sdv.sa
Estática E Dinâmica 
  
Doris Moura Campos 
  
Glória Dulce 
  
Almeida Soares 
  
Karine Anselme 
  
Moura 
  
Doris Moura 
  
  
  
  
  
  
  
CULTIVO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS EM COMPÓSITO 3-D HIDROXIAPATITA-COLÁGENO SOB CONDIÇÕES

Aos meus avós, Luiza e Ilia, por representarem tudo o que eu precisava acreditar. À Elizabeth Zagallo.

"Antes que o navio fosse pensado e construído, houve o sonho de uma terra a que se chegar. O sonho de cruzar os mares precede a ciência de construir navios. A ciência existe por causa do sonho." (Rubem Alves) AGRADECIMENTOS 1.

A Deus, aos guias e a tudo em que acredito ser importante dentro desse Universo infinito, por concederem-me mais uma vitória na caminhada profissional e pessoal. Obrigado pela proteção e força interior que me deram.

2.

Às minhas orientadoras Glória Soares e Karine Anselme, que por muitos momentos não foram apenas chefes, mas também amigas, protetoras e conselheiras. À Glória, por ter me orientado na vida desde tão jovem. Um pedaço dela e de seu trabalho carregarei comigo. À Karine, pour m'écouter pendant les moments difficiles et pour être um exemple de chercheur.

3.

Aos membros da banca pela honra da presença, por avaliarem esse trabalho e o enriquecerem com suas sugestões. Vocês são meus exemplos em suas respectivas especialidades.

4.

À minha pequenina família, que compreendeu o quanto eu precisava desenvolver esse trabalho tão longe de casa. Em especial, à minha avó Luiza Stojanoff, que é meu tudo e à Elizabeth Zagallo, que foi, infelizmente, a última gota de estímulo desse trabalho.

5.

Aos incríveis amigos do incrível Laboratório de Biomateriais do PEMM, mesmo aqueles que já passaram durante esses últimos 8 anos de trabalho. Obrigada a todas as pessoas que não mediram esforços para que nossos momentos juntos sempre fossem de inspiração científica e pessoal. Aos amigos do IS2M, que me receberam e acolheram de maneira única e inesquecível. Aos pesquisadores, professores, engenheiros, técnicos, administrativos, doutorandos e estagiários que contribuíram com esse trabalho e com minha felicidade nos últimos anos.

6.

Ao CNPQ, CAPES, CNRS e FAPERJ pelo apoio financeiro durante a execução desse trabalho.

7.

A todos os amigos "não-científicos", que foram minha luz em momentos de trevas. A todos, mesmo não lembrados, por todo apoio e carinho. The progress in Tissue Engineering area allows the development of biomaterials that mimic the properties of natural tissues. For biomedical applications in mineralized tissues, composites based on hydroxyapatite (HA) and collagen (Col) have presented good results when implanted in vivo. The aim of this work was to produce a 3-D matrix and to observe the cell behaviour when stromal cells are cultured in contact with HA-Col scaffold under static and dynamic conditions. For in vitro biological evaluation, osteoprogenitor human cells (Stro+1A cells) were grown and their colonization capacity and adhesion, proliferation and differentiation behaviour were quantified. Two perfusion flow rates (0,03ml/min and 0,3ml/min) were proposed for dynamic culture.

The HA-Col composite was prepared by reorganization of Col fibrils simultaneously with HA crystal nucleation and precipitation from calcium and phosphate rich solutions.

Afterwards, the composites were crosslinked and sterilized by gamma radiation.

Stro+1A cells were inoculated (5x10 5 cells/sample) into the scaffolds and cultured over 21 days in a humid incubator at 37°C and 5% CO 2 . Infrared spectroscopy and X-ray diffraction results suggested a calcium-deficient hydroxyapatite as mineral phase. About cell culture, the cell number increased under higher flow rate dynamic culture. By scanning electron microscopy and histological sections, we observed cells adhered and spread inside colonized scaffolds.

Lista de Figuras:

Figura IV.1: Diagrama da extração das fibrilas de colágeno através da dissociação das fibras pela solução de ácido acético 0,5M, 10% de pepsina à [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF][START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF]Chang & Tanaka, 2002).

Ce type de matériaux présente une composition chimique similaire à la matrice osseuse naturelle, lui permettant d´être dégradé par les cellules locales [START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF]1999). Une fois que le tissu osseux possède un processus constant de remodélisation, le composite HA-Col fonctionne comme un support temporaire jusqu'au rétablissement total.

En effet, la structure tridimentionnelle lui confère des propriétés telles qu'il lui permettent d'être colonisé par les cellules et ainsi de participer au mécanisme d'adhésion, prolifération et différentiation cellulaire. Dans le composite, les cellules ostéoprogénitrices ont la capacité de produire une nouvelle matrice [START_REF] Vernon | Microgrooved Fibrillar Collagen Membranes as Scaffolds for Cell Support and Alignment[END_REF]. Ce comportement peut être optimisé par la culture dynamique en bioréacteur [START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF][START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF]. Ce complexe tridimensionnelle semblable à un tissu naturel sera utilisé par l'ingéniererie tissulaire. Dentro da área multidisciplinar da bioengenharia tecidual, os materiais biomiméticos destacam-se por possuírem características semelhantes às da própria matriz extracelular na qual serão aplicados [START_REF] Engel | Nanotechnology in Regenerative Medicine: the Materials Side[END_REF]. Para acelerar o reparo da lesão, integram-se facilmente ao tecido original adjacente, sendo substituídos ao longo do tempo e dispensando novas intervenções cirúrgicas.

O tecido ósseo, assim como os outros tecidos do organismo humano, apresenta um constante processo de renovação ou remodelação tecidual. Em taxas interrelacionadas, a deposição de matriz mineralizada, e sua posterior dissolução, ocorrem como resultado da atuação de osteoblastos e osteoclastos, respectivamente.

Porém, quando essas taxas entram em desequilíbrio (osteoporose, por exemplo) ou quando o organismo sofre um processo de injúria (como uma fratura ou um tumor), o organismo deve rapidamente responder aos estímulos externos aplicados. Para isso, os materiais selecionados para intervenções de reparo ou reestruturações ósseas devem se assemelhar a um "osso artificial" (Whal and Czernuszka, 2006;[START_REF] Vallet-Regí | Introduction to the World of Biomaterials[END_REF].

Os biomateriais utilizados no reparo de tecidos duros (ossos e dentes) apresentam propriedades mecânicas, biológicas e/ou estruturais semelhantes às encontradas nos tecidos sadios. Destacam-se as próteses metálicas (que atendem bem aos requisitos mecânicos) e os enxertos poliméricos, cerâmicos e de materiais compósitos. Estes últimos podem ser constituídos por moléculas de diferentes origens (natural/sintética; orgânica/mineral) [START_REF] Comarck | estratégias de Bioengenharia Tecidual na Reconstrução Óssea[END_REF]. A biocompatibilidade, biofuncionalidade e a taxa de biodegradação/ reposição do tecido natural são algumas características requeridas ao biomateriais utilizados [START_REF] Zhang | Nanotechnology and Nanomaterials: Promises for Improved Tissue Regeneration[END_REF].

Atualmente, a produção de arcabouços 3-D vem ganhando um amplo espaço dentro da comunidade científica graças às novas condições de cultivo. A cultura estática, tradicionalmente utilizada desde o início do século XX, apresenta limitações em relação ao aporte de gases e nutrientes, restringindo o desenvolvimento de arcabouços de grandes dimensões (Zhang et al., 2009;[START_REF] Martin | The Role of Bioreactors in Tissue Engineering[END_REF]. A introdução de câmaras -ou biorreatores -com transporte de massa constante aprimora a troca de oxigênio, nutrientes e excretas celulares [START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF][START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF].

As aplicações para esse novo cultivo vão desde a fabricação de biomateriais homogeneamente colonizados por células, até como modelos para a descrição de diferentes patologias (Zhang et al., 2009;[START_REF] Martin | The Role of Bioreactors in Tissue Engineering[END_REF].

Com respeito à produção de materiais biomiméticos para bioengenharia óssea, o uso de compósitos baseados em hidroxiapatita (HA) e colágeno tipo I (Col I) pode potencializar o reparo quando aplicados às lesões [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF][START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF]Chang and Tanaka, 2002a,b). A apatita biológica é o principal fosfato de cálcio encontrado na matriz óssea mineralizada e essa característica permite ao osso desempenhar sua função de sustentação do organismo. Colágeno tipo I é a proteína mais abundante da matriz orgânica óssea conferindo-lhe tenacidade. O compósito natural formado por essas duas moléculas pode ser sintetizado in vitro e utilizado como biomaterial biomimético [START_REF] Kikuchi | The biomimetc synthesis and biocompatibility of self-organized hydroxyaoatite/collagen composites[END_REF][START_REF] Long | Osteogenesis and Bone-Marrow-Derived Cells[END_REF].

O objetivo de se produzir esse compósito está relacionado, a médio prazo, em sua taxa de substituição por tecido ósseo neoformado. No decorrer desse processo, devem oferecer o suporte mecânico até o tecido regenerar-se e remodelar-se naturalmente. Podem ser implantados com células específicas no estágio desejado e com moléculas sinalizadoras a fim de maximizar o crescimento do tecido e, portanto, a velocidade do reparo. Adicionalmente, resistem às forças de cisalhamento inerentes ao cultivo dinâmico em perfusão, pois suas razões de degradação e reabsorção também podem ser controladas com processos físico-químicos, como a reticulação das fibrilas de colágeno durante o processo de produção (Wahl & Czenuska, 2006;[START_REF] Usha | Structure and conformation of intramolecularly Cross-linked Collagen[END_REF][START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF].

A compreensão dos processos relacionados ao cultivo dinâmico de células em arcabouços 3-D contribui para a evolução das pesquisas na área de biomateriais para aplicações biomédicas. A fabricação de biomateriais complexos, com estrutura e propriedades controladas, colonizados por células em processo de diferenciação no interior de biorreatores pode nos levar a uma nova geração de biomateriais mais similares aos órgãos naturalmente formados. De uma maneira mais direta, esses 

II(a)-BIBLIOGRAPHIE

Le vieillissement progressif de la population actuelle aura comme conséquence l'augmentation du taux de maladie chronique (tumeurs, arthrites, etc). Les progrès de la médecine régénérative conduisent à une amélioration des conditons de vie des malades.

L'utilisation déjà importante de cellules souches comme thérapie pour le traitement des différentes pathologies permet d'envisager de nouvelles perspectives. De plus, depuis la découverte du potentiel d'auto-régénération des tissus dans l'orgnisme humain, les recherches s'orientent vers cette capacité naturelle [START_REF] Vernon | Microgrooved Fibrillar Collagen Membranes as Scaffolds for Cell Support and Alignment[END_REF].

Dans ce domaine, la bioingénierie tissulaire réunit ces connaissances avec le développement des supports temporaires tridimentionnelles qui serviront de substituts biomimétiques [START_REF] Engel | Nanotechnology in Regenerative Medicine: the Materials Side[END_REF]Whal and Czernuszka, 2006). Les différents matériaux, comme des molécules organiques naturelles, peuvent être fonctionnalisées afin de garantir la réussite du traitement [START_REF] Zhang | Nanotechnology and Nanomaterials: Promises for Improved Tissue Regeneration[END_REF][START_REF] Comarck | estratégias de Bioengenharia Tecidual na Reconstrução Óssea[END_REF].

Les « complexes structurés » sont selectionnés pour présenter des propriétés similaires aux tissus substitués (Whal and Czernuszka, 2006 ;[START_REF] Vallet-Regí | Introduction to the World of Biomaterials[END_REF]. Des cellules progénitrices cultivées à l'intérieur de ces structures ont la capacité de les coloniser et de produire une nouvelle matrice extracellulaire. Les complexes peuvent encore servir de source pour la libération contrôlée de biomolécules comme les antibiotiques (Whal and Czernuszka, 2006;[START_REF] Friess | Collagen -Biomaterial for Drug Delivery1[END_REF].

Récemment, les avancements dans le champ de la culture dynamique à l'intérieur des bioréacteurs permet la construction des biomatériaux de dimensions plus importantes (Zhang et al., 2009 ;[START_REF] Martin | The Role of Bioreactors in Tissue Engineering[END_REF]. Le transport de masse constant optimise l'échange des gaz, de substances nourrissantes ainsi que des dêchets cellulaires [START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF][START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF]. Cependant, l'utilisation de bioréacteurs standartise la production de « complexes structurés », éléve les potentiels cellulaires et diminue les coût de conception [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF][START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF]Yeatts et al., 2011a, b).

Pour l'ingéniererie des tissus osseux, les composites tridimensionnelles à base de hydroxyapatite (HA) et collagène (Col) montrent de bons résultats in-vitro et in-vivo [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF][START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF]. La capacité ostéoconductrice de l'HA et la baisse immunogénicité du Col potentialisent leurs applications dans les os et les dents [START_REF] Kikuchi | The biomimetc synthesis and biocompatibility of self-organized hydroxyaoatite/collagen composites[END_REF][START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF]. En effet, la surface de fibre de Col favorise l'adhésion cellulaire pendant que le procédé de minéralisation augmente les propriétés mécaniques [START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF].

Afin de maintenir la structure du composite en culture dynamique, nous pouvons réaliser des liaisons chimiques entre les résidus des amino-acides des fibres de Col. Le composite réticulé par le glutaraldéhyde présente le meilleur résultat, malgré sa citotoxicité connue [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF][START_REF] Usha | Structure and conformation of intramolecularly Cross-linked Collagen[END_REF]. Néanmoins, l'usage en faible concentration et la stabilité de ses liaisons encouragent son utilisation.

Une fois réticulé, il résiste aux forces de cisaillemenent provoquées par le flux des systèmes dynamiques.

L'étude du comportement cellulaire sur les composites HA-Col sous les conditions statiques et dynamiques contribue au développement des nouvelles technologies en bioingénieureries tissulaires. La biodégradabilité contrôlées de la matrice minéralisées et la capacité de différenciation des cellules ostéoprogénitrices sont deux propriétés primordiales dans la réparation totale tissulaire et la restauration de l'équilibre de l'organisme. [START_REF] Zhao | Preparation and Histological Evaluation of Biomimetic Threedimensional Hydroxyapatite/Chitosan-Gelatin Network Composite Scaffolds[END_REF]. O tecido adjacente passou a ser visto como uma ferramenta importante para o sucesso da integração do material no sítio de aplicação.

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

A bioengenharia tecidual é uma área multidisciplinar que pode ser classificada como medicina regenerativa pois substitui tecidos e órgãos danificados por substitutos funcionais e estruturalmente equivalentes [START_REF] Carvalho | Bioengenharia Tecidual: Uso de Células Tronco na Prática Médica[END_REF]. Agregando o termo "biomimética", esses materiais planejados apresentam sua constituição e/ou função semelhantes aos encontrados nos tecidos vivos (Whal and Czernuszka, 2006;Vallet-Regí & arcos, 2005;[START_REF] Vallet-Regí | Introduction to the World of Biomaterials[END_REF].

Dentre inúmeras propriedades, a bioengenharia tecidual faz uso de arcabouços tridimensionais (3-D) biocompatíveis, células autólogas e moléculas sinalizadoras que são implantados no paciente conjuntamente [START_REF] Barbanti | Polímeros Bioreabsorvíveis na Engenharia de Tecidos[END_REF][START_REF] Hardouin | Ingénierie tissulaire et maladies du squelette[END_REF]. Esse "complexo" de moléculas fornece elementos que irão favorecer: a diferenciação de células progenitoras implantadas e do tecido adjacente, a integração e substituição gradativa do material e, conseqüentemente, a retomada da saúde do indivíduo (Yeatts & Fisher, 2011).

Portanto, no interior dos biomateriais, células pluripotentes teciduais podem ser estimuladas bioquimicamente a proliferarem, diferenciarem e criarem uma nova matriz extracelular, resultando na substituição progressiva do material implantado [START_REF] Vernon | Microgrooved Fibrillar Collagen Membranes as Scaffolds for Cell Support and Alignment[END_REF] [START_REF] Zhang | Nanotechnology and Nanomaterials: Promises for Improved Tissue Regeneration[END_REF][START_REF] Engel | Nanotechnology in Regenerative Medicine: the Materials Side[END_REF].

Os materiais utilizados devem permitir a adesão das células do paciente e manter-se como um arcabouço 3-D durante todo o processo de manipulação in vitro.

Adicionalmente, devem ser bioativos e apresentar: poros, para a infiltração de vasos sanguíneos; pontos de ancoragem e sinalização celular, que facilitam a adesão, proliferação e diferenciação das células progenitoras da linhagem correspondente; resistência mecânica, para sustentar o tecido neo-formado; e uma razão de degradação compatível com a velocidade de deposição da matriz e formação do novo tecido [START_REF] Dawson | Development of Specific Collagen Scaffolds to Support the Osteogenic and Chondrogenic Differentation of Human Bone Marrow Stromal Cells[END_REF][START_REF] Wiesmann | Aspects of Collagen Mineralization in Hard Tissue Formation[END_REF][START_REF] Rose | Bone Tissue Engineering: Hope vs Hype[END_REF].

A biocompatibilidade dos materiais segue uma relação particularmente estreita com o ambiente de contato e a adesão das células na superfície. Por apresentarem estruturas vivas, os estudos de determinadas interações celulares com os diversos biomateriais possuem alguns incovenientes, como o envolvimento de muitos e simultâneos parâmetros, os quais alguns não podem ser completamente controlados [START_REF] Anselme | Osteoblasts Adhesion on Biomaterials[END_REF][START_REF] Anselme | Modeling Approach in Cell/Material Interactions Studies[END_REF].

Dentre os biomateriais utilizados atualmente em bioengenharia do tecido ósseo, os compósitos formados por uma fase mineral depositada numa matriz tridimensional orgânica vêm se destacando [START_REF] Dolatshahi-Pirouz | Cell shape and spreading of stromal (mesenchymal) stem cells cultured on fibronectin coated gold and hydroxyapatite surfaces[END_REF][START_REF] Swetha | Biocomposites Containing Natural Polymers and Hydroxyapatite for Bone Tissue Engineering[END_REF][START_REF] Sotome | Synthesis and In-vivo Evaluation of a Novel Hydroxyapatite/Collagen-Alginate as a Bone Filler and a Drug Delivery Carrier of Bone Morphogenetic Protein[END_REF]. Esses biomateriais apresentam propriedades desejadas, como a facilidade de manipulação, osteocondução e indução e biodegradabilidade [START_REF] Wang | Composite Scaffolds for Bone Tissue Engineering[END_REF]. Cadeias poliméricas naturais, como proteínas, podem servir de suporte à mineralização e facilitar a integração com o tecido adjacente. Destacam-se os compósitos hidroxiapatita-colágeno, cujas aplicações in vivo demonstraram bons resultados, como a capacidade de permitir o processo de remodelação e nova formação de tecido ósseo (Kikuchi et al. 2004a[START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF][START_REF] Itoh S | Development of an Artificial Vertebral Body using a Novel Biomaterial, Hydroxyapatite/Collagen Composite[END_REF][START_REF] Dong | Application of Low-pressure System to Sustain In-Vivo Bone Formation in Osteoblast/Porous Hydroxyapatite Composite[END_REF].

II. 3-COMPÓSITOS HIDROXIAPATITA-COLÁGENO

Um grande avanço na produção de compósitos baseados em hidroxiapatita (HA) e colágeno (Col) tem sido relatado nos últimos 15 anos (Kikuchi et al., 2004a(Kikuchi et al., , 2004b;;[START_REF] Long | Osteogenesis and Bone-Marrow-Derived Cells[END_REF]1999;Ficai et al., 2010a,b). A partir do conhecimento da nanoestrutura da matriz óssea, muitos pesquisadores têm assumido que uma combinação nanoestruturada entre HA e Col seria o melhor biomaterial a ser utilizado em intervenções ósseas [START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF]Chang & Tanaka, 2002a, b). Kikuchi et. al. (2004a,b;[START_REF] Long | Osteogenesis and Bone-Marrow-Derived Cells[END_REF]1999) Compósitos HA-Col podem ser classificados como materiais biomiméticos [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF][START_REF] Pek | Porous Collagen-apatite Nanocomposite Foams as Bone Regeneration Scaffolds[END_REF][START_REF] Rhee | Biomimetic Configurational Arrays of Hydroxyapatite Nanocrystals on bio-organics[END_REF]. As reações biomiméticas são baseadas na idéia que sistemas biológicos armazenam e processam informações estruturais ao nível molecular (Chang & Tanaka, 2002a,b). Sua nanoestrutura é semelhante a da matriz óssea naturalmente formada durante o processo embrionário, onde nanocristais de HA são embebidos numa matriz orgânica. A nucleação dos cristais de HA ocorre dentro e sobre as fibras de Col durante a síntese [START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF][START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF].

Para atingir tal resultado, a síntese da HA deve ser concomitante à re-agregação das fibrilas de Col em ambiente com temperatura e pH controlados (Ficai et al., 2010a,b;[START_REF] Sena | Synthesis and Characterization of Biocomposites with Different Hydroxyapatite-Collagen Ratios[END_REF][START_REF] Kannan | Bio-composites: A Review of Literature[END_REF].

Os compósitos HA-Col têm demonstrado grande biocompatibilidade quando colocados em contato com células da linhagem óssea (in vitro) ou com as do próprio tecido ósseo (in vivo). Em trabalhos utilizando ensaios in vivo, o compósito HA-Col apresentou boa osteocondução e biointegrabilidade (sem formação de cápsula fibrosa) [START_REF] Itoh S | Development of an Artificial Vertebral Body using a Novel Biomaterial, Hydroxyapatite/Collagen Composite[END_REF][START_REF] Dong | Application of Low-pressure System to Sustain In-Vivo Bone Formation in Osteoblast/Porous Hydroxyapatite Composite[END_REF]. Observou-se osteoclastos em lacunas de Howship´s ao redor dos compósitos aplicados, indicando o início do processo de absorção e remodelação em experimentos in-vivo após 8 semanas. [START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF].

Em experimentos utilizando o arcabouço compósito HA/Col, [START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF] apresentam como resultado uma total regeneração da lesão em tíbias de coelhos. Ao final do 1 o mês, o grupo descreve a formação massiva de uma rede de capilares, ocupação por células sanguíneas, presença de infiltrado inflamatório; no 2º mês, a maior parte do defeito estava ocupado por nova matriz óssea; colorações evidenciaram a alta atividade de secreção de colágeno por parte das células locais; observou-se ainda a degradação do material, separado por seus resíduos; ao final do 4º mês, a substituição do biomaterial por um novo osso trabecular foi completa.

Colágeno compreende uma família de moléculas de matriz extracelular responsáveis pela integridade e propriedades mecânicas de tecidos conjuntivos moles e rígidos, incluindo córnea, pele, tendão, cartilagem e osso. Apesar de menos bioativa que a natural, a HA sintética apresenta a habilidade de ligar-se diretamente ao tecido ósseo adjacente do sítio implantado, sem a formação de cápsula fibrosa [START_REF] Kalita | Nanocrystalline Calcium Phosphate Ceramics in Biomedical Engineering[END_REF][START_REF] Rouahi | Quantitative kinetic analysis of gene expression during human osteoblastic adhesion on orthopaedic materials[END_REF][START_REF] Campbell | Bioceramics for implants coatings[END_REF]. Para uso clínico, a HA sintética apresenta boa compatibilidade e osteointegratividade [START_REF] Uemura | Transplantation of Cultured Bone Cells Using Combinations of Scaffolds and Culture Techniques[END_REF].

A matriz 3-D orgânica baseada em fibras de Col ancora as células mediadas pela adesão inicial entre as integrinas da membrana celular e as regiões RGD (Arginina -Glicina -Ácido Aspártico) das fibras. Quando total ou parcialmente mineralizadas, as fibras apresentam maior resistência mecânica, otimizando as características do biomaterial e ainda mantendo sua plasticidade e propriedades dúcteis. Entretanto a estrutura das fibrilas de Col mineralizadas a nível nanométrico ainda não está totalmente clara e é objetivo de intensa pesquisa [START_REF] Gelinsky | Porous Three-Dimensional Scaffolds Made af Mineralised Collagen: Preparation and Proporties af a Biomimetic Nanocomposite Material For Tissue Engineering af Bone[END_REF][START_REF] Landis | The structure and Function of Normally Mineralizing Avian Tendons[END_REF].

II. 4-RETICULAÇÃO

A regeneração do tecido ósseo é uma reconstrução extremamente complexa, com uma taxa de renovação tecidual marcadamente inferior às dos tecidos epitelial e sanguíneo. Portanto, podemos presumir que o processo de remodelação da matriz óssea corresponda a uma etapa de longa duração, exigindo que o material implantado tenha uma adequada resistência à degradação naturalmente realizada.

Propriedades mecânicas e resistência à degradação são peças-chave em aplicações biomédicas no tecido ósseo [START_REF] Liu | Biomimetic Synthesis of Collagen/Nano-hydroxyapatite Scaffold for Tissue Engineering[END_REF][START_REF] Oreffo | Future Potentials for Using Osteogenic Stem Cells and Biomaterials in Orthopedics[END_REF]. Essas características devem ser avaliadas durante as fases de seleção e produção dos materiais.

Adicionalmente, devem ser consideradas as diferentes condições encontradas no ambiente in vivo, com constante requerimento mecânico, presença de fluidos (líquido intersticial) e secreções celulares (biodegradação).

Arcabouços 3-D baseados em Col podem ser quimicamente modificados devido a grande quantidade de grupos reativos (aminas (NH 2 ), ácido carboxílico (COOH) e hidroxilas (OH)) na superfície das fibras [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF][START_REF] Bigi | Mechanical and Thermal Properties of Gelatin Films at Different Degrees of Glutaraldehyde Crosslinking[END_REF]. Essas reações permitem a otimização das propriedades estruturais, mecânicas e fisico-químicas, o que possibilitariam novas aplicações no campo dos biomateriais.

Além disso, esses materiais são geralmente estabilizados por ligações cruzadas para reduzir sua imunogenicidade [START_REF] Jiang | Electron Beam Irradiation Modification of Collagen Membrane[END_REF].

Compósitos HA-Col não tratados quimicamente degradam rapidamente in vivo, resultando no decréscimo da resistência mecânica (Kikuchi, 2004b). [START_REF] Friess | Collagen -Biomaterial for Drug Delivery1[END_REF] observou que filmes de colágeno que não sofreram ligações cruzadas químicas adicionais são degradados em 2-7 semanas. A degradação do material pode ocorrer pelo processo celular de fagocitose (onde células englobam partículas sólidas) ou pela digestão das fibrilas de colágeno e dos cristais de HA pela queda do pH, resultante da secreção de enzimas.

Glutaraldeído (GTA) é o reagente aldeídico mais extensivamente utilizado para formar rapidamente ligações cruzadas via base de Schiff. Desde os últimos 25 anos, pacientes vêm recebendo válvulas cardíacas fixadas por GTA com bons resultados; sem terapia anticoagulante, as válvulas apresentam biocompatibilidade e são nãotrombogênicas [START_REF] Jayakrishnan | Glutaraldehyde as a Fixative in Bioprotheses and Drug Delivery Matrices[END_REF]. Apesar do uso de GTA ser clinicamente aceitável, alguns resultados relativos à sua toxicidade ainda são observados. Eles estariam relacionados à degradação química, envolvendo quebra da estrutura de tripla-hélice do Col e liberação de resíduos ou grupos funcionais não ligados oriundos do processo de reticulação [START_REF] Bigi | Mechanical and Thermal Properties of Gelatin Films at Different Degrees of Glutaraldehyde Crosslinking[END_REF].

As ligações cruzadas são formadas entre os grupos ε-amino das cadeias laterais dos aminoácidos lisina e hidroxilisina presentes nas fibras de colágeno. Também ocorrem ligações do tipo aldol entre os aldeídos adjacentes. Após a formação dessas ligações, uma grande variedade de reações subseqüentes está envolvida no processo de total reticulação do material (Chang & Tanaka, 2002a,b;[START_REF] Friess | Basic thermoanalytical studies of insoluble collagen matrices[END_REF].

Comparado com formaldeído e outros aldeídos fixadores, o processo de reticulação utilizando GTA em colágeno e albumina apresenta uma maior estabilidade [START_REF] Jayakrishnan | Glutaraldehyde as a Fixative in Bioprotheses and Drug Delivery Matrices[END_REF]. Devido sua natureza polimérica, GTA forma ligações cruzadas de grande comprimento, por exemplo, entre resíduos de aminoácidos distantes, conferindo-lhe aplicações importantes em biomateriais [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF]. [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF] compararam diversos agentes de ligações cruzadas em membranas de Col obtendo o máximo de pontos de ligações cruzadas quando utilizado glutaraldeído (GTA). O aumento da resistência à tração e à degradação por ação enzimática também foram observadas. Segundo [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF], o processo de reticulação "mascara" os sítios de atuação da enzima colagenase.

Entretanto, altas concentrações de GTA levam a uma elevada velocidade de reação na superfície, podendo resultar em uma barreira química artificial na superfície das fibras. Esse excesso de GTA em solução e a rápida reticulação levam ao acúmulo de água adsorvida entre as unidades fibrilares do Col, diminuindo a resistência mecânica do material quando aplicado (Kikuchi et al., 2004b;[START_REF] Ruijgrok | Glutaraldehyde crosslinking of collagen: Effects of time, temperature, concentration and presoaking as measured by shrinkage temperature[END_REF][START_REF] Cheung | Mechanism of Crosslinking of Proteins by Glutaraldehyde III. Reaction with Collagen en Tissues[END_REF]. Apesar de aumentar sua resistência à degradação, essa rápida reação pode resultar em heterogeneidade no interior do material e finalizar com a rápida degradação no interior do organismo [START_REF] Rodrigues | Comportamento Térmico de Matrizes de Colágeno tipo I Reticuladas com Glutaraldeído[END_REF]. Baixas concentrações de GTA favorecem as ligações cruzadas intramoleculares [START_REF] Cheung | Mechanism of Crosslinking of Proteins by Glutaraldehyde III. Reaction with Collagen en Tissues[END_REF].

II. 5-MINERALIZAÇÃO BIOLÓGICA

A matriz óssea é formada por duas fases: a mineral (ou inorgânica) e a orgânica.

Na fase mineral estão presentes grande quantidade do fosfato de cálcio denominado apatita biológica, traços de íons magnésio, carbonato, hidroxila, cloro, flúor e citrato [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF]; a fase orgânica está representada por fibras de Col, proteo e glicosaminoglicanas e moléculas sinalizadoras (como hormônios, fatores de crescimento e citocinas). As fibras de Col proporcionam ductilidade aos ossos enquanto os cristais de HA, resistência à compressão. Participando das atividades teciduais estão as principais células ósseas: células osteoprogenitoras, osteoblastos, osteócitos e osteoclastos.

A substituição tecidual óssea ocorre por intermédio de moléculas de comunicação entre células, hormônios sinalizadores e das próprias células do tecido.

Osteoblastos e osteoclastos trabalham de maneira dinâmica e integrada na deposição e degradação da matriz, respectivamente. Os osteoblastos produzem cadeias de Col -que serão posteriormente mineralizadasenquanto os osteoclastos controlam o pH local e produzem enzimas que irão dissolver a fase mineral depositada e degradar as proteínas da matriz [START_REF] Kikuchi | The biomimetc synthesis and biocompatibility of self-organized hydroxyaoatite/collagen composites[END_REF].

A construção detalhada da nanoestrutura do osso ainda não foi bem evidenciada.

Apesar da matriz estar supersaturada por cálcio e fosfato depositados, isso não provoca a mineralização de Col ou de outras substâncias orgânicas sob condições saudáveis no processo de remodelação. Dessa maneira, é assumido que algumas condições químicas, por exemplo, altas concentrações dos íons Ca 2+ e PO 4 3-

, temperatura (40 o C) e o pH [START_REF]Estudar os processos de osteointegração e substituição tecidual em testes invivo; IX-REFERÊNCIAS[END_REF](9) na região da calcificação, são necessárias para a mudança do ambiente que culminará no processo de mineralização das fibrilas de Col (Kikuchi et al., 2004a).

Os modelos atuais vêm indicando que sítios hidrofóbicos e hidrofílicos são potenciais locais de mediação para a formação mineral do tecido. Adicionalmente, as regiões flexíveis da molécula de Col podem atuar de maneira importante em relação às regiões "gap" e localização de cálcio e fosfato [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF]. [START_REF] Provenzano | Collagen Fibril Morphology and Organization: Implications for Force Transmission in Ligament and Tendon[END_REF] sugerem que, durante a fibrilogênese, proteoglicanas guiam e estabilizam a formação e amadurecimento das fibrilas de Col formando ligações cruzadas. Estudos mostram que decorina, limucan, e fibromodulina atuam regulando a organização na formação e mineralização das fibras de Col [START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF][START_REF] Baht | Bone Sialoprotein-Collagen Interaction Promotes Hydroxyapatite Nucleation[END_REF][START_REF] Landis | The structure and Function of Normally Mineralizing Avian Tendons[END_REF].

Investigações anteriores indicaram que a nucleação dos nanocristais de HA ocorre com a interação de sítios negativamente carregados, como os grupos carboxila [START_REF] Kalita | Nanocrystalline Calcium Phosphate Ceramics in Biomedical Engineering[END_REF]. Este está presente em grande quantidade nas moléculas de Col e, em pH neutro, apresentam-se sob a forma de -COO -, o que favorece a quelação de íons cálcio [START_REF] Cui | Self-assembly of Mineralized Collagen Composites[END_REF]. É presumido que a atração eletrostática forma -COOCa + ou (-COO) 2 Ca e -O-Ca + na indução da nucleação da apatita. Apesar das cargas positivas de alguns amino-grupos poderem formar ligações iônicas com grupos carboxila, isso pode acelerar a interação de íons fosfato com R-Ca + para formar HA [START_REF] Cui | hydroxyapatite Nucleation and Growth Mechanism on Electrospun Fibers Functionalized with Different Chemical Groups and Their Combinations[END_REF].

A partir das concentrações adequadas, ocorre o produto iônico entre íons cálcio e fosfato que, posteriormente, sofrem um processo de transição e interconversão. Como conseqüência, formam-se vários arranjos cristalinos alternativos (de graus variáveis de complexidade), com orientação preferencial ao de elongação das fibras de Col. Uma vez iniciada a formação dos cristais de HA, eles tenderão a crescer e a catalisar a posterior cristalização de fosfatos de cálcio, mesmo nos locais que as concentrações de íons cálcio e fosfato sejam semelhantes às do nível plasmático [START_REF] Comarck | estratégias de Bioengenharia Tecidual na Reconstrução Óssea[END_REF].

Diferentes fatores parecem atuar, sinergicamente ou de forma permutável, para iniciar a deposição mineral. Ainda não está muito claro se a fase sólida primeiramente formada é amorfa ou cristalina. [START_REF] Landis | The structure and Function of Normally Mineralizing Avian Tendons[END_REF] sugerem que a formação mineral é mediada por uma combinação de efeitos biológicos, físico-químicos e biomecânicos no tecido.

II. 6-CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS

O osso é um órgão composto por diferentes tecidos com capacidade de sustentação do organismo. Adicionalmente, funciona como reserva de íons cálcio e essa capacidade é devido à sua matriz mineralizada. A matriz 3-D de colágeno, secretada por células ósseas denominadas osteoblastos, sofre um processo de maturação e mineralização, torna-se rígida.

De maneira a renovar e manter o equilíbrio fisiológico, permitindo o crescimento e reparação dos ossos, um processo constante de remodelação óssea provoca a degradação e deposição contínua da matriz. Esse processo de rejuvenescimento ósseo, mantém a integridade do esqueleto removendo a matriz óssea antiga com alta densidade mineral e alta prevalência de microestruturas (Kassem, 2008).

Nesse processo, células da linhagem óssea são recrutadas por células mesenquimais (também chamadas de células da mesenquimais ou estromais), diferenciando-se em células denominadas osteoblastos. Osteoblastos possuem como função, entre outras, produzir colágeno do tipo I, que irá compor a matriz orgânica ainda não mineralizada (matriz osteóide). De maneira contrária, células hematopoiéticas precursoras de osteoclastos, unem-se formando células multinucleadas (osteoclastos) com capacidade de digestão da matriz. Estas células aderem-se às superfícies sinalizadas, dissolvendo a fase mineral e digerindo a matriz orgânica. Esse processo é controlado por diversos fatores de sinalização, mantendo-se um equilíbrio saudável entre a deposição e a degradação da matriz [START_REF] Kartsogiannis | Cell Lines and Primary Cell Cultures in the Study of Bone Cell Biology[END_REF]. Essas regiões de deposição/reabsorção apresentam unidades ósseas multicelulares (conhecidas como "bone multicellular units" ou "BMU") e mediam o processo de rejuvenescimento do osso (Kassem, 2008).

Embebidos nessa matriz, encontramos células ósseas denominadas osteócitos.

Iniciado o processo de maturação, os osteócitos produzem prolongamentos sob a forma de canalículos, se interconectando e se comunicando com osteoblastos e células osteoprogenitoras. Esses canalículos são mantidos mesmo após o processo de mineralização total. Durante os processos de produção, maturação e mineralização, não só o ambiente externo às células modifica-se como sua própria estrutura interna e atividades. Uma cascata de diferenciação culmina na transformação de células indiferenciadas, ou pré-osteoblastos, em osteoblastos e posteriormente em osteócitos [START_REF] Long | Osteogenesis and Bone-Marrow-Derived Cells[END_REF][START_REF] Aubin | Bone Stem Cells[END_REF].

A renovação constante da matriz óssea é influenciada pelos estímulos mecânicos. In vivo, o estresse mecânico é realizado através do fluxo de líquido intersticial que culmina na diferenciação de osteoblastos em osteócitos e na mineralização da matriz. Osteoblastos e células mesenquimais vêm demonstrando sua sensibilidade quando submetidas ao esforço mecânico (forças de cisalhamento) em experimentos in vitro (Yeatts & Fisher, 2011).

Como o osso é um órgão ativo, um intenso processo de renovação celular é desenvolvido no interior dos ossos longos, dentro da medula vermelha (presente no interior do osso trabecular). A medula vermelha é a origem das populações sanguíneas da série branca e vermelha (processo denominado hematopoese). Entretanto, inúmeras populações celulares vêm sendo identificadas e é reconhecida a presença de compartimentos de células não-hematopoiéticas (conhecidas como células da medula estromal) (Kassem, 2008;Away et al., 2002). Dentro desses compartimentos, as células apresentam o potencial de diferenciação em linhagem osteoblástica [START_REF] Gronthos | Molecular and Cellular Characterisation of Highly Purified Stromal Stem Cells Derived from Human Bone Marrow[END_REF][START_REF] Bianco | Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biology and Potential Applications[END_REF][START_REF] Oyajobi | Isolation and Characterization of Human Clonogenic Osteoblast Progenitors Immunoselected from Fetal Bone Marrow Stroma using STRO-1 Monoclonal Antibody[END_REF]. A posição desses compartimentos ainda não foi bem elucidada, mas sugere-se que eles estejam localizados nos espaços perivasculares da medula óssea [START_REF] Tare | Skeletal Stem Cells: Phenotype, Biology and Environmental Niches Informing Tissue Regeneration[END_REF].

Células osteoprogenitoras da medula estromal podem ser selecionadas e cultivadas, apesar da baixa incidência (~0,0005% do total de células estromais) [START_REF] Oyajobi | Isolation and Characterization of Human Clonogenic Osteoblast Progenitors Immunoselected from Fetal Bone Marrow Stroma using STRO-1 Monoclonal Antibody[END_REF]. Existe uma heterogeneidade conhecida dentro dessa população e essa característica culmina na formação de colônias com diferentes capacidades de proliferação e diferenciação [START_REF] Xiao | Clonal Characterization of Bone Marrow Derived Stem Cells and their Application for Bone Regeneration[END_REF]. [START_REF] Oyajobi | Isolation and Characterization of Human Clonogenic Osteoblast Progenitors Immunoselected from Fetal Bone Marrow Stroma using STRO-1 Monoclonal Antibody[END_REF] afirmam que as células osteoprogenitoras presentes nesses compartimentos apresentam diferentes estágios de diferenciação. De acordo com os autores, a fase de seleção das células osteoprogenitoras oriundas da medula óssea deve levar em consideração a marcação positiva ao anticorpo STRO-1, que reconhece todos os precursores estromais, incluindo todos os osteoprogenitores [START_REF] Oyajobi | Isolation and Characterization of Human Clonogenic Osteoblast Progenitors Immunoselected from Fetal Bone Marrow Stroma using STRO-1 Monoclonal Antibody[END_REF].

A manipulação de células primárias da medula óssea pode trazer alguns problemas, como a restrição da fonte do material (paciente, por exemplo), variações entre os pacientes (no caso de mais de um doador), limite do potencial de crescimento e alta heterogeneidade da amostra coletada. O uso de linhagens imortalizadas assegura os resultados e reduzem os equívocos na interpretação dos resultados.

II. 7-CULTIVO DINÂMICO EM BIOREATORES

A aprovação do uso dos "complexos" (arcabouço 3-D + células progenitoras + fatores de crescimento osteogênicos) criados pela bioengenharia tecidual parece ser consenso na comunidade científica, além de trazer esperança aos pacientes por ser uma técnica revolucionária. Entretanto, os produtos dessa área têm suas limitações. O desenvolvimento artificial de sistemas mais complexos, como órgãos, depende da manipulação e interação de diferentes tipos e matrizes celulares. O organismo humano apresenta uma complexa comunicação e sinalização entre os diferentes sistemas, órgãos e tecidos. Mimetizar tantas variáveis é um papel difícil mesmo para uma área que agrega muitos conhecimentos diferentes.

A cultura de células data do início do século XX. A cultura de células tradicionalmente utilizada nos dias atuais promoveu o desenvolvimento de inúmeras terapias, curando doenças e salvando vidas. Entretanto, o cultivo de células em ambiente estático apresenta alguns incovenientes, que se agravam quando estruturas 3-D são utilizadas como suporte para o crescimento celular. São eles: heterogeneidade nas concentrações de oxigênio e nutrientes -com consequente aporte inferior no interior do arcabouço; acúmulo de excretas; restrição nas dimensões dos arcabouços [START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF][START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF], Zhang et al., 2009).

Estruturas 3-D apresentam dimensões macrométricas. Os arcabouços ou membranas utilizados na bioengenharia tecidual deveriam ser extensos e espessos, para permitir o total preenchimento da lesão uma vez aplicados. Para a otimização do material usado e aceleração do reparo, esses materiais são pré-colonizados por células do paciente. Neste caso, o cultivo das células no interior das matrizes 3-D deve ser realizado dentro de câmaras de fluxo contínuo denominadas "biorreatores" [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF][START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF]Yeatts et al., 2011). O desenvolvimento de novos biomateriais vem sendo acompanhado pelo incremento desses equipamentos que facilitam, monitoram e controlam processos biológicos ou bioquímicos.

Biorreatores vêm sendo utilizados desde as duas últimas décadas pelas indústrias de fermentação, dejetos, tratamento de água, processamento alimentar e produção de fármacos [START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF]Zhang et al., 2009). A produção de biomoléculas por células não-aderentes no interior de grandes biorreatores já vem sendo desenvolvida com sucesso na produção da insulina humana, por exemplo. Os novos conhecimentos em modelagem e simulação permitiram os cálculos e padrões em entrada e saída de fluidos, controlando o suprimento de nutrientes, gases, pH e osmolaridade, forças às quais as células são submetidas, entre outros.

Os biorreatores utilizados atualmente em bioengenharia tecidual são divididos de acordo com o movimento do fluxo: movimento rotatório no interior de uma câmara ("spinner flasks" e "rotating walls") ou passagem do fluxo em perfusão. Os sistemas rotatórios encontrados nos primeiros biorreatores apresentam limitações, criando um gradiente homogêneo na superfície das amostras e sem penetração de oxigênio e nutrientes em seu interior; sistemas em perfusão vêm demonstrando bons resultados, com colonização de materiais 3-D pelas células e aumento da diferenciação osteoblástica (Yeatts & Fisher, 2011b).

O cálculo da vazão utilizada no interior dos biorreatores possibilita conhecer os valores das taxas de cisalhamento e, consequentemente, as forças e estímulos aos quais as células estão expostas, além do alto suprimento de glicose requerido. Também demonstrou-se que células mensenquimais, neurais e embrionárias retêm a capacidade de diferenciarem-se em suas respectivas linhagens quando submetidas a sistemas dinâmicos em biorreatores [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF].

Para a bioengenharia no tecido ósseo, o uso de biorreatores objetiva colonizar de forma uniforme e homogênea o interior do arcabouço (não apenas na superfície) [START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF], além de provocar estímulos nas células expostas às mudanças de pressão hidrostática, tensões diretas na superfície celular e formação de campos elétricos.

Diversos autores [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF]Yeatts et al., 2011), descrevem as consequências das tensões de cisalhamento causadas pelas correntes de convecção do fluxo no fenótipo, metabolismo e capacidades proliferativa e de diferenciação em osteoblastos humanos.

Células da linhagem osteoblástica são influenciadas por estímulos mecânicos e essa propriedade incentiva o desenvolvimento de "complexos bioengenheirados" no interior de biorreatores (Yeatts & Fisher, 2011;[START_REF] Mccoy | Influence of Shear Stress in Perfusion Bioreactor Cultures for the Development of Three-Dimensional Bone Tissue Constructs: A Review[END_REF]. Jaasma et al. Adicionalmente, deve-se pensar na extensa área de superfície e no volume do biomaterial. A porosidade, natureza do material de origem, geometria do arcabouço, tamanho, anisotropia, grau de interconectividade dos poros, posição no interior do biorreatores e viscosidade do meio também devem ser considerados para o sucesso do biomaterial [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF].

De maneira geral, a utilização de biorreatores é relativamente recente no campo da bioengenharia tecidual. A determinação da vazão para cada tipo de câmara de biorreator, arcabouço 3-D utilizado e tipo celular adequado é recomendável para o planejamento e desenvolvimento científico.

III(a)-OBJECTIF GÉNÉRAL

Comme objectif général, cette thèse a été développée pour étudier le comportement des cellules ostéoprogénitrices cultivées dans um système tridimensionel 

III-OBJETIVO GERAL

Como objetivo geral, estudou-se o comportamento celular e a influência de diferentes condições de cultivo em células osteoprogenitoras cultivadas em um arcabouço compósito 3-D reticulado composto por hidroxiapatita-colágeno.

III.1-OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Como objetivos específicos desse trabalho, podemos citar: Des cellules ostéoprogénitrices stromalles ont été cultivées sur la matrice 3-D pendant 24 heures, 3, 7, 14 et 21 jours. Leur comportements d'adhésion, de prolifération et de différentiation ont été observés sous les différentes conditions proposées. Avant la culture cellulaire, les échantillions ont été incubés pendant 24 heures dans de milieu de culture complet (Iscove's avec L-glutamine + 10% de serum de veau + 100U/ml penicilline G, 100µg/ml streptomicine sulfate + 10 -8 M de dexametasone). Un total de 5x10 5 cellules par échantillion a été inoculé. Dans toutes les conditions, les cellules ont été mantenues pendant 24 heures dans la condition statique pour promouvoir la total adhésion. Les conditions de culture peuvent être divisées comme:


(1) Statique: les cellules sur les échantillions ont été cultivées pendant toute la durée dans des plaques de 24 puits. Le milieu cellulaire complet a été changé chaque 2 jours. Pour les analyses, les échantillions ont été déplacées dans une autre plaque pour éviter des faux positifs.

( A maioria dos colágenos fibrilares são solúveis a baixos pHs. Quando o pH é ajustado para próximo ao neutro e a temperatura próxima a fisiológica, a formação de fibrilas ocorre espontaneamente, resultando em fibrilas de maiores diâmetros ligadas entre si [START_REF] Roschger | Bone mineralization density distribution in health and disease[END_REF]. A partir dessa propriedade, as fibrilas de Col em solução ácida foram conservadas à 4 o C até seu uso na produção do arcabouço .

Para a produção do arcabouço compósito hidroxiapatita-colágeno (HA/Col) (50:50wt%), duas soluções foram adicionadas com o auxílio de bombas peristálticas (0,9ml/min) em um bécher contendo, previamente, 25ml de água ultrapura, segundo esquema da Figura IV.2. A solução contendo as fibrilas de Col resultante da diálise em ácido fosfórico foi mantida em temperatura ambiente, enquanto era preparada a segunda solução de nitrato de cálcio (37.2mM) (Merck, Brasil). A solução de síntese foi agitada (240rpm) através de uma haste presa a um agitador mecânico a fim de promover o máximo de interação entre as fibrilas de Col em processo de reorganização e os íons cálcio e fosfato (Figura IV.2). Durante todo o tempo de envelhecimento (3 horas), as condições de síntese foram mantidas. Ao final do processo, o material produzido permaneceu 24 horas em temperatura ambiente sem agitação. Posteriormente, o sobrenadante foi retirado e o material compósito foi lavado com H 2 O deionisada (pH=7,4) para a retirada do excesso de hidróxido de amônio utilizado durante a síntese.

IV. 2-RETICULAÇÃO

Devido à rápida perda estrutural do material em ambiente de cultivo celular (ambiente aquoso à 37 o C), houve a necessidade de se promover ligações cruzadas entre as fibras de Col que compõem o material. Neste trabalho, utilizou-se a concentração de 0,125% (v/v) e o processo de reticulação química através do agente reticulador glutaraldeído (GTA) (TedPella, USA). Apesar de seu uso ser questionado pela comunidade científica, sua capacidade de aumentar a resistência à degradação motiva sua utilização em concentrações e processamentos que não gerem produtos citotóxicos para o organismo.

Após a fabricação do material compósito, este foi reticulado através da adição de uma solução de GTA de concentração final 0,125% (v/v) a um bécher contendo água destilada pH=7,4 por 30 minutos sob agitação de 240rpm.

Posterior ao processo de reticulação, as amostras foram extensivamente lavadas (3x) com H 2 O desionisada (pH=7,4). Estas foram moldadas em moldes de PVC (8mm

de diâmetro e 6mm de altura) e liofilizadas por 24 horas. Todas as amostras foram esterilizadas por radiação gama (25kGy). Os diferentes processos envolvidos na produção do arcabouço estão exibidos na Figura IV.3.

Figura IV.3: Diagrama do processo de reticulação, moldagem e esterilização do arcabouço compósito HA/Col.

Para o cultivo celular, as amostras cilíndricas liofilizadas foram cortadas na metade da sua altura (3mm).

IV.3-CARACTERIZAÇÃO DOS ARCABOUÇOS

Amostras do compósito produzido, reticulado e incubado sob as diferentes condições de cultivo foram caracterizadas por diversas técnicas a fim de obter o máximo de informações sobre as propriedades estruturais e físico-químicas, e suas modificações. Amostras com células cultivadas também foram observadas e seu comportamento estudado. As técnicas serão relatadas a seguir.

IV.3.1-Difração de raios x (DRX) e Espectroscopia no infravermelho com transformada de fourier (FT-IR):

A fim de caracterizar o fosfato de cálcio produzido, o processo de síntese foi realizado sem a presença de fibrilas de Col sob as mesmas condições de reação Elmer, EUA) por refletância total atenuada. Os modos vibracionais dos grupamentos químicos foram identificados. Todos os espectros foram coletados entre 4000 to 400cm - 1 , com resolução de 4.00cm -1 e número total de varreduras de 100.

IV.3.2-Termogravimetria (TGA):

A utilização das técnicas de análise térmica do arcabouço compósito HA/Col permitiu avaliar a resistência à temperatura do material formado por fibras de Col mineralizadas e reticuladas com GTA. As amostras processadas foram cultivadas em diferentes tempos sob condição estática. Esperava-se obter informações sobre a perda da resistência à degradação térmica através de uma possível quebra das ligações cruzadas e liberação de GTA durante os 21 dias de cultivo. Adicionalmente, pode-se estimar a relação entre a fase orgânica (Col), inorgânica (HA) e água adsorvida (a) TGA:

As variações de massa em função da temperatura e tempo foram analisadas por análise termogravométrica (TGA 851 e , Mettler Toledo, US). O objetivo foi observar o comportamento do arcabouço compósito HA/Col sob as condições de cultura (ambiente úmido à 37 o C) após os 21 dias, uma vez que, através da derivada da curva obtida, podese estimar as temperaturas de início e fim do processo de perda.

As análises de TGA foram realizadas em ar, com uma taxa de aquecimento de 10 o C/min e uma amplitude de 30 a 1200 o C.

IV.3.3-Microscopia eletrônica de varredura (MEV), transmissão (MET) e

Espectroscopia de energia dispersiva (EDS):

O MEV foi utilizado com o intuito de se conhecer a microestrutura do arcabouço compósito HA/Col, avaliar a capacidade de mineralização das fibras, a microporosidade da superfície e o comportamento e morfologia celular. Um detector para espectroscopia de energia dispersiva (EDS) acoplado ao microscópio eletrônico foi utilizado para verificar o perfil químico do arcabouço compósito HA/Col.

As amostras foram fixadas com solução Karnovsky composta por GTA 2,5% e paraformaldeído 4% em tampão cacodilato de sódio 0,2 e 0,1M por 24 horas.

Sucessivas lavagens com tampão foram realizadas a fim de retirar totalmente os reagentes utilizados.

O processo de desidratação deu-se em bateria de álcool etílico (Sigma-Aldrich, UK) com concentrações crescentes de 50, 70, 85, 90, 100%. Para MEV, após a total substituição da água por álcool, as amostras foram secas através do uso da solução alcoólica 100% + etanol/hexametildisiliazano (HMDS -Fluka/Sigma-Aldrich, UK)

(1:1, v/v) durante 30 minutos, seguida de mais 30 minutos em solução pura de HMDS.

As Através do processamento de imagens, as dimensões das fibras de Col e dos cristais de HA foram mesuradas. Adicionalmente, foram observadas a orientação e disposição dos cristais embebidos na matriz orgânica.

IV.4-POROSIDADE

A porosidade do compósito foi analisada por 2 diferentes métodos. Uma porosidade geral foi calculada utilizando o solvente orgânico Hexano (Hexane 99%, Spectrosol, SDS, France). O outro método utilizou os cortes histológicos corados com picrosirius e o tratamento de imagem (Image J ® ) para a obtenção dos resultados.

IV.4.1-Hexano:

O método utiliza o deslocamento do líquido de um volume conhecido pela amostra analisada. O hexano possui a capacidade de penetrar na matriz sem deformá-la.

A partir da equação abaixo, pode-se determinar a porosidade das amostras:

Equação IV.2: Cálculo da porosidade por deslocamento de líquido

ε(%) = (V 1 -V 3 ) / (V 2 -V 3 ) x100 onde: V 1 = Volume inicial de hexano conhecido;
V 2 = Volume total de hexano + material impregnado por 5 minutos;

V 3 = Volume residual de hexano após a retirada do material;

Para o cálculo da porosidade, um n=4 de amostras foi realizado em um volume inicial de 4 mililítros.

IV.4.2-Histologia e análise de imagens:

As amostras correspondentes a cada tempo de cultivo e condição foram fixadas durante 24 horas em solução de formaldeído tamponada à 10% (Sigma-Aldrich, UK). Figura IV.6: Tratamento de imagens pelo programa Image J® através de micrografias de luz branca de seções histológicas (15µm) coradas com Picrosirius.

IV.5-CITOTOXICIDADE

A presença de citotoxicidade proveniente do processo de reticulaçãoou mesmo do processo de síntesefoi investigada. Dois métodos foram realizados com objetivos diferentes e seus resultados foram interpretados conjuntamente.

No primeiro, utilizou-se um kit (Cytotox, Xenometrix, Germany) com três Figura IV.10: Diagrama do sistema fechado dinâmico em alta vazão. Em (1), reservatório de "entrada" e "saída" de meio de cultivo; (2) bomba peristáltica; (3) biorreator contendo 3 amostras e (4) tubo permeável à gases para passagem de meio.

IV.7-CULTURA DE CÉLULAS

Células osteoprogenitoras estromais foram utilizadas ao longo desse trabalho. As células foram concebidas pelo grupo de pesquisa do professor Pierre Marie em Paris (França) [START_REF] Oyajobi | Isolation and Characterization of Human Clonogenic Osteoblast Progenitors Immunoselected from Fetal Bone Marrow Stroma using STRO-1 Monoclonal Antibody[END_REF]. Tratam-se de células estromais humanas imortalizadas com baixa capacidade de diferenciação quando cultivas em meio de cultura nãodiferenciador (ausência de dexametasona, vitamina-D ou ácido ascórbico). As células apresentam morfologia poligonalcom evidências de seus filopódios, alta capacidade de proliferação e marcação positiva para o anticorpo STRO-1, sendo denominadas STRO + 1. As células concebidas fazem parte da colônia "A", à qual possui a menor produção de fosfatase alcalina dentre as diferentes colônias oriundas dessa mesma população celular, sendo então denominada Stro+1A.

O meio de cultivo Iscove's com L-glutamina (Sigma-Aldrich, UK) foi utilizado com adição 10% de soro fetal bovino, 100U/ml penicilina G (Sigma-Aldrich, UK), 100µg/ml streptomicina sulfatada (Sigma-Aldrich, UK), e 10 -8 M de dexametasona (Sigma-Aldrich, UK). Todas as células utilizadas nessa tese foram mantidas nos tempos de cultivo em estufa úmida à 37 o C à 5% CO 2 /95% ar. A fim de obter, a partir da absorbância, o número de células em cada amostra, uma curva base foi feita (Figura IV.10). Para isso, plaqueou-se 5 concentrações crescentes de células Stro+1A em duas placas de cultura tradicionais. Após 24 horas de incubação em estufa úmida, uma placa recebeu uma solução de MTT e foi incubada durante 3 horas. As absorbâncias foram obtidas através da leitura da solução de isopropanol à 570nm em leitor de ELISA. Na outra placa, as células de cada poço foram tripsinizadas e contadas manualmente em câmara de Newbauer. Realizou-se o gráfico "absorbância x número de células" e a equação da reta foi utilizada durante todo esse estudo para a conversão das absorbâncias em número de células. As imagens foram tratadas de maneira que a penetração das células e a colonização das amostras pudessem ser mensuradas (n=4) (Figura IV.11). Figura IV.13: Tratamento de imagens pelo programa Image J® através de micrografias de fluorescência de seções histológicas (15µm) com núcleos celulares marcados por DAPI.

IV.8.3-Diferenciação celular: (a) Fosfatase alcalina (FA):

A atividade de FA foi medida usando p-nitrofenilfosfato (Sigma-Aldrich, UK) como susbtrato em solução tampão alcalina (20mM p-nitrofenilfosfato + 100mM dietanolamino 98% + 10mM MgCl 2 , pH 9.5) em temperatura ambiente. As amostras (arcabouço + células) foram retiradas do cultivo, rinsadas em PBS, permeabilizadas com solução aquosa 0.5% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich, UK) e incubadas com solução de substrato durante 30 minutos a 37 o C. Para finalizar a reação, foi adicionado um mesmo volume de solução de EDTA (0.1M EDTA em 1M NaOH).

A densidade ótica foi lida em placa de 96 poços pelo leitor de ELISA (ELX, 800UV, Biotec Instruments, INC) no comprimento de onda à 405nm. Os resultados foram calculados para a obtenção da concentração de ALP por célula. Para cada experimento, um n=6 foi realizado, com 3 leituras em cada.

(b) Osteocalcina (OC):

A concentração de osteocalcina secretada pelas células em processo de diferenciação osteoblástica foi mensurada através do uso do kit comercial Gla-type osteocalcin EIA (TANAKA Bio INC., Japão). A placa de 96 poços presente no kit apresenta duas reações imuno-enzimáticas. Um primeiro anticorpo está imobilizado na superfície dos poços e apresenta alta especificidade ao antígeno "osteocalcina" solúvel no meio de cultivo. Após a ligação entre as duas moléculas, um segundo anticorpo ligado à peroxidase é utilizado para amplificar o sinal. A transformação do substrato por uma reação colorimétrica pode ser lida pelo leitor de ELISA à 450nm. A intensidade da solução é proporcional à concentração de osteocalcina presente nas amostras.

O fabricante sugere a realização de uma curva padrão para a conversão das absorbâncias em concentração (ng/ml). Os resultados foram calibrados e calculados para a obtenção da concentração de osteocalcina por célula (ng/ml/cel). Para cada experimento, um n=3 foi realizado, com 2 leituras em cada.

(c) Pró-colágeno I (PIP):

Para a determinação da concentração de PIP secretado pelas células Stro+1A cultivadas no arcabouço sob diferentes tempos e condições de cultura, foi utilizado o kit comercial Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA (TANAKA Bio INC., Japão). O kit é composto por uma placa de 96 poços previamente tratada. A placa apresenta na superfície de seus poços um ligante específico para a molécula em questão. O princípio do método imuno-enzimático é de ligar o anticorpo imobilizado no fundo do poço com o antígeno (pró-colágeno) em solução. Uma vez ligado, uma reação colorimétrica permite a leitura da placa pelo leitor de ELISA. Uma curva padrão é recomendada pelo fabricante a fim de converter os resultados de absorbância em concentração do antígeno (ng/ml).

As amostras de meio de cultivo foram incubadas na placa durante 3 horas à 37 o C. Após a incubação, a placa foi lavada 4x com solução tampão PBS e novamente incubada com uma solução de substrato por 15 minutos. A reação foi finalizada por uma solução stop (concedida pelo fabricante) e a placa lida à 450nm em leitor de ELISA. A concentração total de cada amostra levou em consideração: (1) a quantidade de amostras em questão (3, no caso de bioreatores); ( 2) o número de células em cada dia e condição estudada. O resultado final foi dado em concentração de PIP por célula (ng/ml/cel). Para cada experimento, um n=3 foi realizado, com 2 leituras em cada.

IV.9-CONCENTRAÇÃO DE ÍONS CÁLCIO EM MEIO DE CULTURA

Os resultados para a concentração de íons cálcio foram obtidos pelo emprego de um kit comercial (Diasys; CE, Alemanha) empregado em diagnósticos na rede médicohospitalar na detecção dos íons em amostras de soro, plasma ou urina. O kit apresenta uma determinação quantitativa através de sistemas de leitura fotométricos em leitores de placa em ultravioleta (UV).

Para a obtenção das concentrações de íons cálcio nas diferentes amostras de meio estudadas, utilizou-se o método colorimétrico do Arsenato III. O princípio do kit é a formação de uma solução azul proveniente do complexo entre os íons cálcio e o arsenato III, em pH neutro. A intensidade da coloração é proporcional à concentração de íons cálcio na solução estudada.

As amostras de meio de cultivo foram incubadas com o reativo durante 5 minutos e lidas em leitor de ELISA à 650nm (ELX, 800UV, Biotec Instruments, INC).

As absorbâncias foram calculadas em relação ao standart (cedido pelo kit) e a concentração final foi calculada em mmol/L.

V(a). RÉSULTATS ET DISCUSSION

Un composite hydroxyapatite et collagène (HA/Col) a été synthétisé avec succès. Pendant la réaction, les fibres de collagènes s'agglomèrent en structures macroscopiques, sans présence de poudre libre en solution.

A travers les résultats de diffraction de rayons X ( (Kikuchi et al. 2004[START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF]. Ces mêmes analyses montrent la préservation de la structure polymère du collagène après la réaction de synthèse (3320cm -1 (amide A; N-H) ; 1650cm -1 (amide I; C=O) ; 1540 cm -1 (amide II; N-H) e 1230 cm -1 (amide III; C-N)) [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF][START_REF] Santos | Synthesis and Characterization of Calcium Phosphate/Collagen Biocomposites doped with Zn 2+[END_REF].

Le composite est formé par une matrice poreuse (~60%) (Figure V.6), avec des pores (~280um) (Figure V.7) distribués de façon hétérogène dans l'ensemble de la structure. La stoechiométrie réelle du composite HA/Col obtenue est similaire à la stoechiométrie théorique (Tableau V.1). Le dépôt minéral se produit à la surface des fibrilles de Col en créant des poly-cristaux d'HA [START_REF] Bohner | Calcium Orthophosphates in Medicine: from Ceramics to Calcium Phosphates Cements[END_REF][START_REF] Elliot | Structure and Chemistry of the Apatite and Other Calcium Orthophosphates[END_REF]. La distribution des cristaux nanométriques (40nm x 5nm) est homogène et sans orientation apparente (Figure V.12).

Le processus de réticulation a créé des liaisons stables [START_REF] Charulatha | Influence of Different Crosslinking Treatments on the Physical Properties of Collagen Membranes[END_REF]; Jayakrishnan e Jameela, 1996) mais sans provoquer de cytotoxicité ( été soumis dans ces systèmes, le changement de l'environnement, avec un transport de masse constant, peut avoir causé l'expression et la sécrétion accrues des protéines dans le milieu de culture [START_REF] Jaasma | Design and Validation of a Dynamic Flow Perfusion Bioreactor for use with Compliant Tissue Engineering Scaffolds[END_REF][START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF]).

V. RESULTADOS E DISCUSSÃO V.1-EXTRAÇÃO DO COLÁGENO E SINTESE DO COMPÓSITO

O processo de extração do colágeno a partir do tendão de Achilles bovino deu-se de maneira simples e eficaz. Uma vez colocados em solução ácida com a presença de pepsina, o colágeno dissociou-se em solução. Após a precipitação salina, foi possível observar a reagregação das fibras de colágeno, desfeita após a diálise em água destilada e solução de ácido fosfórico (59mM). A solução obtida transparente e viscosa apresenta uma concentração final de 12mg/ml e foi armazenada à 4 o C.

Durante a síntese do arcabouço compósito hidroxiapatita-colágeno (HA/Col), as fibras de colágeno reagregam-se rapidamente, formando estruturas macroscópicas à medida que as soluções são adicionadas. Não foi observada a presença de pó livre durante todo o processo. O material produzido é altamente moldável, de fácil manipulação e processamento (Figura V.1). Foram mensuradas as concentrações de glutaraldeído após a reticulação e lavagens, até a completa eliminação de seus resíduos.

Não foram observadas modificações físico-químicas e morfológicas (macroscópicas e químicas, através do FT-IR) do arcabouço produzido após a esterilização por radiação gama [START_REF] Campos | Effect of Sterilization Method on Physico-Chemical Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composite[END_REF]. 

V.2.1-Fase mineral na ausência do colágeno:

A caracterização da fase mineral formada sob as condições de síntese -pH=9 e O padrão de difração da fase sintetizada a 38 o C é compatível com a HA pouco cristalina (Kikuchi et al. 2004a(Kikuchi et al. ,b, 2001;;[START_REF] Legeros | Biological and Synthetic Apatites[END_REF] O mecanismo de formação da fase mineral consistiu em liberar íons cálcio e fosfato através de seus precursores (nitrato de cálcio e ácido ortofosfórico, descritos anteriormente) para total dispersão e homogeneização no sistema aquoso, seguido de uma nucleação dos cristais de HA nas moléculas do Col. É conhecido que a razão de formação do mineral é altamente dependente de fatores como pH e concentrações de íons cálcio, fosfato e outros íons fisiológicos [START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF]. A formação das fases minerais em estruturas compostas por uma fase orgânica muitas vezes apresenta variações em seus padrões já conhecidos (Ficai et al., 2010a,b;[START_REF] Wopenka | A Mineralogical Perspective on the Apatite in Bone[END_REF].

Os parâmetros da célula de HA -a=b=9,4564Ǻ e c=6,8836Ǻ -mostra a formação de cristais com características semelhantes as dos ossos jovens (a=b=9,4411Ǻ e c=6,8845Ǻ) [START_REF] Meneghini | Rietveld Refinement on X-Ray Diffraction Patterns of Bioapatite in Human Fetal Bones[END_REF] Os espectros da molécula de Col e do arcabouço compósito (figura V.4 a,b, respectivamente) apresentam as bandas: 3320cm -1 (amida A; N-H), 1650cm -1 (amida I; C=O), 1540 cm -1 (amida II; N-H) e 1230 cm -1 (amida III; C-N), variando a intensidade das mesmas. A presença das amidas indica que a composição das cadeias polipeptídicas presentes nas fibras de Col foi preservada mesmo após o processo de síntese [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF]. A presença da amida I (correspondente ao grupo carbonila) é um marcador de peptídeos com estrutura terciária [START_REF] Santos | Synthesis and Characterization of Calcium Phosphate/Collagen Biocomposites doped with Zn 2+[END_REF], corroborada pela presença da amida II, indicativa de conformação de tripla-hélice [START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF].

Adicionalmente, a vibração dos anéis pirrolidínicos da hidroxiprolina na banda 1450cm - 1 corrobora a manutenção do componente orgânico [START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF][START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF].

Os grupos químicos presentes na superfície das fibras de colágeno participam na nucleação dos nanocristais de HA. Segundo [START_REF] Santos | Synthesis and Characterization of Calcium Phosphate/Collagen Biocomposites doped with Zn 2+[END_REF] e [START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF], em pH acima de 7, a superfície das moléculas de Col estão altamente carregadas.

Adicionalmente, o acúmulo de íons Ca +2 na superfície das fibras de colágeno em pH=9 provoca a nucleação e formação estável dos nanocristais [START_REF] Kikuchi | Self-Organization Mechanism in a Bone-Like Hydroxyapatite/Collagen Nanocomposite Synthesizes in vitro and its Biological Reaction in vivo[END_REF]. A banda 1330cm -1 presente dos espectros A e B da Figura V.4, corresponde ao estiramento assimétrico dos grupos carboxila dissociados (-COO -) e participam do processo de mineralização por autorganização dos nanocristais de HA na superfície de Col durante a síntese do compósito (Chang & Tanaka, 2002a).

Os espectros de FT-IR da HA sintetizada e do arcabouço compósito HA/Col (Figura V.4C e B) evidenciam as bandas na região 500-1200cm -1 característica dos grupos PO 43-como: 560cm -1 e 604cm -1 (PO 4 ) e 1420cm -1 [START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF][START_REF] Scharnweber | Mineralization Behaviour of Collagen Type I Immobilized on Different Substrates[END_REF]. Nota-se a presença da banda 1450cm -1 , que está relacionada à substituição do tipo B dos grupos PO 4 3-pelos grupos CO 3 2-(4) [START_REF] Santos | Synthesis and Characterization of Calcium Phosphate/Collagen Biocomposites doped with Zn 2+[END_REF][START_REF] Slósarczyk | FTIR and XRD Evalution of Carbonated Hydroxyapatite Powders Synthesized by Wet Methods[END_REF]. Essa substituição também é observada na apatita biológica encontrada na matriz óssea [START_REF] Wopenka | A Mineralogical Perspective on the Apatite in Bone[END_REF].

Após o processo de reticulação do material produzido (Figura V. 

V.2.3-Estimativa das fases mineral e orgânica no arcabouço HA/Col:

A análise termogravimétrica do arcabouço compósito HA/Col permitiu estimar a proporção entre a fase orgânica, composta por Col e a fase mineral (HA), assim como a água adsorvida. A estequiometria calculada para a realização da síntese previu uma proporção entre HA:Col de 50:50. Entretanto, aproximadamente 40% da composição da matriz do arcabouço correspondem à água adsorvida e fase orgânica composta por colágeno e 60% correspondem à fase mineral.

De acordo com a Tabela V.1, uma primeira perda de massa ocorre na faixa de temperatura de 40-170 o C, correspondendo ao processo endotérmico de liberação da água adsorvida na superfície das amostras. A segunda faixa de perda de massa está relacionada aos processos exotérmicos no intervalo de 170-650 o C. Nela ocorre a degradação e pirólise da tripla-hélice do colágeno combinadas com os nanocristais de HA na matriz do compósito [START_REF] Gelinsky | Porous Three-Dimensional Scaffolds Made af Mineralised Collagen: Preparation and Proporties af a Biomimetic Nanocomposite Material For Tissue Engineering af Bone[END_REF][START_REF] Chang | Preparation of Hydroxyapatitegelatin Nanocomposite[END_REF]. Em temperaturas mais altas, em uma terceira faixa, ocorreria a degradação final térmica dos resíduos orgânicos ainda presentes.

Ao analisarmos os resultados para os 21 dias sob condições de cultivo estático, a perda de massa até a temperatura de 670 o C é de aproximadamente 40%, mantendo a proporção do material sintetizado. Continua-se a observar 3 faixas de perda de massa (Tabela V.1). A primeira, correspondente à liberação de água adsorvida (entre 40 e O processo de reticulação do material aumenta sua temperatura de degradação.

As duas etapas observadas podem ser explicadas pela degradação de duas formas estruturais. Uma primeira, onde as fibras de colágeno estariam menos compactadas e outra com uma organização estrutural mais importante, além das fortes ligações de hidrogênio da própria tripla-hélice da proteína.

A estabilidade reconhecida das ligações cruzadas realizadas pelo GTA resultou na manutenção da estrutura, mesmo com o processo de rehidratação e entumescimento da matriz 3-D. Segundo [START_REF] Friess | Basic thermoanalytical studies of insoluble collagen matrices[END_REF], as moléculas de GTA não reagem apenas com aminoácidos na formação de ligações cruzadas, mas formam uma rede complexa, com ligações entre derivados de piridina e outros produtos de polimerização. Segundo, [START_REF] Wu | Studies on the Microspheres comprised of Reconstituted Collagen and Hydroxyapatite[END_REF], os próprios cristais de HA conectam as fibras de Col formando uma matriz melhor organizada.

V.3-POROSIDADE

A porosidade dos arcabouços 3-D utilizados em Bioengenharia do tecido ósseo possui uma importância considerável pois influencia vários processos relacionados às propriedades físico-químicas (como a área de superfície, liberação de íons pela matriz, propriedades mecânicas, entre outras) e aos processos biológicos (colonização celular, difusão de gases e nutrientes, formação de novos vasos sanguíneos, etc.).

A porosidade de biomateriais pode ser controlada através de inúmeros processos, como a adição de moléculas durante a síntese ou no processo de liofilização [START_REF] Yunoki | Control of Pore Structure and Mechanical Property in Hydroxyapatite/Collagen Composite Using Unidirectional Ice Growth[END_REF]. Nesse trabalho, a porosidade do material não foi controlada e é resultante do processo de moldagem e liofilização. Adicionalmente, o tratamento com GTA pode ter influenciado na compactação da estrutura, uma vez que provocou a agregação das fibras. Dois métodos foram utilizados para a caracterização da porosidade do arcabouço HA/Col produzido: o método por deslocamento de líquido e a análise de imagens de cortes histológicos. Em ambos, encontrou-se uma porosidade média de 60-70% do volume da matriz. A porosidade mostrou-se muito heterogênea, com uma distribuição de tamanho de poros entre nano à microporos. Durante a formação do material, as fibras agregaram-se à medida que são adicionadas à solução de síntese em movimento.

Formaram-se grupos macroscópicos de fibras mineralizadas que, após o preenchimento manual do molde e liofilização, mantêm macroporos na estrutura. Em análise microscópica, a substituição da água adsorvida entre as fibras de menores diâmetros por ar durante a liofilização, resultou em poros menores.

V.3.1-Hexano:

A porosidade obtida para as três amostras analisadas foi semelhante (Tabela 

V.3.2-Porosidade por análise de imagens:

O resultado para a porosidade através da análise de imagens dos cortes histológicos apresenta-se semelhante ao encontrado pelo deslocamento de hexano (Tabela V.2). De acordo com o gráfico da Figura V.6, podemos afirmar que a porosidade paralela à superfície é de ~68% (nas duas amostras analisadas: 69 (±5) e 67 (±3)%). Essa porosidade é uniforme ao longo das seções paralelas à superfície em uma profundidade de 150µm. 

V.4-CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DO ARCABOUÇO HA/COL

A caracterização morfológica do arcabouço compósito 3-D HA-Col foi realizada através de microscopia óptica de fluorescência e através de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e transmissão (MET). As micrografias e análises relacionadas estão descritas a seguir.

V.4.1-Microscopia óptica e de fluorescência:

O arcabouço compósito reticulado HA/Col foi corado com Picrosirius e observado. Através micrografia da Figura V.7, pode-se observar a distribuição das dimensões dos poros (áreas marcadas com *). Observa-se uma grande heterogeneidade dos poros com dimensão média de 280µm ±80. Adicionalmente, não há um controle estrito da agregação das fibras durante a síntese, resultando em estruturas fibrosas de diferentes dimensões. Essas estruturas são também resultantes do processo de reticulação e liofilização [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF]Chang & Tanaka, 2002a, b). espraiamento da célula serão iniciados a partir dos primeiros contatos célula/material e, a qualidade desse primeiro contato, terá influência para a capacidade proliferativa e de diferenciação dessas células em contato com o material [START_REF] Anselme | Osteoblasts Adhesion on Biomaterials[END_REF][START_REF] Hutmacher | Scaffolds in Tissue engineering Bone and Cartilage[END_REF]. Deste modo, a preservação das propriedades de superfície das moléculas de Col otimizariam a colonização da matriz 3-D e subsequentes eventos celulares.

V.4.2-Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET):

As microestruturas de MEV do arcabouço compósito HA/Col são apresentadas na Figura V.9. A superfície do material apresenta-se fibrosa, com alta concentração de fibras mineralizadas de diâmetros variados(Figura 9 a). Em maiores magnificações (Figura V.9 b), podemos observar fibras altamente mineralizadas e organizadas randomicamente. As micrografias de MET mostram que o processo de mineralização foi bem sucedido (Figura V.12), com a formação de estruturas policristalinas de HA (estruturas com alta densidade eletrônica) embebidos na matriz de Col (Figura V.12 a,c).

Entretanto, em V.12b, observamos ainda a heterogeneidade do processo, com formação de agregados ("clusters") de cristais de HA (*). A rápida e forte agregação das fibrilas com a brusca mudança de pH (da solução ácida de armazenamento para a solução aquosa e pH=9 da síntese) pode ter favorecido o aprisionamento de nanocristais em algumas regiões. A Figura V.12c revela a formação de microporos de diâmetro médio de 300µm (*).

Os cristais formados são alongados e apresentam dimensões nanométricas de 45nm ±9 de comprimento e 5nm ±1 de largura e morfologia de placas policristalinas sobrepostas e fracamente orientadas por fibras de Col (Figura V.12 a). [START_REF] Elliot | Structure and Chemistry of the Apatite and Other Calcium Orthophosphates[END_REF] Os resultados sugerem que fibrilas curtas de Col, orientam a nanoestrutura e se aglomeram randomicamente durante o processo de reticulação por GTA (Kikuchi et al., 2004b).

Adicionalmente, a ausência de algumas moléculas, como a decorina e a sialoproteína óssea, conhecidamente importantes durante o processo natural de nucleação dos cristais sob e entre as fibrilas de Col (regiões gap) pode resultar em arranjos diferentes dos encontrados na matriz óssea [START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF][START_REF] Baht | Bone Sialoprotein-Collagen Interaction Promotes Hydroxyapatite Nucleation[END_REF]. Os processos de mineralização variam entre os compósitos HA/Col produzidos atualmente por diferentes grupos (Ficai et al., 2010a,b;Cui et al. 2008). A utilização do tendão bovino como fonte de Col pode influenciar no processo de mineralização, uma vez que tecidos não mineralizados apresentam configuração estrutural das moléculas de Col diferentes da dos tecidos mineralizados ou que irão sofrer mineralização iminente.

Adionalmente, a síntese proposta apresenta fibrilas de Col dissociadas em ambiente ácido, sem as ligações cruzadas naturais que ocorrem entre as fibrilas na matriz osteóide recém-formada.

V.5-CITOTOXICIDADE DO ARCABOUÇO COMPÓSITO HA/COL

A citotoxicidade do arcabouço compósito HA/Col foi avaliada por dois diferentes métodos. No primeiro, o material reticulado foi avaliado anteriormente à cultura celular através de três testes. No segundo, as amostras do material foram imersas e mantidas até 21 dias em solução tampão fosfato salina (PBS) em todas as condições de cultivo propostas para a verificação liberação do agente reticulador GTA. Os resultados são apresentados a seguir.

V.5.1-Citotoxidade do extrato do arcabouço pós-síntese:

A citotoxicidade foi mensurada utilizando três testes diferentes (Figura V.14).

Seus resultados mostram a ausência de citotoxicidade do arcabouço compósito HA/Col reticulado.

No teste de XTT, a viabilidade celular foi significantemente mais elevada nas 

V.5.2-Liberaçao de GTA:

A utilização de um agente reticulador é essencial à manutenção da macroestrutura do material sugerido neste trabalho. Entretanto, com a rehidratação e entumescimento da matriz 3-D durante o cultivo celular (estático ou dinâmico), uma eventual quebra das ligações cruzadas poderia levar a uma liberação de GTA e toxicidade local [START_REF] Jiang | Electron Beam Irradiation Modification of Collagen Membrane[END_REF]. Na Figura V.15, são apresentados os espectros das soluções de PBS em detalhe, onde amostras do arcabouço compósito reticulado foram mantidas durante 21 dias.

-0,2 0 

V.6.1-Adesão:

O teste de adesão realizado teve por objetivo comprovar que, após o período de pré-incubação (24 horas em cultivo estático), a maior parte das células estava aderida, sem riscos de serem retiradas pelo meio de cultivo em movimento (sob condição dinâmica).

Na Figura V.16, podemos observar que a maior parte das células semeadas estão aderidas a partir de 6 horas. Segundo [START_REF] Anselme | Osteoblasts Adhesion on Biomaterials[END_REF], as primeiras interações eletrostáticas ocorrem rapidamente, iniciando o processo de adesão já nas primeiras horas de contato com a superfície. Essas primeiras interações serão determinantes para os processos posteriores de proliferação de diferenciação [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF]. [START_REF] Kim | Early Osteogenic Signal Expression of Rat Bone Marrow Stromal Cells is Influenced by Both Hydroxyapatite Nanoparticle Content and Initial Cell Seeding Density in Biodegradable Nanocomposite Scaffolds[END_REF], afirmam que uma inoculação celular otimizada em ambientes 3-D pode aumentar a resposta celular e promover a regeneração tecidual. Entretanto, o processo de inoculação utilizado, com adição de meio de cultivo imediatamente após o contato celular com a superfície do material, pode ter provocado a perda de inúmeras células para o fundo do poço da placa de cultura. O processo de inoculação pode ser otimizado através de diferentes métodos de inoculação, como por exemplo, a adição do meio de cultivo após 2-4 horas da inoculação ou a centrifugação do material + células após a inoculação [START_REF] Partap | Stimulation of Osteoblasts using Rest Periods During Bioreactor Culture on Collagen-Glycosaminoglycan Scaffolds[END_REF][START_REF] Gutwald | How to Optimize Seeding and Culturing of Human Osteoblast-Like Cells on Various Biomaterials[END_REF].

A morfologia celular durante o processo de adesão pode ser observada na Figura V.17. Nos tempos iniciais (3h), as células estão aderidas e levemente alongadas. O processo de reconhecimento da superfície se desenvolve ao longo das 9 horas apresentadas.

Pode-se observar que, ao longo do tempo (6 e 9h), a superfície do compósito apresenta-se progressivamente recoberta pelas células (Figura V.17). Estas são aparentemente mais numerosas. Morfologicamente, as células Stro+1A tornam-se mais poligonais e desenvolvem interações com a superfície fibrosa, apresentando maior número de processos celulares como filopódios. Um efeito negativo na proliferação pode estar relacionado ao fato das células, em cultivo dinâmico, estarem mais dispersas na superfície em relação ao cultivo estático [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF]. A diferenciação celular da linhagem osteoblástica necessita de alta confluência e de contatos tipo célula-célula [START_REF] Gutwald | How to Optimize Seeding and Culturing of Human Osteoblast-Like Cells on Various Biomaterials[END_REF]. A distância célula-célula atua na troca de sinais osteogênicos e nas sinalizações parácrinas [START_REF] Kim | Early Osteogenic Signal Expression of Rat Bone Marrow Stromal Cells is Influenced by Both Hydroxyapatite Nanoparticle Content and Initial Cell Seeding Density in Biodegradable Nanocomposite Scaffolds[END_REF]. Adicionalmente, para o cultivo em baixa vazão, o sistema de recuperação de meio é aberto, ou seja, não há o retorno do mesmo meio uma vez que este atravessa o biorreator. A passagem de meio diluindo e "lavando" os fatores de sinalização locais -ou até mesmo as próprias células -pode ter provocado esse resultado negativo (Yeatts & Fisher, 2011;[START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF].

0,00E+00 5,00E+03 1,00E+04 1,50E+04 2,00E+04 2,50E+04 3,00E+04 3,50E+04 4,00E+04 4,50E+04 5, 
Em condição dinâmica em alta vazão, a viabilidade aumenta significativamente entre os três primeiros dias (*), equilibrando-se até o vigésimo-primeiro. Nas duas últimas semanas de cultivo (14 e 21 dias), a viabilidade celular apresenta-se significativamente maior que nas outras duas condições (*). Os efeitos da mecanotransdução da alta vazão do fluido nas células podem ter contribuído para o efeito positivo. As forças de cisalhamento podem ativar padrões de sinalização, com estímulo na regulação via AMP cíclico (adenosina monofosfato) e óxido nítrico (Zhang et al., 2009). Todas essas vias implicam nos mecanismos de reparo tecidual.

Adicionalmente, o acúmulo de fatores de sinalização do sistema fechado em alta vazão (com retorno contínuo do mesmo meio durante 7 dias) pode resultar em comunicações intercelulares mais importantes que no sistema de cultivo estático ou dinâmico de baixa vazão (sistema aberto).

O gráfico da Figura V.19 apresenta a contagem de núcleos feita através das seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col. Apesar do alto desvio padrão apresentado, pode-se extrair algumas informações pertinentes ao cultivo sob diferentes condições.

Observa-se que a quantidade de núcleos marcados por seção para o cultivo estático aumenta na primeira semana, com ligeira queda a partir da segunda. Em relação à viabilidade apresentada na Figura V.18, as células apresentam perfil semelhante, com diminuição da viabilidade por volta do 21 o dia. [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF] observaram o início do processo de diferenciação e deposição de uma nova matriz extracelular a partir do 7º dia.

As limitações apresentadas em cultivo estático podem ter sido influenciadas por um ambiente desfavorável à proliferação e ao aumento da população celular. De maneira geral, arcabouços 3-D desenvolvidos para engenharia tecidual apresentam deficiências em relação ao aporte de nutrientes e gases em baixos volumes de meio (Zhang et al., 2009). Segundo [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF], estruturas 3-D altamente porosas podem provocar gradientes de fatores de crescimento e citocinas em seu interior, diminuindo a adesão e a sinalização celular. Apesar do sistema dinâmico em alta vazão apresentar um sistema fechado (com troca do volume de meio a cada 7 dias), nenhuma mudança brusca na coloração do meio de cultivo, e logo do pH, foi verificada. A difusão dos gases ocorre pelos tubos de silicone permeáveis dos sistemas. Segundo [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF], células com maior capacidade proliferativa apresentam uma taxa de glicólise (via anaeróbia) mais elevada e um menor consumo de oxigênio (via aeróbia). Portanto, o uso de um sistema fechado para a alta vazão, não afeta a capacidade proliferativa das células, mesmo com uma menor renovação da taxa de oxigênio.

V.6.3-Análise morfológica -microscopia eletrônica de varredura (MEV):

A morfologia celular durante os 21 dias de cultivo sob as diferentes condições foi observada. Micrografias de MEV referentes às 24 primeiras horas e aos 3 primeiros dias de cultivo são exibidas na Figura V.21; aos 7 e 14 dias de cultivo na Figura V. A partir do 7º dia de cultivo, observam-se diferenças morfológicas mais expressivas entre as condições de cultura. As células submetidas ao cultivo estático mantêm a morfologia já apresentada até o 3º dia, com o surgimento de estruturas de aparência mineral nas superfícies celulares (Figura V.22 a,d). Essas estruturas podem ser secreções celulares de uma nova matriz extracelular composta por proteínas e posteriormente mineralizadas [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF].

Em relação ao cultivo dinâmico, as células não são facilmente visualizadas na superfície dos arcabouços submetidos à baixa vazão (Figura V.22b). Adicionalmente, estruturas arredondadas, semelhantes a células em processo de morte celular, são observadas (Figura V.22 e). Do mesmo modo que nos resultados de viabilidade, a partir do 7º dia, a diminuição do número de células pode estar relacionada a um processo apoptótico. Outros métodos podem ser utilizados futuramente para comprovar tal comportamento.

Células submetidas à alta vazão apresentaram morfologia fibroblastóide (altamente espraiadas) ao 7º dia (Figura V.22 c). Na micrografia da Figura V.22 f, visualiza-se estruturas semelhantes a uma nova matriz fibrosa entre as células (setas).

De acordo com os resultados da viabilidade, as células Stro+1A estão em uma fase de intensa atividade mitocondrial e, provavelmente, de metabolismo e produção de proteínas. Aos 14º dias, visualiza-se estruturas correspondentes à produção de uma nova matriz extracelular na Figura V.22 f (setas). 

V.6.4-Concentração de íons cálcio em solução:

A fim de analisar as estruturas encontradas nas superfícies celulares, as concentrações de íons Ca +2 foram mensuradas no meio de cultivo. Devido ao possível processo de produção de matriz extracelular por parte das células e de precipitação/ dissolução da matriz em biomateriais cerâmicos, os resultados de concentração de cálcio sem e com a presença de células foi averiguado.

Em todas as condições de cultivo ocorre a adsorção de íons cálcio.

Adicionalmente, mesmo na ausência de células, o material é capaz de adsorver íons cálcio oriundos do meio (Figura V.24 a,b).

De maneira geral, a condição dinâmica apresenta taxas de adsorção de cálcio superiores à condição estática. Na Figura V.24 a, aos 14 dias de cultivo sem células, ambas as condições dinâmicas apresentam uma maior quantidade de íons Ca +2 Em relação à presença de células, existem diferenças significativas em todos os tempos de cultivo ( 7, 14 e 21 dias) para a condição estática. Segundo [START_REF] Declercq | Calcification as an Indicator of Osteoinductive Capacity of Biomaterials in Osteoblastic Cell Cultures[END_REF], a capacidade de osteoindução e mineralização do biomaterial deve se dar de maneira verdadeira, isto é, com deposição de uma nova matriz extracelular mediada por células, e não apenas como conseqüência da precipitação espontânea de íons cálcio e fosfato.

Em condição dinâmica em vazão, apenas o 7º dia apresenta diferença significativa. E em condição dinâmica em alta vazão, as células desempenham um papel importante na adsorção de cálcio apenas aos 21 dias. Esse resultado é interessante quando comparamos as morfologias das células na micrografia da Figura V.23 c, onde estruturas semelhantes a uma nova matriz extracelular secretada foi visualizada.

Como demonstrado nas micrografias eletrônicas, as células Stro+1A começam, a partir da segunda semana em cultivo dinâmico em alta vazão, a apresentar em sua superfície estruturas minerais semelhantes a uma matriz extracelular. Entretanto, esse perfil ainda é tímido em relação ao observado para as células em cultivo estático.

Geralmente, células estromais iniciam a deposição de cálcio na matriz após 8-10 dias com aumento ao longo do tempo de cultivo. Essa deposição de cálcio ocorre de maneira desorganizada e não-modular [START_REF] Fromigué | Differential Effects of Transforming Growth Factor β2, Dexamethasone and 1,25-Dihydroxyvitamin D on Human Bone Marrow Stromal Cells[END_REF]. [START_REF] Kassem | Osteoblastic Cells: Differentiation and trans-differentiation[END_REF] afirmam que o processo de mineralização é mediado por várias proteínas não-colagênicas e proteglicanas, e a ausência dessas moléculas pode acarretar em padrões de mineralização diferentes dos obtidos naturalmente ou em cultura em condição estática. O mesmo comportamento é observado para as amostras submetidas ao sistema dinâmico de baixa vazão (Figura V.26 b, e). Provavelmente, os aportes de oxigênio e nutrientes não são suficientes para promover a migração em direção ao interior da amostra. Adicionalmente, uma diminuição da quantidade de núcleos marcados pode ser reparada à partir da segunda semana (imagem não mostrada). Yeatts & Fisher (2011b) afirmam que, quando as concentrações de oxigênio e nutrientes no interior do material estão abaixo do mínimo necessário, ocorre o processo de morte celular.

V.6.5-Colonização do arcabouço HA/Col reticulado pelas

Um fato interessante para ser comparado a esse sistema de cultivo é que essa diminuição não é claramente vista na condição estática. A partir de 14 dias, as células submetidas à baixa vazão experimentam uma condição de cultivo com efeito negativo ao seu desenvolvimento e proliferação. A Figura V.27 detalha a morfologia de um núcleo celular submetido à condição dinâmica de baixa vazão. Nota-se que o volume nuclear é maior que os outros núcleos observados na mesma amostra. Em seu interior a cromatina apresenta-se altamente condensada. Apesar da ausência de marcadores específicos de apoptose, presume-se que esse fenômeno pode estar alterando a morfologia celular. A partir da segunda semana em condição dinâmica de alta vazão, os núcleos celulares apresentam-se dispersos no arcabouço, assim como visto nos resultados de [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF]. Em seus experimentos, as células osteoblásticas apresentaram um alto nível de processos de adesão e migração no arcabouço poroso provocado pela passagem do fluxo na superfície do material. As células permanecem proliferando na superfície, com penetração em maiores profundidades no interior da amostra (Figura V.26 c e f).

Aos 21 dias de cultivo (Figura V.28), as células em condição estática mantêm a camada na superfície do arcabouço, sem migração celular em direção ao interior da Em cultivo dinâmico de alta vazão, as seções histológicas revelam a intensa migração celular e colonização do material pelas células Stro+1A (Figura V.28 c).

Entretanto, essa migração celular não se dá de maneira homogênea através da amostra.

A heterogeneidade do cultivo dinâmico já foi observado anteriormente por diversos trabalhos do grupo de [START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF].

A migração celular pode ter sido influenciada por mudanças na porosidade das amostras. Segundo [START_REF] Liu | Gradiente Collagen/hydroxyapatite Composite Scaffold: Development and Characterization[END_REF], a hidratação do material em meio de cultura pode levar a expansão de 50-100%, resultando em poros de maiores dimensões.

A Figura V. velocidades rotacionais e pela viscosidade do fluido [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF]. No interior de biorreatores, o fluido (meio de cultivo) em movimento se depara com várias superfícies e objetos, resultando na mudança de direção do movimento para regiões de mais fácil escoamento. Neste caso, as regiões periféricas das amostras no interior da câmara. As forças de cisalhamento e a velocidade do fluido aumentam próximas às paredes da câmara [START_REF] Kinney | The Multiparametric Effects of Hydrodynamic Environments on Stem Cell Culture[END_REF].

Forças relacionadas ao movimento do meio de cultivo podem atuar diferentemente em relação à posição da célula na amostra [START_REF] Bancroft | Design of a Flow Perfusion Bioreactor System for Bone Tissue-Engineering Applications[END_REF]. O impacto da hidrodinâmica aparece: na agregação celular (cinética e tamanho); no metabolismo celular (viabilidade, transporte e proliferação); e no fenótipo celular

(diferenciação e funções). Evidentemente, um único parâmetro não atua nas atividades celulares.

Na Figura V.32, o diagrama demonstra um dos movimentos realizados pelo meio de cultivo. Forças de cisalhamento perpendiculares são encontradas na face superior da amostra, enquanto que na periferia, essas forças tornam-se tangentes, se desmembrando em diferentes direções (Figura V.32 c). Provavelmente, a ausência de células nas regiões centrais pode estar relacionada com um conjunto de fatores relacionados a essas forças atuantes (Zhang et al., 2009).

Note que o líquido provavelmente escoa pela lateral das amostras, sem forçar a penetração das células em direção ao centro do arcabouço (Figura V.32 b). Uma vez na periferia, as correntes de convecção podem carregar consigo uma maior concentração de oxigênio e nutrientes, removendo excretas e favorecendo a proliferação celular e colonização do arcabouço 3-D (Yeatts & Fisher, 2011). Segundo [START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF], a pressão e força de cisalhamento, e outros estímulos mecânicos, dirige a proliferação e diferenciação de células osteogênicas.

Além disso, estruturalmente, o arcabouço compósito pode se tornar mais poroso nessa região, com a disponibilidade de fibras mais livres e poros de dimensões maiores.

A porosidade e o microambiente do arcabouço determinam o comportamento local, resultando em um discreto impacto nas células [START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF]. A arquitetura de arcabouços com organização randômica de suas fibras provoca uma alta variação dos efeitos das forças de cisalhamento no interior de biorreatores. Uma porosidade uniforme e bem determinada pode otimizar as propriedades mecânicas e a biocompatilidade [START_REF] Martin | The Role of Bioreactors in Tissue Engineering[END_REF]. Os resultados apresentados na Figura V.34 evidenciam que, iniciada a adesão celular na face superior imediatamente em contato as células durante o processo de inoculação, as células podem migrar e aderir em todo arcabouço. Após 2 semanas, um alto número de células migra da face superior da amostra (Figura V.34 a), passando pelas periferias (Figura V.34 c, f), colonizando as laterais esquerda e direita (Figura V.34 b,e), até atingirem a face inferior da amostra (Figura V.34 d).

Progressivamente ocorre a formação de uma camada celular fina e uniforme pelas células nas superfícies externas do arcabouço impedindo a transferência de massa entre o interior e exterior da mesma amostra [START_REF] David | A Perfusion Bioreactor for Engineering Bone Constructs: an In-Vitro and In-Vivo Study[END_REF]. detalhes da região periférica na superfície superior.

V.6.6-Diferenciação celular:

A diferenciação celular foi verificada através da concentração de três moléculas envolvidas ao processo: a enzima fosfatase alcalina (FA), a proteína osteocalcina (OC) e a proteína pró-colágeno I (PIP). As amostras e as alíquotas de meio foram analisadas ao longo dos 21 dias de cultivo sob as diferentes condições propostas.

Os resultados são apresentados para cada sistema e condição (estático, dinâmico baixa e alta vazão). Apesar das células estarem em contato com o mesmo material, preferiu-se a apresentação dos resultados separadamente. Para os resultados da FA, as análises foram realizadas nas próprias amostras, com a lise das células. Entretanto, para as análises de OC e PIP, alíquotas do meio de cultivo foram recuperadas. Nas amostras em cultivo dinâmico, a passagem constante de meio de cultivo provocou a diluição das proteínas em questão (Yeatts & Fisher, 2011b).

Todos os resultados foram calibrados para serem submetidos à comparação. Os valores sofreram adequação em relação: ao número de células (ou absorbância referente), aos volumes diários passados pelas amostras e o tempo de cultivo. É evidente que, para os cultivos submetidos ao sistema dinâmico, um possível erro esteja incorporado aos resultados, visto que essas moléculas foram altamente diluídas.

Adicionalmente, para concentrações muito diluídas, um efeito de "threshold" dos kits utilizados pode ter causado um aumento nos resultados em questão.

As tensões de cisalhamento provocadas pela passagem do fluido são suficientes para a indução da diferenciação osteoblástica, mesmo em culturas sem o acréscimo de dexametasona (Yeatts & Fisher, 2011b;[START_REF] Liao | Stem Cells and Biomimetic Materials Strategies for Tissue Engineering[END_REF]. Em atuação conjunta, os estímulos provocados pela adição de dexametasona e pela perfusão produzem um efeito sinérgico na diferenciação osteogênica em células mesenquimais de ratos.

Adicionalmente, os efeitos de íons Ca +2 também parecem influenciar esse processo [START_REF] Liao | Stem Cells and Biomimetic Materials Strategies for Tissue Engineering[END_REF]. Zhang et al. (2009) observaram um significante aumento na proliferação, distribuição celular e diferenciação osteogênica in-vitro com a utilização de biorreatores. As tensões de cisalhamento estimulam a proliferação e diferenciação de osteoblastos humanos por via kinase-dependente, entre outros padrões [START_REF] Rauh | Bioreactor Systems for Bone Tissue Engineering[END_REF].

Segundo [START_REF] Fromigué | Differential Effects of Transforming Growth Factor β2, Dexamethasone and 1,25-Dihydroxyvitamin D on Human Bone Marrow Stromal Cells[END_REF] As concentrações obtidas para a proteína OC estão apresentadas na Figura V.36.

A utlização de dexametasona afeta negativamente a produção de OC [START_REF] Liao | Stem Cells and Biomimetic Materials Strategies for Tissue Engineering[END_REF].

Entretanto, a nanoestrutura da matriz compósita parece estimular a produção de FA.

A utilização de dexametasona em culturas de células estromais provoca uma inibição na produção de OC em até 3-4 semanas e um aumento na produção de FA. [START_REF] Fromigué | Differential Effects of Transforming Growth Factor β2, Dexamethasone and 1,25-Dihydroxyvitamin D on Human Bone Marrow Stromal Cells[END_REF] verificaram uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de OC em até 3 semanas. Geralmente, os maiores níveis de secreção de OC são encontrados ao final do processo de diferenciação (3-4 semanas) [START_REF] Declercq | Calcification as an Indicator of Osteoinductive Capacity of Biomaterials in Osteoblastic Cell Cultures[END_REF].

Em condição estática, ocorre o aumento não significativo na concentração de OC em meio de cultura ao longo dos 21 dias de cultivo(Figura V. 

Pró-colágeno I (PIP):

Os resultados referentes às concentrações de PIP estão apresentados na Figura V.37. A produção desse peptídeo pode ser considerada um indício da produção de O sistema dinâmico em alta vazão apresenta concentrações inferiores aos da baixa vazão, mas ainda significativamente maiores que as do cultivo estático (Figura V.37 c). Em relação ao sistema dinâmico de cultivo no interior de biorreatores muito já se avançou para otimizar a migração celular e colonização. Entretanto, o efeito sinérgico de inúmeras variáveis parece determinar o sucesso/insucesso de um "complexo" proposto para aplicações em bioengenharia tecidual. Foi demonstrado nessa tese que vazões que diferem 10x influem de forma drasticamente diferente no comportamento celular. A partir do 7 o dia, duas possíveis vias metabólicas podem ter sido seguidas pelas células Stro+1A: a da morte celular para as células submetidas à baixa vazão; e a alta atividade metabólica, diferenciação e secreção de matriz para as submetidas à alta vazão.

A diferença no transporte de massa de nutrientes e oxigênio, o aumento da porosidade da matriz, as maiores forças de cisalhamento e o aumento da viabilidade, número de células e sinalizações parácrinas podem ter agido conjuntamente para atingir o resultado obtido.

VII(a). CONCLUSIONS

1. Une matrice composite tridimensionnelle poreuse et malléable a été synthétisée par l'agglomération de fibres de collagènes et la déposition de phosphate de calcium. 

VII. CONCLUSÕES

1. Através da síntese de fosfato de cálcio com concomitante agregação de fibras de colágeno, foi produzido um arcabouço compósito tridimensional poroso e moldável.

2. Obteve-se como fase mineral uma hidroxiapatita carbonatada do tipo B deficiente em cálcio depositada sobre e entre as fibras de colágeno. Os policristais nanométricos aparecem embebidos na matriz orgânica sem orientação aparente.

3. O processo de reticulação provocou aumento da resistência do arcabouço à degradação em ambiente de cultivo. O arcabouço compósito não é citotóxico.

Não foi verificada a liberação de glutaraldeído durante 21 dias sob diferentes condições de cultivo celular. Em contrapartida, para a condição estática e sistema de cultivo em alta vazão, as células continuam a apresentar a morfologia fibroblastóide, com presença de estruturas secretadas mineralizadas em sua superfície. 9. Durante os 21 dias de cultivos nos três sistemas apresentados, observou-se a adsorção de íons cálcio. A presença de células aumenta significativamente a adsorção.

10. A migração celular e colonização do arcabouço ocorreram ao longo dos 21 dias de cultivo em sistema dinâmico de alta vazão. Em condição estática, verifica-se a formação de uma camada estratificada na superfície da amostra.

11. Diferentes comportamentos de migração celular foram visualizados. As regiões periféricas das amostras submetidas aos sistemas dinâmicos mostram-se mais colonizadas que as regiões centrais. Em sistema dinâmico de alta vazão, as células também foram uma camada em torno de toda a amostra.

12. As células Stro+1A apresentam baixas concentrações dos indicadores de diferenciação. Os resultados das análises para o cultivo dinâmico são significativamente maiores que os encontrados no cultivo estático.

  Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.) CULTIVO DE CÉLULAS OSTEOPROGENITORAS EM COMPÓSITO 3Metalúrgica e de Materiais Os progressos na área da Bioengenharia tecidual vêm permitindo o desenvolvimento de biomateriais que mimetizam as propriedades encontradas nos tecidos humanos. Compósitos formados por hidroxiapatita (HA) e colágeno (Col) são classificados como bio-derivados e biomiméticos. Os objetivos desse trabalho foram: produzir um arcabouço 3-D e observar o comportamento de células osteoprogenitoras cultivadas em seu interior sob condições de cultura estática e dinâmica (utilizando duas vazões -0,03ml/min e 0,3ml/min). Para a avaliação biológica, células estromais (Stro+1A) foram cultivadas e sua capacidade de colonização e comportamentos de adesão, proliferação e diferenciação foram observados. O arcabouço 3-D HA-Col foi produzido pela reorganização das fibras de colágeno simultânea ao processo de nucleação e crescimento dos cristais de HA. O material foi reticulado e esterilizado por radiação gamma. Células Stro+1A foram inoculadas (5x10 5 células/amostra) e cultivadas em 37°C e 5% CO 2 por até 21 dias. Os resultados da espectroscopia no Infravermelho e da difração de raios X sugerem a formação de uma HA carbonatada deficiente em cálcio. Na condição dinâmica de maior vazão, a viabilidade celular aumentou no decorrer dos 21 dias de cultura. Adicionalmente, pela microscopia eletrônica de varredura e de luz em cortes histológicos corados, as células apresentaramse aderidas e com morfologia fibroblastóide, colonizando o interior do arcabouço compósito. Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.

Figura V. 1 :Figura V. 2 :Figura V. 3 :Figura V. 4 :Figura V. 6 :Figura V. 7 :Figura V. 8 :

 1234678 Figura IV.2: Diagrama do processo de síntese do arcabouço compósito HA/Col.............................................................................................................................44 Figura IV.3: Diagrama do processo de reticulação, moldagem e esterilização do arcabouço compósito HA/Col.........................................................................................46 Figura IV.4: Diagrama da seção do arcabouço compósito usada para o cálculo da porosidade paralela à superfície......................................................................................52 Figura IV.5: Diagrama da seção do arcabouço compósito usada para o cálculo da porosidade transversal à superfície..................................................................................52 Figura IV.6: Tratamento de imagens pelo programa Image J® através de micrografias de luz branca de seções histológicas (15µm) coradas com Picrosirius...........................53 Figura IV.7: Sistema dinâmico e seus componentes. Em (A), esquema do sistema dinâmico com bioreator, garrafas de cultivo e suportes posicionados. Detalhe do bioreator utilizado (B), dos suportes que posicionam as amostras (C), do bioreator montado (D) e do sistema completo (E). Direitos autorais Minucells ® ...........................56 Figura IV.8: Diagrama das amostras do arcabouço HA/Col no interior do biorreator Minucells ® .......................................................................................................................56 Figura IV.9: Diagrama do sistema dinâmico em baixa vazão. Em (1), reservatório de "entrada" de meio fresco de cultivo; (2) bomba peristáltica; (3) biorreator contendo 3 amostras; (4) tubo permeável à gases para passagem de meio e (5) reservatório de "saída" de meio de cultivo..............................................................................................57 Figura IV.10: Diagrama do sistema fechado dinâmico em alta vazão. Em (1), reservatório de "entrada" e "saída" de meio de cultivo; (2) bomba peristáltica; (3) biorreator contendo 3 amostras e (4) tubo permeável à gases para passagem de meio.................................................................................................................................57 Figura IV.11: Diagrama da preparação das amostras do arcabouço compósito para o cultivo celular em três condições de cultura. FA= fosfatase alcalina, OC= osteocalcina, PIP= Pró-colágeno I.........................................................................................................59 Figura IV.12: Gráfico referente à linha base das células STRO+1A. A equação da reta foi utilizada para a conversão das absorbâncias lidas pelo método do MTT em número de células.........................................................................................................................60

"

  complexos engenheirados in-vitro" visam acelerar o processo de reparo tecidual e melhoram a vida dos pacientes e da população. O arcabouço compósito HA/Col foi sintetizado, reticulado e caracterizado para servir de suporte aos processos celulares observados ao longo de 21 dias de cultivo. A capacidade de adesão, proliferação, diferenciação celular e de colonização do material por parte de células osteoprogenitoras estromais foram avaliados. Três diferentes condições de cultivo foram estabelecidas: estática, dinâmica em baixa vazão e dinâmica em alta vazão. O complexo formado pelo biomaterial 3-D proposto e células osteoprogenitoras contribui para o entendimento dos fenômenos relacionados aos processos de reparo após a aplicação e faz parte dos avanços em bioengenharia tecidual.

( 2008 )

 2008 observaram que os estímulos mecânicos em osteoblastos aumentou 800-1200% a produção de prostaglandina E2 em comparação com o cultivo estático. Uma propriedade determinante para o sucesso da colonização do arcabouço 3-D e saúde celular é a concentração celular inoculada. A adesão e reconhecimento célulacélula são fatores determinantes para a continuidade da população celular cultivada na matriz. Uma vez que os arcabouços 3-D apresentam grandes dimensões, um elevado número de células deve ser utilizado.

( 3 -

 3 D). Une matrice 3-D composée de collagène et d'hydroxyapatite a été proposée pour des applications en Ingénierie Tissulaire. Trois conditions de culture ont été établies: statique, dynamique basse vitesse et haute vitesse. Les comportements d'adhésion, de prolifération et de différenciation cellulaire ont été étudiés et, ses résultats, analysés statistiquement. Les événtuelles différences chimique-structurales du matériau ont été aussi observées.

  Produzir, reticular e caracterizar físico-quimicamente o arcabouço compósito 3-D baseado em colágeno e hidroxiapatita;  Estudar o comportamento inicial de adesão das células osteoprogenitoras estromais em cultura tridimensional (em contato com o arcabouço);  Avaliar o comportamento de proliferação, colonização e diferenciação das células osteoprogenitoras sobre os arcabouços em ambiente estático;  Avaliar o comportamento de proliferação, colonização e diferenciação das células osteoprogenitoras sobre o arcabouço sob duas diferentes vazões em cultura dinâmica;  Observar modificações estruturais e físico-químicas no arcabouço tridimensional compósito submetido às diferentes condições de cultivo. IV(a)-MATÉRIAUX ET MÉTHODES Le collagène utilisé pendant cette étude a été extrait du tendon d'Achilles bovine. Le tendon a été lavé, coupé en petits morceaux (3mm 3 ) et traité avec une solution d'acide acétique 0,5M + 10% de pepsine pendant 24 heures à 30 o C. Après la totale élimination des telopeptides, la solution de fibres de collagène dissociées a été centrifugée (90000G) et les fibres ont été précipitées em contact avec une solution de NaCl 10%. La solution a été dialysée en eau destilée et en acide phosphorique 36,52mM et conservée à 4 o C jusqu'à son utilisation (Figure IV.1). Pour la synthèse de la matrice 3-D composée par des fibres de collagène minéralisées par l'hydroxyapatite (50/50 wt%; Ca/P=1,67), une solution de nitrate de calcium et la solution de collagène conservée en acide phosphorique ont été ajoutées dans um bécher sous les conditions de synthèse d'agitation de 240 rpm, pH=9.0 à 38 o C. Ensuite au processus de minéralisation, les fibres minéralisées ont été mantenues pendant 3 heures sous les conditions de synthèse pour stabiliser les crystaux formés (Figure IV.2). Le produit a été reticulé avec une solution de glutaraldehyde (GTA) à 0,125%, lavé plusiers fois avec de l'eau destilée et lyophilisé pendant 24 heures. La matrice 3-D a été stérilisée par radiation gamma (15kGy) (Figure IV.3). La matrice 3-D composée par collagène et hydroxyapatite a été caractérisée par: Diffraction de rayons-X, Spectroscopie d'Infrarouge, Microscopie élétronique à balayage (MEB) et à transmission. La porosité a été étudiée par: le déplacement de liquide et l'analyse d'images sur les coupes de 15µm (histologie). La cytotoxicité a été observée à travers de trois méthodes: (1) kit Cytotox, Xenometrix (tests: XTT, crystal violette et rouge neutre) (normes ISO 10993-12 e 10993-5); (2) analyse de la présence de GTA dans les solutions en contact avec la matrice réticulée; (3) analyse de la viabilité cellulaire utilisant les extraits de la matrice réticulée (norme EM 30 993-5). Les libérations et/ou adsorptions d'ions calcium et phosphate ont été quantifié par des kits Diasys.

  Figura IV.1 esquematiza as diversas etapas envolvidas na extração do colágeno.

Figura IV. 2 :

 2 Figura IV.2: Diagrama do processo de síntese do arcabouço compósito HA/Col.

  amostras permaneceram em contato com o ar durante 48 horas para total remoção do líquido. Para visualização ao microscópio (Quanta 400 -FEI, USA; JEOL modelo JSM6460LV, USA), as amostras foram cobertas por uma camada de ouro e observadas em 15kV. Para a avaliação do processo de mineralização das fibrilas de Col em nível nanométrico, foi utilizado o MET. Ao final do processo de desidratação (etanol 100%), as amostras foram impregnadas em resina Spurr™ (TedPella, USA) (através de trocas sucessivas e crescentes de resina em solução alcoólica) e embutidas em resina à 70 o C. Cortes ultra-finos (60-80nm) (ultramicrótomo RMC, Power TomeX) foram corados com citrato de chumbo (TedPella, USA) por 15 minutos e acetato de uranila (TedPella, USA) por 30 minutos e observados ao microscópio eletrônico de transmissão (FEI, Tecnai G20, USA).

( 1 )( 2 )

 12 Figura IV.4: Diagrama da seção do arcabouço compósito usada para o cálculo da porosidade paralela à superfície.

IV. 5 . 1 -IV. 5 . 2 -

 5152 Figura IV.7: Sistema dinâmico e seus componentes. Em (A), esquema do sistema dinâmico com bioreator, garrafas de cultivo e suportes posicionados. Detalhe do bioreator utilizado (B), dos suportes que posicionam as amostras (C), do biorreator montado (D) e do sistema completo (E). Direitos autorais Minucells ® .

4

  Figura IV.11: Diagrama da preparação das amostras do arcabouço compósito para o cultivo celular em três condições de cultura. FA= fosfatase alcalina, OC= Osteocalcina; PIP= Pró-colágeno I.

Figura

  Figura IV.12: Gráfico referente à linha base das células Stro+1A. A equação da reta foi utilizada para a conversão das absorbâncias lidas pelo método do MTT em número de células.

  Figure V.3) et de spectroscopie infrarouge (Figure V.4), il est possible d'affirmer la présence dans la matrice collagène d'une phase minérale peu cristalline constituée par de l'hydroxyapatite carbonatée du type-B déficiente en calcium (2Ɵ= 31,96 o , 32,19 o e 33,09 o ) (JCPDS n o 09-0169)

  Figure V.14). La résistance à la dégradation du composite HA/Col après réticulation dans les conditions de cultures est plus importante. La libération de glutaraldéhyde n'a pas été observée durant 21 jours (Figure V.15).Malgré le processus de minéralisation, les fibres de Col sont encore accessibles et permettent l'adhésion cellulaire(Figure V.16). Les cellules ostéoprogénitrices stromales adhèrent en majorité à partir de 6 heures de contact avec le matériau(Figure V.17).La viabilité cellulaire est fortement influencée par les systèmes de culture au cours des 21 jours(Figure V.18). En condition statique, les cellules présentent une faible viabilité. Dans les systèmes dynamiques, les comportements cellulaires diffèrent à partir du 7 ième jour. Une forte chute de la viabilité et de la quantité de cellules est observée en basse vitesse après 7 jours alors qu'en haute vitesse, une augmentation de la quantité de cellules est observée(Figure V.19).Dans les 7 premiers jours, les cellules soumises aux systèmes dynamiques sont plus actives qu'en conditions statiques(Figure V.18). Les limitations de l'apport en oxygène et en nutriments sont des facteurs déterminants pour la culture[START_REF] Jaasma | Design and Validation of a Dynamic Flow Perfusion Bioreactor for use with Compliant Tissue Engineering Scaffolds[END_REF]. La diffusion des molécules forme un gradient sur maximum 100-200µm[START_REF] Bjerre | Flow Perfusion Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Silicate-Substituted Tricalcium Phosphate Scaffolds[END_REF]. Les sections histologiques révèlent la formation des couches cellulaires stratifiée durant les 21 jours de cultures (Figure V.28a) en condition statique. De manière générale, les cellules en condition statique de culture forment des couches à la surface des matériaux (Wang et al. 2007). Des structures illustrant la formation, d'une nouvelle matrice extracellulaire ont été observées à partir de 7 jours sur des micrographies de MEB (Figure V.22 d et f) en condition statique et dynamique en haute vitesse. Durant les 3 premiers jours, la position à l'intérieur du bioréacteur est importante pour le système dynamique à basse vitesse. Des différences significatives en quantité de cellules ont été observées (Figure V.20) entre les échantillons dans la première position (plus proche de l'entrée du milieu) par rapport aux deux autres. Ces différences n'ont pas été remarquées pour le système dynamique à haute vitesse. A partir de la deuxième semaine, les comportements cellulaires dans les systèmes dynamiques diffèrent fortement. Pour le système à basse vitesse, la chute de la viabilité peut être expliquée par le processus de mort cellulaire programmé (apoptose) (Figure V.27). Ce résultat est corroboré par la disparition des noyaux cellulaires et par les micrographies électroniques (Figure V.26 et V.28). Dans ce système à basse vitesse, le passage du flux en système ouvert pourrait résulter en un lavage des molécules de signalisations paracrines et d'une dispersion des cellules à la surface limitant ainsi la capacité de survie des cellules (Bjerre et al. 2008). Les résultats du système dynamique en haute vitesse, qui est lui un système fermé, montrent une excellente capacité du composite à supporter les processus cellulaires. Les cellules sont capables d'adhérer, de proliférer et de coloniser la matrice tridimensionnelle (Figure V.26 et V.28). L'importante quantité de cellules, les forces de frictions, un meilleur transport de masse ainsi que la concentration des molécules de signalisations intercellulaires dans le système fermé peuvent expliquer ce succès (McCoy & O'Brien, 2010 ; Bjerre et al. 2008). La migration cellulaire peut avoir été influencée par des changements dans la porosité des échantillons. Selon Liu et al. (2009), l'hydratation des matrices 3-D dans le milieu de culture peut conduire à l'expansion (50-100%) du volume, résultant en des pores plus larges. La Figure V.29 montre qu'il y a eu des variations subtiles dans la porosité des échantillons. Toutefois, la porosité ne semble pas être un déterminant de la migration dans notre système. Différents facteurs (des forces cisaillement, le transport de masse et d'oxygène, etc) semblent agir ensemble dans la migration cellulaire et la colonisation de la matrice 3-D. Des coupes histologiques de différents points de l'échantillon ont été observées (Figure V.30). En général, dans tous les échantillons soumis à des systèmes dynamiques, un grand nombre de noyaux marqués par le DAPI est retrouvé dans les régions périphériques (Figure V.31). Jaasma et al. (2008) afirment que la culture dans des bioréacteurs de perfusion montre d'importantes différences suivant la vitesse de passage du milieu de culture. Dans leurs résultats, des différences entre les régions centrales et périphériques ont été observées. Dans notre expérience, la région centrale de l'échantillon soumis au système de culture à basse vitesse (Figure V.31a) présente une faible quantité de noyaux marqués, tandis que la région périphérique montre une quantité plus importante de cellules (Figure V.31b). Ce profil a été également retrouvé dans nos échantillons, cultivés à haute vitesse. La stimulation par le passage d'un flux constant augmente significativement les concentrations des marqueurs de différenciation cellulaires (Figure V.35 ; V.36 et V.37). Nos résultats pour les deux flux sont nettement plus élevés que ceux trouvés pour la condition statique. Malgré la forte dilution à laquelle les échantillons de millieu ont

Figura V. 1 :

 1 Figura V.1: Macrografia do arcabouço compósito HA/Col sintetizado antes da conformação em cilindros-molde.

Figura V. 2 :

 2 Figura V.2: Difratograma do fosfato de cálcio produzido na ausência do colágeno. Em (A), amostra calcinada à 1000 o C e (B) em condições de síntese (38 o C).

Figura V. 3 : 4 :

 34 Figura V.3: Difratograma do arcabouço compósito HA/Col sob condições de síntese pH=9 e 38 o C.

Figura

  Figura V.5: FT-IR do compósito HA/Col antes (a) e após (b) o processo de reticulação pela solução de 0,125% de GTA.

  170 o C), semelhante ao pico endotérmico apresentado para o osso natural; uma segunda, entre 190 e 400 o C, e uma terceira entre 400 e 670 o C, correspondentes à microdegradação seguida de uma macrodegradação das estruturas em hélice das moléculas de Col. Chang et al. (2003) afirmam que, até 800 o C, ocorre a liberação de dióxido de carbono presente na HA carbonatada (observada por FT-IR). O dióxido de carbono é dissolvido na solução aquosa durante a síntese e reage com os íons hidroxila e/ou fosfato da HA. Tabela V.1: Análise termogravimétrica do arcabouço compósito HA/Col reticulado e submetido durante 21 dias às condições de cultivo estático.

V. 2 )

 2 . Uma porosidade homogênea de 62 ±5% foi encontrada entre as amostras. O compósito HA/Col absorveu rapidamente o líquido, sem entumescimento aparente da sua macroforma. Tabela V.2: Porosidade de 3 amostras do arcabouço compósito HA/Col reticulado medida por deslocamento de líquido.

Figura V. 6 :

 6 Figura V.6: Porosidade correspondente às seções histológicas seriadas paralelas à superfície de uma amostra do arcabouço compósito. Análise de imagem em seções de 15 µm coradas com Picrosirius e tratadas por Image J ® .

Figura V. 7 :

 7 Figura V.7: Micrografia do arcabouço compósito HA/Col reticulado corado por Picrosirius. Fibras de colágeno em vermelho. Detalhes (*) nos poros presentes na estrutura 3-D.

Figura V. 9 :

 9 Figura V.9: Micrografias de microscopia eletrônica de varredura compósito HA/Col reticulado (A). Detalhe para a deposição mineral das fibras (B). Magnificações: 250x; 10000x.

  e[START_REF] Bohner | Calcium Orthophosphates in Medicine: from Ceramics to Calcium Phosphates Cements[END_REF] afirmam que a precipitação em soluções aquosas, onde a temperatura não excede 100 o C, pode resultar cristais de tamanhos nanométricos ou até milimétricos, dependendo das condições de síntese.[START_REF] Zhai | Formation of Nano-Hydroxyapatite on Recombinant Human-Like Collagen Fibrils[END_REF] controlaram as dimensões dos cristalitos de HA e o diâmetro das fibras de Col através das proporções dessas soluções no momento de síntese. O material final apresenta cristalitos na superfície das fibrilas de Col e foi altamente influenciado por essas concentrações e condições de síntese.

Figura V. 12 :

 12 Figura V.12: Micrografias de TEM do arcabouço compósito HA/Col reticulado. Em (a), alto padrão de dispersão dos nanocristais de HA na matriz orgânica de Col; em (b), formação de alguns aglomerados policristalinos (*) evidenciando a heterogeneidade do processo e em (c) detalhes da microporosidade (*).

Figura V. 13 :

 13 Figura V.13: Micrografias de MET do arcabouço compósito HA/Col reticulado contrastado com uranila. Em (A), detalhe da fibrila de Col após mineralização e em (B) orientação dos nanocristais de HA imersos na matriz de Col.

  Figura V.14: Citotoxicidade do compósito HA/Col reticulado segundo três métodos de determinação: XTT, vermelho neutro e cristal violeta. Diferenças significantes entre os grupos de materiais testados (*, **, ***). p < 0.05.

  Figura V.15: Detalhe dos espectros de UV-visível das soluções de PBS expostas ao arcabouço até 21 dias. Sta= condição estática; Dyn= condição dinâmica em alta vazão.

Entre 3 e

 3 6 horas (*), provavelmente ocorre o reconhecimento e início das interações entre proteínas da membrana (integrinas) e regiões RGD da superfície das fibras de colágeno da matriz compósita (Thein-Han & Xu, 2011).

Figure V. 16 :

 16 Figure V.16: Adesão das células Stro+1A no arcabouço compósito HA/Col reticulado. n=3. Diferenças significativas entre os tempos (*). n=6. p < 0.05.

Figura V. 17 :V. 6 . 2 -

 1762 Figura V.17: Micrografias das células Stro+1A em processo de reconhecimento da superfície e adesão sobre o arcabouço compósito HA/Col reticulado. Magnificações: 500x, 1000x e 2000x.

Jaasma

  Figura V.19: Contagem dos núcleos celulares marcados por DAPI presentes por seção histológica do arcabouço compósito HA/Col submetido às diferentes condições de cultivo por até 21 dias. n= 4.

  Figura V.20: Número de células Stro+1A cultivadas no arcabouço compósito HA/Col reticulado em diferentes tempos, vazões e posições no interior do bioreator. Diferenças significativas entre os tempos e condições de cultivo (*,**). n=6. p < 0.05.

  22; e aos 21 dias de cultivo na Figura V.23. Nos 3 primeiros dias de cultivo, sob todos as condições, as células apresentam morfologia fibroblastóide (espraiadas) na superfície dos arcabouços. Não foram identificadas diferenças morfológicas entre as condições. As células interagem bem com a superfície fibrosa e visualiza-se uma maior quantidade de filópodios nas amostras submetidas às tensões de fluxo do cultivo dinâmico (Figura V.21, b,c,e,f). É evidente que as células submetidas às forças de cisalhamento do meio de cultivo formam um maior número de processos de adesão focal e fibras de tensão (Marques da Silva et al., 2010).

Figura V. 21 :

 21 Figura V.21: Micrografias das células Stro+1A cultivadas no arcabouço compósito HA/Col reticulado após 1 e 3 dias de cultivo sob diferentes condições. Magnificação: 2000x.

Figura V. 22 :

 22 Figura V.22: Micrografias das células Stro+1A cultivadas no arcabouço compósito HA/Col reticulado após 7 e 14 dias de cultivo sob diferentes condições. Magnificação: 2000x.

Figura V. 24 :

 24 Figura V.24: Concentração de Ca +2 em meio de cultura com o arcabouço compósito HA/Col reticulado em ausência (A) e presença (B) de células Stro+1A com 7, 14 e 21

  Figura V.25: Seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col com núcleos das células Stro+1A marcados por DAPI. Imagens correspondentes a 1 e 3 dias de cultivo sob diferentes condições.

Figura V. 27 :

 27 Figura V.27: Micrografia do núcleo das células Stro+1A marcadas por DAPI cultivadas sob o arcabouço HA/Col em sistema dinâmico de baixa vazão após 7 dias. Detalhe para a cromatina altamente condensada no interior do núcleo (setas).

matriz 3 -

 3 Figura V.28: Seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col com núcleos das células Stro+1A marcados por DAPI. Imagens correspondentes a 21 dias de cultivo sob diferentes condições.

  Figura V.29: Porosidade do arcabouço compósito HA/Col submetido às condições de cultivo: estático, dinâmica baixa e alta vazão. Em vermelho, porosidade do compósito após 24 horas imerso em meio de cultura.

Figura V. 31 :

 31 Figura V.31: Seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col com núcleos das células Stro+1A marcados por DAPI. Imagens correspondentes a 21 dias de cultivo sob sistema dinâmico em baixa vazão. Em (A), detalhe da região central da amostra e, em (B), da região periférica.

Figura V. 32 :

 32 Figura V.32: Diagrama das forças atuantes na superfície do arcabouço compósito HA/Col submetido ao sistema dinâmico.

Figura V. 34 :

 34 Figura V.34: Seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col com núcleos das células Stro+1A marcados por DAPI. Imagens correspondentes a 14 dias de cultivo sob sistema dinâmico em alta vazão. Em (A e D), detalhe da região central da amostra na superfície superior e inferior; em (B e E), detalhe das laterais da amostra; e em (C e F),

Figura V. 35 :

 35 Figura V.35: Concentração de fosfatase alcalina expressa por células Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e tempos de cultivo. Em (A), condição estática, e em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão, respectivamente. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p< 0.05.

  Figura V.36: Concentração de osteocalcina produzida por células Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e tempos de cultura. Em (A), cultivo estático, em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p < 0.05.

  parte das células cultivadas. Apesar da detecção da secreção de PIP, a distinção de novas moléculas apresenta dificuldades devido à natureza colagênica da própria matriz[START_REF] Dawson | Development of Specific Collagen Scaffolds to Support the Osteogenic and Chondrogenic Differentation of Human Bone Marrow Stromal Cells[END_REF].Em condição estática, ocorre o aumento da produção de PIP ao longo dos 21 dias, sendo significativo em relação aos 7º e 14º dias (Figura V.37 a). A produção de colágeno pode ser corroborada com as imagens de MEV (Figuras V. 25 e 26), onde células Stro+1A provavelmente iniciam a produção de matriz extracelular. Uma vez aderidas na superfície do arcabouço compósito, as células proliferam, diferenciam e iniciam o processo de produção da matriz. Entretanto, as concentrações observadas são significativamente inferiores aos encontrados em ambos os cultivos dinâmicos. O sistema de fluxo constante parece ser responsável pelo aumento da concentração de PIP pelas células Stro+1A.O cultivo sob sistema dinâmico em baixa vazão apresenta um pico de concentração de PIP em 14 dias. O aumento em relação ao 7º dia e a queda aos 21 dias são estatisticamente significantes (Figura V.37 b). É difícil justificar a produção de PIP pelas células nesse sistema. Na maioria dos resultados, observou-se uma diminuição no metabolismo celular e na quantidade de núcleos observados. A limitação do baixo número de células pode acarretar em erros de cálculo. Além disso, esse tipo sistema (aberto) resulta em um elevado fator de diluição da proteína no meio de cultivo coletado.

Fromigué

  Figura V.37: Concentração de pró-colágeno do tipo I (PIP) produzida por células Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e tempos de cultura. Em (A), cultivo estático, em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão, respectivamente. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p < 0.05.

2 . 7 .

 27 La phase minérale est constituée d'une hydroxyapatite carbonatée de type B déficiente en calcium déposée sur et entre les fibres de collagène. Les cristaux nanométriques sont présents dans la matrice organique sans orientation apparente. 3. Le processus de réticulation accroit la résistance du composite dans l'environnement de culture. Le composite synthétisé et réticulé n'est pas cytotoxique et aucune libération de glutaraldéhyde n'a été constatée pendant 21 jours de culture. 4. Les fibres de collagènes minéralisées maintiennent leurs propriétés de surfaces tout en permettant l'adhésion cellulaire. Les cellules semblent bien adhérées avec une morphologie polygonale durant 7 jours quelles que soient les différentes conditions d'immersion (statique, dynamiques à basse et haute vitesse). 5. La viabilité cellulaire est fortement influencée par les systèmes de culture utilisés au cours des 21 jours. En conditions statiques, les cellules présentent une faible viabilité.Dans les systèmes dynamiques, le comportement cellulaire diffèrent à partir du 7 ième jour. Une forte chute de la viabilité et de la quantité de cellule est observée en basse vitesse alors qu'en haute vitesse, une augmentation du nombre de cellule est observée.6. La position de l'échantillon à l'intérieur du bioréacteur est un facteur déterminant pour la viabilité seulement durant les 3 premiers jours dans le système dynamique à basse vitesse. La morphologie cellulaire corrobore les résultats obtenus pour la viabilité. En basse vitesse, les cellules cultivées disparaissent après le 14 ième jour. Néanmoins, dans les conditions statiques et dynamiques haute vitesse, les cellules continuent de bien adhérer et de petites structures minéralisées peuvent être observées à leur surface. 8. La migration cellulaire et la colonisation de la matrice sont bien établies durant les 21 jours de culture dans le système dynamique à haute vitesse. En système statique, une couche continue de cellules se forme à la surface de l'échantillon. 9. À l'intérieur du bioréacteur, les échantillons subissent différentes contraintes dynamiques. Dans les 2 systèmes dynamiques, la région périphérique présente une quantité de cellule plus importante comparée à la région centrale. 10. Le système dynamique à haute vitesse montre les meilleurs résultats pour la à haute vitesse est apte à l'utilisation en bioingénierie.

4 .

 4 A proporção HA:Col encontrada (60:40) foi similar à teórica (50:50). O arcabouço HA/Col mantém suas propriedades estruturais mesmo após 21 dias de cultivo. 5. O arcabouço formado pelas fibras de colágeno mineralizadas mantém sua disponibilidade à adesão celular. As células apresentam-se bem aderidas e com morfologia fibroblastóide até 7 dias de cultivo em todos os sistemas propostos. 6. A viabilidade celular foi altamente influenciada pelos sistemas de cultivo até 21 dias. Em condição estática, as células apresentam baixa e constante viabilidade. Nos sistemas dinâmicos, o comportamento celular difere a partir do 7 o dia, com intensa queda na viabilidade e número de células em sistema dinâmico de baixa vazão (0,03ml/min); e aumento significativo para as células submetidas à alta vazão (0,3ml/min). 7. A posição da amostra no interior do biorreator é um fator determinante para a viabilidade nos primeiros 3 dias no sistema dinâmico de cultivo em baixa vazão. 8. A morfologia celular corrobora os resultados obtidos para a viabilidade. Em baixa vazão ocorre o desaparecimento das células no material a partir do 14 o dia.

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  Concentração de fosfatase alcalina expressa por células Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e tempos de cultivo. Em (A), condição estática, e em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão, respectivamente. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p<0,05............................................................................................................................112 Figura V.36: Concentração de osteocalcina produzida por células Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e tempos de cultura. Em (A), cultivo estático, em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p<0,05....................................................114 Tabela V.1: Análise termogravimétrica do arcabouço compósito HA/Col reticulado e submetido durante 21 dias às condições de cultivo estático............................................75 Tabela V.2: Porosidade de 3 amostras do arcabouço compósito HA/Col reticulado medida por deslocamento de líquido...............................................................................77

	I(a)-INTRODUCTION
	L'organisme humain présente de nombreuses constantes de régénération
	tissulaires et c'est cette caractéristique essentielle qui maintient l'équilibre
	physiologique. Toutefois, l'existance de lésions importantes provoquée par un
	déséquilibre interne ou externe peut empêcher l'organisme de s'auto-régénerer. Dans ce
	cas, l'application des biomatériaux développés pour des applications biomédicales
	peuvent améliorer le processus de guérison.
	Figura V.37: Concentração de pró-colágeno do tipo I (PIP) produzida por células Pour les applications en tissus durs, les biomatériaux doivent posséder des
	Stro+1A cultivadas sob arcabouço compósito HA/Col sob diferentes condições e propriétés similaires aux matrices naturelles tant sur le plan biologique que physico-

(B), da região periférica.................................................................................................105 Figura V.32: Diagrama das forças atuantes na superfície do arcabouço compósito HA/Col submetido ao sistema dinâmico.......................................................................107 Figura V.33: Diagrama das seções observadas na colonização periférica do arcabouço compósito HA/Col por células Stro+1A sob sistema dinâmico de alta vazão após 21 dias.................................................................................................................................108 Figura V.34: Seções histológicas do arcabouço compósito HA/Col com núcleos das células Stro+1A marcados por DAPI. Imagens correspondentes a 14 dias de cultivo sob sistema dinâmico em alta vazão. Em (A e D), detalhe da região central da amostra na superfície superior e inferior; em (B e E), detalhe das laterais da amostra; e em (C e F), detalhes da região periférica na superfície superior......................................................109 Figura V.35: tempos de cultura. Em (A), cultivo estático, em (B e C), sistema dinâmico de baixa e alta vazão, respectivamente. Diferenças significativas entre os tempos de cultivo (*). p<0,05............................................................................................................................116 Lista de Tabelas: mécanique (Engel et al., 2007). De plus, les propriétés d'ostéoconduction, d'ostéoinduction et de biodégradabilité sont primordiales dans la réussite de l'implantation. Dans les applications en bioingénierie osseuse, les implants métalliques et les greffes à base de polymères et céramiques sont très largement utilisés. Les combinaisons entre différents matériaux, tel que les composites, augmentent les possibilités d'applications. Dans ce domaine, les composites à base de collagène (Col) et d'hydroxiapatite (HA) sont devenus tellement performant qu'ils peuvent être classifiés comme des matériaux biomimétiques

  Col inibe o crescimento e o tamanho do cristalito de HA, principalmente na direção (002). Em contrapartida, segundo[START_REF] Zhang | Effects of Crystalline Phase on the Biological Properties of Collagen-Hydroxyapatite Composites[END_REF], materiais utilizados atualmente para regeneração óssea apresentam fases cristalinas diferentes das do osso natural.

	Entre as fases minerais verificadas não foi encontrada a fase de óxido de cálcio
	como um dos constituintes desse material. Segundo a norma francesa NF S 94-066
	(1998), o óxido de cálcio é citotóxico, sendo sua ausência um requisito importante para
	os materiais que entrarão em contato com células.

. Segundo Sena et al. (2009) e Sogo et al. (2004), o

  adsorvidos em relação ao cultivo estático (*,**). Ainda para a condição dinâmica em alta vazão, o resultado é significativamente maior no 7º, 14º, e 21º em relação ao estático e 7º e 21º dia para a condição dinâmica de baixa vazão (*). Entretanto, não existem diferenças significativas entre os tempos de cultivo para a condição de alta vazão. A renovação constante de meio com maior vazão resulta em uma elevada concentração de íons disponíveis em contato com a matriz do material.

	Em presença das células Stro+1A (Figura V.24 b), o comportamento de adsorção
	dos íons Ca +2 é mantido. As condições de cultivo não apresentam diferenças
	significativas entre os tempos. Entretanto, entre as condições, assim como nos
	resultados apresentados na ausência de células, a condição dinâmica em alta vazão
	difere significativamente nos 7º, 14º e 21º dia do cultivo estático e do dinâmico em
	baixa vazão (*).