chim.othe
Dos Débora 
  
D.Sc Santos 
  
Débora Dos 
  
Santos Tavares 
  
Fosfato Tricálcico 
  
Com E Sem 
  
Magnésio Débora 
  
Glória Dulce 
  
Almeida Soares 
  
José Mauro Granjeiro 
  
Dr Karine Anselme 
  
E Macrófagos Osteoprogenitoras 
  
E M Humanos 
  
D E Pastilhas 
  
Tricálcico Fosfato 
  
E Com 
  
Magnésio Sem 
  
Débora 
  
Tese Submetida 
  
DOCENTE DO INSTITUTO A O Corpo 
  
Alberto Luiz 
  
Coimbra De Pós-Graduação 
  
COPPE) DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Pesquisa De Engenharia 
  
Como Parte 
  
Dos Requisitos 
  
Necessários Para 
  
A Obtenção Do 
  
Grau De Doutor 
  
E M Ciências 
  
Em Engenharia Metalúrgica 
  
E De 
  
Materiais Examinada 
  
Prof Dulce Gloria 
  
Almeida De 
  
D.Sc Soares 
  
Prof Mauro José 
  
D.Sc Granjeiro 
  
Prof Mara Rossana 
  
Moreira Da Silva 
  
D.Sc Thiré 
  
Prof Araujo Dos Euler 
  
Prof Jorge Lima Edson 
  
D.Sc Moreira 
  
Prof Henrique Marcelo 
  
D.Sc Prado Da Silva 
  
Tavares 
  
Gloria Dulce 
  
Karine Anselme Tese 
  
Gloria Soares 
  
Pela Orientação 
  
Tavares Santos 
  
Junho 
  
Gloria Dulce 
  
Gloria Dulce 
  
D E Phosphate 
  
Tricalcique Dopee 
  
O U Non 
  
Avec Du 
  
Magnesium Débora 
  
Dos Santos 
  
Tavares Juin 
  
Gloria Dulce 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
AVALIAÇÃO IN VITRO DO COMPORTAMENTO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS E MACRÓFAGOS HUMANOS EM PASTILHAS DE

à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura II.1 -Diagrama esquemático do bioreator por perfusão em incubadora a 37 o C/5%CO 2 (sistema aberto). Um tubo de silicone conduz o meio de cultura fresco acoplado a uma garrafa de vidro com filtro de ar para a câmara de cultura contendo as amostras em sentido transversal ao fluxo (as amostras são separadas por um filtro). O fluxo continua através do tubo de silicone até a garrafa de saída de meio. Uma bomba peristáltica localizada antes da câmara mantém o fluxo de meio de cultura constante (2 mL/h). . Figura II.3 -Diagrama esquemático do papel de citocinas secretadas por macrófagos nos processos de inflamação e cicatrização. Adaptado de BRODBECK et al, 2003. .. 24 Figura IV.1 -Diagrama esquemático das pastilhas após sinterização, mostrando a diferença no diâmetro (áreas β-TCP = 116,8 ± 2,2 mm 2 ; β-TCMP = 98,8 ± 1,7 mm 2 ). 36 Figura V.5 -Alteração na concentração média de íon (PO 4 ) 3-em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (*xii mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de (PO 4 ) 3-da pastilha para o meio (); precipitação de (PO 4 ) 3-na pastilha a partir do meio (). ....... 59 Figura V.6 -Alteração na concentração média de íon Mg em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCMP em Figura V.9 -Alteração na concentração média de íon (PO 4 ) 3-em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (*mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de (PO 4 ) 3-da pastilha para o meio (); precipitação de (PO 4 ) 3- 

INTRODUCTION

Les biocéramiques phosphocalciques (biomatériaux synthétiques) sont de plus en plus utilisées pour remplacer les os: leur composition qui ressemble à la partie minérale de l'os permet le développement d'un nouveau tissu osseux. Les plus utilisées sont l'hydroxyapatite (HA) et le phosphate tricalcique-β (-TCP). Bien que l'HA soit biocompatible, elle est très peu résorbable, ne permettant pas un remplacement efficace par de l'os néoformé (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006).

La bioingénierie tissulaire est un domaine interdisciplinaire qui étudie la combinaison de cellules, de substances biochimiques et de matériaux afin d'améliorer, de restaurer ou de maintenir l'intégrité des tissus et des organes. En ce qui concerne les propriétés chimiques des biocéramiques, des modifications dans la structure peuvent être obtenues par de nouvelles synthèses de phosphates de calcium dopés avec différents ions [START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF]. Le magnésium (Mg) est un cation qui suscite un intérêt particulier car sa déficience dans l'organisme affecte toutes les étapes du métabolisme osseux (LANDI, LOGROSCINO, et al., 2008). Pour cette raison, du -TCP dopé avec du magnésium a été étudié en tant que greffe osseuse.

L'un des mécanismes responsables de la bioactivité des biocéramiques consiste en la dissolution des ions calcium et phosphate, contribuant ainsi à l'accumulation de ces ions entre l'os et l'implant, qui favorise ensuite une apposition osseuse plus rapide sur la surface de l'implant. Le fait que la substitution partielle du calcium par le magnésium dans la structure du TCP augmente significativement le taux de dissolution est un facteur majeur pour comprendre son mécanisme d'action, ainsi que l'évaluation de l'effet de l'ion magnésium sur le métabolisme des cellules osseuses (GUTH, CAMPION, et al., 2011).

Au niveau cellulaire, l'équilibre entre la formation et la résorption osseuse implique la régulation coordonnée et l'interaction de deux types de cellules, les ostéoblastes qui forment l'os et les ostéoclastes qui résorbent l'os (THIRUNAVUKKARASU, HALLADAY, et al., 2000). Dans ce contexte, des recherches récentes montrent que les bioréacteurs (culture cellulaire en régime dynamique) sont essentiels dans le domaine de la bioingénierie, non seulement car ils offrent un environnement in vitro plus proche des conditions du vivant, avec un flux constant de milieu de culture, mais surtout car ils permettent des études systématiques de la réponse cellulaire à différents signaux mécaniques et biochimiques (CHEN e HU, 2006).

L'implantation du biomatériau dans l'organisme provoque un traumatisme tissulaire et ensuite une inflammation, liée à la réaction de cicatrisation. De nombreuses cytokines, cruciales pour l'intégration osseuse du matériau, coordonnent la réaction de l'organisme (KIRKPATRICK, KRUMP-KONVALINKOVA, et al., 2002). La résolution de la réponse inflammatoire et la progression de la cicatrisation coïncident avec la différenciation des monocytes en macrophages adhérents sur le biomatériau, qui peuvent ensuite fusionner et former des cellules géantes. C'est pour ces raisons que les cytokines responsables du recrutement et de l'activité des macrophages et des cellules géantes adhérentes aux biomatériaux sont largement étudiés actuellement (BRODBECK, NAKAYAMA, et al., 2002).

Cette thèse propose l'évaluation du comportement in vitro de cellules ostéoprogénitrices cultivées dans un environnement statique et dynamique sur des pastilles de β-TCP dopées ou non avec du Mg (β-TCMP ; raison Mg/Ca = 0,15). De plus, une étude biomimétique a été réalisée afin de comprendre la cinétique de dissolution des biocéramiques quand elles sont immergées dans le milieu de culture

CAPÍTULO I INTRODUÇÃO

A implantação de substitutos ósseos como as biocerâmicas de fosfato de cálcio vem aumentando progressivamente em subsitituição aos auto ou aloenxertos. Estas apresentam várias vantagens: previnem tempos cirúrgicos adicionais, visto que são sintéticas (auto-enxertos necessitam de dois tempos cirúrgicosum para sua retirada e outro para implantação de enxerto) e transferência de doenças e reações imunológicas, já que não são provenientes de outras pessoas [START_REF] Legeros | Properties of osteoconductive biomaterials: calcium phosphates[END_REF].

Biocerâmicas de fosfato de cálcio possuem uma característica ímpar em sua utilização como substitutos ósseos quando comparadas com outros biomateriais: sua composição semelhante à parte mineral do osso (hidroxiapatita) promove um arcabouço adequado para o processo de formação óssea. As mais utilizadas são a hidroxiapatita (HA) e fosfato tricálcico na fase beta (-TCP). Apesar de ser altamente biocompatível a HA é pouco reabsorvível, não permitindo uma substituição efetiva por tecido ósseo neoformado. A grande vantagem do -TCP é ser mais solúvel que a HA, sendo mais rapidamente reabsorvido no organismo (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006). Um dos principais objetivos na área de bioengenharia é a síntese de um material que seja reabsorvido na medida em que o novo tecido é formado.

A bioengenharia é uma área interdisciplinar que estuda a combinação de células, materiais e substâncias bioquímicas em várias formas para melhorar, restaurar ou manter a integridade de tecidos e até mesmo órgãos. No caso de enxertos ósseos, o objetivo principal é desenvolver arcabouços sintéticos porosos constituídos basicamente de cerâmicas de fosfatos de cálcio. Por isto, atualmente, as pesquisas estão direcionadas para diferentes modificações nos fosfatos de cálcio. Em relação as suas propriedades químicas, as modificações incluem novas sínteses de fosfatos de cálcio substituídos parcialmente por vários íons [START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF]. O magnésio é um cátion que desperta especial interesse, pois sua deficiência afeta todas as etapas do metabolismo ósseo (LANDI, LOGROSCINO, et al., 2008). Por conseguinte, o -TCP, e mesmo outros fosfatos, biovidros, ligas metálicas, contendo magnésio vem sendo estudado como substituto ósseo.

Tem sido proposto que um dos mecanismos subjacentes responsáveis pela bioatividade de cerâmicas envolve a dissolução dos fosfatos de cálcio, onde a dissolução leva a aumentos na concentração destes ions entre o osso existente e o enxerto implantado, favorecendo uma aposição óssea mais rápida na superfície do enxerto. A verificação de que se a substituição de magnésio no TCP aumenta significativamente a taxa de dissolução é um fator importante para entender seu mecanismo de ação, em conjunto com a avaliação do efeito do íon magnésio sobre o metabolismo das células ósseas (GUTH, CAMPION, et al., 2011).

O crescimento, desenvolvimento e manutenção do tecido ósseo em mamíferos é um processo altamente regulado. O nível de massa óssea é dependente do equilíbrio entre formação e reabsorção óssea. No nível celular, este equilíbrio envolve a regulação coordenada e a interação de dois tipos celulares em especial: osteoblastos, que formam osso, e osteoclastos, que reabsorvem o osso. Osteoblastos controlam as atividades de reabsorção óssea dos osteoclastos e estão também diretamente envolvidos na diferenciação de osteoclastos. (THIRUNAVUKKARASU, HALLADAY, et al., 2000).

Neste contexto, pesquisas recentes mostram que bioreatores (cultura de células em meio dinâmico) são essenciais na área da bioengenharia, porque fornecem um ambiente in vitro mais próximo às condições in vivo, com fluxo constante de meio de cultura, controle da temperatura e pH. Além disso, permitem a realização de estudos sistemáticos da resposta celular a vários sinais mecânicos e bioquímicos (CHEN e HU, 2006).

A implantação de um biomaterial envolve trauma tecidual, que induz uma resposta inflamatória conjugada a reação de reparo tecidual, composta de várias etapas: angiogênese, ativação de fibroblastos e remodelação da matriz. Inúmeras citocinas inflamatórias estão envolvidas nesta reação do organismo, que são cruciais para a biointegração do material com o osso (KIRKPATRICK, KRUMP-KONVALINKOVA, et al., 2002). A resolução da resposta inflamatória e a progressão da cicatrização da ferida coincidem com a diferenciação de monócitos em macrófagos, que podem se fundir e formar células gigantes de corpo estranho. As células gigantes são responsáveis por danos e degradação prematura do implante através de sua capacidade fagocítica e secreção de enzimas. Portanto, as citocinas envolvidas na modulação da presença e atividade de macrófagos e células gigantes aderentes ao biomaterial e sua resposta como um todo à superfície do material estão sendo amplamente pesquisadas (BRODBECK, NAKAYAMA, et al., 2002).

O presente trabalho tem como objetivo a avaliação in vitro do comportamento de células osteoprogenitoras sob condições estática e dinâmica em pastilhas de -TCP e -TCP parcialmente substituído por Mg (razão Mg/Ca = 0,15). Um estudo biomimético foi realizado visando compreender a cinética de dissolução das cerâmicas quando imersas em meio de cultura celular. A interação destes materiais com macrófagos humanos in vitro também foi analisada, através da detecção e quantificação de citocinas mediadoras do processo inflamatório. A influência topográfica foi descartada através da determinação da rugosidade superficial das pastilhas por microscopia de força atômica, logo foi possível avaliar apenas a influência química nas respostas biológicas.

CHAPITRE II (a) BIBLIOGRAPHIE

En raison de l'amélioration de la qualité de vie et de l'augmentation de l'espérance de vie, le nombre de personnes âgées et par conséquent le taux de maladies chroniques augmente de plus en plus. Désormais, la recherche dans le domaine de la régénération osseuse augmente aussi continuellement pour satisfaire les besoins de la chirurgie ostéoarticulaire et maxillofaciale (HABIBOVIC e DE GROOT, 2007).

Le phosphate tricalcique (TCP) a été largement étudié comme greffe osseuse, car il est plus soluble que l'hydroxyapatite (HA), permettant un remplacement progressif du biomatériau par l'os néoformé (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006;[START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF]. Parmi les substituants cationiques du TCP, le magnésium (Mg) possède des caractéristiques intéressantes, car il est le quatrième cation en termes d'abondance dans le corps et le second dans le milieu intracellulaire.

Par ailleurs, environ 50-60% du magnésium se trouvent dans les os, et la carence en magnésium dans l'alimentation a déjà été considérée comme un facteur de risque pour l'ostéoporose. De plus, le magnésium joue un rôle important dans l'activité des cellules osseuses (BIGI, COJAZZI, et al., 1997;WOLF e CITTADINI, 2003;RUDE e GRUBER, 2004;LANDI, LOGROSCINO, et al., 2008).

En effet, l'échange ionique, c'est à dire, la dissolution des ions calcium et phosphate est également responsable de la bioactivité de phosphates de calcium, puisque l'augmentation du niveau de ces ions dans l'espace os-greffe peut favoriser l'apposition osseuse par les ostéoblastes qui utilisent ces ions pour fabriquer le tissu osseux (GUTH, CAMPION, et al., 2011). L'association des biomatériaux à des cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse (par exemple les cellules STRO+1A) contribue au développement d'innovations en bioingénierie osseuse, grâce à leur capacité de se différencier en de nombreuses cellules spécialisées, comme des ostéoblastes (OYAJOBI, LOMRI, et al., 1999;AHDJOUDJ, LASMOLES, et al., 2001). D'autre part, le développement de bioréacteurs à perfusion, qui permettent la circulation en continu du milieu de culture, apparait désormais indispensable à la culture des cellules sur les biomatériaux supports pour la fabrication de substituts osseux cellularisés. De plus, la contrainte de cisaillement induite par la dynamique des fluides (ex. milieu de culture cellulaire) dans les bioréacteurs joue aussi un rôle très important dans la stimulation cellulaire par l'activation de signaux mécanotransducteurs dans les ostéoblastes (PLUNKETT e O 'BRIEN, 2011). D'autre part, l'interaction entre les cellules immunitaires et la surface d'un matériau, appelée réaction à corps étranger, où la cellule la plus importante est le macrophage, détermine ou au moins influence fortement le succès ou l'échec d'un matériau implanté. Considérant que l'expression des cytokines par des macrophages est plus élevée lorsque la biocompatibilité des biomatériaux est réduite, les études des cytokines produites en présence des biomatériaux deviennent de plus en plus nécessaires (HUMMEL, CZERLINSKI, et al., 1994).

Il apparaît donc essentiel d'élaborer de nouveaux matériaux possédant des capacités de reconstruction du tissu osseux. D'après les informations déjà mentionnées, l'étude du comportement des cellules ostéoprogénitrices ainsi que des macrophages humains sur des pastilles de phosphate tricalcique dopées ou non avec du magnésium est donc pertinente dans le domaine de la bioingénierie.

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

II.1 -BIOCERÂMICAS DE FOSFATO DE CÁLCIO

A necessidade de inovações na área de regeneração óssea cresce continuamente devido à melhoria na qualidade de vida com aumento da expectativa de vida. Uma das conseqüências desse fenômeno é o aumento de lesões e doenças ósseas em pessoas mais idosas, que apresentam uma capacidade de regeneração óssea diminuída. Defeitos em tecidos orais e crânio-faciais, resultantes de trauma, tumores ou infecções são um desafio clínico e sua restauração depende de esforços conjuntos da ciência e bioengenharia (HABIBOVIC e DE GROOT, 2007;[START_REF] Dorozhkin | Calcium Orthophosphates as Bioceramics: State of the Art[END_REF].

O osso é um órgão importante que apresenta como funções a sustentação do corpo, proteção de órgãos internos e também atua como local de armazenamento e fonte de íons, principalmente cálcio e fosfato. A capacidade de regeneração do tecido ósseo humano perdido ou danificado é limitada. Quando a perda óssea é muito extensa, um enxerto torna-se necessário. Auto-enxertos são substitutos ósseos obtidos de local diferente da área da lesão, mas do mesmo indivíduo, aumentando a morbidade e com grande possibilidade de mais de um tempo cirúrgico. Aloenxertos são substitutos ósseos obtidos de outro indivíduo da mesma espécie, com importantes questões referentes a infecções devido a contaminações do enxerto com vírus e/ou bactérias e imunogenicidade. Neste contexto, um especial destaque tem-se atribuído aos biomateriais sintéticos para a reconstrução de tecidos ósseos danificados, apresentando reduzida contaminação patogênica e quantidade disponível ilimitada (DEN BOER, WIPPERMANN, et al., 2003;KAMINTAKAHARA, OHTSUKI e MIYAZAKI, 2008).

O tecido ósseo é altamente mineralizado, composto por uma matriz orgânica reforçada por depósitos de cristais de fosfatos de cálcio, ou seja, um compósito natural. Seus principais constituintes são: minerais de fosfatos de cálcio, como hidroxiapatita (50-60%), colágeno (30-40%) e água (até 10%). A matriz orgânica calcificada envolve as células ósseas que participam do metabolismo ósseo, como as células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e osteoclastos (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006;[START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF].

Baseando-se nas características e composição do tecido ósseo, vários biomateriais são continuamente desenvolvidos para sua utilização no processo de regeneração óssea. Biomateriais são materiais sintéticos ou naturais utilizados na substituição de partes do organismo ou para funcionamento em contato direto com tecido vivo. As cerâmicas de fosfato de cálcio são amplamente utilizadas como substitutos ósseos em virtude de sua similaridade com a fase mineral do osso e por serem bioativas (se ligando quimicamente ao osso). As biocerâmicas mais utilizadas são a hidroxiapatita (HA) e fosfato tricálcico (TCP) (VALLET-REGI e GONZALEZ- [START_REF] Vallet-Regi | Calcium phosphates as substitution of bone tissues[END_REF]KAMINTAKAHARA, OHTSUKI e MIYAZAKI, 2008;[START_REF] Dorozhkin | Calcium Orthophosphates as Bioceramics: State of the Art[END_REF].

De modo geral, um biomaterial para enxerto ósseo deve apresentar uma taxa de biodegradação comparável à taxa de formação de tecido ósseo, ou seja, entre alguns meses e cerca de 2 anos. A HA exibe solubilidade e cinética de reabsorção mais lentas quando comparada ao TCP: enquanto a HA permanece em defeitos ósseos muitos anos após o implante, o TCP é reabsorvido em cerca de 6 meses a 1 ano, tempo dependente de vários fatores como razão Ca/P, grau de cristalinidade, etc (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006;[START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF].

A hidroxiapatita, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 , é o fosfato de cálcio mais estável sob temperatura normal. As apatitas biológicas possuem várias substituições em sua rede cristalina, que alteram sua estrutura e geralmente apresentam efeitos críticos nas propriedades minerais, como solubilidade, dureza, deformação, estabilidade térmica entre outros. Dentre os íons substituintes relatados na literatura estão: F -, Cl -, Na + , K + , Fe +2 , Zn +2 , Sr +2 , Mg +2 , CO 3 O fosfato tricálcico [Ca 3 (PO 4 ) 2 ] tem sido amplamente estudado por apresentar uma solubilidade maior que a da HA, possibilitando uma substituição gradativa do biomaterial por tecido ósseo neoformado. O fosfato tricálcico não pode ser obtido por precipitação em meio aquoso, mas sim por calcinação de apatitas cálcio deficiente, apresentando duas fases distintas: -TCP e -TCP. A fase alfa é obtida após tratamento térmico acima de 1125 o C e a fase beta acima de 800 o C. Apesar de suas composições químicas similares, seus perfis cristalográficos diferentes resultam em padrões de reabsorção distintos: -TCP é menos solúvel em água que -TCP. Além disso, a fase beta é estável a temperatura ambiente. A alta reatividade e, consequentemente, a alta taxa de dissolução do α-TCP in vitro e in vivo limitam sua aplicação no campo biomédico. Por outro lado, a menor taxa de dissolução do β-TCP, juntamente com sua estabilidade química e resistência mecânica adequadas preenche os requisitos dos materiais reabsorvíveis de substituição óssea. O -TCP puro não ocorre em calcificações biológicas, somente sua forma parcialmente substituída por magnésio (Mg) chamada de -TCMP, de formula química (Ca,Mg) 3 (PO 4 ) 2 , é encontrada em tártaro dentário, cálculo renal e salivar, cáries dentárias (BARRERE, VAN BLITTERSWIJK e DE GROOT, 2006;KAMINTAKAHARA, OHTSUKI e MIYAZAKI, 2008;[START_REF] Dorozhkin | Calcium Orthophosphates as Bioceramics: State of the Art[END_REF]. Kondo e colaboradores (2005) examinaram cortes histológicos de côndilos femorais de ratos implantados com -TCP. Observou-se neoformação óssea após 7 dias, com substituição da região do implante por medula óssea decorridos 28 dias.

Células multinucleadas que aderiram ao -TCP em todas as fases assemelhavam-se a osteoclastos que continuamente reabsorviam o biomaterial (KONDO, OGOSE, et al., 2005). Em conjunto com os resultados de outro estudo in vivo descrito por Shiratori e colaboradores (2005), conclui-se que -TCP é um material osteocondutor visto que tanto a reabsorção do material quanto a formação óssea foram iniciadas em fase precoce após a implantação (SHIRATORI, MATSUZAKA, et al., 2005).

Dentre os substituintes catiônicos dos fosfatos de cálcio, o magnésio merece destaque especial, por ser um dos mais importantes íons bivalentes associados ao tecido biológico. Magnésio é o quarto cátion mais abundante no corpo e o segundo mais prevalente no meio intracelular. Em termos fisiológicos, é essencial em muitas reações enzimáticas. Aproximadamente 50-60% do magnésio localiza-se nos ossos, incorporado nos cristais de HA e a deficiência de magnésio na dieta já foi implicada como fator de risco para osteoporose. Quanto às substituições catiônicas na apatita, o íon magnésio é o mais abundante, com aproximadamente 6% mol na cartilagem e tecido ósseo durante a fase inicial da osteogênese, com tendência de redução no osso maduro. Além disso, o magnésio tem um papel importante na atividade das células ósseas. É mitogênico para osteoblastos e sua depleção causa inibição do crescimento celular in vitro devido à resultante redução na síntese de DNA, RNA e proteínas (BIGI, COJAZZI, et al., 1997;WOLF e CITTADINI, 2003;RUDE e GRUBER, 2004;LANDI, LOGROSCINO, et al., 2008).

Biomateriais contendo magnésio já foram sintetizados, dentre eles HA e -TCP substituídas parcialmente por magnésio. Landi e colaboradores (2008) sintetizaram uma série de pós de HA contendo 5-10% Mg, em seguida produziram grânulos de HA-Mg 5,7% e implantaram em defeitos no osso femoral de coelhos: a osteocondutividade (capacidade de suportar o desenvolvimento ósseo) e a reabsorção do material foi maior quando comparado ao resultado obtido com HA comercial. Klammert e colaboradores (2010) cultivaram células MC3T3-E1 em contato com scaffolds de TCP de fórmula Mg 2,25 Ca 0,75 (PO 4 ) 2 durante 21 dias. Verificou-se um aumento considerável na proliferação celular e expressão de fosfatase alcalina, sugerindo um futuro promissor na sua utilização como substituto ósseo (KLAMMERT, REUTHER, et al., 2010). Zhao e colaboradores (2011) compararam o efeito do recobrimento de titânio por HA e HA parcialmente substituida por Mg [Mg/(Mg + Ca) = 10 % mol] na indução da osteogênese in vitro e osseointegração in vivo. Células MC3T3-E1 cultivadas sobre o titanio revestido por Mg-HA promoveram diferenciação osteogênica in vitro e podem melhorar a osseointegração do implante durante as fases iniciais de cicatrização óssea quando comparado com o revestimento de HA pura (ZHAO, JIANG, et al., 2011).

Sader e colaboradores (2009) cultivaram osteoblastos humanos (SaOs2) sob pastilhas sinterizadas de -TCMP (relação Mg/Ca = 0,2 mol) e de -TCP (MERCK) por 4 horas, 24 horas e 7 dias. Verificou-se uma maior proliferação de osteoblastos no -TCMP quando comparado ao -TCP. Estes dados preliminares demonstraram que -TCMP promove adesão e proliferação de osteoblastos humanos. Ainda, a incorporação de magnésio em apatitas cálcio deficientes seguida de sinterização a 1000 o C parece ser uma rota eficaz de obtenção de pastilhas densas com estrutura cristalina do -TCP, apresentando potencial aplicação em regeneração óssea.

(SADER, LEGEROS e SOARES, 2009). Contudo, parte do magnésio poderia estar adsorvida a superfície do material, já que o máximo de substituição de cálcio (Ca) por Mg na estrutura do -TCP é de 0,15 mol (ARAÚJO, SADER, et al., 2009).

Além da frequente utilização como substituto ósseo, recentemente, tem-se estudado nanopartículas de fosfato de cálcio para transferência de DNA ao invés de vetores virais, devido à sua biocompatibilidade, condensação de DNA e capacidade de transferência de genes. Nesta área, nanoparticulas de fosfato de cálcio parcialmente substituidas por Mg foram sintetizadas e caracterizadas fisico-quimicamente. Concluiuse que a presença de íons de Mg reduzem o tamanho da patícula e a cristalinidade das amostras; aumentam a carga positiva da superfície assim como a fração de β-TCP na fração de fases do fosfato de cálcio. Essas propriedades conferem um aumento da capacidade de condensação de DNA, área superficial específica e velocidade de dissolução das amostras, tornado-as assim adequadas para utilização como partículas de transferência de genes (HANIFI, FATHI e VARSHOSAZ, 2010).

II.2 -DISSOLUÇÃO IÔNICA DE FOSFATOS DE CÁLCIO

Um dos mecanismos responsáveis pela bioatividade de fosfatos de cálcio envolve a saída de íons cálcio e fosfato da rede cristalina, com o consequente aumento da concentração de cálcio e fosfato nos espaços entre o osso existente e o enxerto implantado, o que pode favorecer uma aposição óssea mais rápida na superfície do enxerto. Assim sendo, considera-se que biomateriais sintéticos que aceleram o processo de dissolução poderiam potencialmente promover a formação mais rápida de uma camada de apatita e acelerar o processo cicatricial na região do implante (GUTH, CAMPION, et al., 2011).

De fato, a reabsorção in vivo de materiais baseados no β-TCP é controlada por dois fatores: sua própria dissolução no meio e a mediada por células (LI, ITO, et al., 2009). Fatores que afetam a solubilidade dos fosfatos de cálcio incluem o método de síntese, a cristalinidade, a densidade e o grau de substituições iônicas na rede cristalina da apatita (FULMER, ISON, et al., 2002).

No trabalho realizado por Li e colaboradores (2009), pós de -TCMP (0, 2,3, 4,9, 7,3 e 10,1% de Mg) foram imersos em solução tampão 0,08 mol/L de ácido acético/acetato de sódio com pH 5,5 a 25 o C por até 27 meses. Observou-se que a redução da solubilidade do material pode ser atribuída à maior estabilidade estrutural com o aumento da incorporação de íons magnésio. Isto porque a estrutura do -TCP pode acomodar íons com raio iônico na faixa de 0,06 a 0,08 nm (o raio iônico do Mg é 0,072 nm). O grau de dissolução dos materiais é um fator importante, pois está diretamente relacionada à quantidade de íons disponíveis no meio para a neoformação óssea (LI, ITO, et al., 2009). No entanto, também foi reportado que Mg poderia diminuir a cristalinidade e assim aumentar a solubilidade de fosfatos quando substituindo parcialmente o Ca na rede cristalina (MARCHI, DANTAS, et al., 2007;JIA, ZHOU, et al., 2010).

Soluções simuladoras do fluido corporal (SBF) e tampão Tris-HCl são frequentemente utilizados como meio de imersão para avaliar o comportamento in vitro de dissolução dos fosfatos de cálcio, assim como alterações de superfície (FULMER, ISON, et al., 2002;MONTEIRO, ROCHA, et al., 2003). Em solução tipo SBF, que apresenta composição inorgânica similar ao plasma sanguineo humano, os processos de dissolução geralmente são acompanhados por precipitação devido à sua alta concentração de íons cálcio e fosfato (YANG, THOMPSON, et al., 2008). Em adição, materiais bioativos caracterizam-se por sua integração com o tecido ósseo através da formação de uma camada de apatita, que se forma na superfície em contato com o fluido corporal (ZHAO, WANG, et al., 2005;KOKUBO e TAKADAMA, 2006).

A apatita formada é semelhante à biológica, corroborando a aplicação da solução SBF em estudos in vitro. No entanto, a presença de proteínas no sangue é um fator importante no que tange a integração ou rejeição de um biomaterial quando implantado in vivo. Quando um biomaterial é implantado, as proteínas se adsorvem rapidamente à superficie deste, sendo um dos indicadores do sucesso clinico do implante. A solução SBF simula os níveis iônicos do sangue humano, mas não inclui proteínas. Como o objetivo é prever a bioatividade in vivo, meio de cultura celular é um sistema bem estabelecido que simula de modo mais fidedigno o ambiente in vivo, podendo ser utilizado com ou sem proteínas. (JUHASZ, BEST, et al., 2008;LEE, LENG, et al., 2011).

Kandori e colaboradores (2005) estudaram a cinética de dissolução e troca iônica de partículas sintéticas de HA na ausência e na presença de proteínas em diferentes soluções aquosas a 15 o C. Na ausência de proteínas, partículas de HA se dissolveram em pequenas proporções de íons cálcio (0,09-0,14 μmol.m -2 ) e fosfato (0,01-0,08 μmol.m -2 ) em soluções de KCl, CaCl 2 , BaCl 2 e AlCl 3 . A concentração de cálcio aumentou conforme a relação Ca/P da HA aumentou, enquanto que a concentração de fosfato diminuiu. Na presença de albumina de soro bovino (BSA), as partículas de HA se dissolveram de modo ligeiramente mais rápido do que nos ensaios sem proteína. Este fato foi explicado pela complexação de íons adsorvidos a grupos funcionais das proteínas. A adsorção às proteinas no meio induziu uma redução de nas concentrações de cálcio e fósforo em meio aquoso (KANDORI, MASUNARI e ISHIKAWA, 2005). Da Silva e colaboradores (2010) monitoraram as variações nas concentrações de cálcio e fosfato no meio de cultura completo e incompleto em contato com pastilhas de HA e HA parcialmente substituida por silicio (HA-Si), sob condição estática e dinâmica por até 14 dias. Concluiu-se que a imersão estática favorece o processo de dissolução da HA enquanto a condição dinâmica inicialmente induz uma precipitação de fosfato seguida de uma leve dissolução. Estes resultados in vitro indicaram uma manutenção constante dos niveis de cálcio, mas principalmente uma redução da concentração de fosfato em meio de cultura. Portanto, pode-se esperar uma precipitação de uma camada de apatita nas amostras com uma relação de Ca/P inferior a 1,67, correspondente a uma apatita Ca-deficiente (DA SILVA, MATEESCU, et al., 2010).

Guth e colaboradores (2011) avaliaram a troca iônica em pastilhas de HA e HA-Si (Si = 2,6% em peso) em meio de cultura completo (com soro fetal bovino) e incompleto (sem soro fetal bovino) sob condição estática e semi-dinâmica (substituição periódica do meio de cultura) por até 28 dias. Em meio incompleto, variações na concentração de Ca não foram observadas em relação a nenhum dos aspectos (química das pastilhas e condições de cultura). Em meio completo, íons Ca foram liberados da HA-Si sob condições estática e semi-dinâmica, enquanto que com HA a concentração de Ca foi reduzida sob condição semi-dinâmica. Uma redução na concentração de fosfato foi observada em todas as situações, embora maior em meio completo sob condição semi-dinâmica. O estudo mostrou que, sob condições fisiológicas o reservatório de íons disponíveis tanto da HA quanto da HA-Si, na ausência de proteínas do soro é limitado, mas que a presença destas proporcionou uma maior troca iônica, em particular com HA-Si (GUTH, CAMPION, et al., 2011).

II.3 -BIOREATORES

A cultura de células ósseas tem sido realizada tradicionalmente em frascos de poliestireno (ambiente estático) com substâncias bioativas tais como a dexametasona e ácido ascórbico para linhagens ósseas específicas. Bioreatores ósseos disponíveis atualmente permitem o monitoramento adequado e controle de determinados parâmetros biológicos, físicos e químicos durante o processo de formação óssea in vitro (RAUH, MILAN e GUNTHER, 2011). De modo geral, bioreatores são fabricados para alcançar ao menos uma das seguintes funções: distribuição celular uniforme, manutenção da concentração de gases e nutrientes no meio de cultura, transporte de nutrientes às células, exposição das células a estímulo físico e obtenção de informações a respeito da formação tecidual tridimensional. Bioreatores do tipo frascos giratórios assim como frascos perfundidos também têm sido utilizados para aumentar a proliferação celular em scaffolds ósseos. Estudos que utilizam bioreatores para semeadura de células e circulação de meio de cultura através de scaffolds possibilitam a remoção de resíduos e difusão de nutrientes. Em adição, estes mostraram aumentar a proliferação de células ósseas (STEVENS, YANG, et al., 2008).

Existem vários tipos de bioreatores que podem ser classificados pelo modo que estimulam as células, como por compressão, rotação, tensão, perfusão, entre outros.

Entre esses, as culturas por perfusão de fluxo apresentam uma aplicação particular para substitutos ósseos porque acredita-se que a tensão cisalhante induzida pela dinâmica do fluido seja o estímulo mecânico mais importante na ativação de sinais mecanotransdutores dos osteoblastos (PLUNKETT e O 'BRIEN, 2011). Forças aplicadas ao osso durante o movimento corporal resultam em alterações na pressão hidrostática, deformação celular direta e tensão cisalhante induzida pelo fluxo de fluido intersticial ósseo e campo elétrico (RAUH, MILAN e GUNTHER, 2011).

Os bioreatores por perfusão de fluxo geralmente consistem de uma bomba e uma câmara para cultura unidos por tubos, além de dois reservatórios de meio de cultura (um de entrada e outro de saída). O biomaterial é mantido na posição transversal ao fluxo de meio (Figura II.1) (RAUH, MILAN e GUNTHER, 2011). O osso, como todos os órgãos, é continuamente perfundido por fluido intersticial devido a pressão vascular e carga mecânica. Quando um implante, como HA ou TCP, substitui uma região óssea danificada, estará em contato com a composição complexa de líquido ósseo intersticial que circula a 2 mL/h (WANG, UEMURA, et al., 2003). Estudos demonstraram que o fluxo de meio de cultura pode estimular as células ósseas com um consequente aumento de marcadores de formação óssea, podendo também favorecer a mineralização. Bioreatores por perfusão de meio aumentam a expressão de fosfatase alcalina (enzima envolvida na mineralização da matriz óssea) após 7 e 14 dias em uma proporção maior quando comparados com frascos rotatórios, sendo portanto o tipo mais utilizado (GOLDSTEIN, JUAREZ, et al., 2001;PLUNKETT e O'BRIEN, 2011).

II.3 -METABOLISMO ÓSSEO

O osso é uma estrutura porosa mineralizada composta de células, vasos e cristais de fosfato de cálcio (hidroxiapatita). Sua proporção varia de acordo com o tipo de osso e região, e seus componentes estruturais consistem em matriz extracelular (altamente mineralizada), colágeno e células. A remodelação pode ser descrita como o processo no qual o osso é renovado, permitindo a manutenção da forma, qualidade e tamanho do esqueleto. Esta é realizada através da reparação de micro fraturas e da modificação da estrutura em resposta a tensão e outras forças biomecânicas. Todo o processo é coordenado pela ação de osteoclastos e osteoblastos, organizados em unidades multicelulares ósseas que seguem uma seqüência de eventos de ativaçãoreabsorção-formação (HADJIDAKIS e ANDROULAKIS, 2006;DATTA, NG, et al., 2008).

Os osteoblastos, responsáveis pela formação óssea, são envoltos pela própria matriz que sintetizam podendo tornar-se osteócitos, células altamente diferenciadas que apresentam atividade de formação óssea muito menor que os osteoblastos (DATTA, NG, et al., 2008;LEE, KIM, et al., 2008). Osteoclastos, em sua maioria, são células multinucleadas altamente diferenciadas provenientes da linhagem monocítica, formadas para reabsorver a matriz óssea. Outras células presentes no microambiente ósseo como monócitos, macrófagos, linfócitos e células endoteliais também contribuem para a remodelação óssea, seja pelo contato direto com células ósseas ou pela secreção de fatores solúveis. A osteoclastogênese é dependente de duas citocinas chaves: RANKL (receptor ativador do fator nuclear -κB ligante) e M-CSF (fator estimulante de colônias de macrófagos). M-CSF é essencial para a proliferação das células progenitoras de osteoclastos e RANKL controla diretamente o processo de diferenciação através da ativação de RANK (receptor ativador do fator nuclear -κB) (DATTA, NG, et al., 2008;THEOLEYRE, WITTRANT, et al., 2004;ZHANG, EGAÑA, et al., 2012).

Recentemente, várias células mesenquimais, tais como as embrionárias derivadas da medula óssea, do sangue umbilical, do tecido adiposo, da polpa dentária ou do tecido muscular têm recebido um atenção especial na área da bioengenharia óssea devido à sua capacidade biológica distinta de se diferenciarem em linhagens osteogênicas (SEON, KIM, et al., 2010;BAPTISTA, SILVA, et al., 2011). Neste contexto, destacam-se as células mesenquimais derivadas dos estroma ósseo, que parecem se diferenciar in vitro em osteoblastos, condrócitos ou adipócitos sob estímulo adequado no meio de cultura. Como exemplo, podemos citar as células STRO+1A derivadas da medula óssea fetal humana, isoladas e caracterizadas como linhagem clonal homogênea e osteogênica (OYAJOBI, LOMRI, et al., 1999;AHDJOUDJ, LASMOLES, et al., 2001). A diferenciação para quaisquer das três linhagens está sob o controle de fatores hormonais e locais. Dexametasona (Dex), proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) e vitamina D3 podem induzir células estromais da medula de rato e humana à se diferenciar em células osteoblásticas, demonstrado pela expressão de osteocalcina, fosfatase alcalina e colágeno tipo I (AHDJOUDJ, LASMOLES, et al., 2001;HENG, CAO, et al., 2004).

A formação óssea ocorre em três fases sucessivas: a produção e maturação da matriz osteóide, seguido da sua mineralização. Inicialmente, os osteoblastos produzem matriz osteóide pela rápida deposição de colágeno. Em seguida há um aumento na taxa de mineralização para alcançar o nível de síntese de colágeno. Na fase final a taxa de síntese de colágeno é reduzida e a mineralização continua até que a matriz osteóide torne-se completamente mineralizada (HADJIDAKIS e , 2006;DATTA, NG, et al., 2008).

ANDROULAKIS

Os osteoclastos reabsorvem o osso por acidificação e proteólise da matriz óssea e dos cristais de hidroxiapatita encapsulados. A primeira etapa da reabsorção da matriz óssea é a mobilização dos cristais de hidroxiapatita por digestão da sua ligação ao colágeno. Em seguida, as fibras de colágeno residuais são digeridas por catepsinas ou colagenases ativadas, que são então internalizados pelas células (HADJIDAKIS e ANDROULAKIS, 2006;DATTA, NG, et al., 2008).

A tríade molecular OPG/RANK/RANKL está no centro da coordenação da remodelação óssea. RANKL, expresso na superfície de células pré-osteobásticas, liga- O isolamento e caracterização de componentes celulares e extracelulares da matriz óssea resultaram no desenvolvimento de marcadores moleculares que refletem a formação ou reabsorção óssea. A fosfatase alcalina, por exemplo, secretada por osteoblastos no processo de formação óssea, é responsável pela remoção de fosfatos de muitos tipos de moléculas, incluindo nucleotídeos e proteínas. Sua função exata ainda é desconhecida, mas definitivamente apresenta um papel importante na formação de matriz osteóide e sua posterior mineralização. No osso, o colágeno é sintetizado por osteoblastos, sob a forma de procolágeno. Cerca de 85% das proteinas da matriz óssea são colagênicas, predominantemente do tipo I. Estas moléculas precursoras são caracterizadas por peptídeos de pequenas extensões terminais: o propeptidio (N-) amino terminal e o propeptidio (C-) carboxi terminal [START_REF] Seibel | Biochemical markers of bone turnover: part I: biochemistry and variability[END_REF].

II.4 -MACRÓFAGOS E BIOMATERIAIS

A interação entre células do sistema imunológico e a superfície de um material, chamada de reação de corpo estranho, acredita-se determinar, ou pelo menos influenciar fortemente, o sucesso ou fracasso de um material implantado. A reação de corpo estranho, composta por macrófagos e células gigantes do tipo corpo estranho (originadas pela fusão de macrófagos), é a última etapa da resposta inflamatória e cicatricial após a implantação de um biomaterial. , et al., 2004;LANGE, SCHILLING, et al., 2009).

Uma vez que a biocompatibilidade é reduzida quando biomateriais induzem uma elevada produção de citocinas, a indução da expressão destas pode ser usada para avaliar a intensidade de uma reação imune anti-biomaterial (HUMMEL, CZERLINSKI, et al., 1994;DING, SUN e ZHANG, 2007;DING, SUN e ZHANG, 2009).

As citocinas constituem uma rede complexa de proteínas secretadas por inúmeras células inflamatórias e de cicatrização (isto é, linfócitos, macrófagos, monócitos, fibroblastos e neutrófilos), que se ligam a receptores de superfície celulares influenciando o comportamento das mesmas (JONES, CHANG, et al., 2007). Citocinas pró-inflamatórias, tais como interleucina-1 (IL-1), IL-6, e interferon-gama (IFN-), podem aumentar a produção de neutrófilos, estimular a proliferação e maturação de linfócitos. Citocinas anti-inflamatórias (isto é, IL-10, IL-4 e IL-13) são capazes de modular os efeitos de citocinas pró-inflamatórias por inibição da produção de citocinas e/ou bloqueio da ligação com receptores na superfície celular (JONES, CHANG, et al., 2007;[START_REF] Gordon | Alternative activation of macrophages[END_REF]. As principais citocinas envolvidas no processo de reparo tecidual e inflamação estão relacionadas na Figura II.3 (BRODBECK, VOSKERICIAN, et al., 2003). 

IV.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUIMICA DOS MATERIAIS

O microscópio eletrônico de varredura é um equipamento capaz de produzir imagens de alta ampliação e resolução. A morfologia das pastilhas foi observada com auxílio de microscopia eletrônica de varredura -MEV JEOL JSM 6460-LV (Laboratório de Microscopia Eletrônica -PEMM/COPPE/UFRJ).

Microscopia de força atômica (AFM, atomic force microscopy), no modo contato intermitente, foi usada para caracterizar a rugosidade média de superfície, Ra, a partir de 3 imagens quadradas (10 X 10 μm) de regiões diferentes de uma mesma amostra.

Todas as medidas foram realizadas no IS2M/CNRS, em nanoscópio do tipo AFM Multimode Nanoscope IV.

As percentagens de cálcio, fósforo e magnésio nas duas amostras foram determinadas por espectroscopia de emissão atômica com plasma induzido (ICP, inductively coupled plasma, PerkinElmer Optima 3000, USA -EMBRAPA).

A técnica de difração de raios X foi utilizada para determinação das fases A técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourrier (FTIR, Fourier transformed infrared spectroscopy) permite a identificação dos modos de vibração molecular em seus respectivos comprimentos de onda, característicos de cada grupamento químico presente. A análise FTIR (Perkin Elmer, Spectrum 100) foi realizada em pastilhas contendo brometo de potássio (KBr) na seguinte proporção: 0,002g de pó obtido pela trituração das pastilhas sinterizadas, para 0,4g de brometo de potássio (KBr, Merck), no Laboratório Multiusuários do PEMM/COPPE/UFRJ. Os espectros foram obtidos com resolução 4 cm -1 , ganho 1, região espectral 4000 a 500 cm -1 e 16 varreduras (média).

IV.3. DEGRADAÇÃO DAS PASTILHAS EM MEIO DE CULTURA

IV.3a) Sistemas estático e dinâmico

No ensaio estático, as amostras foram dispostas em placas de 24 poços para cultura celular e incubadas em atmosfera a 37 o C/5%CO 2 (Hera Cell, France Todo o sistema era esterilizado antes de cada experimento a 105°C e a 1 Bar em uma autoclave modelo VARIOKLAV do tipo 300/400/500 EP-Z. Já as pastilhas foram esterilizadas em calor seco a 180°C por 1,5 hora.

IV.3b) Morfologia superficial das pastilhas e análise do meio de cultura

As superfícies das pastilhas antes e após imersão no meio de cultura foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) em um microscópio JEOL JSM 6460LV, para verificar a possível formação de cristais de fosfato de cálcio.

A variação da concentração de cálcio, fosfato e magnésio em função do tempo foi determinada através de método colorimétrico utilizando os kits Calcium AS Fluid Stable e Phosphate Fluid Stable, Magnesium XL Fluid Stable (Diasys, França). As análises dos grupos foram realizadas após 7, 14 e 21 dias no meio de cultura ISCOVE (Sigma-Aldrich, EUA) completo e não-completo, em condição estática e dinâmica.

IV.4. CULTURA DE CELULAS OSTEOPROGENITORAS STRO+1A

IV.4a) Cultura sob condição estática e dinâmica

Células osteoprogenitoras STRO+1A (OYAJOBI, LOMRI, et al., 1999) foram cultivadas em meio de cultura do tipo ISCOVE (Sigma-Aldrich, EUA), suplementado com 10% de soro fetal bovino (VWR International, EUA), 1% de L-glutamina e 1% de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich, EUA). Para indução da diferenciação osteoblástica, foi adicionada dexametasona a 10 -8 M (Sigma-Aldrich, EUA) ao meio, tanto em condição estática quanto dinâmica (HENG, CAO, et al., 2004).

As amostras esterilizadas foram dispostas em placas de 24 poços, recobertas com gel de ágar (2% em água). A densidade de 5 x 10 3 células foi inoculada sobre as pastilhas e incubadas a 37°C em atmosfera contendo 5% de CO 2 por 7, 14 e 21 dias, em condição estática.

Para a condição dinâmica, o sistema era composto de duas garrafas, a primeira contendo meio de cultura ISCOVE completo, e a segunda de saída do meio, após passagem pela câmara de cultura onde estavam três amostras (Figura II.1). Foi inoculada a mesma densidade celular, no entanto as pastilhas foram deixadas 24 horas em condição estática na incubadora a CO 2 para garantir a adesão celular sobre as superfícies das mesmas. Em cada câmara de cultura foi colocada três pastilhas a velocidade de meio de 2mL/h (velocidade do líquido ósseo intersticial) (WANG, UEMURA, et al., 2003). Os tempos de análise foram os mesmos da condição estática.

IV.4b) Avaliação da atividade (proliferação) celular

A atividade celular foi obtida através do método colorimétrico utilizando Methylthiazolyl-tetrazolium -MTT (Sigma-Aldrich, EUA). Este método baseia-se na redução do sal tetrazólico dentro das mitocôndrias ativas formando um sal de formazan. Uma solução de 5 mg/mL MTT diluída 10X em tampão fosfato -PBS (Sigma-Aldrich, EUA)

foi colocada em contato com as amostras e incubada a 37ºC por 3h. Após a retirada do MTT, foi colocado isopropanol (Carlos Erba Reagents, França) em meio ácido (0,3% de HCl) durante 10 min. A absorbância foi lida a 570 nm pelo leitor de placa ELISA -ELX800UV (Bio-Tech Instruments, EUA). A quantificação das células viáveis sobre as pastilhas foi efetuada indiretamente pela observação da sua atividade mitocondrial, através de uma correlação linear (curva padrão) entre a absorbância e a concentração de células STRO+1A (de 1 x 10 3 a 5 x 10 3 células/mL). O número de células em cada tempo de cultura foi ajustado de acordo com a superfície as pastilhas (área) e foi expresso como células/mm 2 .

Em ambas as condições estática e dinâmica, as células foram fixadas para a análise da morfologia celular e grau de confluência por MEV. A ativação foi verificada pela determinação dos níveis de nitrito no sobrenadante da cultura de macrófagos, que é um metabolito estável de radicais de óxido nítrico, reconhecidamente produzido por macrófagos ativados (MENG e LOWELL, 1997). Após a exposição a LPS, 100 μL do sobrenadante de cultura foi adicionado a um igual volume de reagente de Griess (1% sulfanilamida, 0,1% de N-1naftil-etilenodiamina, ácido fosfórico a 2,5%) numa placa de microtitulação estéril, e a absorvância foi registada a 540 nm. Os níveis de nitrito foram calculados a partir de uma curva padrão de NaNO 2 com concentrações conhecidas (de 1,6 a 200 μM).

IV.5a) Inoculação do extrato dos grânulos densos

Primeiramente, foi obtido o extrato dos grânulos esterilizados (180 o C/1,5h) na faixa de 250-500 μm, pela incubação de 1 grama de cada amostra em 10mL de meio de cultura RPMI sem soro fetal bovino em incubadora com 5% de CO 2 a 37 o C por 24 horas, de acordo com norma padrão ISO (ISO10993-12, 2007). O extrato consiste no meio de cultura adicionado à parte solúvel do material. O meio de cultura RPMI dos macrófagos (densidade de 1 x 10 6 células) na placa de cultura foi substituído pelo extrato e o SFB foi acrescido de modo a atingir uma concentração final de 10%. Após 24 horas, 48 e 72 horas coletou-se 100 l de sobrenadante da cultura, que foram armazenados em freezer a -80 o C para dosagem posterior das citocinas secretadas.

Como grupo controle cultivou-se os macrófagos com meio RPMI suplementado com SFB. O ensaio foi realizado em triplicata para cada material/tempo e condição (macrófago ativado e não ativado).

IV.5b) Dosagem de citocinas secretadas

Os sobrenadantes armazenados foram analisados para detecção de citocinas Concernant la synthèse de collagène (Figure V.17), une production supérieure est observée sur le β-TCMP par rapport au β-TCP à 7 et 14 jours de culture, suggérant que la présence de Mg peut stimuler la formation du tissu osseux. Toutefois, le système dynamique augmente de façon significative la synthèse de collagène à tous les temps de l'étude (Tableau V.5). Lors de la différenciation ostéoblastique, les cellules expriment différents facteurs (phosphatase alcaline, collagène de type I, ostéopontine, etc.) qui participent à la formation du tissu ostéoïde (la matrice organique de l'os) puis à sa minéralisation (SHU, MCMULLEN, et al., 2003;LIAN e STEIN, 1992). , FERNANDEZ, et al., 2011;WATANABE, ICHIKI, et al., 2007). , et al., 2010). Deste modo, também visando a eliminação da variável área de superficie, os grânulos de ambos os materiais foram peneirados selecionando a faixa de 250-500μm.

CAPÍTULO V RESULTADOS E DISCUSSÃO

Mais uma vez, somente a variável química dos materiais permanece para a análise biológica.

A Figura V.2 mostra os difratogramas de raios X de ambos os materiais A incorporação de Mg na estrutura do TCP refletiu-se no deslocamento dos picos no difratograma (evidenciado pelos ângulos 2θ), devido à substituição parcial de Mg-por-Ca, causando uma contração na dimensão da célula unitária e estabilização da estrutura. Este efeito pode ser atribuído ao menor raio iônico do Mg (0,65 Å) em relação ao Ca (0,99 Å): substituições por íons de menor dimensão levam a uma deformação na rede cristalina, favorecendo sua contração e, ao mesmo tempo, a estabilização da estrutura (TARDEI, GRIGORE, et al., 2006). Os espectros de FTIR (Figura V.3) do β-TCP e β-TCMP após sinterização mostram bandas de fosfato a 1126 e 1025 (3) cm -1 , bem como em 604 e 554 (4) cm - 1 para ambos os materiais, características de fosfatos tricálcico (GIBSON, REHMAN, et al., 2000;SADER, LEGEROS e SOARES, 2009).

Esses resultados em conjunto indicam que foram produzidas pastilhas monofásicas com composição β-TCP e β-TCMP e rugosidade superficial similar. 

V.2. DEGRADAÇÃO DAS PASTILHAS EM MEIO DE CULTURA

Foi determinada a variação da concentração de cálcio, fosfato e magnésio em função do tempo de imersão das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em meios de cultura não completo (MNC) e completo (MC) em condições estática e dinâmica (sistema fechado -2mL/h). Os dados foram expressos como a concentração dos íons no meio subtraída da concentração inicial no meio ISCOVE. Assim sendo, valores positivos refletem uma liberação de íons das pastilhas para o meio e valores negativos uma precipitação destes sobre as pastilhas. Em adição, a superfície das pastilhas foi verificada ao MEV e AFM ao fim de 21 dias para verificar a formação de cristais de fosfato de cálcio e alterações na rugosidade superficial.

V.2a) Análise em condição estática

A Figura V.4 apresenta a variação na concentração de Ca 2+ após imersão das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em MNC e MC por 7, 14 e 21 dias. Tanto para as amostras de MNC quanto para as de MC em contato com β-TCP, verificou-se uma precipitação de Ca durante todo o período estudado, com tendência significativa de redução dessa precipitação ao fim de 21 dias (MNC).

Quanto às amostras de MNC em contato com β-TCMP, verificou-se uma liberação gradativa de Ca 2+ ao longo do período de imersão (p < 0,05). Já nas amostras de MC para o β-TCMP, inicialmente verificou-se uma precipitação de Ca 2+ (7 dias), porém ao fim de 21 dias há uma liberação de Ca 2+ . Assim sendo, ficou evidenciado que a presença de proteínas influencia a dinâmica de dissolução do íon Ca 2+ em meio estático, para ambos os materiais. No caso do β-TCP, houve precipitação mais intensa no MC, já para o β-TCMP, no MC foi observada uma precipitação inicial de Ca 2+ (7 dias), ao contrário do comportamento em MNC. Contudo, o β-TCMP apresentou de modo geral um perfil de liberação de Ca 2+ ao fim de 21 dias, principalmente em MNC.

O comportamento observado de maior redução do íon Ca 2+ no MC, ou seja, na presença de proteínas, já foi reportado anteriormente, e explicado pela complexação de íons dissolvidos a grupos funcionais das proteínas, reduzindo a sua detecção no meio (KANDORI, MASUNARI e ISHIKAWA, 2005).

A maior liberação de Ca 2+ pelas pastilhas de β-TCMP pode favorecer sua bioatividade, conceito associado a disponibilidade de íons no meio favorecendo a deposição óssea por osteoblastos na região do implante (GUTH, CAMPION, et al., 2011).

A Figura V.5 apresenta a variação na concentração de (PO 4 ) 3-após imersão das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em MC e MNC por 7, 14 e 21 dias. Para as amostras de MNC em contato com β-TCP, verificou-se uma precipitação de (PO 4 ) 3- durante todo o período estudado. Já nas amostras de MC para o β-TCP, houve também precipitação durante todo o período, com aumento significativo dessa ao fim de 21 dias.

Quanto às amostras de MNC em contato com β-TCMP, verificou-se também uma precipitação de (PO 4 ) 3-, que aumentou ao longo do período de imersão. Já nas amostras de MC para o β-TCMP, observou-se o mesmo comportamento. MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de (PO 4 ) 3-da pastilha para o meio (); precipitação de (PO 4 ) 3-na pastilha a partir do meio ().

Quanto à dinâmica de dissolução do íon (PO 4 ) 3-, de modo geral, a presença de proteínas não exerceu influência em meio estático, visto que para ambos os materiais e condições foi observado um comportamento de precipitação. Entretanto, comparando-se o β-TCP e o β-TCMP, o primeiro apresentou uma precipitação de (PO 4 ) 3-mais acentuada em ambos os meios (MC e MNC), diferença esta maior no MNC (p < 0,05). Os resultados estão de acordo com o estudo descrito por Guth e colaboradores (2011) em pastilhas de HA-Si e HA incubadas em MC e MNC por até 28 dias, onde também verificaram uma redução da concentração de íons (PO 4 ) 3- disponíveis nos meios analisados.

Apesar de vários estudos envolvendo biocerâmicas de fosfato de cálcio parcialmente substituídas haverem detectado certo grau de dissolução dos materiais, deve-se determinar a taxa de liberação do íon dopado, e uma discussão acerca dos níveis que devem ser alcançados para obtenção de um efeito terapêutico deve ser estimulada [START_REF] Bohner | Silicon-substituted calcium phosphates -a critical view[END_REF]. Isto porque a possibilidade de que a liberação de Ca 2+ , e não do íon dopante, ser responsável pelo possível resultado biológico positivo deve ser considerada, uma vez que os íons Ca 2+ são conhecidos por apresentarem um forte efeito sobre as células ósseas, em particular os osteoblastos (DVOARK, SIDDIQUA, et al., 2004). Uma análise da degradação dos materiais avaliada somente pela liberação de Ca 2+ e (PO 4 ) 3-não pressupõe a liberação do íon dopante da rede cristalina [START_REF] Bohner | Silicon-substituted calcium phosphates -a critical view[END_REF]. Neste ponto, torna-se importante verificar a liberação do Mg 2+ no meio para então associar o efeito da incorporação deste ao resultado biológico observado.

A Figura V.6 apresenta a variação na concentração de Mg 2+ após imersão das pastilhas de β-TCMP em MC e MNC por 7, 14 e 21 dias. Para as amostras de MNC e MC em contato com β-TCMP, verificou-se uma liberação de Mg 2+ durante todo o período estudado, com aumento significativo ao fim de 21 dias. , et al., 2007;JIA, ZHOU, et al., 2010).

Apesar de não ter sido observada uma diminuição na cristalinidade do β-TCMP quando comparado ao β-TCP, através dos dados aqui reportados, verificou-se uma maior liberação de Ca 2+ e Mg 2+ do β-TCMP, assim como uma menor sorção de (PO 4 ) 3- do β-TCMP em relação ao β-TCP.

De acordo com Monteiro e colaboradores ( 2003), o processo de dissoluçãoprecipitação de fosfatos de cálcio é cíclico e rápido, podendo ser dividido em três etapas. Na primeira (30 minutos), a dissolução é muito intensa e predomina sobre a precipitação de novas fases de fosfato de cálcio. No intervalo de 30-80 min, a taxa de precipitação aumenta e equilibra-se com a dissolução. Depois, a precipitação de nova fase de fosfato de cálcio predomina na cinética de dissolução/precipitação (MONTEIRO, CAMPOS DA ROCHA, et al., 2003). Isso sugere uma cinética mais lenta de dissolução-precipitação para o β-TCMP, já que o menor tempo deste estudo foi de 7 dias e o processo dissolução-precipitação se inicia em questão de minutos, ou ainda a ocorrência de mais de um ciclo deste processo dinâmico.

Na verdade, substitutos ósseos de fosfato de cálcio são mecanicamente frágeis [START_REF] Dorozhkin | Calcium orthophosphates[END_REF]. Assim, parece que a melhor estratégia para o reparo de um defeito ósseo é favorecer uma rápida neoformação óssea na região do defeito, implicando na substituição completa do biomaterial por osso neoformado [START_REF] Bohner | Silicon-substituted calcium phosphates -a critical view[END_REF].

Após 21 dias de incubação em MC e MNC, verificou-se a formação de cristais de apatita sobre a superfície de ambas as pastilhas, conforme exemplificado na Figura V.7. As micrografias mostraram que a capacidade de induzir a formação de apatita foi similar entre as biocerâmicas, independente da presença de proteína no meio, ao término do período de incubação. Em adição, a Tabela V. "Controle" corresponde ao tempo zero, ou seja, antes da imersão.

Pastilhas

Meio não-completo Meio completo Ra (nm) Ra (nm) β-TCP controle 95,7 ± 18,4 β-TCP após 21 dias 92,0 ± 11,4 95,2 ± 20,2 β-TCMP controle 105,2 ± 28,8 β-TCMP após 21 dias 98,4 ± 11,1 79,8 ± 12,1

V.2b) Análise em condição dinâmica

Apesar da eliminação da variável quantidade de meio de cultura nos ensaios estáticos e dinâmicos através da fórmula química C=m/v (C= concentração; m=massa; v=volume), já que o kit utilizado nos fornece a concentração e o volume é um dado pré-determinado em ambos os casos, a quantidade de íons ofertada no início do experimento por pastilha permanece diferente (maior em condição dinâmica), não permitindo uma comparação fidedigna com o sistema estático. Outro aspecto que dificulta a comparação dos dois sistemas diz respeito aos materiais utilizados para a fabricação do bioreator. No sistema estático a degradação foi efetuada em placas de 24 poços de poliestireno e no caso do biorreator utilizou-se câmara de teflon e tubos de silicone. Apesar de ambos serem polímeros, ensaios em recipientes diferentes, na geometria e material, podem influenciar a cinética de precipitação de fosfatos de cálcio [START_REF] Marques | Reacções de Superfície de Cerâmicos de Fosfato de Cálcio em Plasma Simulado[END_REF].

A Figura V.8 apresenta a variação na concentração de Ca 2+ após imersão das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em MC e MNC por 7, 14 e 21 dias. Para as amostras de MNC em contato com β-TCP, verificou-se uma precipitação de Ca 2+ até 14 dias, em 21 dias o comportamento observado foi de liberação. Já nas amostras de MC para o β-TCP, houve também precipitação durante todo o período.

Quanto às amostras de MNC em contato com β-TCMP, verificou-se uma precipitação de Ca 2+ ao longo do período de imersão, mesmo comportamento observado em MC. Assim sendo, de modo geral, a presença de proteínas não influenciou a dinâmica de dissolução do íon Ca 2+ em meio dinâmico para o β-TCMP, já que não houve alteração no perfil de precipitação observado. No caso do β-TCP, houve mudança de comportamento em 21 dias no MNC. Esta evidência é oposta à observada em meio estático, onde efetivamente a presença de proteínas alterou a troca iônica pastilha-meio, sugerindo um efeito da velocidade do fluxo de meio de cultura no grau de dissolução das pastilhas.

Da Silva e colaboradores (2010) monitoraram as variações nas concentrações de cálcio e fosfato de meio de cultura completo e incompleto em contato com pastilhas de HA e HA-Si, sob condição estática e dinâmica por até 14 dias. Não houve diferença na concentração de cálcio em nenhuma das condições/pastilhas analisadas, contudo os autores utilizaram um sistema dinâmico aberto, ou seja, com troca constante do meio de cultura. Deste modo, duas variaveis estão presentes: reposição de meio novo e o fluxo do mesmo, limitando uma comparação de resultados.

A Figura V.9 apresenta a variação na concentração de (PO 4 ) 3-após imersão das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em MC e MNC por 7, 14 e 21 dias. Para as amostras de MNC em contato com β-TCP, verificou-se uma liberação de (PO 4 ) 3- durante todo o período estudado. Já nas amostras de MC para o β-TCP, houve predomínio de liberação de (PO 4 ) 3-, com pontual precipitação em 14 dias. Quanto às amostras de MNC e MC em contato com β-TCMP, verificou-se uma liberação de (PO 4 ) 3-nos meios.

Quanto à dinâmica de dissolução do íon (PO 4 ) 3-, verificou-se que a presença de proteínas, de modo geral, não exerce influência em meio dinâmico, ao final de 21 dias de imersão. O comportamento observado em meio dinâmico foi o oposto do meio estático: nesse último não houve influencia do tipo de meio (MC ou MNC) na troca iônica, porém observou-se precipitação ao invés de liberação. Finalmente, parece que a imersão dinâmica, ou seja, o fluxo de meio de cultura favorece a liberação de (PO 4 ) 3- no meio. A Figura V.10 apresenta a variação na concentração de Mg 2+ após imersão das pastilhas de β-TCMP em MC e MNC por 7, 14 e 21 dias. Para as amostras de MNC, verificou-se uma precipitação inicial de Mg 2+ (7 dias), seguida de liberação no meio até 21 dias. Em MC, observou-se praticamente o mesmo comportamento, em 7 dias não houve mudança na concentração iônica de Mg 2+ em relação a quantidade inicial, seguida de liberação a partir de 14 dias. Parece que a presença de proteínas em ambiente dinâmico favorece uma liberação mais rápida de magnésio para o meio. (2009), que relataram uma maior proliferação celular em condição estática sobre pastilhas de -TCMP (Mg/Ca = 0,2 mol) por até 7 dias quando comparado ao -TCP.

As observações ao MEV das células cultivadas sobre as superfícies das pastilhas corroboram os dados de densidade celular obtido pelo ensaio do MTT (Figuras V.13, V.14 e V.15). Ainda, verificou-se visualmente a formação de matriz extracelular e certo grau de mineralização em ambas as pastilhas após 21 dias de cultura celular. 

V.3c) Análise da diferenciação osteoblástica em condições estática e dinâmica

Como já reportado, a dexametasona é uma substância capaz de induzir a diferenciação osteoblástica de células mesenquimais da medula óssea, como a STRO+1A, exatamente de acordo com o protocolo aqui utilizado (AHDJOUDJ, LASMOLES, et al., 2001;HENG, CAO, et al., 2004).

Três períodos distintos na expressão de genes que codificam os marcadores de fenótipo osteoblástico podem ser definidos: um período de proliferação (nos primeiros 12 dias), um período de desenvolvimento da matriz extracelular , MCMULLEN, et al., 2003;LIAN e STEIN, 1992).

Em condição estática, não se observou diferença significativa na produção de fosfatase alcalina entre as pastilhas em mesmo tempo. Já em condição dinâmica verificou-se uma maior produção da enzima para as amostras de β-TCMP em todos os tempos (p < 0,05), sugerindo que a presença de Mg não inibiu a diferenciação osteoblástica (Figura V.16). Os resultados estão de acordo com outros autores que utilizaram fosfatos de cálcio em contato com osteoblastos. A secreção de fosfatase alcalina na presença de cerâmicas bifásicas (HA-TCP) dopadas com Mg foi aumentada quando comparada a cerâmica bifásica sem Mg (KANNAN, GOETZ-NEUNHOEFFER, et al., 2009). Klammert e colaboradores (2010) já haviam relatado um aumento considerável na expressão de fosfatase alcalina após a cultura por 21 dias de células MC3T3-E1 em contato com scaffolds de β-TCMP de fórmula Mg 2,25 Ca 0,75 (PO 4 ) 2 . Ademais, em condição estática (Figura V.17 , et al., 2004). Assim sendo, a produção acentuada de colágeno a 7 dias de culura pode refletir uma maior produção de matriz extracelular para, desse modo, tornar a adesão celular mais efetiva. Entretanto, a condição dinâmica aumentou significativamente a secreção de colágeno em todos os tempos estudados (Tabela V.) quando comparada a condição estática, ou seja, é possível também que o fluxo de meio da condição dinâmica associado à troca de meio constante aumente a secreção de matriz extracelular óssea. Sabe-se que a condição dinâmica se aproxima mais da realidade, uma vez que o fluxo utilizado de 2mL/h corresponde à circulação do líquido ósseo intersticial (WANG, UEMURA, et al., 2003).

Tabela V.5 -Avaliação da secreção de colágeno sob condições estática (Est) e dinâmica (Din). Infecções ocorrem ao redor de implantes mesmo após a inoculação de pequena quantidade de bactérias no biomaterial. Apesar da presença de macrófagos e granulócitos em torno do implante, estes microrganismos não são eliminados. Tais infecções são caracterizados pela sua evolução prolongada, tipicamente observada no tecido periprotético (ZIMMERLI e SENDI, 2011). Considerando-se essas características clínicas, foi levantada a hipótese de que a interação de granulócitos com uma superfície não-fagocitável (isto é, do implante), ou, alternativamente, com partículas de desgaste, pode prejudicar a função de granulócitos (BERNARD, VAUDAUX, et al., 2005).

Marcador ósseo

Sabe-se que infecções associadas a biomateriais são geralmente de origem bacteriana e que LPS é um polisscarideo bacteriano capaz de ativar macrófagos

(MENG e LOWELL, 1997); assim sendo, o contato de macrófagos com LPS simula uma situação de infecção associada a biomaterial, permitindo uma análise da resposta dessas células nesta situação peculiar previamente planejada.

A resposta inflamatória é uma tentativa de proteção do organismo visando a eliminação de estímulos nocivos, como microrganismos e a iniciação do processo de cura. Infecções associadas a biomateriais constituem um grave problema clínico de difícil tratamento que, muitas vezes, necessita de substituição do implante. Estes podem ser contaminados por microorganismos de diferentes maneiras, seja por via direta durante a cirurgia (peri-operatória) ou durante a hospitalização (pós-operatória) (SUBBIAHDOSS, FERNANDEZ, et al., 2011).

Os biomateriais analisados apresentaram um perfil anti-inflamatório, ou seja, macrófagos ativados por LPS expostos aos biomateriais inibiram a produção de citocinas inflamatórias, observação condizente com o fato de que infecções relacionadas a biomateriais são de difícil tratamento. Além disso, estudos prévios já demonstraram que células imunes podem de fato perder sua capacidade de eliminação de bactérias na presença de biomateriais (SUBBIAHDOSS, FERNANDEZ, et al., 2011;WATANABE, ICHIKI, et al., 2007).

O β-TCMP apresentou um perfil anti-cicatrização, similar ao controle (TCPS), ou seja, é possível que na presença de infecção infecção bacteriana, além da resposta inflamatória, o reparo tecidual também seja inibido. O comportamento observado no β-TCP, de modo geral, foi um equilíbrio anti-pró, tendendo para o reparo, além de anti-inflamatório. Os dados demonstram que a presença de Mg no TCP afeta de modo negativo a resposta biológica de macrófagos ativados por LPS, visto que a expressão de citocinas pró-reparo é reduzida (SUBBIAHDOSS, FERNANDEZ, et al., 2011).

Contudo, este resultado é considerado favorável, já que o controle apresentou o mesmo comportamento.

Ao comparar-se os resultados dos macrófagos não-ativados e ativados (Tabela V.6), as citocinas abrangidas no reparo foram as que apresentaram uma alteração mais significativa no perfil: de pró para anti. Ou seja, os biomateriais na presença de infecção apresentam uma tendência a reduzir a expressão de citocinas envolvidas no reparo tecidual, porém mantém o perfil anti-inflamação, necessário para a eliminação de microorganismos associados a estes. quelque soit le régime (statique ou dynamique), ce qui suggère que la présence de magnésium a stimulé la production de matrice osseuse.

 Selon les résultats obtenus, il apparait, qu'en régime dynamique, les forces de cisaillement appliquées sur les cellules par le flux du milieu (0,03 ml/min, la vitesse du fluide interstitiel dans l'os) associées au renouvellement constant du milieu de culture accelérènt la différenciation des ostéoblastes.

 Le matériau synthétisé, le β-TCMP, par comparaison avec le β-TCP, ne modifie en général pas la réponse des macrophages, activés ou non par les LPS.

CAPÍTULO VI CONCLUSÕES

 Por difração de raios X foi identificada uma única fase nas pastilhas e grânulos sinterizados: fosfato tricálcico (β-TCP), no material sem magnésio e whitlockita magnesiana (β-TCMP) no material contendo magnésio. Nesses últimos, foi confirmada, por espectroscopia de plasma, a presença de Mg, provavelmente em solução sólida no fosfato tricálcico.

 De modo geral, a presença de proteínas no meio de cultura parece não influenciar o comportamento de precipitação/dissolução de ambos os materiais sob condição estática e dinâmica. Além disso, após a incubação em ambos os meios de cultura (com ou sem proteínas), em condições estática e dinâmica por 21 dias, verificouse a formação de cristais de fosfato de cálcio sobre a superfície de ambos os materiais, o que é considerado um indicativo da bioatividade das cerâmicas.

 A presença de Mg na estrutura do TCP não modificou a taxa de proliferação das células osteoprogenitoras STRO+1A, tanto sob condição estática quanto dinâmica, após 21 dias de cultura.

 Quanto à diferenciação osteoblástica das células STRO+1A, verificou-se uma maior produção de fosfatase alcalina nas amostras de β-TCMP em todos os tempos sob condição dinâmica, enquanto que sob condição estática, a produção foi similar para ambos os materiais. A presença de Mg na estrutura do TCP em conjunto com os efeitos do fluxo dinâmico de meio estimularam a função osteoblástica das células STRO+1A.

STRO+1A cultivadas sobre as pastilhas de β-TCMP, em ambas as condições de cultura, quando comparado ao β-TCP: a presença de Mg estimulou a secreção de colágeno de modo diferenciado, favorecendo assim a deposição de matriz extracelular.

 Observou-se um deslocamento do pico de produção de fosfatase alcalina de 21 dias (ambiente estático) para 7 dias (ambiente dinâmico) em ambos os materiais, ou seja, o fluxo dinâmico de meio de cultura acelerou a expressão do fenótipo osteoblástico. Sabe-se que a tensão resultante do fluxo de meio (similar ao líquido intersticial ósseo) da condição dinâmica associado à troca de meio constante é um fator importante para a diferenciação osteoblástica.

 O material sintetizado, β-TCMP, de modo geral, não modificou a resposta de macrófagos ativados ou não por LPS, quando comparado ao β-TCP.

CHAPITRE VII (a) SUGGESTIONS D'ETUDES FUTURES

 Étudier la cinétique de dégradation des matériaux sous forme de granules, plus proches de l'application clinique, dans un environnement statique et dynamique ;

 Évaluer l'adsorption des protéines à la surface des biocéramiques, ainsi que l'effet sur la cinétique de dissolution/précipitation après immersion dans le milieu de culture complet ;

 Évaluer la production in vitro d'autres protéines osseuses, comme OPG et RANKL, qui jouent un rôle central dans la régulation du métabolisme osseux ;

 Évaluer l'effet des cytokines inflammatoires sur le métabolisme osseux à travers la co-culture de macrophages et d'ostéoblastes avec les extraits des biomatériaux.

CAPÍTULO VII SUGESTÕES FUTURAS

 Estudar a cinética de degradação dos materiais em forma de grânulos, aproximando-se da aplicação clínica, em tempos menores que 24 horas, tanto em meio estático quanto em dinâmico;

 Avaliar a adsorção de proteínas na superfície das cerâmicas, após imersão em meio completo, correlacionado seu efeito na cinética de dissolução/precipitação dos materiais;

 Avaliar a produção in vitro de outras proteínas do metabolismo ósseo por osteoblastos, como RANKL e OPG, que apresentam papel central na regulação do metabolismo ósseo;

 Avaliar o efeito das citocinas inflamatórias produzidas pelos macrófagos no metabolismo ósseo, através da co-cultura de macrófagos e osteoblastos com o extrato dos biomateriais.

  Figura II.2 -Desenho esquemático mostrando o papel da tríade molecular OPG/RANK/RANKL no controle da remodelação óssea. Adaptado de THIRUNAVUKARASU et al., 2000. ............................................................................. 22

Figura IV. 2 -

 2 Figura IV.2 -Diagrama esquemático do bioreator em sistema fechado, onde o mesmo meio de cultura circula continuamente através da câmara de cultura. ........................ 39 Figura V.1 -Micrografia eletrônica (MEV; aumento 1000X) e perfis 3D/rugosidade média (AFM) da superfície das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após sinterização a 1150 o C/2h. .................................................................................................................. 52 Figura V.2 -Difratogramas do β-TCP (ficha 09-0169 JCPDSprograma PCPDFWIN) e β-TCMP (ficha 87-1582 JCPDSprograma PCPDFWIN) após sinterização a 1150°C/2h. .................................................................................................................. 54 Figura V.3 -Espectros de FTIR do β-TCP e β-TCMP após sinterização a 1150°C. .... 55 Figura V.4 -Alteração na concentração média de íon Ca em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de Ca da pastilha para o meio (); precipitação de Ca na pastilha a partir do meio (). ..................................... 57

  Figura V.7 -Micrografia das superfícies das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após 21 dias de incubação em MC sob condição estática. As imagens das outras superfícies são similares às aqui apresentadas. ........................................................................... 63 Figura V.8 -Alteração na concentração média de íon Ca em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de Ca da pastilha para o meio (); precipitação de Ca na pastilha a partir do meio (). ..................................... 65

  Figura V.10 -Alteração na concentração média de íon Mg em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Asteriscos indicam diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (*mesma amostra); liberação de Mg da pastilha para o meio (); precipitação de Mg na pastilha a partir do meio (). ....................................................................................... 68 Figura V.11 -Micrografia das superfícies das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após 21 dias de incubação em MC sob condição dinâmica. As imagens das outras superfícies são similares às aqui apresentadas. ........................................................................... 70 Figura V.12 -Número de células aderentes ao longo do tempo sobre as superfícies de β-TCP e β-TCMP em (a) condição estática e (b) condição dinâmica. Diferenças significativas para um mesmo tempo de cultura entre as superfícies cerâmicas (*). ... 72 Figura V.13 -Micrografias obtidas por MEV das células STRO+1A cultivadas sobre as superfícies das pastilhas em condição estática e dinâmica (7 dias); aumento 2500X. 73

- 2 .

 2 Por apresentar uma estrutura cristalina, dependendo do íon substituinte, existem limites quanto à quantidade que determinado íon pode ser incorporado (WOPENKA e PASTERIS, 2005; DOROZHKIN, 2007; SHADANBAZ e DIAS, 2012).

  Zhao e colaboradores (2011) compararam o efeito do recobrimento de titânio por HA e HA parcialmente substituida por Mg [Mg/(Mg + Ca) = 10% mol] na indução da osteogênese in vitro e osseointegração in vivo. Células MC3T3-E1 cultivadas sobre o titanio revestido por Mg-HA promoveram diferenciação osteogênica in vitro, podendo melhorar a osseointegração do implante durante as fases iniciais de cicatrização óssea quando comparado com o revestimento de HA pura (ZHAO, JIANG, et al., 2011).

Figura II. 1 -

 1 Figura II.1-Diagrama esquemático do bioreator por perfusão em incubadora a 37 o C/5%CO 2 (sistema aberto). Um tubo de silicone conduz o meio de cultura fresco acoplado a uma garrafa de vidro com filtro de ar para a câmara de cultura contendo as amostras em sentido transversal ao fluxo (as amostras são separadas por um filtro). O fluxo continua através do tubo de silicone até a garrafa de saída de meio. Uma bomba peristáltica localizada antes da câmara mantém o fluxo de meio de cultura constante (2 mL/h).

  se a RANK, na superfície de células precursoras de osteoclastos. M-CSF, que se liga a seu receptor nas células pré-osteoclásticas, parece ser essencial para o desenvolvimento dos osteoclastos, pois é o determinante primário deste grupo de células precursoras. Entretanto, RANKL é um fator crítico para a diferenciação, fusão em células multinucleadas, ativação e sobrevivência dos osteoclastos. Ademais, osteoblastos também secretam osteoprotegerina (OPG), um membro solúvel da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral que age como um ligante de RANKL impedindo sua interação com o seu receptor RANK. Assim sendo, OPG caracteriza-se como um potente inibidor da diferenciação, sobrevivência e ativação dos osteoclastos in vitro e reabsorção óssea in vivo (Figura II.2)(THIRUNAVUKKARASU, HALLADAY, et al., 2000).

Figura II. 2 -

 2 Figura II.2 -Desenho esquemático mostrando o papel da tríade molecular OPG/RANK/RANKL no controle da remodelação óssea. Adaptado de THIRUNAVUKARASU et al., 2000.

Figura II. 3 -

 3 Figura II.3 -Diagrama esquemático do papel de citocinas secretadas por macrófagos nos processos de inflamação e cicatrização. Adaptadode BRODBECK et al, 2003. 



  fator de necrose tumoral (TNF-) e interleucina 1 (IL-1), controlam o sistema imune essencialmente pela estimulação de M-CSF (aumentando o número de células préosteoclásticas) e através de aumento direto da expressão de RANKL[START_REF] Khosla | The OPG/RANKL/RANK system[END_REF]. A citocina IL-1 apresenta duas formas: IL1- (liberada por células em apoptose) e IL1- (produzida por macrófagos), mas sua atividade biológica é indistinguível, induzem a reabsorção óssea. IL-1ra (antagonista do receptor da IL-1) é uma pequena molécula que inibe a atividade biológica da IL-1, ocupando seu receptor tipo I sem suscitar uma resposta de transdução de sinal. Estudos indicaram que IL-10 reduz a secreção das citocinas inflamatórias IL-1, IL-6, IL-8, TNF- e GM-CSF por monócitos/macrófagos, aumentando a produção deIL-1ra (TRINDADE, LIND, et al., 2001; LEE, KIM, et al., 2008). été développée pour évaluer le comportement in vitro de cellules ostéoprogénitrices cultivées dans un environnement statique et dynamique sur des pastilles de β-TCP dopées ou non avec du Mg (β-TCMP ; raison Mg/Ca = 0,15). La cinétique de dissolution des biocéramiques immergées dans le milieu de culture cellulaire a été aussi observée à travers la quantification des ions calcium, magnésium et phosphate dans le milieu. De plus, la réponse des macrophages humains après contact avec des extraits de granules de matériaux a été également évaluée, par la quantification des cytokines produites. desse trabalho foi avaliar o comportamento in vitro de células osteoprogenitoras cultivadas sobre as pastilhas de fosfato tricálcico com e sem magnésio em meio estático e dinâmico. Em adição, foi avaliado também o comportamento de macrófagos humanos in vitro após o contato com o extrato dos grânulos dos materiais, obtidos após trituração das pastilhas. Produzir e caracterizar fosfato tricálcico substituído parcialmente por Mg (TCMP);  Produzir pastilhas de TCP comercial (Merck), e caracterizá-las, sendo este o material referência para comparação dos resultados obtidos com β-TCMP;  Avaliar a cinética de degradação das pastilhas de β-TCP e β-TCMP em meio de cultura completo (com proteína) e incompleto (sem proteína), sob condições estática e dinâmica, através da detecção de alterações na concentração iônica;  Avaliar o comportamento (proliferação e diferenciação) de células de linhagem osteoblástica humana in vitro sobre as pastilhas dos biomateriais, sob condições estática e dinâmica, via dosagens de proteínas ósseas e análise de imagens celulares; Avaliar o perfil de citocinas secretadas por macrófagos humanos in vitro após contato com o extrato dos materiais. Production et caractérisation physico-chimique des échantillons Vu que le phosphate tricalcique ne peut pas être obtenu par précipitation dans une solution aqueuse en raison de son instabilité dans l'eau, il a été synthétisé par frittage à haute température d'une apatite déficiente en calcium (SADER, LEGEROS e SOARES, 2009). L'apatite déficiente en calcium dopée au magnésium (ratio Ca/Mg = 0,15) a été obtenue par précipitation dans un milieu aqueux à partir d'une solution aqueuse d'hydroxyde de calcium [Ca(OH) 2 , pur à 96%, Merck] à 1,3 M et de chlorure de magnésium à 2,8 M [MgCl 2 0,6 H 2 O, PA, Merck], et d'une deuxième solution d'acide phosphorique à 0,17 M [H 3 PO 4 , pur à 85%, Merck]. Les solutions préparées ont été ajoutées lentement grâce à des pompes péristaltiques dans 50 ml d'eau pendant 3 heures sous agitation mécanique constante, à la température de 39°C et au pH=9, maintenu par l'addition d'une solution d'hydroxyde d'ammonium à 50%. Le produit de la réaction a été maintenu pendant 3 heures dans les conditions de synthèse pour stabiliser la formation de l'apatite. Ensuite, il a été rincé avec de l'eau ultra pure jusqu'au pH de 7, puis mis à sécher dans le four pendant deux jours à 37°C. Finalement, la poudre obtenue a été broyée et tamisée à 125 μm manuellement. La mise en forme des poudres (du TCP -Merck et de la poudre synthétisée avec du magnésium) sous forme de pastille a été assurée par pressage sous vide, à froid. Ensuite, elles ont été frittées à 1150 o C pendant 2 heures à l'air (chauffage et refroidissement de 3,3°C/min) puis stérilisées à sec (180 o C/1,5 heure). Les échantillons ont été caractérisés par : diffraction de rayons-X (DRX), spectroscopie d'infrarouge, microscopie électronique à balayage (MEB), microscopie à force atomique et spectrométrie par émission plasma (ICP). Le dosage des ions calcium, phosphate et magnésium a été effectué après l'immersion des pastilles en environnement statique et dynamique dans le milieu de culture complet (avec addition de 10% de sérum de veau foetal) ou non, grâce à des kits Diasys. Culture des cellules ostéoprogénitrices en régime statique et dynamique Des cellules ostéoprogénitrices STRO+1A (inoculation de 5 x 10 5 cellules/échantillon) ont été cultivées en régime statique et dynamique sur des pastilles de β-TCP et β-TCMP pendant 7, 14 et 21 jours. Leur prolifération et leur différenciation cellulaire ont été vérifiés dans les deux régimes de culture cellulaire. De la dexamethasone à 10 -8 M a été ajoutée au milieu de culture afin de stimuler la différenciation ostéoblastique. Pour la condition statique, les cellules ont été cultivées dans des plaques 24 puits. Pour la condition dynamique, les cellules ont été d'abord maintenues pendant 24 heures en condition statique pour atteindre une adhésion complète. Ensuite, les pastilles avec les cellules adhérées ont été installées dans les bioréacteurs (Figure II.1). Un flux de 0,03 ml/min, la vitesse du fluide interstitiel dans l'os, a été établi entre les bouteilles d' « entrée » et de « sortie » (WANG, UEMURA, et al., 2003).La méthode du MTT a été utilisée afin de vérifier la viabilité/prolifération cellulaire. La morphologie cellulaire a été observée par MEB et la différenciation cellulaire a été quantifiée par des dosages de l'activité phosphatase alcaline et de la synthèse de pro-collagène de type I.Culture des macrophages en régime statiqueLes macrophages humains ont été isolés à partir de sang périphérique de donneurs sains, et une partie a ensuite été activée par des lipopolysaccharides (LPS) (10ng/mL pendant 1 heure), activation confirmée par l'augmentation de la concentration en nitrites dans le surnageant de culture (MENG e LOWELL, 1997). Les cellules (10 6 cellules/puits) en culture ont été incubées avec des extraits des deux matériaux (sous forme de granules de 250-500 μm) obtenus dans des conditions normalisées(ISO10993-12, 2007).Après 24, 48 et 72 heures, 100L du surnageant de culture ont été recueillis et congelés à -80°C pour la détermination ultérieure des cytokines sécrétées. La quantification de 16 cytokines a été effectuée par la technologie Luminex ® et les cytokines produites ont été classées en fonction de leur rôle dans la guérison et l'inflammation(Figure II.3).Para a síntese do -TCMP, os números de mols foram definidos em função da composição desejada, 0,15 mol/L, levando-se em consideração a razão molar (Ca + Mg)/P igual a 1,5.Visto que o fosfato tricálcico não pode ser obtido por precipitação em meio aquoso devido a sua instabilidade em água, este foi produzido através da calcinação de uma apatita cálcio deficiente(SADER, LEGEROS e SOARES, 2009). A apatita cálcio deficiente substituída por magnésio foi obtida pelo método de precipitação em meio aquoso a partir de uma solução aquosa de hidróxido de cálcio [Ca(OH) 2 , 96% puro, Merck] a 1,3mol/L, contendo cloreto de magnésio [MgCl 2 .6H 2 O, P.A., Merck] a 0,17mol/L e ácido fosfórico [H 3 PO 4 , 85% puro, Merck] 2,8mol/L. As soluções de cálcio/magnésio e ácido fosfórico foram adicionadas lentamente, com o auxilio de bombas peristálticas, a 50 ml de água durante 3 horas, sob agitação mecânica constante, a 39 o C e pH 9, mantido pela adição de uma solução de hidróxido de amônio a 50%. O produto da reação foi deixado em suspensão, com agitação e aquecimento a 39 o C constantes por 3 horas (tempo de digestão). Em seguida, este foi deixado somente sob agitação por 24 horas à temperatura ambiente.O precipitado foi filtrado até alcançar pH 7 com água ultra pura (Purelab UHQ, Elga), e então posto para secar na estufa por dois dias a 37ºC. O pó resultante foi triturado em grau de ágata manualmente e peneirado a 125 m.IV.1b) Produção das pastilhas e grânulos densosTanto o pó da apatita Ca deficiente substituída por Mg quanto o pó comercial do TCP (Merck, puro, Darmstadt, Alemanha) foram peneirados de modo a selecionar a fração < 125 m.Foi utilizada uma matriz metálica de 13 mm de diâmetro para obtenção das pastilhas, através de prensagem uniaxial a frio (prensa CARVER), sob tensão compressiva de 216 MPa, lubrificada com ácido oleico. Visando alcançar uma máxima densificação, as mesmas foram sinterizadas a 1150 o C por 2 horas em ar (taxa de resfriamento e aquecimento de 3,3 o C/min) em forno tipo mufla (Quimis), com a eliminação do ácido oleico durante o aquecimento. Devido a diferentes níveis de densificação, o diâmetro das pastilhas após sinterização foi também alterado de modo diferenciado para os dois materiais (Figura IV.1), conforme já descrito na literatura (SADER, LEGEROS e SOARES, 2009).

Figura IV. 1 -

 1 Figura IV.1 -Diagrama esquemático das pastilhas após sinterização, mostrando a diferença no diâmetro (áreas β-TCP = 116,8 ± 2,2 mm 2 ; β-TCMP = 98,8 ± 1,7 mm 2 ).

  cristalinas dos materiais após sinterização. O equipamento usado foi o difratômetro SHIMADZU (XRD 6000), configuração theta-2theta, com raio goniométrico de 185 mm e alvo de cobre (radiação Cukα) do Laboratório Multiusuários do PEMM/COPPE/UFRJ. A faixa angular selecionada foi de 0 o a 80°, contudo os difratogramas apresentados mostrarão a faixa de 20 o a 40 o para facilitar a observação dos picos característicos dos materiais. Os traçados resultantes foram analisados no programa PCPDFWIN e comparados com a biblioteca de padrões de difracção conhecidos (JCPDS, Joint Committee on Powder Diffraction Standards).

Figura IV. 2 -

 2 Figura IV.2 -Diagrama esquemático do bioreator em sistema fechado, onde o mesmo meio de cultura circula continuamente através da câmara de cultura.

no

  Luminex. Inicialmente, um kit de 16 citocinas foi utilizado (G-CSF, IL-1, IL-6, IL-8, IL-1ra, MCP-1, MCP-3, MIP-1, MIP-1, MIP-3, TNF-, PDGF-bbfator de crescimento derivado de plaquetas, VEGFfator de crescimento endotelial vascular, IL-10, IFN-, GM-CSF) para rastrear potenciais citocinas que poderiam ser secretadas. Dentre essas, apenas as 11 primeiras foram selecionadas para posterior análise baseando-se nas concentrações medidas e no seu papel no processo inflamatório. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante com todos os reagentes do kit (Kit Procarta Cytokine Assay da Panomics, EUA). Foi feito um pool das amostras em triplicata e, em seguida, executados em duplicata para a medição das citocinas no Luminex. Concentrações da amostra (pg/mL) foram determinadas a partir da intensidade média de fluorescência em comparação com uma curva padrão de quatro ou cinco parâmetros gerada a partir de padrões de concentrações conhecidas contidos no kit. Os valores obtidos foram normalizados pelo dado referente a quantidade de citocinas produzidas pelo grupo controle, cultivado com meio de cultura suplementado com soro fetal bovino em placa de poliestireno de cultura de tecidos (TCPS). IV.6. ANÁLISE ESTATÍSTICA Foi realizada uma análise descritiva a partir do cálculo da média e desviopadrão em cada grupo. Em seguida, utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov para análise da distribuição normal. Após a identificação da normalidade dos dados, aplicou-se a análise de variância do tipo ANOVA a um critério (one-way) e o teste de Tukey: diferenças com p<0,05 foram consideradas significativas. Todo o estudo quantitativo envolvendo células foi realizado em triplicatas de ensaio. Les valeurs des rapports (Ca + Mg)/P et Mg/Ca du β-TCMP ont été définis comme 1,45 et 0,14 par ICP, respectivement. Le rapport molaire (Ca+Mg)/P du β-TCP a été défini comme 1,38, aussi par ICP. L'interaction cellule-matériau est fortement influencée par la rugosité et la topographie de la surface du substrat (PONCHE, BIGERELLE e ANSELME, 2010). Vu que les deux pastilles pressées possèdent des valeurs de rugosité de surface similaires (Figure V.1), on considère que seule la chimie est variable entre les matériaux. Les pics de diffraction (Figure V.2) observés pour la pastille de TCP (2θ: 31,05, 34,43 et 27,84 o ) correspondent à ceux du β-TCP (fiche JCPDS n°09-0169), tandis que les pics de la pastille synthétisée à partir de la poudre dopée (2θ: 31,31, 34,8 e 28,13 o ) correspondent à ceux du β-TCMP (fiche JCPDS n°87-1582). L'incorporation du magnésium dans la structure du TCP est démontrée par le déplacement à droite des pics des diagrammes DRX (selon les angles 2θ). Ceci traduit une substitution partielle du Ca par le Mg qui provoque une contraction de la cellule unitaire suivie d'une stabilisation de sa structure (TARDEI, GRIGORE, et al., 2006). Les spectres FTIR (Figure V.3) montrent, pour les deux types de matériaux, les bandes d'adsorption relatives aux groupements PO 4 caractéristiques des phosphates tricalciques (GIBSON, REHMAN, et al., 2000; SADER, LEGEROS e SOARES, 2009).Dissolution des pastilles a) En régime statique La Figure V.4 montre la variation de la concentration en Ca après l'immersion des pastilles de β-TCP et de β-TCMP dans le milieu de culture complet (MC) ou non (MNC) pendant 7, 14 et 21 jours. Il a été constaté que la présence de protéines modifie l'échange ionique de l'ion calcium pour les deux matériaux. Ce fait peut être expliqué par la complexation d'ions dissous dans le milieu de culture avec des groupes fonctionnels des protéines (KANDORI, MASUNARI e ISHIKAWA, 2005). La libération supérieure de Ca par des pastilles de β-TCMP peut être associée à sa bioactivité, un concept récemment relié à la disponibilité des ions dans l'environnement osseux et promouvant la formation de l'os par les ostéoblastes (GUTH, CAMPION, et al., 2011). La présence des protéines n'a pas modifié la concentration des ions PO 4 dans le milieu de culture ni pour le β-TCP ni pour le β-TCMP (Figure V.5). La libération des ions Mg a été vérifiée dans le MC et le MNC, et augmente avec le temps (Figure V.6). Des études ont rapporté que le Mg pouvait diminuer la cristallinité de l'apatite et augmenter la solubilité des phosphates de calcium à cause d'une substitution partielle du Ca dans le réseau cristallin (MARCHI, DANTAS, et al., 2007; JIA, ZHOU, et al., 2010). Bien que nous n'ayons pas observé une réduction de la cristallinité du β-TCMP, une plus grande libération de Ca et de Mg à partir du β-TCMP a été vérifiée par rapport au β-TCP. b) En régime dynamique La présence des protéines n'a pas modifié l'échange ionique du Ca dans l'environnement dynamique, pour les pastilles de β-TCMP. Dans le cas du β-TCP, un changement du comportement a été observé après 21 jours d'immersion dans le MNC (Figure V.8). Comme ce comportement n'a pas été vérifié en régime statique, on peut conclure que la vitesse du milieu de culture change probablement le taux de dissolution des pastilles. En ce qui concerne les ions (PO 4 ) 3-(Figure V.9), en général, la présence de protéines ne modifie pas l'échange ionique après 21 jours d'immersion dynamique, contrairement à ce qui est observé en régime statique. De plus, il semble que le flux de milieu de culture favorise le maintien des ions (PO 4 ) 3-dans le milieu, vu qu'une précipitation de (PO 4 ) 3-est observée en régime statique. La libération des ions Mg dans le milieu a été observée à partir de 14 jours d'immersion dans un environnement dynamique alors qu'en régime statique la libération commence dès 7 jours (Figure V.10). Le flux de milieu de culture est probablement responsable de la différence de comportement observé. Culture des cellules ostéoprogénitrices en régime statique et dynamique Le nombre de cellules observées sur les surfaces des deux matériaux était le même à la fin de la période de culture (21 jours), que ce soit en régime statique ou dynamique (Figure V.12). Dans un environnement statique, on n'a pas trouvé de différences significatives de l'activité phosphatase alcaline, entre les deux types de matériaux au même temps de culture. Par contre, en régime dynamique, une augmentation de l'activité phosphatase alcaline des échantillons de β-TCMP a été observée à tous les temps de l'étude, suggérant que la présence de magnésium n'a pas inhibé la différenciation ostéoblastique (Figure V.16). De plus, les pics d'activité phosphatase alcaline pour les deux échantillons étaient à 21 jours et à 7 jours de culture, en régime statique et dynamique, respectivement. Cela suggère que les forces de cisaillement, le transport de masse et d'oxygène grâce au passage d'un flux constant de milieu accélère la production de l'enzyme.

  Donc, d'une façon générale, la stimulation des cellules par le passage d'un flux constant de milieu de culture promeut l'expression du phénotype ostéoblastique. Culture des macrophages en régime statique L'analyse des données actuelles est limitée en raison d'un possible effet cytotoxique sur les macrophages en culture des extraits des biomatériaux. En effet, une production supérieure de cytokines peut refléter aussi un plus grand nombre de cellules viables. Afin de comparer effectivement la production de cytokines, le nombre de macrophages viables dans toutes les conditions établies reste à évaluer avant la publication de ces résultats. D'après la Figure V.19, les macrophages non-activés produisent surtout des cytokines anti-inflammatoires et pro-guérison, un résultat similaire à celui trouvé par Schutte et al. (2009), qui ont évalué la production de cytokines par des macrophages non-activés après contact avec différents matériaux. Lors de l'analyse du ratio pro-anti, il n'y a pratiquement aucune différence entre les biomatériaux, ce qui suggère que le β-TCP dopé avec du Mg ne modifie pas la réponse biologique des macrophages. Par ailleurs, le graphique montre que la production de cytokines du groupe témoin (TCPS) est supérieure à celle des biomatériaux, mais cette augmentation reste à valider par le calcul de la viabilité cellulaire, comme expliqué ci-dessus. En ce qui concerne la guérison (Figure V.20), le profil anti prédomine pour le β-TCMP et le groupe témoin (TCPS), tandis que le β-TCP montre un profil procicatrisant. Par rapport à l'inflammation, les deux matériaux montrent un profil antiinflammatoire, tandis que le TCPS a une tendance vers l'équilibre pro-anti. Bien qu'ils présentent le même profil lorsqu'on considère la quantité de cytokines produites, il y a une différence entre les deux matériaux, indiquant que le β-TCP dopé avec du Mg, par la modification de ses propriétés physico-chimiques par exemple, affecte différemment la réponse des macrophages. Les biomatériaux analysés ont induit plutôt un profil anti-inflammatoire, c'est à dire que des macrophages activés par LPS exposés aux biomatériaux ont une production inhibée de cytokines inflammatoires. Ceci peut être mis en rapport avec le fait que les infections liées à l'implantation des biomatériaux sont difficiles à traiter. En effet, des études antérieures ont montré que les cellules immunitaires peuvent tout à fait perdre leur capacité à éliminer des bactéries en présence de biomatériaux (SUBBIAHDOSS

V. 1 .

 1 Figura V.I -Micrografia eletrônica (MEV; aumento 1000X) e perfis 3D/rugosidade média (AFM) da superfície das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após sinterização a 1150 o C/2h.

  Figura V.2 -Difratogramas do β-TCP (ficha 09-0169 JCPDSprograma PCPDFWIN) e β-TCMP (ficha 87-1582 JCPDSprograma PCPDFWIN) após sinterização a 1150°C/2h.

Figura V. 3 -

 3 Figura V.3 -Espectros de FTIR do β-TCP e β-TCMP após sinterização a 1150°C.

Figura V. 4 -

 4 Figura V.4 -Alteração na concentração média de íon Ca em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC.Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de Ca da pastilha para o meio (); precipitação de Ca na pastilha a partir do meio ().

Figura V. 5 -

 5 Figura V.5 -Alteração na concentração média de íon (PO 4 )3-em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b)

  Figura V.6 -Alteração na concentração média de íon Mg em amostras sob condição estática de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Asteriscos indicam diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra); liberação de Mg da pastilha para o meio ().

Tabela V. 1 -

 1 Figura V.7 -Micrografia das superfícies das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após 21 dias de incubação em MC sob condição estática. As imagens das outras superfícies são similares às aqui apresentadas.

  Figura V.8 -Alteração na concentração média de íon Ca em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b) MC.Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de Ca da pastilha para o meio (); precipitação de Ca na pastilha a partir do meio ().

  Figura V.9 -Alteração na concentração média de íon (PO 4 )3-em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCP e β-TCMP em (a) MNC e (b)MC. Diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra) e entre as amostras (# -mesmo tempo); liberação de (PO 4 ) 3-da pastilha para o meio (); precipitação de (PO 4 ) 3-na pastilha a partir do meio ().

  Figura V.10 -Alteração na concentração média de íon Mg em amostras sob condição dinâmica de meio de cultura em contato com pastilhas de β-TCMP em (a) MNC e (b) MC. Asteriscos indicam diferença significativa (p < 0,05; ANOVA) entre os tempos (* -mesma amostra); liberação de Mg da pastilha para o meio (); precipitação de Mg na pastilha a partir do meio ().

  Figura V.11 -Micrografia das superfícies das pastilhas de β-TCP e β-TCMP após 21 dias de incubação em MC sob condição dinâmica. As imagens das outras superfícies são similares às aqui apresentadas.

  Figura V.12 -Número de células aderentes ao longo do tempo sobre as superfícies de β-TCP e β-TCMP em (a) condição estática e (b) condição dinâmica. Diferenças significativas para um

Tabela V. 3 -

 3 Figura V.13 -Micrografias obtidas por MEV das células STRO+1A cultivadas sobre as superfícies das pastilhas em condição estática e dinâmica (7 dias); aumento 2500X.

  Figura V.16 -Nível de atividade da fosfatase alcalina ao longo do tempo sobre as superfícies de β-TCP e β-TCMP em (a) condição estática e (b) condição dinâmica. Diferença significativa

  Figura V.17 -Nível de produção de colágeno ao longo do tempo sobre as superfícies de β-TCP e β-TCMP em (a) condição estática e (b) condição dinâmica. Diferença significativa para um

  Figura V.18 -Efeito do LPS na produção de nitrito pelos macrófagos. * Diferença significativa (p < 0,05).

  Figura V.20 -Produção de citocinas (pg/mL) agrupadas em (a) pró ou anti-reparo e (b) pró ou anti-inflamação a partir de macrófagos não-ativados cultivados com os extratos dos grânulos de β-TCP, β-TCMP e TCPS (controle) após 24, 48 e 72h. Os dados são mostrados como média ± desvio padrão (razão pró/anti).

Tabela V. 6 -

 6 Avaliação do perfil de produção de citocinas quanto ao reparo tecidual e inflamação (pró ou anti) pro macrófagos ativados e não-ativados após contato com extrato dos biomateriais (β-TCP e β-TCMP) e controle (TCPS). sobre o mecanismo de degradação de biomateriais por macrófagos, assim como a resposta contra bactérias associadas a implantes e reparo de tecidos são fundamentais na melhoria dos biomateriais utilizados na engenharia tecidual e medicina regenerativa. Les biomatériaux synthétisés ont été identifiés comme du phosphate tricalcique-β (-TCP) et du β-TCP dopé avec du Mg (β-TCMP), par diffraction de rayons-X. La présence de Mg, probablement en solution solide dans le phosphate tricalcique, a été confirmée grâce à la spectrométrie par émission plasma. De manière générale, l'addition de protéines dans le milieu de culture ne modifie pas le comportement de précipitation/dissolution ionique des deux matériaux, tant en régime statique que dynamique. De plus, après incubation dans les milieux de culture (avec ou sans protéines) pendant 21 jours, en régime statique et dynamique, la formation des cristaux de phosphate de calcium sur la surface des deux échantillons a été observée, ce qui est considéré comme un marqueur de bioactivité des céramiques. En ce qui concerne la prolifération des cellules ostéoprogénitrices STRO+1A, on n'a pas observé de différence significative entre les matériaux sur le nombre de cellules après 21 jours de culture que ce soit en régime statique ou dynamique. À propos de la différenciation ostéoblastique des cellules STRO+1A, les échantillons de β-TCMP ont induit une activité phosphatase alcaline supérieure à tous les temps de l'étude dans un environnement dynamique, tandis que dans un environnement statique la production de l'enzyme était similaire sur les deux matériaux. L'incorporation du Mg dans la structure cristalline du TCP tel que le flux de milieu de culture ont favorisé la différenciation ostéoblastique des cellules STRO+1A. D'une façon générale, une production de collagène supérieure par les cellules STRO+1A a été observée dans les échantillons de β-TCMP (7 et 21 jours)

  

  

  Infecções associadas a biomateriais constituem um grave problema clínico que é difícil de tratar e, muitas vezes necessita de substituição do implante. Os agentes patogênicos, geralmente bactérias, podem ser introduzidos na superfície do implante durante a cirurgia e competir com células hospedeiras na tentativa de se integrar.

	Ding e colboradores (2007) estimularam macrófagos peritoneais de ratos com biomateriais que estavam em contato com as células endoteliais previamente e que a inibição da inflamação também apresenta efeitos no osso. Osteoimunologia é
	diferentes extratos de biomateriais de acordo com as normas ISO 10993-12 e a estimuladas por TNF-α e IL-1β (meio de cultura dos macrófagos). Concluiu-se que a um campo emergente de pesquisa dedicado à investigação das interações entre o
	expressão das citocinas TNF-α e IL1-β foi medido por RT-PCR. Foi observada uma expressão de MCP-1 foi regulada pelo TNF-α e IL-1β e sua expressão poderia ser Citocinas foram analisadas a partir de sobrenadantes de monócitos e sistema imunológico e esquelético. Essas interações não são apenas mediadas pela
	expressão significativamente aumentada por macrófagos não estimulados por LPS utilizada como marcador do grau da resposta imune induzida por biomateriais (DING, macrófagos da linhagem monocitica THP-1 (ATCC) cultivados em biomateriais com liberação de citocinas, mas também por contato direto célula-célula (CAETANO-
	Durante a infecção, os macrófagos detectam as bactérias através de receptores de após contato com extrato do controle positivo (cloreto de polivinila -PVC contendo 8% SUN e ZHANG, 2009). diferentes químicas de superfície. Inicialmente, 27 citocinas foram analisadas através LOPES, CANHÃO e FONSECA, 2009). Em geral, citocinas pró-reabsorção, como o
	superfície celular que se ligam a proteínas bacterianas e opsoninas (SUBBIAHDOSS, de estanho), e politetrafluoroetileno (PTFE), em comparação ao controle negativo Lange e colaboradores (2009) investigaram os efeitos de partículas de HA e -da tecnologia Luminex, contudo somente nove foram selecionadas para continuar o
	FERNANDEZ, et al., 2011). Em seguida, estes são ativados e secretam proteínas e (poliestireno de cultura de tecidos -TCPS). A liga metálica NPG também induziu uma TCP do mesmo tamanho em células mononucleares de sangue periférico humano in estudo, a partir das concentrações medidas e papel na reação de corpo estranho:
	citocinas, além de recrutar outras células imunes para o local. Contudo, a presença de produção moderada de citocinas moderada, contudo ácido poli-lático co-glicólico vitro. Como controle positivo foi utilizado LPS e zymosan (1g/ml) bacterianos. A TNF-, MCP-1, proteína inflamatória de macrófagos-1α (MIP-1), IL-8, IL-1, IL-6,
	um corpo estranho pode prejudicar o sistema imune e, consequentemente, números (PLGA), β-TCP, e cimento de fosfato de cálcio (CPC) não induziram uma expressão
	baixos de bactérias aderentes já podem ser suficientes para causar uma infecção
	Jones e colaboradores (2007), através da cultura de macrófagos humanos
	obtidos a partir de sangue periférico, quantificaram a expressão de citocinas por ELISA
	(técnica imuno-enzimática) após contato com filmes de polietileno de diferentes O mesmo grupo realizou outro estudo no qual foram investigados os efeitos de Basicamente, o sistema Luminex baseia-se em microesferas de poliestireno
	químicas de superfície (hidrofóbico, hidrofílico e iônico) por até 10 dias. IL-4 (15ng/ml) partículas de β-TCP de diferentes tamanhos (1, 3, 13, 32 e 40 μm) em monócitos com 5,6 m de diâmetro coradas internamente com dois fluorocromos distintos.
	derivados de sangue periférico na secreção de TNF-α, IL-1β e IL-8 após 6 e 18 h de Através da utilização de quantidades precisas de cada um destes fluorocromos, mais foi adicionado nos dias 3 e 7 ao meio de cultura para promover a fusão dos Os níveis de RNAm (ácido ribonucleico) da proteína quimiotática de monócitos-1 incubação, bem como os níveis intracelulares em subpopulações determinadas de de 100 esferas diferentes são criadas, possibilitando a detecção de vários analitos macrófagos. De modo geral, a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e IL-6) foi (MCP-1) foram medidos por RT-PCR em ambos os meios. O nível de MCP-1 das monócitos após 12 h. β-TCP (1 μm) não induziu qualquer produção de citocina após 6 (DNA, RNA, proteinas ou citocinas alvo) em uma mesma amostra simultaneamente reduzida com o tempo, enquanto citocinas anti-inflamatórias, como IL-10, aumentaram células cultivadas com o sobrenadante de cultura de macrófagos (TNF-α e IL-1β) foi (DUNBAR, 2006).

(BOELENS, DANKERT, et al., 2000)

.

Lipopolissacarídeo (LPS), um componente da membrana externa de bactérias Gram negativas, é um potente ativador de monócitos e macrófagos. LPS desencadeia a produção abundante de citocinas. A exposição de macrófagos ao LPS bacteriano inicia uma cascata de transdução de sinais que desencadeia um aumento da produção de nitrito (NO 2 -), a secreção de citocinas pró-inflamatórias, e aumento da atividade bactericida, as quais são características típicas de um macrófago ativado

(MENG e LOWELL, 1997)

.

progressivamente. A resolução da resposta inflamatória foi evidenciada por uma diminuição na secreção de IL-8 e MIP-1 com o decorrer dos dias

(JONES, CHANG, et al., 2007)

. detectável. Os níveis de TNF-α e IL-1β aumentaram quando macrófagos estimulados por LPS (1 μg/mL) entraram em contacto com os extratos dos biomateriais. O controle positivo e PTFE induziram uma elevada expressão das citocinas, enquanto PLGA, NPG, β-TCP e CPC induziram uma expressão moderada. Os resultados mostraram que β-TCP e CPC apresentaram um boa biocompatibilidade, e CPC foi o mais biocompatível de todos os biomateriais testados (DING, SUN e ZHANG, 2007).

Em outro estudo, os autores cultivaram macrófagos de ratos estimulados por LPS (1 g/ml) com extratos dos mesmos biomateriais por 2 horas, onde dosagens de citocinas no sobrenadante da cultura revelaram que a expressão de TNF-α e IL-1β foi aumentada por PTFE, PLGA e a liga metálica. Células humanas endoteliais da veia umbilical (ECV-304) foram cultivadas com meio de cultura RPMI-1640, e com meio de cultura de macrófagos estimulados por LPS (contendo TNF-α e IL-1β). Em seguida, foram estimuladas pelos extratos dos biomateriais (1g/5ml de meio por 72 h a 37 o C). maior que o das cultivadas com somente meio de cultura expostas aos mesmos extratos dos biomateriais. A expressão de MCP-1 foi maior em todos os grupos de produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-, IL1-, IL-8) e outras envolvidas na diferenciação de células dendríticas em osteoclastos (OPG, RANKL, M-CSF, GM-CSF) foram determinadas por ELISA. Após 6 e 18 horas de incubação, ambos os materiais causaram uma indução muito similar de TNF-, IL1- e IL-8. Não foram detectados efeitos sobre a produção do M-CSF e OPG. No entanto, em contraste com HA, -TCP causou menos indução de GM-CSF, e nenhuma indução de RANKL, ambos conhecidos por promover a proliferação de células dendríticas e osteoclastogênese, respectivamente. Concluiu-se que partículas de -TCP apresentam uma menor probabilidade de induzir osteoclastos e subseqüente reabsorção óssea quando comparada às partículas de HA

(LANGE, SCHILLING, et al., 2009)

. h, mas aumentou levemente a produção de TNF-α, IL-1β e IL-8 após 18 h. Partículas maiores (32 e 40 μm) induziram níveis mais elevados de citocinas devido a um aumento do número de monócitos produtores. Concluiu-se que um menor tamanho de partícula inicial do β-TCP induz um perfil de citocinas menos inflamatório quando comparadas com partículas maiores

(LANGE, SCHILLING, et al., 2011)

. fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), IL-1ra, IL-10. Estas foram medidas em sobrenadantes de culturas de monócitos/macrófagos em diferentes fases de ativação (estimulados por LPS -1g/ml por 24 horas) e diferenciação (estimulados por PMA -50nM por 72 horas) semeados em polietileno (PE), poliuretano (PU), PTFE, polimetacrilato de metila (PMMA). TCPS e PVC com estanho foram utilizados como controle negativo e positivo, respectivamente. Os resultados mostraram um aumento global das citocinas e na produção do fator de crescimento à medida que os monócitos eram ativados ou diferenciados em macrófagos e que o perfil de citocinas dominante era pró-inflamatório e anti-reparo tecidual. No entanto, a produção de citocinas foi apenas ligeiramente afetada pela química de superfície dos quatro biomateriais testados (SCHUTTE, PARISI-AMON e REICHERT, 2009).

Além do aspecto inflamatório por si só, mas ainda neste contexto, surgem cada vez mais evidências de uma complexa ligação entre o tecido ósseo e o sistema imune,

CULTURA DE CELULAS STRO+1A SOBRE AS PASTILHAS V.3b) Análise da proliferação celular em condições estática e dinâmica

  

	dias), a densidade celular sobre as superfícies das pastilhas foi a mesma. Em adição,
	ao observar o perfil da curva de proliferação celular, tornou-se evidente que para o β-
	TCP a confluência celular foi alcançada em 14 dias, ao contrário do verificado para o
	β-TCMP, onde a proliferação celular apresenta perfil ascendente até 21 dias.
	Já em condição dinâmica (Figura V.12), verificou-se uma inversão do
	comportamento em ambiente estático: inicialmente o número de células nas amostras
	de β-TCP foi maior (p < 0,05). Porém, mais uma vez, ao fim do período estudado (21
	dias), a densidade celular sobre as superfícies das pastilhas foi a mesma. Em
	contrapartida, ao observar o perfil da curva de proliferação celular, ambas as amostras
	apresentaram perfil ascendente até 21 dias.	
	Os resultados obtidos estão de acordo com o estudo de Sader e colaboradores
	Pastilhas	Meio não-completo Ra (nm)	Meio completo Ra (nm)
	β-TCP controle	95,7 ± 18,4
	β-TCP após 21 dias	100,27 ± 6,24	212,83 ± 12,4 *
	β-TCMP controle	105,2 ± 28,8
	β-TCMP após 21 dias	95 ± 11,3	76,7 ± 12,2
	* (p<0,05) na comparação entre β-TCP controle e após 21 dias em MC
	V.3 Em condição estática (Figura V.12), inicialmente o número de células nas
	amostras de β-TCMP foi maior (p < 0,05). Contudo, ao fim do período estudado (21

  De modo geral, a produção de citocinas aumentou de 24 para 48 e 72 horas, em ambas as condições de tratamento (macrófagos ativados ou não por LPS). No

	monócitos/macrófagos. As proteínas quimioatratoras de monócitos (MCP) funcionam
	como potentes quimioatratores para monócitos, basófilos, eosinófilos e linfócitos T,
	grupo não-ativado, um maior nível (> 100pg/mL) de produção de IL1-ra foi observado, excluindo-se os neutrófilos. Já as proteínas inflamatórias de macrófagos (MIP) atuam
	enquanto que no grupo ativado a maior produção observada foi na citocina IL-8. Em no recrutamento e ativação de monócitos, linfócitos T e neutrófilos (MURDOCH e
	ambos os grupos, o controle (TCPS) foi o que apresentou uma maior produção, FINN, 2000; ANDERSON, RODRIGUEZ e CHANG, 2008).
	quando comparado aos biomateriais. Isto sugere que os biomateriais reduzem a A análise dos dados obtidos é limitada devido ao possível efeito citotóxico em
	produção das citocinas, porém, como não foi avaliada a quantidade de macrófagos parte dos macrófagos cultivados com os extratos dos biomateriais.
	viáveis após a exposição aos extratos dos grânulos, este fato pode refletir Consequentemente, uma maior produção de citocinas pode refletir somente uma
	simplesmente um número maior de células produtoras no grupo TCPS. A IL-1 está no maior quantidade de células viáveis. Para a publicação destes resultados, de modo à
	centro da resposta inflamatória, por sua capacidade de recrutar neutrófilos, ativar efetivamente comparar a produção de citocinas, será realizada a quantificação dos
	macrófagos viáveis após exposição aos extratos, assim como no grupo controle. Deste
	modo, a produção de citocinas será apresentada como picogramas/célula.
	Como a produção individual de citocinas é de difícil interpretação, também foi
	analisada a resposta integrada de classes de citocinas, agrupadas de acordo com seu
	papel na inflamação e reparo tecidual em anti e pró, como descrito no capítulo revisão
	Comparando-se os dois grupos de macrófagos (tratados e não-tratados com de literatura na Figura II.2.
	LPS), verificou-se um aumento, após a ativação das seguintes citocinas: no grupo A Figura V.20 mostra o perfil de secreção de citocinas dos macrófagos não-
	controle (TCPS) -IL-1β, IL-6, IL-8, MIP-1α e β, MIP-3α (proteína inflamatória de ativados subdividido em pró-anti reparo (a) e pró-anti inflamação (b), enfatizando a
	macrófagos); no grupo β-TCP -IL-8, MIP-1α; no grupo β-TCMP -IL-6, IL-8, todas razão pró/anti. De modo geral, os dados mostram que os macrófagos não-ativados
	citocinas pró-inflamatórias. Destaca-se a citocina IL-8, a única que apresentou produziram predominantemente citocinas anti-inflamatórias e pró-reparo, resultado
	aumentos nos dois materiais e também no controle. semelhante ao encontrado por Schutte e colaboradores (2009) ao estudarem a
	A IL-6 não só induz a ativação de neutrófilos como também pode atrasar a produção de citocinas por macrófagos não-ativados após contato com diferentes
	eliminação fagocítica dos neutrófilos senescente prolongando desta forma sua ação materiais. Ao considerar-se a razão pró-anti, praticamente não houve diferença entre
	local. O fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) atua os biomateriais, sugerindo que o β-TCMP não afetou a resposta biológica dos
	sobre a linhagem de macrófagos, enquanto o fator estimulante de colônias de
	granulócitos (G-CSF) atua seletivamente em células da linhagem de granulócitos. O

linfócitos e induzir a produção de mediadores inflamatórios. IL-1ra (antagonista do receptor da IL-1) é uma pequena molécula que inibe a atividade biológica da IL-1, através da ocupação do seu receptor celular. Já a IL-8 é uma citocina pró-inflamatória que atua como um potente quimioatrator de leucócitos

(TRINDADE, LIND, et al., 2001; ANDERSON, RODRIGUEZ e CHANG, 2008)

. macrófagos. Além disso, o gráfico mostra que a produção de citocinas do grupo controle (TCPS) é maior que a dos biomateriais, contudo este aumento é questionável,

cellulaire. L'interaction de ces biomatériaux avec des macrophages humains in vitro a aussi été analysée, par la détection et la quantification des cytokines qui interviennent dans l'inflammation. L'influence topographique a été exclue car la rugosité superficielle déterminée grâce à la microscopie à force atomique n'est pas différente entre les pastilles, permettant d'évaluer seulement l'influence chimique sur les réponses biologiques.

Quanto à dissolução de íons Mg, comprovou-se a sua liberação independente da presença de proteínas (MNC e MC), em ambiente estático. Em ambiente dinâmico também foi comprovada a liberação de magnésio, contudo somente a partir de 14 dias, independente do tipo de meio. Isso sugere que o fluxo de meio influencia a troca iônica de Mg pastilha-meio. Esta diferença torna-se relevante quando da análise da resposta biológica inicial (até 7 dias) de osteoblastos em contato com pastilhas deste biomaterial.Após 21 dias de incubação em MC e MNC, verificou-se a formação de cristais de apatita sobre a superficie de ambas as pastilhas, conforme exemplificado na Figura V.11. As micrografias mostraram a formação de apatita para ambos os materiais após 21 dias, independente da presença de proteína no meio, mesmo comportamento observado em condição estática. Em adição, a Tabela V.2 apresenta os valores de rugosidade (Ra) média para β-TCP e β-TCMP após 21 dias de imersão em MC e MNC sob condição dinâmica. De modo geral, não houve diferença significativa na rugosidade superficial das pastilhas, exceto para o β-TCP em meio completo, onde se verificou um aumento significativo da rugosidade, sugestivo de dissolução ou intensa precipitação na pastilha. Contudo, os valores finais de Ca e (PO 4 ) 3-sugerem a prevalência da dissolução.

materiais, sugerindo que o Mg na estrutura do TCP, mesmo que de modo indireto, por alteração de suas propriedades físico-quimicas, por exemplo, afeta a resposta dos macrófagos de modo diferenciado. Schutte e colaboradores (2009), observaram um perfil de citocinas pró-inflamatório e anti-reparo tecidual, este último coerente com os resultados obtidos para o β-TCP e β-TCMP, após exposição de macrófagos ativados por LPS à vários biomateriais.O gráfico mostra também que a produção de citocinas do grupo controle (TCPS) é maior que a dos biomateriais e que, de modo geral, as citocinas apresentam uma tendência de aumento com o tempo, como o observado no experimento com macrófagos não-ativados.

ANEXO I

Dados brutos da concentração das citocinas detectadas no sobrenadante de macrófagos cultivados com extrato dos biomateriais (média com desvio padrão).