuir um sistema redox reversível ou quase reversível com potenciais mais próximos possível do potencial redox da enzima, ou mais especificamente do cofator enzimático, de maneira a garantir uma transferência eficiente. A molécula deve ser estruturalmente compatível com a enzima, ou seja, possuir dimensão estrutural adequada para difundir entre o sítio ativo da enzima até o eletrodo. O MR deve ser estável, sobretudo a variações de pH e não reativo com oxigênio 6,122,153,154 . Alguns exemplos comuns de MRs são os corantes azul de metileno, fenazinas, violeta de metila, amarelo de alizarina, azul da prússia, entre outros. Contudo, os corantes são problemáticos quanto a variações de pH, bem como a baixa solubilidade em sistemas salinos.

Especialmente em eletrodos a base de carbono aplicados na construção de EFCs, as naftoquinonas e derivados são os MRs mais empregados. Reuillard et al. 155 reportaram pioneiramente a aplicação da 1,4-naftoquinona (1,4-NQ) como mediador redox para o bioânodo enzimático composto por nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) e glucose oxidase (GOx) como catalisador da glicose dependente do cofator FAD (FAD-GOx). Devido à baixa solubilidade em água, forte interação π-stacking com o eletrodo de MWCNTs e também por possuir potencial redox em PBS de -0,17 V vs.

Ag/AgCl, adequadamente próximo ao potencial redox do cofator FAD, -0,48 V vs. Ag/AgCl, a EFC com biocátodo composto por MWCNTs e lacase ausente de MR obtiveram uma densidade de corrente de 4,47 mA cm -2 . A corrente catalítica do bioânodo MWCNTs/NQ/GOx foi de 0,14 mA, consideravelmente superior ao bioânodo na ausência do mediador, MWCNTs/GOx de 0,01 mA, demonstrando uma otimização da transferência eletrônica pelo mecanismo mediado na presença do mediador redox 1,4-NQ 156 . Em um outro trabalho, Gross et al. 155 apresentaram uma proposta de EFC glicose/O2 a partir da utilização de buckypaper como eletrodo e com as enzimas FAD-GDH com o mediador redox 1,10fenantrolina-5,6-diona como catalisador da glicose. Os autores demonstraram alcançar correntes catalíticas anódicas de 5,38 ± 0,54 mA cm 2 155 . Especificamente para oxidação da glicose como combustível, duas enzimas são convencionalmente utilizadas, a glicose oxidase (GOx) e glicose desidrogenase (GDH). A GOx sem dúvidas é a mais frequente enzima utilizada para catálise da glicose, não apenas em EFCs mas também na construção de biossensores de glicose 6,7,141,150 . A GOx é uma enzima homodimérica que possui uma massa de 160 kDa e 8 nm de diâmetro em média. Em EFCs, a GOx é capaz de gerar elétrons através da catálise da glicose a ácido glucônico por transferência eletrônica direta (DET) na presença de um cofator adequado, como o dinucleótido de flavina e adenina (FAD). Contudo, sob presença de mediadores redox, como naftoquinonas, a catálise enzimática é otimizada 156 . Como caraterística importante, a GOx conduz a reação catalítica formando como produto não apenas o ácido glucônico mas também H2O2 (Equação 28 e 29) 157 , o que é um grande inconveniente quando tem se por objetivo implantar in vivo.

𝐹𝐴𝐷(𝐺𝑂𝑥) + 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 → á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜 + 𝐹𝐴𝐷𝐻 2 (𝐺𝑂𝑥) Equação 28 𝐹𝐴𝐷𝐻 2 (𝐺𝑂𝑥) + 𝑂 2 → 𝐹𝐴𝐷(𝐺𝑂𝑥) + 𝐻 2 𝑂 2 Equação 29
Em contraste, a GDH é uma enzima de menor massa molecular (30 kDa) e capaz de oxidar a glicose na presença de cofatores como dinucleótido de nicotinamida e adenina, pirroloquinolina quinona (PPQ) e dinucleótido de flavina e adenina. A GDH é especialmente atraente para aplicações in vivo porque na reação catalítica não há a geração de subprodutos (Equação 30) e principalmente devido a catálise não ser sensível ao O2 158,159 . 𝐹𝐴𝐷(𝐺𝐷𝐻) + 2 𝑔𝑙𝑖𝑐𝑜𝑠𝑒 → 2 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑛𝑜𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑛𝑎 + 𝐹𝐴𝐷𝐻 2 (𝐺𝐷𝐻) Equação 30

Eletrodos em EFCs

Não menos importante que os componentes anteriores, os eletrodos utilizados em EFCs devem possuir características a otimizar a transferência de elétrons. Ao contrário das FCs que normalmente utilizam plataformas metálicas planares ou com pequenas rugosidades como catalisadores, os catalisadores em EFCs são enzimas que possuem estruturas mais volumosas e complexas e, por isso, exigem eletrodos com maior razão área/volume 7,153 . O principal caminho para superar esse problema é por meio da utilização de nanomateriais como eletrodos. Os nanomateriais possuem uma alta área específica, o que permite uma série de vantagens em relação a eletrodos convencionais 160 . A Figura 34 ilustra claramente algumas vantagens em utilizar eletrodos com maiores áreas superficiais. Figura 34. Imagem ilustrativa de algumas vantagens da utilização de nanomateriais ou materiais porosos como eletrodos em EFCs. Imagem extraída na íntegra de Mazurenko, I., Curr. Opin. Electrochem. 2017, 5, 74 160 .

A primeira e evidente vantagem em utilizar nanomateriais é a possibilidade de biofuncionalização de uma maior quantidade de catalisadores por área, ou seja, promover uma maximização da produção de corrente catalítica por área. Outra principal vantagem na utilização de nanomateriais é a possibilidade de promoverem a transferência eletrônica diretamente sem a necessidade de mediadores redox devido a diminuição das distâncias entre as enzimas frente a superfície do condutor. As rugosidades e porosidades também agem protegendo as enzimas garantindo uma maior vida ativa, entre outras vantagens. No entanto, o tamanho do poro é inversamente proporcional a área, e tem relação direta com o desempenho da EFC 161,162 . Uma estratégia interessante reportada foi a construção de eletrodos com diferentes tamanhos de poros para a criação de microambientes. Hiroto et al. 163 construíram em carbono dois tamanhos de poros distintos, macroporos de 150 nm para a difusão dos substratos, mais especificamente O2, e mesoporos de 40 nm por onde foram biofuncionalizadas as enzimas bilirrubina oxidase. Os autores reportaram alcançar uma corrente catalítica catódica de 15 mA cm -2 . Em um estudo de distribuição entenderam que o rendimento é melhor alcançado quando 33% dos poros são macroporos e 67% mesoporos 163 .

Os principais materiais utilizados como eletrodos nanoestruturados são ouro e carbono. O ouro geralmente utilizado na forma de nanoestruturas como nanopartículas, nanobastões, entre outros 164,165,166 . O ouro é atrativo devido a estabilidade química, relativa facilidade de obtenção de nanoestruturas e também por formar ligações químicas com grupos tióis, que permitem o desenvolvimento de uma infinidade de estratégias de biofuncionalização, bem como permite a aplicação com mecanismos de mediação eletrônica direta e indireta. Siepenkoetter et al. 150 verificaram que ao construir poros de 100 nm (fator de rugosidade: 9) sobre um eletrodo de ouro, o qual foi eletromodificado com um complexo polimérico condutor para biofuncionalização das enzimas bilirrubina oxidase e glicose desidrogenase, foi possível observar que a densidade de potência da EFC aumentou de 0,08 µW cm -2 em um eletrodo de ouro planar para 1,3 µW cm -2 no eletrodo poroso 150 .

Os eletrodos de carbono são atraentes devido ao baixo custo, alta disponibilidade na natureza, relativa estabilidade, possui estruturas flexíveis, são versáteis a modificações, são ótimos condutores e possuem áreas eletroativas superiores a 1000 m² g -1 . Os materiais de carbono nanoestruturados ou porosos utilizados são reportados nas formas de buckypaper (BP) 167,168 , nanotubos de carbono (CNTs) 169,170 , nanofibras de carbono (CNFs) 171 e grafeno 172,[START_REF] Objetivos | [END_REF] . Em um trabalho pioneiro, Chen et al. 174 demostraram uma EFC de glicose (GOx)/O2 (lacase) sob duas fibras de carbono, 7 µm de diâmetro e 2 cm de comprimento, que apresentou potência de 137 µW cm -2 174 . Em MWCNTs como eletrodos, Kwon et al. 175 reportaram a confecção de uma EFC de glicose (GOx)/ O2 (Lacase) e obtiveram potência de 1,3 m W cm -2 175 . A evolução dos eletrodos é evidente e o desenvolvimento de novas estruturas segue como uma das vertentes mais promissoras em EFCs. Diante de todos esses conceitos abordados, o desenvolvimento em EFCs possui uma variedade de caminhos a serem explorados, sejam no aperfeiçoamento de obtenção energética dos combustíveis, na organização estrutural das enzimas de modo a maximizar a quantidade de catalisadores por área, nos mecanismos de transferência eletrônica mediado e direto, na estrutura dos eletrodos como novos nanomateriais, entre muitos outros. Neste trabalho, o desenvolvimento foi realizado em alinhamento ao grupo de pesquisa liderado pelo pesquisador Dr. Serge Cosnier que, com o objetivo de aplicações in vivo dos dispositivos ECFs desenvolvidos pelo grupo, associado ao knowhow na manipulação de eletrodos de MWCNTs e buckypaper, bem como a necessidade de resolver demandas associadas a eficiência de transferência eletrônica entre catalisador e eletrodo, foi proposto o desenvolvimento de um novo mediador redox a ser sintetizado in situ de maneira a obter melhores conexões elétricas entre o mediador redox e o eletrodo.

OBJETIVOS

Objetivo Geral:

Eletrossintetizar in situ mediadores redox com eficiente cinética de transferência eletrônica sobre a superfície de eletrodos de MWCNTs para a aplicação em bioânodos oxidantes de glicose catalisados pela enzima dinucleótido de flavina adenina-dependente glicose desidrogenase em biocélulas a combustível enzimáticas.

Objetivos Específicos:

▪ Propor uma condição de eletrossintese de mediadores redox a partir de moléculas préselecionadas; ou Ag/AgCl (KCl saturado) como eletrodo de referência (RE), um filamento de platina como contra eletrodo (CE), e os eletrodos recobertos com MWCNTs anteriormente citados como eletrodos de trabalho (WE). Pela técnica de voltametria cíclica (CV), varreduras sequenciais de 1 a 100 mV s -1 entre os potenciais -0,5 a 1,0 V vs. SCE-Ag/AgCl foram realizadas em uma solução aquosa de Fe(CN)6 -3/-4

▪

MATERIAIS E MÉTODOS

(5 mmol L -1 ) e KCl (0,5 mol L -1 ) em um potenciostato (Autolab, PGSTAT 100). A área eletroativa foi então estimada a partir dos picos máximos de corrente catódica e anódica (Ipc e Ipa) em função da velocidade de varredura (scan rate) aplicados à equação de Randles-Sevcik 176 .

As espessuras de filmes de MWCNTs sobre os eletrodos foram determinadas após a realização de uma ranhura sobre a superfície dos eletrodos de MWCNTs alcançando a superfície dos eletrodos de GC. Foi utilizado um microscópio a laser 3D (Keyence -VK-X200) para o mapeamento das superfícies ao gerar imagens 3D, que foram devidamente processadas.

Eletrossintese de Mediadores Redox sobre MWCNTs

Foram previamente selecionadas seis moléculas aromáticas (Tabela 6) como precursores com potenciais para aplicação como mediadores redox em bioânodo sobre eletrodos de MWCNTs em EFCs.

Os precursores foram solubilizados em diclorometano em concentrações de 10 mmol L -1 . Foram depositados, via dropcasting, diferentes volumes (0,1 a 60 µL) dos precursores sobre a superfície dos eletrodos de MWCNTs (35,5 µg cm -2 ). Após isso, foi realizada uma secagem do solvente por 30 min a condição ambiente. As eletrossinteses dos precursores foram realizadas por voltametria cíclica em janelas de potenciais específicas a cada precursor, as quais variaram entre -1,0 a 1,2 V vs. SCE, sob velocidade de varredura 100 mV s -1 em tampões fosfato de pH 2,0, 7,0 e 12,0. A configuração eletroquímica utilizada foi a mesma descrita anteriormente para determinação da área eletroativa dos eletrodos. 

Varredura e pH

A reversibilidade do sistema redox de cada produto eletrossintetizado foi verificada submetendo as moléculas na matriz de MWCNTs a diferentes pH, bem como diferentes cenários de velocidades de varredura. Voltametrias cíclicas foram realizadas a 20 mV s -1 em tampão fosfato de pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, em janelas de potenciais que variaram de acordo com o potencial redox observado a cada produto.

Em pH 7,0, o mesmo sistema redox foi submetido a diferentes velocidades de varredura, 2 a 100 mV - 1 , em janelas de potencias compatíveis com os potenciais redox reversíveis dos produtos.

Estabilidade Eletroquímica dos Mediadores Redox sobre MWCNTs

A estabilidade dos produtos de eletrossintese sobre a superfície do eletrodo de MWCNTs foi analisada em pH 7,0 sob velocidade de varredura 20 mV s -1 . As moléculas foram submetidas a 100 ciclos consecutivos em janela de potencial específica a cada produto abrangendo os potenciais redox, acompanhando a perda da capacidade de reversibilidade dos sistemas redox.

Caracterização Estrutural dos Mediadores Eletrossintetizados

Os produtos de eletrossintese que apresentaram capacidade de realizar a transferência eletrônica de maneira eficiente entre o eletrodo de MWCNTs e o catalisador foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio. Os produtos de eletrossintese de um total de dez eletrodos juntamente com o MWCNTs foram coletados e solubilizado em CDCl3. A mistura foi centrifugada à 12000 rpm por 30 min a 25 ºC e o sobrenadante ausente de MWCNTs, decantado ao fundo do frasco, foi submetido a análise de RMN de 1 H (Bruker Avance III 400 MHz). Figura 36. Voltamograma da sonda eletroquímica Fe(CN)6 3-/4-sob velocidades de varredura 1 a 100 mV s -1 para A) eletrodo de carbono vítreo comercial e B) 20 µL da suspensão de MWCNTs a 5,0 mg mL -1 . Espessura dos eletrodos de MWCNTs obtidas a partir da imagem 3D.

Eletrossintese dos Mediadores Redox

Os precursores a mediadores redox (Tabela 6) selecionados foram definidos com base nas fortes interações π-stacking entre o MWCNTs e os anéis aromáticos dos precursores 153,177 Com uma maior disponibilidade de mediadores redox para a transferência de elétrons, é esperado que a corrente catalítica também seja maior. A Figura 39 mostra as correntes catalíticas dos eletrodos de MWCNTs com os produtos de eletrossintese do pireno em pH 2,0, 7,0 e 12,0. Nota-se que há uma relação direta da quantidade de MRs eletrossintetizados com a corrente catalítica, onde em pH 2,0 foi observado uma densidade de corrente de 8,51 mA cm -2 frente aos produtos de eletrossintese em pH 7,0 e 12,0, respectivamente 6,45 e 2,05 mA cm -2 .

-0. Por fim, a construção do bioânodo pode ser representada pela Figura 52, onde todas as reações envolvidas são resumidas a partir da oxidação de duas glicoses (combustível) em dois glucono lactona pela transferência de dois elétrons a enzima FAD-GDH (catalisador) por meio da reação de redução do FAD a FADH2, que por sua vez realiza a transferência dos mesmos dois elétrons ao par mediador redox 1,6-pirenodiona e 1,8-pirenodiona, que são reduzidos a 1,6-dihidroxi-pireno e 1,8dihidroxi-pireno, respectivamente; e então os elétrons são finalmente capturados pelo eletrodo de MWCNTs gerando corrente elétrica 152 . Figura 52. Esquema representativo da série de reações que compõe o bioânodo a biocatálise da glicose a partir da enzima FAD-GDH com mediadores redox 1,6-pirenodiona e 1,8-pirenodiona.

CONCLUSÕES

PARTE I: O sistema microfluídico gerador de gradiente de concentração biomolecular proposto inicialmente foi alcançado utilizando o modelo matemático de analogia de sistemas de diluição em série a circuitos elétricos, por onde foi possível construir um perfil não linear de gradiente de concentração com coeficientes de concentração 0; 0,16; 0,50; 0,83, e 1,00, que são ajustados em uma curva sigmoidal logística descrita pelos parâmetros matemáticos k e x0. O dispositivo final δ-2x5-Y confeccionado em PDMS apresentou capacidade de gerar um gradiente definido e reprodutível para moléculas de soluto simples como fluoresceína e azul de metileno, bem como para a proteína BSA. As caracterizações envolveram a utilização de técnicas paralelas como espectroscopia de fluorescência e de UV-Vis. Os dados experimentais do dispositivo δ-2x5-Y foram utilizados para atribuição estatística de reprodutibilidade com intervalo de confiança de 95% e também validados por simulação computacional pelo software COMSOL Multiphysics®. O dispositivo δ-2x5-Y foi acoplado a uma plataforma de biossensoriamento SPR baseado em arranjos de nanoburacos confeccionadas em um substrato de ouro estrategicamente a serem excitadas a partir de comprimentos de onda em 638 nm.

A plataforma foi caracterizada por imagens de microscopia eletrônica de varredura apresentando nanoburacos circulares de diâmetros de 196,7 ± 9,0 nm e periodicidade de 401,3 ± 4,7 nm. A transmissão óptica extraordinária decorrente dos plasmons de superfície nos arranjos de nanoburacos foram verificadas por UV-Vis e a sensibilidade dos arranjos a variações de índice de refração foi de 358,7 nm RIU -1 . A bioquantificação de uma amostra de BSA pseudodesconhecida (160 ug mL -1) foi realizada ao associar a modelagem matemática realizada para o dispositivo δ-2x5-Y com os dados de aquisição de imagem dos biossensor SPR. Por fim, o sistema foi capaz de quantificar a amostra de BSA pseudodesconhecida a 138 ug mL -1 , que foi validado paralelamente espectroscopia de fluorescência com 154,8 ± 16,6 ug mL -1 . PARTE II: O desenvolvimento de mediadores redox para bioânodos em biocélulas a combustível enzimática foi realizado baseado na proposta de eletrossintese in situ sobre eletrodos de MWCNTs de precursores com potenciais aplicações em mediar a transferência eletrônica entre o catalisador enzimático e o eletrodo. Os eletrodos de MWCNTs com 17,7; 35,5 e 70,9 µg cm -2 foram caracterizados morfologicamente por imagens eletrônicas 3D. Os precursores naftaleno, antraceno, fenantreno, pireno, perileno e coroneno, foram eletrossintetizados sobre MWCNTs em meio aquoso por voltametria cíclica para formar os mediadores redox. Com destaque para os mediadores redox originados do pireno que como em um bioânodo enzimático, para catálise da glicose a partir da enzima FAD-GDH, o sistema apresentou densidade de corrente catalítica de 8,51 mA cm -2 , superior ao mediador redox 1,4-naftoquinona normalmente utilizado em sistemas similares, que foi capaz de gerar uma densidade de corrente catalítica de 3,30 mA cm -2 . Apoiado em estudos eletroquímicos sob diferentes pH e velocidades de varreduras, bem como por RMN 1 H, os produtos foram caracterizados e atribuídos a formação das espécies 1,6 e 1,8-pirenodiona. Em complemento foi sugerido o mecanismo de eletrossintese dos produtos em meio aquoso. Por fim, o bioânodo apresentou capacidade máxima de catálise a 100 mmol L -1 e uma perda de estabilidade de 76,4% após 100 ciclos consecutivos.

Figura 1 . 7 Figura 2 . 8 Figura 3 . 9 Figura 4 . 11 Figura 5 . 13 Figura 6 . 15 Figura 7 . 16 Figura 8 .

 1728394115136157168 Figura 1. Esquema ilustrativo de analogia entre circuitos elétricos e sistemas microfluídicos. Imagem adaptada de Kwang W. Oh, Lab Chip, 2012, 12, 515 32 . A) Escoamento Hagen-Poiseuille. B) Resistência hidráulica em correspondência a um resistor elétrico. C) Parâmetros hidráulicos de um canal. D) Malha fluídica com seus respectivos indicadores. E) Resistor elétrico. F) Resistência elétrica. G) Parâmetros elétricos de um resistor e H) Resultante dos parâmetros da malha fluídica. ................. 7 Figura 2. Esquema genérico de divisão e mistura em sistemas microfluídicos geradores de gradientes de concentração. ..................................................................................................................................... 8 Figura 3. Circuito elétrico equivalente para geração de um gradiente de concentração A) 2-fold log e B) linear, e os seus respectivos arranjos convertidos para sistemas microfluídicos C) 2-fold log e D) linear. Imagem extraída na íntegra de Zheng, G, Anal. Chem. 2018, 90, 13280 3 . ................................ 9 Figura 4. Dispositivo gerador de gradiente de concentração ''christmas tree'' e perfil do gradiente final formado para o soluto FITC. Imagem extraída na integra de Li Jeon, N, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 826 -830. ..................................................................................................................................................... 11 Figura 5. Representação dos fenômenos envolvidos na geração dos SPs. A) Interface metal/dielétrico por onde é representado a formação e a evanescência dos SPs. B) Extensão de propagação dos SPs no metal e no dielétrico bem como no eixo z perpendicular à superfície. C) Diferença entre os números de onda dos SPs em relação ao número de onda da radiação incidente. ........................................... 13 Figura 6. Setup experimental para geração de SPR propostos por A) Kretschmann e B) Otto. ......... 15 Figura 7. A) Esquema representativo do mecanismo de transmissão da luz extraordinária (EOT) de um orifício em um substrato metálico. B) Espectro de transmissão representativo de um único orifício em um substrato metálico. .......................................................................................................................... 16 Figura 8. A) Esquema ilustrativo do fenômeno de Plasmon de Superfície em arranjos de nanoburacos. B) Representação da propagação do campo elétrico no eixo z. .......................................................... 17

Figura 9 . 18 Figura 10 .Figura 11 . 22 Figura 12 . 22 Figura 13 . 23 Figura 14 . 26 Figura 15 . 27 Figura 16 . 27 Figura 17 . 28 Figura 18 . 29 Figura 19 . 30 Figura 20 . 31 Figura 21 . 31 Figura 22 . 32 Figura 23 . 33 Figura 24 . 34 Figura 25 . 35 Figura 26 . 36 Figura 27 . 37 Figura 28 . 39 Figura 29 . 40 Figura 30 . 45 Figura 31 . 46 Figura 32 . 48 Figura 33 . 50 Figura 34 . 52 Figura 35 . 57 Figura 36 . 58 Figura 37 . 59 Figura 38 . 60 Figura 39 . 61 Figura 40 . 62 Figura 41 . 64 Figura 42 . 65 Figura 43 . 67 Figura 44 . 68 Figura 45 . 70 Figura 46 . 71 Figura 47 . 71 Figura 48 . 72 Figura 49 . 73 Figura 50 . 73 Figura 51 . 74 Figura 52 .

 918101122122213231426152716271728182919302031213122322333243425352636273728392940304531463248335034523557365837593860396140624164426543674468457046714771487249735073517452 Figura 9. A) Esquema representativo do biossensor SPR baseado em arranjo de nanoburacos B) Etapa de captura do vírus por parte do anticorpo. C) Espectro de transmissão da EOT na ausência do anticorpo 8G5-VSV. D) Espectro de transmissão da EOT de detecção do VSV na presença do anticorpo 8G5-VSV. Imagem extraída na integra de Yanik, A. A. Nano Lett. 2010, 10, 4962 102 . ....................... 18 Figura 10. Esquema ilustrativo do processo de fabricação de um dispositivo microfluídico genérico em PDMS. ................................................................................................................................................... 20 Figura 11. Ilustração representativa do substrato plasmônico com os respectivos dezoito arranjos de nanoburacos, bem como apresentação de seus respectivas identificações e dimensões. ................. 22 Figura 12. Esquema representativo do setup experimental utilizado para a caracterização da EOT de cada arranjo. .......................................................................................................................................... 22 Figura 13. Esquema ilustrativo do setup experimental utilizado para a realização do bioensaio de quantificação da BSA pelo método de aquisição de imagens. ............................................................. 23 Figura 14. Esquema ilustrativo do perfil do gerador de gradiente de concentração para o dispositivo δ-2x5-Y. .................................................................................................................................................... 26 Figura 15. Perfil de uma curva sigmoidal logística observada ao estimar pelo método matemático os coeficientes de concentração em função do número de canais de saída. ........................................... 27

  𝛻 2 𝐶 𝐴 -(𝑣 𝛻)𝐶 𝐴 Equação 6

  microfluídicos são linhas de canais com paredes imóveis que orientam o fluxo do fluido. Sob a ótica dessa observação Jean Louis Poiseuille e Gotthilf Hagen, paralelamente estabeleceram o entendimento a seguir. Considere um cilindro como canal de escoamento na presença de um fluxo laminar (𝑅 𝑒 < 20). Após estabelecido o equilíbrio do escoamento o sistema pode ser considerado estável por não haver aceleração do escoamento e então a equação de Navier-Stokes é resumida a 𝛻𝑝 = 𝜇𝛻²𝑣. Se aplicadas condições de contorno onde 𝑣 = 0 e relacionado o gerador de pressão 𝛻𝑝 a secção do canal cilíndrico (πr²), a equação assume 𝑄 = microfluídicos geralmente L/r >> 1 e L/r >> Re, sendo L o comprimento do canal; então pode-se fazer aaproximaçãofim, ser representada por meio da Equação 729,[START_REF] Pfitzner | Poiseuille and his law[END_REF][START_REF] Hagen | Ueber die Bewegung des Wassers irr engcn cylindrisciwn Bdhren[END_REF] . Note que o fluido Poiseuille considera que a injeção deve advir de um ∆p, ou seja, uma força externa deve ser responsável pela geração da taxa de injeção ou fluxo Q.

12 Figura 1 .

 121 Figura 1. Esquema ilustrativo de analogia entre circuitos elétricos e sistemas microfluídicos. Imagem adaptada de Kwang W. Oh, Lab Chip, 2012, 12, 515 32 . A) Escoamento Hagen-Poiseuille. B) Resistência hidráulica em correspondência a um resistor elétrico. C) Parâmetros hidráulicos de um canal. D) Malha fluídica com seus respectivos indicadores. E) Resistor elétrico. F) Resistência elétrica. G) Parâmetros elétricos de um resistor e H) Resultante dos parâmetros da malha fluídica.

Figura 3 .

 3 Figura 3. Circuito elétrico equivalente para geração de um gradiente de concentração A) 2-fold log e B) linear, e os seus respectivos arranjos convertidos para sistemas microfluídicos C) 2-fold log e D) linear. Imagem extraída na íntegra de Zheng, G, Anal. Chem. 2018, 90, 13280 3 .

  apresentaram a formação de um sistema com 3 etapas de diluição em série (2 inlets e 5 outputs). A Figura 4 mostra a configuração do sistema (20 x 50 mm), bem como a caracterização do gradiente de concentração observado em uma imagem de fluorescência do soluto polissacarídeo ligado a fluoresceína (FITC, fluoresceínaisotiocianatodextran, 8 kDa, D = 8,0 E -11 m² s -1 ). Os canais foram confeccionados com 50 x 50 µm de largura e altura, e comprimento L de serpentina não informado; o splitter e combiner são em formato T. Nota-se que a intensidade normalizada apresenta um perfil linear pela secção transversal do canal (350 µm) por onde fluxos se unem. No entanto, não são demonstradas caracterizações sobre a completa mistura do soluto antes da câmara onde os fluidos se encontram, em adição, nenhum tipo de caracterização quanto a linearidade também foi proposta.

Figura 4 .

 4 Figura 4. Dispositivo gerador de gradiente de concentração ''christmas tree'' e perfil do gradiente final formado para o soluto FITC. Imagem extraída na integra de Li Jeon, N, Nat. Biotechnol. 2002, 20, 826 -830.

Figura 5 .

 5 Figura 5. Representação dos fenômenos envolvidos na geração dos SPs. A) Interface metal/dielétrico por onde é representado a formação e a evanescência dos SPs. B) Extensão de propagação dos SPs no metal e no dielétrico bem como no eixo z perpendicular à superfície. C) Diferença entre os números de onda dos SPs em relação ao número de onda da radiação incidente.

  e outro por Kretschmann[START_REF] Kretschmann | Reflection and Transmission of Light By a Rough Surface, Including Results for Surface-Plasmon Effects[END_REF] consistem nas configurações mais utilizadas para o estudo do acoplamento da radiação eletromagnética em SPR, sendo a configuração de Kretschmann a mais empregada nos equipamentos comerciais de sensoriamento. Ambas as configurações se utilizam de um prisma para alcançar o incremento Δkx a partir da incidência de uma frequência sob ângulo ϴ perfeito para que o número de onda K0 se iguale ao número de onda Ksp necessário para a excitação dos SPs. No entanto, a configuração de Otto apresenta uma vacância entre o prisma e o metal, o que soma uma dificuldade experimental na montagem do sistema.A mudança do RI causada pela formação de ligações químicas na interface metal/dielétrico, por exemplo, proporciona uma variação da permissividade elétrica do dielétrico εd. Como consequência, uma variação do ângulo ϴ de incidência é observado. Por esse mecanismo, denominado de reflexão interna total atenuada, são monitorados os eventos na superfície do metal condutor[START_REF] Homola | Em Optical Biosensors: Today and Tomorrow (2 nd Edition)[END_REF] . A Figura 6 ilustra a configuração dos dispositivos desenvolvidos por Kretschmann e Otto, respectivamente.

Figura 6 .

 6 Figura 6. Setup experimental para geração de SPR propostos por A) Kretschmann e B) Otto.

Figura 8 .Figura 9 .

 89 Figura 8. A) Esquema ilustrativo do fenômeno de Plasmon de Superfície em arranjos de nanoburacos. B) Representação da propagação do campo elétrico no eixo z.2.8.Biossensores SPR Baseados Arranjos de Nanoburacos

4. 1 .

 1 Confecção dos Dispositivos Microfluídicos em PDMSOs dispositivos microfluídicos foram confeccionados por meio da técnica soft-lithography, ou litografia macia. Substratos de vidro (dimensões adequadas a cada configuração de dispositivo) foram limpos em solução piranha (3:1; H2SO4 e H2O2) e recobertos com fotorresiste (SU-100, Microchem ® ) utilizando um spin coating (Spincoating Systems, G3P-8), programado para rotacionar a 500 rpm por 5 s e acelerar por 8 s até 2000 rpm e, permanecer com essa rotação constante por mais 25 s. Os substratos foram então aquecidos sequentemente por 6 minutos a 65 °C e por 25 minutos a 95 °C. As fotomáscaras (fotolitos) com as configurações dos dispositivos foram confeccionadas no software AutoCAD ® e impressas em politereftalato de etileno (PET), após, foram ajustadas sobre o substrato com o fotorresiste. Uma fotocolimadora ultravioleta (Tamarack Scientific, 2110CP) foi utilizada para fotografar os substratos com a fotomáscara durante 18,5 s a uma potência de 1000 W, demarcando as regiões por onde houvera transmissão da radiação no fotolito. Os substratos foram então revelados com o fotorrevelador SU-8 ® (solução a base de lactato de etila) para extração do fotorresiste não fotopolimerizado. Os dispositivos microfluídicos foram enfim confeccionados com uma mistura de polidimetilsiloxano (PDMS, Sylgard 184 ® ) e o agente de cura na proporção de 10:1. As misturas foram desareadas por 30 min sob vácuo, despejadas sobre o molde positivo e curados sob aquecimento a 95 °C por 2 h. A Figura 10 ilustra o processo de confecção dos dispositivos em PDMS.

Figura 11 .Figura 12 .Figura 13 .

 111213 Figura 11. Ilustração representativa do substrato plasmônico com os respectivos dezoito arranjos de nanoburacos, bem como apresentação de seus respectivas identificações e dimensões. A caracterização óptica dos modos SPs dos arranjos nanoestruturados foi realizado conforme esquema ilustrado na Figura 12. Um feixe de luz branca (lâmpada de halogênio, 250 W) foi colimado por meio de um espelho côncavo e uma lente objetiva (50 x) de maneira a atingir individualmente um arranjo de nanoburacos por vez. O substrato foi posicionado em uma mesa xyz e exposto a meio dielétrico de índice de refração 1,3327 (água milli-Q, 25 °C). A radiação transmitida (EOT) por cada arranjo foi coletada por uma fibra óptica conectada a um espectrofotômetro UV-Vis (Ocean Optics, USB2000) que, por sua vez, realizou o processamento dos espectros de transmissão no software Ocean Optics. Um dos arranjos foi exposto a diferentes soluções de D-(+)-glucose com índices de refração que variaram entre 1,3361 a 1,4035. Os índices de refração foram determinados com auxílio do refratômetro digital portátil (Atago, 3850 PAL-RI). Os espectros de transmissão foram registrados e a sensibilidade (nm RIU -1 ) foi determinada ao correlacionar o deslocamento da banda EOT vs. índice de refração.

  Figura 14) pode ser melhor percebido aplicando as condições de contorno utilizadas neste trabalho. Quando injetado QA = QB, ou seja, ΔPA = ΔPB, a razão entre Q1 e Q2 e também entre Q3 e Q4 é governada pelas respectivas resistências hidráulicas que cada fração venha a sofrer. Logo, Q1 = Q4 porque ambos estão expostos a mesma resistência hidráulica 𝑅𝐻α = 𝑅𝐻γ enquanto Q2 = Q3, pois estão expostos a mesma resistência hidráulica 𝑅𝐻β. Se assumido as dimensões adotadas neste trabalho w = 150 µm, h = 100 µm e L = 50000 µm, ou seja, uma configuração de diluição em série simétrica (Figura 14, dispositivo δ-2x5-Y), as resistências hidráulicas serão 𝑅𝐻α = 𝑅𝐻γ = 6,80E +11 Pa s m -3 e 𝑅𝐻β = 2,60E +12 Pa s m -3 de acordo com a Equação 12. Como consequência 𝑅𝐻α = 𝑅𝐻γ são ≈ 3,8 vezes menores que 𝑅𝐻β, que por sua vez apresenta maior resistência hidráulica por possuir apenas w/2 (75 µm) para acomodação das frações Q2 e Q3. Se aplicado esse mesmo raciocínio para 3 etapas de diluição em série (2 inlets e 5 outputs) os coeficientes de concentração esperados seria 0; 0,16; 0,50; 0,83, e 1,00. Nota-se que, por essa abordagem as resistências hidráulicas periféricas serão sempre menores que as resistências hidráulicas internas. Essa desproporção é um fator relevante na formação do perfil do gradiente de concentração final.

Figura 14 .

 14 Figura 14. Esquema ilustrativo do perfil do gerador de gradiente de concentração para o dispositivo δ-2x5-Y.

(

  configurações) em T e Y. Para cada design foram preparados dispositivos com 1, 2 e 3 etapas de diluição em série. A Figura 16 apresenta os sistemas confeccionados com w = 150 µm, h = 100 µm e L = 25000 µm.

Figura 16 .

 16 Figura 16. Configuração dos dispositivos de diluição em série com 1, 2 e 3 etapas de diluição em série com câmara de mistura (splitter + combiner) em design T e Y.

Figura 17 .

 17 Figura 17. Curvas do gradiente de concentração observados para os dispositivos A) 2x3 com câmara de mistura em T e Y; B) 2x4 com câmara de mistura em T e Y e C) 2x5 com câmara de mistura em T e Y.

  entanto, para uma eficiente mistura em design T é necessário que os fluidos alcancem o segmento combiner com ΔP2 = ΔP3 para que o equilíbrio entre Q2 e Q3 não causem uma disfunção no caminho a ser seguido pelo fluxo. Essa observação pode ser melhor visualizada na Figura 18, nas quais imagens de microscópio de fluorescência dos dispositivos 2x5 com design T e Y foram registradas quando injetado solução aquosa de fluoresceína (10 -3 mol L -1 ; 333,3 g mol -1 , D = 5,0 E -10 m² s -1 ) e água mili-Q a QA = QB = 1,000 mL h -1 . É possível perceber que há uma disfunção na imagem do design em T (destacado na imagem da Figura 18A). O fluxo de água invade o ''espaço'' da solução de fluoresceína, desregulando o processo de mistura. Essa disfunção provavelmente acontece por irregularidades e/ou imperfeições ao longo dos canais, processo de selagem irregular, entre outros. Todos esses fatores associados são potencializados pela configuração do design em T que dificulta uma continuidade do fluxo, o que não é observado no design em Y, em que a configuração favorece uma continuidade do fluxo. Para evitar possíveis problemas nos gradientes resultantes e um afastamento dos coeficientes de concentração observados pelo método matemático, os dispositivos com designs em T foram descartados para posteriores estudos.

Figura 18 .

 18 Figura 18. Imagens de fluorescência obtidas em um microscópio de fluorescência dos dispositivos 2x5-T e Y quando injetado fluoresceína 10 -3 mol L -1 a QA = QB = 1,000 mL h -1 . Outro fator não considerado no método matemático é o comprimento necessário para que dois fluidos em processo de mistura se homogeneízem por completo. Primeiramente se faz necessário caracterizar qual o fenômeno de transporte envolvido no processo de mistura. A partir das dimensões dos canais (w = 150 µm e h = 100 µm), bem como QA = QB = 1,000 mL h -1 foi determinado o número de Reynolds Re = 2,21, índice característico de escoamento laminar. Enquanto que o número de Peclet para os solutos fluoresceína, azul de metileno e rosa de bengala foram respectivamente 4443,2; 2676,5 e 4628,3. Ambos os valores indicam que o processo de mistura é predominantemente convectivo, ou seja, há uma contribuição majoritária do transporte mássico convectivo das espécies frente ao transporte de difusivo. A mistura por convecção acontece de maneira mais rápida, o que exige comprimentos de misturas L menores aos necessários para processos de misturas puramente difusivos 1 .

Tabela 1 .

 1 Figura 19. A) Configuração do dispositivo gerador de gradiente de concentração 2x6, simétrico. B) Dispositivo gerador de concentração 2x6-QD, assimétrico. C) Imagem de microscopia de fluorescência obtida da secção em destaque quando injetado fluorescência 10 -3 mol L -1 a QA = QB = 1,000 mL h -1 .

Figura 21 .

 21 Figura 20. Coeficientes de concentração determinados pelo método matemático e experimental do dispositivo 2x6-QD.O dispositivo 2x6-QD mostrou-se suficiente para completa mistura dos solutos sobreditos.Contudo, a aplicação na plataforma plasmônica demanda um dispositivo capaz de gerar gradientes de concentração para biomoléculas que, no geral, mostram maiores massas molares e com menores coeficientes de difusão. O processo de mistura para espécies com coeficiente de difusão menores exige taxas de injeções volumétricas muito pequenas. Considerando os inconvenientes observados para o dispositivo 2x6-QD, optou-se pelo desenvolvimento de uma nova configuração em dois módulos: o primeiro composto pelo dispositivo gerador de gradiente de concentração a ser utilizado externamente a plataforma plasmônica biossensorial; e um segundo módulo para apenas direcionar os fluxos de saída do primeiro módulo sobre os conjuntos de arranjos de nanoburacos. Como os principais problemas relacionados ao dispositivo 2x6-QD foram a assimetria entre os comprimentos dos canais de mistura e as prováveis imperfeições decorrentes da fabricação do dispositivo em um espaço bastante limitado, foi proposto a confecção de um dispositivo simétrico e linear, buscando evitar complexidades na produção do dispositivo. A Figura 21 apresenta o dispositivo simétrico δ-2x5-Y (módulo 1) com 3 etapas de diluição em série com comprimento de serpentina L = 50000 µm. Foi decidido aumentar o comprimento da serpentina de 25000 µm para 50000 µm prevendo a incapacidade do comprimento de 25000 µm de realizar completa mistura de uma espécie biomolecular.

Figura 22 .

 22 Figura 22. A) Imagem do dispositivo δ-2x5-Y obtidas de um microscópio de fluorescência quando injetado fluoresceína (10 -3 mol L -1 ) a QA = QB = 1,000 mL h -1 . B) Perfil do gradiente de concentração gerado pelo dispositivo δ-2x5-Y a partir das intensidade luminosa da imagem A. C) Gradiente de concentração gerado pelo dispositivo δ-2x5-Y para o soluto rosa de bengala (10 µg mL -1 ) e D) azul de metileno (10 µg mL -1 ) a QA = QB = 1,000 mL h -1 .

Figura 24 .

 24 Figura 24A e na Tabela 2. A convergência assegura a reprodutibilidade do gradiente formado pelo

5. 4 .

 4 Caracterização da Plataforma Plasmônica Contendo Arranjos de Nanoburacos O transdutor óptico de SPR foi confeccionado e doado pelo Professor Dr. Alexandre G. Brolo do Departamento de Química da Universidade de Vitória no Canadá (University of Victoria, Victoria, British Columbia). Como recebido o substrato foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura (MEV, Shimadzu Superscan SSX-550). Os arranjos de nanoburacos confeccionados por FIB são observados na imagem de MEV (Figura 25A) que enquadra seis arranjos de nanoburacos que se encontram a uma distância ≈ 300 μm um do outro. Em uma segunda ampliação (Figura 25B) pode-se observar um arranjo com 60 x 60 nanoburacos que possuem 196,7 ± 9,0 nm de diâmetro e periodicidade de 401,3 ± 4,7 nm (Figura 25C).

(Figura 27 .

 27 Figura 27. A) Variação de intensidade de EOT normalizado frente a água ao passo da modificação química de funcionalização do biossensor. B) Esquema representativo do efeito de variação da intensidade de EOT dos eventos de funcionalização causando redshift de um modo SPs hipotético.A injeção da BSA em gradiente de concentração gerado pelo dispositivo δ-2x5-Y foi orientada de maneira que cada conjunto de arranjos de nanoburacos #1 a #5 foi exposto a uma concentração diferente, isto é, sob o conjunto #1 passou a concentração 0% e sob o conjunto #5 passou a concentração 100%, enquanto o conjunto #S foi reservado para a injeção da amostra de BSA pseudodesconhecida. A preparação da superfície do substrato de ouro com MUA/EDC-NHS foi realizada de maneira idêntica para todos os conjuntos de arranjos, incluindo o conjunto reservado para a amostra (#S). Sendo assim, pode-se representar a variação de intensidade de EOT após exposição da BSA em diferentes concentrações em função da modificação MUA/EDC-NHS. A Figura 28A expõe a diminuição de intensidade de EOT pelos arranjos #1 a #5 e #S após a exposição de BSA em gradiente de concentração (comparado os pontos em preto, referente à modificação MUA/EDC-NHS, com os pontos em vermelho, referente à modificação MUA/EDC-NHS/BSA). É possível notar um perfil de diminuição da intensidade de EOT sigmoidal como esperado ao considerar o gradiente de concentração gerado pelo dispositivo δ-2x5-Y. Contudo, a curva apresenta uma relação de variação em valores

  pelo método de aquisição de imagens para BSA Curva de Calibração por espectroscopia de fluorescência para BSA

  Quantificação de BSA a partir do biossensor SPR por aquisição de imagem. Quantificação da BSA recolhida após o ensaio de biodetecção.

Figura 30 .

 30 Figura 30. Configuração ilustrativa de uma biocélula a combustível enzimática (EFC).Como destacado na Figura 30 o arranjo de uma EFC pode ser representado de maneira genérica com seus componentes: I) Combustível, espécie química ou bioquímica com energia química em potencial a ser convertida em eletricidade. II) Enzima, biocatalisador responsável por realizar reações redox bioeletroquímicas com o combustível. III) Eletrodo, transdutor responsável pela condução dos elétrons envolvidos na reação de biocatálise6,7 . Os três componentes são melhor

Figura 31 . 2 . 3 . 1 .

 31231 Figura 31. Imagem de uma EFC não implantável desenvolvida para gerar corrente elétrica a partir do lactato presente suor. Imagem extraída na íntegra de Chen, X. et al, Adv. Funct. Mater. 2019, 29, 1. Introduzidas as principais características das EFCs, se faz necessário neste momento explorar mais detalhes dos componentes abordando conceitos que são importantes para o desenvolvimento das EFCs.

Figura 32 .

 32 Figura 32. A) Configuração de uma EFC glicose/O2. B) Reação proposta de catálise da glicose a forma CO2 no bioânodo. Imagem extraída na íntegra de Xu, S., ACS Catal. 2012, 2, 91. O mecanismo proposto foi separado em três etapas. Na primeira etapa é organizado a catálise sequencial da glicose e gluconato pelas enzimas glicose desidrogenase (GDH) e 2-gluconato desidrogenase (2-GDH), respectivamente. Ambas enzimas foram extraídas de Gluconobacter sp. e são dependentes do cofator redox pirroloquinolina quinona (PPQ). A segunda etapa é a clivagem do ácido glucorônico pela enzima aldolase (S. solfataricus) em duas moléculas, gliceraldeído e hidróxipiruvato.

4. 4 .Figura 35 . 5 . RESULTADOS E DISCUSSÕES 5 . 1 .

 435551 Figura 35. Resumo dos procedimentos experimentais referente a Parte II deste trabalho.

Figura 37 .

 37 Figura 37. Imagem eletrônica 3D dos eletrodos A) 17,7 µg cm -2 B) 35,5 µg cm -2 C) 70,9 µg cm -2 de MWCNTs. Espessura dos eletrodos de MWCNTs obtidas a partir da imagem 3D.

Figura 38 .

 38 Figura 38. Voltamogramas de eletrossintese do pireno sobre MWCNTs sob velocidade de varredura 100 mV s -1 em A) pH 2,0, B) pH 7,0 e C) pH 12,0.

Figura 40 .

 40 Figura 40. Voltamogramas de eletrossintese em pH 2,0 de potenciais MR a partir dos precursores A) Naftaleno, B) Antraceno, C) Fenantreno, D) Pireno, E) Perileno e F) Coroneno.

Figura 41 .Figura 42 .

 4142 Figura 41. Voltamograma sob variadas velocidades de varreduras em pH 7,0 dos produtos de eletrossintese dos precursores A) Naftaleno, B) Antraceno, C) Fenantreno, D) Pireno, E) Perileno e F) Coroneno. O rendimento da eletrossintese dos MRs do pireno mostrou-se uma dependência com o pH. Logo, é esperado que o produto da eletrossintese dos precursores seja sensível a variações de concentração do íon hidrônio. Os produtos de antraceno, fenantreno, pireno, perileno e coroneno foram submetidos a voltametrias cíclicas a 20 mV s -1 sob pH 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8. Os voltamogramas são mostrados na Figura 42. É possível observar que há o deslocamento dos Ea e Ec de todos os produtos para menores potenciais, sugerindo uma forte relação da reversibilidade do sistema redox dos produtos com a concentração de H + , como percebido na eletrossintese do MR a partir do pireno.

Figura 43 .Figura 44 .Figura 45 .Tabela 8 .Figura 46 .Figura 47 .

 43444584647 Figura 43. Voltamogramas de reversibilidade dos sistemas redox dos produtos de eletrossintese sobre MWCNTS para os precursores A) Naftaleno, B) Fenantreno, C) Pireno, D) Perileno e E) Coroneno.

Figura 48 .Figura 49 .Figura 50 .Figura 51 .

 48495051 Figura 48. Espectro de RMN1 H dos produtos de eletrossintese do pireno e as respectivas atribuições dos deslocamentos químicos dos hidrogênios dos compostos.A partir da identificação estrutural dos MRs, foi proposto um mecanismo de eletrossintese em meio aquoso. Mas primeiramente é importante observar o primeiro e segundo ciclo (Figura 49) do voltamograma de eletrossintese em pH 2,0 dos MRs do pireno. É possível notar que a varredura anódica do primeiro ciclo (preto) gerou uma corrente anódica em Ea ≈ 1,0 -1,2 V atribuída a oxidação do pireno a 1,6 e 1,8-pirenodiona; na sequência é observado uma corrente catódica em Ec ≈ 0,0 V atribuída a redução dos compostos 1,6 e 1,8-pirenodiona à 1,6 e 1,8-dihidroxi-pireno; no segundo ciclo (laranja) surge uma corrente anódica Ea ≈ 0,3 -0,4 V, atribuída a oxidação dos grupos hidroxi à cetonas, reestabelecendo os compostos 1,6 e 1,8-pirenodiona; por fim, novamente é observada uma corrente

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  7 

  Uma configuração 2-fold log exige que a cada combiner (Equação 17) seja abastecido por uma razão 1:1 da solução concentrada do soluto e do seu respectivo solvente. Após a determinação das razões, é necessário estimar as resistências hidráulicas RH para cada linha de escoamento (Equação 11), uma vez que Q ∝ RH. Os autores fizeram uso de um software EDA (automação de design eletrônico) para determinação dos comprimentos das linhas de canais L. A Figura 3 ilustra a planta eletrônica simulada e o sistema microfluídico convertido em dispositivo. Por fim, os autores demonstraram a efetiva formação dos gradientes monitorando a resistência das microalgas por imagens de microscopia de fluorescência a diferentes concentrações dos agentes tóxicos.

	desejado.
	desenvolveram um sistema gerador de gradiente de concentração linear (2
	inlets e 8 outputs; 0, 14,3, 28,6, 42,9, 57,2, 71,5, 85,8 e 100,0%) e 2-fold log (2 inlets e 5 outputs; 0,
	6,25, 12,5, 25,0, 50,0 e 100,0%) para entrega controlada de agentes tóxicos (cobre, benzeno,
	metilbenzeno, nitrobenzeno e clorobenzeno) às câmaras de cultura das microalgas Platymonas
	subcordiformis, Phaeodactylum tricornutum e Porphyridium cruentum. Inicialmente foram estimados os
	comprimentos L mínimos necessários para que cada soluto (agentes tóxicos) se homogeneizassem
	completamente com base nos seus respectivos coeficientes de difusão. A segunda etapa consistiu em
	determinar as razões de volumes necessárias para cada splitter, de maneira a gerar o gradiente

  32,[107][108][109] . A partir do software COMSOL Multiphysics

® 

, o dispositivo gerador de gradiente de concentração desenvolvido (δ-2x5-Y) foi simulado pelos modelos que descrevem a conservação de movimento do sistema em fluxo laminar pela equação de Navier-Stokes (Equação 4) e pelo modelo de Transport of diluted species regidos pelas equações de continuidade para conservação de massa (Equação 6) para sistemas incompressíveis, apresentando uma única fase e em estado estacionário

[START_REF] Bird | Phenomena Second Edition о Macroscopic Microscopic[END_REF] 

. A equação da Lei de Fick (Equação 18) foi utilizada para expressar o fluxo mássico, ou seja, a soma entre o transporte de massa convectivo e difusivo

[START_REF] Javaid | Analysis of passive mixing in a serpentine microchannel with sinusoidal side walls[END_REF] 

.

4.4. Nanofabricação e Caracterização da Plataforma Plasmônica Baseada em Arranjos de

Nanoburacos

Uma matriz de 3x6 arranjos quadrados de nanoburacos idênticos foi construída por feixe de íons focados (FIB, 235 feixe duplo) utilizando uma fonte de íons de gálio sob um substrato de ouro comercial com 100 nm de espessura. Os arranjos foram nomeados como #1, #2, #3, #4, #5 e #S (reservado para uma amostra do analito) dependendo da localização do arranjo na matriz. A potência do feixe foi ajustada em 30 keV com uma taxa de milling de 1,6 nm s -1 e corrente de 300 nA. Cada arranjo foi disposto a 300 μm entre si por onde cada arranjo possui uma configuração de 60 x 60 buracos circulares de diâmetros de 200 nm sob uma distância de 400 nm (periodicidade) entre os buracos. A Figura 11 ilustra a configuração dos arranjos de nanoburacos, bem como as identificações adotadas para cada conjunto de arranjo. O substrato foi caracterizado por imagens obtidas em um microscópio eletrônico de varredura, (MEV, Shimadzu Superscan SSX-550) e as dimensões dos arranjos (diâmetro e periodicidade dos buracos) foram determinadas com auxílio do software Image-Pro Plus ® .

  . Logo a EOT decorrente do confinamento dos modos SPs perde energia (red shift) sob aumento do índice de refração local 101 . A Figura 26B apresenta a sensibilidade S =

	Δλ/Δn = λ (εm/n (n² + εm) = 358,7 nm RIU -1 , R² = 0,9985, de um dos arranjos de nanoburacos quando
	variado o índice de refração. O red shift é um evidente sinal da capacidade dos arranjos de
	nanoburacos em identificar sutis mudanças na interface condutor/dielétrico, como por exemplo a
	montagem de mono ou policamadas de moléculas sobre a superfície dos nanoburacos 104 . A
	sensibilidade observada é sutilmente superior a observada pelo nosso grupo de pesquisa
	anteriormente (304,5 nm RIU -1 , R² = 0,9976) 104 em um substrato plasmônico de arranjos de
	nanoburacos idêntico ao utilizado nesse trabalho.					
	A)						B)					
	Normalizada Intensidade	0.2 0.4 0.6 0.8 1.0		Arranjo #1A Arranjo #2A Arranjo #3A Arranjo #4A Arranjo #5A 632 nm	Arranjo #1B Arranjo #2B Arranjo #3B Arranjo #4B Arranjo #5B	Arranjo #1C Arranjo #2C Arranjo #3C Arranjo #4C Arranjo #5C	Normalizada Intensidade	1.0 1.1 1.2 0.8 0.9	1.3327 1.3361 1.3431 1.3476 1.3576 1.4035	RI 632 nm	max. / nm	625 630 635 640 645 650 655	1.33 1.34 1.35 1.36 1.37 1.38 1.39 1.40 1.41 Índice de Refração S = 358.7 nm RIU -1 R² = 0.99845
		0.0		Arranjo #SA	Arranjo #SB	Arranjo #SC		0.7				
		600	620	640	660	680	700	600	620	640	660	680	700
				 / nm					 / nm	

  também política. Segundo o balanço anual BP Statistical Review of World Energy 2018, o consumo de energia primária no mundo aumentou 2,2% no ano de 2017, maior aumento desde 2013 117 . Diante deste cenário, a produção de energia por meios sustentáveis se torna ainda mais valoroso. Como temática deste trabalho, serão abordados apenas os conceitos relacionados a geração de energia por células a combustível e mais detalhadamente por biocélulas a combustível enzimáticas. O grande responsável por impulsionar o desenvolvimento de FCs, principalmente MFCs foi o programa espacial dos EUA. Os cientistas em corrida espacial nas décadas de 1950 e 1960, buscavam uma forma alternativa de produção de energia para abastecer seus equipamentos durante voos espaciais 126 . Contudo, houve pouco interesse nas BFCs até o desenvolvimento de moléculas mediadoras na transferência eletrônica entre os biocatalisadores e os eletrodos, que proporcionaram um aumento significativo nas correntes catalíticas das BFCs 126 . As MFCs se diferenciam estruturalmente das demais FCs por utilizarem como catalisadores microrganismos. Como consequência, as reações bioeletroquímicas são complexas e dependentes de muitos fatores, como pH, temperatura, organização estrutural e principalmente dos microrganismos utilizados. No geral, os microrganismos oxidam via catabolismo ‡ combustíveis orgânicos como carboidratos, por exemplo, e os elétrons são coletados pelo ânodo 126 . Alguns exemplos de microrganismos utilizados em MFCs são Shewanella oneidensis 127 , Rhodoferax ferrireducens 128,129 , Geobacter sulfurreducens 130 , Clostridium butyricum 130 , Pseudomonas aeruginosa 131 , Saccharomyces cerevisiae 132 e Streptococcus lactis 133 . Enquanto no cátodo geralmente são utilizados metais nobres como platina ou não nobre como paládio para redução do O2 em água 126 . Exemplos de MFCs com a composição do ânodo e cátodo e suas potências.

	A classificação mais frequentemente adotada para FCs se baseiam no tipo de eletrólito utilizado 118,122 . Alguns exemplos são: • Alcalinas FCs • Óxidos sólidos FC 2.2. Biocélulas a Combustível Microbial (MFCs) Tabela 4. Ânodo Densidade Cátodo de Potência
	• Ácido fosfórico FCs • Membrana de eletrodo poliméricos FC Eletrodo Combustível	Eletrodo	• Ácido fórmico FC • Cerâmicas FC Receptor de elétrons	W m -²
	• Carbonato fundido FC Fibra de Grafite 135 Glicose	• Outros. Pt (30%) recoberto de fibra de carbono Oxigênio	2,4
	As FCs alcalinas que empregam KOH 6,0 mol L -1 como eletrólito suportam temperaturas de até Fibra de Grafite 136 Águas Residuais c/ Carvão Ativado em Oxigênio 1,1 Malha de Aço Acetato 120 °C e são recomendadas para aplicações onde há a disponibilidade de hidrogênio em alto grau de Papel-Carbono 137 Glicose Fibra de Carbono Permanganato 0,1
	pureza para melhor desempenho; FCs que utilizam uma mistura de carbonato de lítio e potássio Placa de Grafite Glicose Placa de Grafite Hexacianoferrato 4,3 Granular 138 fundidos são atraentes para aplicações em elevadas temperaturas (≈ 600°C); FCs com ácido fosfórico (98%) são operáveis a temperaturas de até 200 °C e são recomendadas em aplicações onde não há Carbono Granulado 139 Acetato de sódio Carbono Granulado Oxigênio 50,9
	grandes perturbações físicas; entre outras composições de eletrólitos e características 118,122 .
	Característica			Biocélula a Combustível	Célula a Combustível
	Catalisador			Enzima -Microrganismos	Metais
	é estritamente relacionado com a composição dos eletrodos. Um exemplo clássico de uma célula a pH 7 -9 < 7
	combustível é a oxidação do H2 e da redução do O2 (Equações 26 e 27) onde é observado um ΔE 0 = Temperatura Temperatura Ambiente Intervalo Variado
	1,23 V que pode expresso em energia livre de Gibbs ΔG 0 = -(2) (96485 C mol -1 ) (1,23 V) = -237 kJ Eletrólito Tampão Ácido Fosfórico
	mol -1 . Em destaque, os produtos dessa reação são somente calor, eletricidade e água 121 . Potência Energética Baixa Alta
	â𝑛𝑜𝑑𝑜: Eficiência 𝑐á𝑡𝑜𝑑𝑜: Combustível	1 2	𝐻 2 → 2𝐻 + + 2𝑒 -> 50% 𝑂 2 + 2𝐻 + + 2𝑒 -→ 𝐻 2 𝑂 Carboidratos, Lactato, etc. 𝐸 â𝑛𝑜𝑑𝑜 0 = 0,00 𝑉 𝐸 𝑐á𝑡𝑜𝑑𝑜 = 1,23 𝑉 0	40 -60% Equação 26 Equação 27 Gás Natural, Hidrogênio, etc.

2.1. Células a Combustível (FCs) e Biocélulas a Combustível (BFCs)

Por definição, células a combustível (FC) são dispositivos capazes de converter diretamente energia química em energia elétrica

118 

. As células a combustível eletroquímicas são compostas por dois eletrodos separados por um eletrólito ou uma membrana 119 . Normalmente os eletrodos são metais nobres como platina, ou não nobres como rutênio e paládio, entre outros, que atuam como catalisadores de combustíveis em reações eletroquímicas. Os combustíveis mais empregados para oxidação são moléculas como o hidrogênio ou pequenas moléculas orgânicas como metanol, etanol, glutaraldeído, entre outros, enquanto no cátodo geralmente é reduzido como combustível o oxigênio

118,119 

.

As FCs são consideradas células galvânicas por produzirem corrente elétrica de forma espontânea. Por uma abordagem termodinâmica, uma reação química ocorre espontaneamente se ΔG < 0. Em eletroquímica a energia livre de Gibbs é expressa como ΔG 0 = -nFE 0 , logo, a reação redox espontânea ocorre na condição de E > 0, sendo E = ΔE = Ecátodo -Eânodo 120 . Essa simples observação nos leva a compreender que o potencial de geração de energia ou densidade de potência de uma FC A necessidade de eletrodos de metais nobres como catalisadores elevam o custo das FCs, além da dificuldade de produção e estocagem de H2, por exemplo 123 . Como alternativa as FCs convencionais mencionadas, surgem-se as biocélulas a combustível (BFCs). As BFCs são consideradas uma subclasse das FCs que se diferenciam pela substituição dos catalisadores metálicos por biomoléculas, mais especificamente por microrganismos e enzimas. As biocélulas a combustível enzimáticas (EFCs)

6 

e microbiais (MFCs) 124 possuem estruturas similares as configurações das FCs convencionais. A grande diferença ocorre pelas reações geradoras de corrente elétrica, que em BFCs ocorrem por meio de reações bioelétroquímicas. Contudo, as BFCs possuem baixa densidade de potência, por isso são recomendadas para aplicações específicas de dispositivos que demandam baixa potência, assunto que será melhor discutido posteriormente

125 

. A Tabela 3 expõe as principais diferenças de características entre FCs e BFCs. Tabela 3. Características gerais de biocélulas a combustível e células a combustível.

Três mecanismos de transferência eletrônica são reportados nos bioânodos em MFCs. I) A partir de mediadores redox solúveis presentes no eletrólito que sofrem redução ao contato com o microrganismo e se oxidam na superfície do eletrodo transferindo os elétrons. II) Transferência direta pela pili ou fimbrias § , em alguns casos ao formar uma camada espessa sobre o eletrodo a transferência eletrônica acontece pelos filamentos responsáveis pela aderência das bactérias. III) Transferência direta por proteínas localizadas na parede externa de algumas bactérias, como por exemplo a família das Geobacteraceae, que transferem elétrons usando citocromos ** presentes na membrana externa.

Um dos principais problemas em MFCs é justamente a eficiência na transferência eletrônica, pois são necessárias estratégias eficientes para atravessar a membrana lipídica não condutora de algumas bactérias

124,126,134 

. A Tabela 4 lista a composição de algumas MFCs e seus respectivos desempenhos na produção de corrente elétrica. ‡ Fase do metabolismo microbial em que ocorre a degradação das moléculas nutritivas com liberação de energia. § Filamentos que promovem aderência dos microrganismos e também auxiliam na transferência de material genético.

** Citocromos são proteínas, geralmente ligadas a uma membrana, que contêm grupos heme e que efetuam o transporte de elétrons.

  Emadição a isso, os biocatalisadores são renováveis, pois as enzimas podem ser extraídas de variados organismos vivos, como bactérias, fungos, e outros 141 . Essas características somadas as condições brandas de operação, fazem com que o principal foco de aplicação das EFCs seja para alimentar pequenos dispositivos, os quais podem ser classificados como implantáveis e não implantáveis a um corpo vivo 125 . Como exemplos de dispositivos implantáveis são marcapassos 142 , bombas de insulina143 , estimuladores neurológicos 142 , lentes de contato elétricas 144 , entre outros143,125 . Exemplos de dispositivos não implantáveis que podem ser alimentados por EFCs são relógios, biossensores, players, pulseiras inteligentes, entre outros7 . MWCNTs) e polynorbornene-pyrene, um polímero de cadeia linear com características ideais para compor a matriz do material e promover uma espécie de ''papel condutor de carbono''. Para catalisar o lactato presente no suor, foi utilizada como catalisador a enzima lactato oxidase (LOx) a qual apresenta mecanismo de transferência eletrônica mediado pelo mediador redox 1,4-naftoquinona (1,4-NQ) depositado sobre o BP via dropcasting. O cátodo foi confeccionado para

6,7 

. Os três componentes são melhor explorados posteriormente nos próximos subtítulos.

Frente aos sistemas convencionais de conversão de energia, as EFCs possuem algumas características para aplicações em interfaces biológicas, como por exemplo a operação em pH fisiológico, temperatura e pressão ambiente, e operação na presença de impurezas, pois reconhecem o combustível na presença de outras espécies químicas. Além dos combustíveis serem quase sempre metabolizáveis ou digeríveis por organismos vivos, como álcoois, ácidos orgânicos, hidrogênio, oxigênio, açúcares, entre outros, esses combustíveis geralmente utilizados em EFCs são compostos presentes normalmente em fluidos corporais, como sangue, suor, lágrima, saliva, entre outros.

Um significativo avanço em EFCs não implantáveis foi recentemente reportado por Chen et al. que desenvolveram um dispositivo capaz de gerar corrente elétrica a partir do suor de uma pessoa em atividade física (Figura 31). Os pesquisadores confeccionaram uma EFC utilizando como eletrodo buckypaper (BP) desenvolvido pelo próprio grupo de pesquisa. O BP é uma mistura de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (

  6,146 . Lista de catalisadores enzimáticos com seus respectivos cofatores normalmente utilizados em BFCs. Adaptado de Beilke, M. C.; Micro Fuel Cells, Elsevier Inc., 20096 . Desnaturação é a perda da conformação estrutural tridimensional de uma enzima por variações nas condições do sistema.50Nota-se que alguns catalisadores foram citados com um respectivo cofator ou coenzima.

	Tabela 5. Ânodo		
	Enzima	Cofator Enzimático	Combustível	Produto
	Álcool Desidrogenase	NAD+	Metanol	Formaldeído
	Formaldeído Desidrogenase	NAD+	Formaldeído	Formiato
	Formiato Desidrogenase	NAD+	Formiato	CO2
	Álcool Desidrogenase	NAD+	Etanol	Acetaldeído
	Álcool Desidrogenase	PQQ	Etanol	Acetaldeído
	Aldeído Desidrogenase	NAD+	Acetaldeído	Acetato
	Aldeído Desidrogenase	PQQ	Acetaldeído	Acetato
	Glucose Oxidase (GOx)	FAD	Glicose	Glucolactona + H2O2
	Glucose Desidrogenase (GDH)	NAD+/PQQ	Glicose	Glicose-6-Fostfato
	Glucose Desidrogenase (GDH)	PQQ	Glicose	Glicose-6-Fostfato
	Frutose Desidrogenase (FDH)	NAD+	Frutose	D-frutose
	Lactato Desidrogenase (LDH)	NAD+	Lactato	Piruvato
		Cátodo		
	Enzima	Cofator Enzimático	Combustível	Produto
	Bilirrubina oxidase	Cobre	Oxigênio	H2O
	Lacase	Cobre	Oxigênio	H2O
	Ciclooxigenase	Heme	H2O2	H2O
	† †			

  Todos os procedimentos referentes a Parte II deste trabalho foram desenvolvidos nas dependências do Departement de Chimie Moleculaire (DCM), na equipe de Biosystèmes

	Electrochimiques et Analytiques (BEA, dcm.univ-grenoble-alpes.fr) situados na Université Grenoble
	Alpes, França; sob orientação dos pesquisadores Dr. Allan Le Goff, Dr. Michael Holzinger e Dr. Serge
	Cosnier e supervisão do Prof. Dr. Emerson M. Girotto
	4.1.	Preparação e Caracterizações Morfológica e Eletroquímicas dos Eletrodos de MWCNTs
		Uma suspensão de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (Sigma-Aldrish 99%) foi obtida
	após banho ultrassônico por 2h de uma dispersão de 5,0 mg mL -1 de MWCNTs em n-metil-2-pirrolidona
	(NMP; Sigma-Aldrish 99,5%). Para construção dos eletrodos recobertos com MWCNTs, foram
	depositados sobre a superfície de eletrodos comerciais de carbono vítreo (GC; 3 mm de carbono vítreo)
	de 6 mm, polidos com dispersão de diamante de 1μm, volumes de 10, 20 e 40 µL de MWCNTS (5,0
	mg mL -1 ), o equivalente a 17,7; 35,5 e 70,9 µg cm -2 , respectivamente; e então o solvente NMP foi seco
	a vácuo por 2 horas.
		Para a caracterização eletroquímica da área eletroativa dos eletrodos de MWCNTs nas três
	diferentes quantidades de MWCNTs (17,7; 35,5 e 70,9 µg cm -2 ) foi utilizado um sistema eletroquímico
	convencional de três eletrodos compostos de um eletrodo de calomelano saturado (SCE; KCl saturado)

Tabela 6 .

 6 Precursores aromáticos pré-selecionados a serem eletrossintetizados sobre MWCNTs.

	Precursor	Estrutura	Anéis Aromáticos	Formula molecular	Massa Molar g mol -1
	Naftaleno (S.A., 99%)		2	C10H8	128,1
	Antraceno (S.A., 99%)		3	C14H10	178,2
	Fenantreno (S.A., 97%)		3	C14H10	178,2
	Pireno (S.A., 99%)		4	C16H10	202,2
	Perileno (S.A., 99+%)		5	C20H12	252,3
	Coroneno (S.A., 97%)		7	C24H12	300,3
	4.3				

. Caracterizações Eletroquímicas das Moléculas Eletrossintetizadas 4.3.1. Comportamento das Moléculas Eletrossintetizadas a Variações de Velocidade de

  

Tabela 7 .

 7 Relação de descrição das características dos eletrodos de GC e MWCNTs.Ao observar a espessura dos eletrodos de MWCNTs podemos concluir que de fato é impraticável a determinação da área eletroativa de eletrodos que promovem a adsorção de analitos por CV120 . A Figura 36 expõe imagens eletrônicas 3D obtidas de um microscópio a laser para os eletrodos de MWCNTs com 17,7, 35,5 e 70,9 µg cm -2 . É possível notar um aumento da espessura proporcional a quantidade de MWCNTs sobre o eletrodo base de GC. A Tabela 7 mostra as espessuras obtidas da

	Eletrodo	Área Superf. Geométrica	V vs. I	V 1/2 vs. I	Área Superf. Eletroativa	Espessura
		(cm 2 )	R² anó. / R² cat. R² anó. / R² cat.	(cm 2 )	(µm)
	CG	0,070	0,923 / 0,912	0,998 / 0,997	0,066 ± 0,017	-
	CG/MWCNTs-17,7 µg cm -2	0,282	0,979 / 0,998	0,988 / 0,985	-	5,8 ± 0,4
	CG/MWCNTs-35,5 µg cm -2	0,282	0,997 / 0,998	0,967 / 0,965	-	7,1 ± 0,7
	CG/MWCNTs-70,9 µg cm -2	0,282	0,999 / 0,999	0,946 / 0,944	-	26,9 ± 1.4

  Ea ≈ 0,02 V e Ec ≈ -0,31 V em pH 7,0 e Ea ≈ -0,11 V e Ec ≈ -0,61 V em pH 12,0. Nota-se que há um deslocamento do sistema redox para menores potenciais com o aumento do pH, indicando uma dependência da reversibilidade com a concentração de íons H + no sistema. Essa observação corrobora com a maior corrente obtida para a eletrossintese realizada em pH 2,0, ou seja, há uma maior conversão do precursor pireno em produto. A segunda observação é o aumento da corrente catódica e anódica a cada ciclo, evidenciando que há a formação de produto a cada novo ciclo, bem como estão adsorvidos na matriz do eletrodo de MWCNTs. Pode-se notar também a existência de uma saturação de formação do produto próximo ao 15° ciclo onde a taxa de crescimento das correntes a cada ciclo é praticamente nula.

	. Também
	foi levado em conta a baixa solubilidade destes compostos em meio aquoso, por esse fato os
	precursores pouco desorveriam da matriz do MWCNTs. Em adição, esses compostos apresentam a
	capacidade de oxidar e formar quinonas, que são ótimos grupos redox 178,179 .
	Inicialmente o precursor pireno foi adicionado a 20 µL (10 mmol L -1 ) sobre a superfície de três
	eletrodos recobertos com MWCNTs (35,5 µg cm -2 ). Após a secagem (30 min) do diclorometano cada
	eletrodo foi submetido a 15 ciclos consecutivos sob velocidade de varredura de 100 mV s -1 . A Figura
	38 apresenta os voltamogramas de eletrossintese em pH 2,0, 7,0 e 12,0. A primeira observação dos
	voltamogramas é o evidente processo redox dos produtos de eletrossintese nos potenciais Ea ≈ 0,31 V
	0.0 e Ec ≈ 0,13 V em pH 2,0; -0.4 0.4 0.8 1.2 -2.0x10

5.3. Caracterização Eletroquímica dos Mediadores Eletrossintetizados. 5.3.1. Comportamento dos Mediadores Redox a Variações de Velocidade de Varredura e pH.

  Um mediador redox eficiente deve possuir caráter reversível ou quase reversível sob diferentes velocidades de varredura e também se mostrar estável a variações de pH 180 . Os produtos de eletrossintese do naftaleno, fenantreno, pireno, perileno e coroneno foram submetidos a pH 7,0, condição aproximada de um ambiente fisiológico, sob velocidades de varredura 1 a 100 mV s -1 , em janelas de potenciais compatíveis com sistemas redox de cada produto. A Figura 41 mostra os voltamogramas, bem como as curvas geradas da relação entre V vs. I. Primeiramente é importante destacar a linearidade entre a velocidade de varredura e a corrente, demonstrando que os produtos de eletrossintese de todos os precursores estão adsorvidos na matriz do MWCNTs (vide seção 4.1.). Para os produtos do antraceno e perileno é possível notar o aparecimento de sistemas redox não observados nos voltamogramas de eletrossintese. Este fato pode ser atribuído a mudança do pH de eletrossintese (pH 2,0) para o pH estudado para diferentes velocidades de varredura (pH 7,0). Os produtos são sensíveis a concentração de íons hidrônio, sobretudo porque em uma mesma estrutura de um produto é possível o surgimento de múltiplos sistemas redox, que por sua vez, possuem característica de reversibilidade específica.

  observados ao valor previsto por Nernst de 0,059. Logo, pode-se afirmar que as reações redox presentes nos produtos de eletrossintese dos precursores ocorrem sob transferência da mesma quantidade de elétrons e íons hidrônio na reação redox reversível, ou seja, ne -= nH + 181,182 .

	𝐸 = 𝐸 1/2 -	0,0592 𝑛	𝑙𝑜𝑔	[𝑀] [𝑀𝐻] -	0,0592 𝑛	𝑙𝑜𝑔 [𝐻 + ]	Equação 35
	Como os precursores e os produtos estão adsorvidos na matriz do MWCNTs, a equação é
	resumida a 182 :						
	𝐸 = 𝐸 1/2 -	0,0592 𝑛	𝑝𝐻	Equação 36
	Ao plotar uma curva de pH vs. E associado a Equação 36 pode ser determinada a relação entre
	a quantidade de elétrons envolvidos no sistema redox dos produtos e a quantidade de íons H + . Nota-
	se na Figura 42 que os produtos de eletrossintese apresentaram uma relação linear entre os potenciais
	e a variação do pH. Os coeficientes angulares (0,0592/n) foram 0,054, 0,054, 0,053, 0,054 e 0,055,
	para os produtos naftaleno, fenantreno, pireno, perileno e coroneno, respectivamente. É evidente a
	aproximação dos valores						
		1/2 -	0,0592 𝑛	𝑙𝑜𝑔	[𝑀][𝐻 + ] [𝑀𝐻]	Equação 34
								66

5.3.2. Estabilidade Eletroquímica dos Mediadores

Redox sobre MWCNTs. Os precursores foram selecionados não apenas pelo potencial em formar quinonas, mas também pela forte interação π-stacking entre o MWCNTs e os anéis aromáticos das estruturas. No entanto, é natural esperar que os produtos das eletrossinteses sejam diferentes de seus precursores e podem apresentar forças de interações diferentes com MWCNTs. Logo, é interessante identificar a estabilidade dos produtos frente a subsequentes ciclos. Dessa maneira, foram realizados 100 ciclos consecutivos por voltametria cíclica a 20 mV s -1 em pH 7,0 para todos os produtos dos precursores sobre os eletrodos de MWCNTs. A Figura 43 apresenta o 1 o e o 100 o ciclo do estudo de estabilidade.

É possível notar que os produtos de naftaleno, pireno e perileno praticamente não apresentaram perda da reversibilidade do sistema, ou seja, a formação de um grupo redox na estrutura não comprometeu as interações π-stacking. Enquanto que os produtos de fenantreno e coroneno apresentaram perda da reversibilidade do sistema redox, indicando uma dessorção dos produtos eletrossintetizados da matriz do eletrodo de MWCNTs, muito provavelmente causada pelo aumento da solubilidade desses produtos a meio aquoso, ou simplesmente pela menor interação com os MWCNTs.

5.4.1. Caracterização Estrutural dos Mediadores Eletrossintetizados Devido

  a eficiência em atuar como mediador redox em bioânodo de MWCNTs com o catalisador FAD-GDH, se fez necessário a caracterização química dos produtos de eletrossintese do pireno. Foram eletrossintetizados os MR do pireno sobre dez eletrodos de MWCNTs, o conteúdo de todos eletrodos foi recolhido e solubilizado em CDCl3 e centrifugado a 12000 rpm por 30 min para decantação do MWCNTs. O sobrenadante foi recolhido e submetidos a espectro de RMN 1 H. A Figura 48 apresenta o espectro de RMN 1 H dos produtos de eletrossintese do pireno. Os deslocamentos químicos foram devidamente identificados e atribuídos a duas estruturas químicas, 1,6-pirenodiona e 1,8-pirenodiona em uma proporção 2:1, respectivamente. As designações das espécies são detalhadas a seguir 184,185 : ▪ 1,6-pirenodiona: 1 H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.72 (d, 2H, HA), δ 7.67 (d, 2H, HB), δ 7.85 (d, 2H, HC), δ 8.49 (d, 2H, HD). -pirenodiona: 1 H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6.67 (d, 2H, HE), δ 7.52 (d, 2H, HF), δ 7.69 (d, 2H, HG), δ 8.65 (d, 2H, HH).

	▪	1,88.8	8.4	8.0	7.6	7.52	*	7.2	6.8	6.72 6.67 E A

Goldstein, R. E.; Austin, R. H.; Brody, J. P.; Yager, P. Biotechnology at low Reynolds numbers.