sdv.bv chim.ther
Keywords: Produits naturels, anthraquinones, flavonoïdes, mélanome humain, activité antispasmodique Produtos naturais, antraquinonas, flavonoides, melanoma humano, atividade antiespasmódica Natural products, anthraquinones, flavonoids, human melanoma, antispasmodic activity

Le Brésil est un pays qui présente une vaste biodiversité, en particulier dans la région de la Caatinga, dans le Nordeste. Dans ce biome poussent des plantes de la famille des Cordiaceae, qui sont utilisées par les communautés locales pour le traitement de certaines maladies. C'est notamment le cas des espèces Varronia dardani et V. leucocephala, dont les infusions sont utilisées pour soulager les douleurs gastriques, les coliques menstruelles et l'arthrite. L'objectif de ce travail était de contribuer à la connaissance de ces espèces, en étudiant leurs propriétés phytochimiques et biologiques. Le matériel végétal a été collecté à Serra Branca-PB et Maturéia-PB et soumis à des processus d'extraction. L'extrait éthanolique brut de V. dardani (EEB-VD) a été soumis à la détermination des composés phénoliques totaux et à la quantification de l'acide rosmarinique, considéré comme l'un des marqueurs chimiotaxonomiques de la famille des Cordiaceae. Un criblage a été effectué avec le EEB-VD pour évaluer son activité spasmolytique dans différents organes. L'activité antiproliférative des extraits et fractions de ces espèces a également été évaluée contre des cellules de mélanome humain (A2058). En utilisant des techniques de RMN, les composés isolés des espèces étudiées ont été identifiés. Le screening concernant l'activité dans le muscle lisse, a montré que l'extrait EEB-VD présente une activité spasmolytique non sélective dans différents tissus et pour différents agonistes testés, avec une puissance maximale sur l'utérus des rats. À partir de la fraction acétate d'éthyle du EEB-VD, il a été possible d'isoler et d'identifier cinq flavonoïdes, dont trois aglycones (isosakuranetine, naringenine et rhamnocitrine) et deux glycosylés (astragaline et isoquercitrine), en plus de l'acide rosmarinique. En ce qui concerne le test d'activité antiproliféartif sur cellules de mélanomes, la fraction isopropanolique de l'extrait de racines de V. dardani s'est révélée la plus active, et c'est à partir de cette fraction qu'a été isolé une nouvelle molécule, la vardanone, la première hydroanthraquinone rapportée dans l'espèce V. dardani. Ce composé a été évalué dans une étude chimio-informatique, dans laquelle l'activité de son groupe d'isomères sur la lignée cellulaire A2058 a été analysée, par rapport aux témoins positifs que sont la dacarbazine et le vemurafenib, des médicaments utilisés dans le schéma thérapeutique actuel du mélanome. La deuxième espèce la plus active dans les tests d'inhibition de prolifération était V. leucocephala, à partir de laquelle il a été possible d'isoler une saikosaponine, déjà isolée précédemment dans l'espèce. Ainsi, les résultats chimiques et biologiques, obtenus dans ce travail, ont contribué à la connaissance du genre Varronia, de plus, l'étude a révélé de nouvelles possibilités de recherche sur ces espèces grâce à la découverte de nouveaux métabolites secondaires, principalement de la classe des quinones.

INTRODUCTION 1 INTRODUÇÃO

As plantas possuem um papel de grande importância na vida do homem desde tempos imemoriais, sendo exploradas de diferentes modos para diversas finalidades, destacando-se a busca por tratamento e cura de doenças [START_REF] Waswa | phytochemistry, pharmacology, and toxicology of the genus Sambucus L. (Viburnaceae)[END_REF].

Evidências arqueológicas recentes apoiadas por dados históricos e etnográficos mostram um amplo consumo de plantas, principalmente venenosas e psicotrópicas, durante a era paleolítica. Ou seja, existem evidências que mostram que a partir do homem paleolítico, houve a construção do conhecimento e uso de metabólitos secundários de plantas (HARDY, 2020).

Ainda hoje, uma vasta parcela da população global ainda opta pela utilização de ingredientes ou preparações medicinais à base de ervas para a manutenção de seu bemestar [START_REF] Khandokar | Ethnomedicinal uses, phytochemistry, pharmacological activities and toxicological profile of Glycosmis pentaphylla (Retz.) DC.: A review[END_REF]. No Brasil, até os dias atuais, as plantas medicinais possuem papel significativo no cotidiano de diversas comunidades e representam, muitas vezes, o único recurso para tratar diversas enfermidades [START_REF] Da Mota | Etnofarmacologia de plantas medicinais utilizadas pela população rural e ribeirinha do município de Itacoatiara-AM[END_REF], o que foi confirmado pela Organização Mundial da Saúde (OMS), onde em um relatório, cita que cerca de 80% da população mundial ainda está habituada a utilizar derivados de plantas, para satisfazer total ou parcialmente suas necessidades primárias necessidade de saúde [START_REF] Shipa | An insight into the anti-ulcerogenic potentials of medicinal herbs and their bioactive metabolites[END_REF].

De todas as espécies de vegetais conhecidas globalmente, aproximadamente 20% é encontrado no Brasil, um país que possui uma biodiversidade extremamente rica, encontrada em vários biomas importantes (MANDOVA, 2022), e apesar do grande uso popular de plantas medicinais, muitas espécies ainda não foram estudadas quanto a sua composição química e atividade biológica, comprovando cientificamente suas propriedades terapêuticas. Diante desta problemática, muitos pesquisadores vêm desenvolvendo métodos de isolamento e identificação com o objetivo de descobrir novos princípios ativos e novas atividades farmacológicas de substâncias já conhecidas oriundas de plantas. Esses estudos são necessários para garantir o uso seguro e confiável de drogas vegetais através do entendimento do mecanismo de ação e efeitos colaterais ou tóxicos dessas plantas [START_REF] Firmo | Contexto histórico, uso popular e concepção científica sobre plantas medicinais[END_REF][START_REF] Aware | Natural bioactive products as promising therapeutics: A review of natural product-based drug development[END_REF].

A maioria das substâncias orgânicas conhecidas são produzidas pela natureza, A região da Caatinga é uma das maiores e mais biodiversas terras do mundo e está restrita ao nordeste do Brasil e norte do estado de Minas Gerais, representada por cerca de 5000 espécies, favorecendo a produção de altas taxas de metabólitos secundários por sua flora e apesar de ser um bioma exclusivamente brasileiro, ainda é pouco protegido e estudado por ser reconhecido como "pobre", porém pesquisas recentes revelaram um grande potencial com ampla diversidade e endemismo [START_REF] Ferreira | Conhecimento e usos de plantas medicinais e suas interconexões com a saúde pública do município de Arauá/SE. 2017. Dissertação[END_REF][START_REF] Cavalcante | Potencial ornamental de espécies do Bioma Caatinga[END_REF]ALVES et al., 2017;SILVA, MOREIRA e FELISMINO, 2017;[START_REF] Silva | Levantamento Etnobotânico das plantas medicinais usadas por pacientes do Sistema Único de Saúde na cidade de Anápolis/GO, com ênfase no Bioma Cerrado[END_REF][START_REF] De Araújo | The Caatinga region is a system and not an aggregate[END_REF].

As comunidades locais das regiões da Caatinga, utilizam muitas plantas endêmicas como uma alternativa para o tratamento de algumas doenças. É importante ainda, destacar que existem diversos estudos que apontam o potencial farmacológico das plantas de caatinga [START_REF] Luna | Antioxidant potential of the Caatinga flora[END_REF].

A Família Cordiaceae

A atual família Cordiaceae era tradicionalmente considerada uma subfamília de C. exaltata (Folhas) 8,8 'dimetil-3,4,3',4''-dimetilenodioxi-7-oxo-2,7'-ciclolignana 8,8'-dimetil-4,5-dimetoxi-3',4'metilenodioxi-7-oxo-2,7'-ciclolignana NOGUEIRA et al. (2013) C. sebestena [START_REF] Gomes | Development and validation of a quantification method for α-humulene and trans-caryophyllene in Cordia verbenacea by high performance liquid chromatography[END_REF].

O gênero Varronia é relatado na literatura como fonte de diversos compostos como flavonoides, chalconas, quinonas e saponinas triterpênicas (DINIZ et al., 2008;[START_REF] Melo | Saponinas das folhas de Cordia leucocephala Moric[END_REF][START_REF] Duarte | Estudo químico e biológico do óleo essencial da Varronia dardani[END_REF][START_REF] Diniz | An Uncommon Naphthaquinoid and a New Lignan Derivative from the Roots of Cordia leucocephala Moric[END_REF][START_REF] Veloso | Flavonoids from Varronia dardani (Taroda) J.S. Mill (Cordiaceae) and the evaluation of spasmolytic activity of its crude ethanolic extract[END_REF]. 

A espécie

27).

Quadro 3 -Alguns compostos isolados da espécie V. leucocephala. -glicopiranosilsiloleano-11,13-dieno-3β,16α, 23,28-tetrol MELO et al. (2012) 

Parte da planta Substâncias Referências

Raízes

Flavonoides encontrados no gênero Varronia

Na constituição química de espécies desse gênero destaca-se a presença de flavonoides, principalmente os que possuem estrutura do tipo favanonas (Figura 4, p.

29). Estes metabólitos são caracterizados pela presença de uma cadeia de três carbonos saturados e um átomo de oxigênio no C4 (D' ARCHIVIO et al, 2007) e outros mediadores da inflamação (elastase, histamina, etc.). Além disso, outras atividades foram comprovadas, como anti-hemorrágica, espasmolítica, diurética e antitumoral (MIDDLETON et al., 2000;NIJVELDT et al., 2001;REVANKAR et al., 2017). Sugeriu-se também que alguns flavonoides diminuem o risco de doença coronariana (MOJZISOVA et al., 2001;ISHIZAWA et al., 2011), e dietas ricas de flavonoides têm efeitos benéficos contra a resistência à insulina (CHUDNOVSKIY et al., 2014;BLUNDER et al., 2017).

Antraquinonas

As antraquinonas são metabólitos secundários muito abundantes na natureza e fazem parte da classe das quinonas, assim como as benzoquinonas e naftoquinonas. São consideradas como pigmentos naturais, com aproximadamente 700 compostos já descritos, isolados de plantas, líquens e fungos e muitos têm como esqueleto básico a 9,10-antracenodiona (Figura 5, p. 31), um composto tricíclico aromático [START_REF] Diaz-Muñoz | Chapter 11: Anthraquinones: An Overview[END_REF].

Essa classe de metabólitos é frequentemente identificada nas famílias Euphorbiaceae, Fabaceae, Rhamnaceae, Solanaceae, Bignoniaceae, Rubiaceae, Verbenacea, entre outras [START_REF] Seigler | Naphthoquinones, and Anthraquinones[END_REF].

Figura 5 -Esqueleto básico 9,10-antracenodiona.

Fonte: Autoria própria (2022).

Os derivados antracênicos podem ser formados a partir de unidades provenientes de acetil-ou malonilcoenzima A, através do ácido o-succinilbenzoico ou do ácido phidroxibenzoico. Adicionalmente, algumas quinonas têm origem biossintética mista, com o anel formado pela via do acetato (policetídeo) e cadeia lateral derivada do isopreno [START_REF] Simões | Farmacognosia -do Produto Natural ao Medicamento[END_REF].

As hidroxiantraquinonas são derivados antracênicos, onde houve a substituição de um ou mais átomos de hidrogênio (H) por um grupo hidroxila. A quinizarina (Figura 6, p. 32) é a dihidroxiantraquinona mais comum [START_REF] Diaz-Muñoz | Chapter 11: Anthraquinones: An Overview[END_REF]. Muitas antraquinonas hidroxiladas são eficazes para superar a quimiorresistência de certas drogas quimioterápicas e também são comumente usadas como compostos antioxidantes em aplicações alimentícias e medicinais [START_REF] Rivas-Sánchez | Quinizarin characterization and quantification in aqueous media using UV-VIS spectrophotometry and cyclic voltammetry[END_REF].

Figura 6 -Estrutura da quinizarina.

Fonte: Autoria própria (2022).

Outros derivados das antraquinonas são as hidroantraquinonas, que são resultantes da hidrogenação de um dos anéis aromáticos. Foram relatados vários efeitos biológicos das hidroantraquinonas, tais como atividades antimalárica, antimicrobiana, antiviral, citotóxica, inibitórias da cinase e fitotóxicas [START_REF] Li | Antioxidant Hydroanthraquinones from the Marine Algal-Derived Endophytic Fungus Talaromyces islandicus EN-501[END_REF][START_REF] Vo | A thermodynamic and kinetic study of the antioxidant activity of natural hydroanthraquinones[END_REF][START_REF] Kuang | Hydroanthraquinones from Nigrospora sphaerica and Their Anti-inflammatory Activity Uncovered by Transcriptome Analysis[END_REF].

Músculo liso

O músculo liso é bem distribuído em muitas partes do corpo e tem funções variadas e especializadas, baseadas em ciclos coordenados de contração e relaxamento [START_REF] Frismantiene | Smooth muscle cell-driven vascular diseases and molecular mechanisms of VSMC plasticity[END_REF]. Alterações nesses ciclos coordenados são consideradas manifestações de que algo na fisiologia normal está perturbado, causando assim a dor, um estímulo que leva muitas pessoas a buscarem auxílio médico [START_REF] Mayoka | Acute toxicity, analgesic, and smooth muscle relaxant effects of the aqueous root extract of Asparagus racemosus from Kenya[END_REF].

Muitas plantas com atividade antiespasmódica têm sido utilizadas na medicina tradicional para aliviar as diferentes doenças desde a antiguidade. Atualmente, os compostos antiespasmódicos são usados para reduzir a ansiedade, a tensão emocional e musculoesquelética e a irritabilidade. [START_REF] Martínez-Pérez | Natural Antispasmodics: Source, Stereochemical Configuration, and Biological Activity[END_REF]. Diversas patologias onde há uma alteração da contratilidade muscular lisa, como, asma, hipertensão arterial, disfunção erétil e complicações durante a gravidez são de grande interesse de pesquisa, por isso a busca de novos compostos com atividade atenuante dessa contração é extremamente importante [START_REF] De Alencar | Pharmacological screening of the phenolic compound caffeic acid using rat aorta, uterus and ileum smooth muscle[END_REF].

Neste sentido, vários óleos essenciais, extratos, fases e substâncias isoladas de algumas espécies da família Cordiaceae foram testadas em modelos, in vivo e/ou in vitro, mostrando-se ativas frente a diversos tipos de músculo liso [START_REF] Albayaty | Mechanism of the Tracheal Smooth Muscle Relaxant Activity of the Cordia myxa Plant Extract in Sheep[END_REF][START_REF] Sánchez-Recillas | Airway smooth muscle relaxant activity of Cordia dodecandra A. DC. mainly by cAMP increase and calcium channel blockade[END_REF][START_REF] Ferede | africana (Lamiaceae) in Mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine[END_REF].

Como já foi falado anteriormente, a família Cordiaceae é rica em flavonoides, naftoquinonas e diversos ácidos fenólicos, e as atividades antiespasmódicas desses compostos já foram relatados na literatura (QIU et al., 2017;[START_REF] Ali | Anti-Atherosclerosis and Anti-Hypertensive Effects of Flavonoid Isorhamnetin Isolated from the Bark of Cordia dichotoma L[END_REF][START_REF] Blažević | Short Chain (≤C4) Esterification Increases Bioavailability of Rosmarinic Acid and Its Potency to Inhibit Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[END_REF].

O ácido rosmarínico, por exemplo, é um composto polifenólico, isolado de várias plantas da família Cordiaceae, que possui atividade antiespasmódica [START_REF] Ticli | Rosmarinic acid, a new snake venom phospholipase A2 inhibitor from Cordia verbenacea (Boraginaceae): antiserum action potentiation and molecular interaction[END_REF][START_REF] Li | Distribution of seven polyphenols in several medicinal plants of Boraginaceae in China[END_REF][START_REF] Blažević | Short Chain (≤C4) Esterification Increases Bioavailability of Rosmarinic Acid and Its Potency to Inhibit Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation[END_REF][START_REF] Guan | A Comprehensive Review of Rosmarinic Acid: From Phytochemistry to Pharmacology and Its New Insight[END_REF]. Além disso, o ácido rosmarínico é considerado um marcador quimiotaxonômico da familia Boraginacea, inclusive de muitas espécies que migraram para a família Cordiaceae [START_REF] Ganos | Rindera graeca (Boraginaceae) Phytochemical Profile and Biological Activities[END_REF][START_REF] Graikou | Chemical Profile and Screening of Bioactive Metabolites of Rindera graeca (A. DC.) Bois. & Heldr. (Boraginaceae) In Vitro Cultures[END_REF][START_REF] Guan | A Comprehensive Review of Rosmarinic Acid: From Phytochemistry to Pharmacology and Its New Insight[END_REF].

Assim sendo, é interessante a hipótese de que a utilização das espécies do gênero

Varronia pela população para aliviar cólicas menstruais, dores gastrointestinais ou outras alterações da contratilidade do músculo liso, seria devido à essas classes de metabólitos secundários. 

O melanoma humano

A quimioinformática

Definida como uma ciência interdisciplinar, a quimioinformática, termo cunhado por Frank Brown em 1998, é a "mistura de recursos de informação para transformar dados em informação e informação em conhecimento, no intuito de tomar decisões melhores e mais rápidas na área de identificação e otimização de compostos líderes"

(ALVES, MURATOV & ANDRADE, 2017).

Estudos envolvendo a quimioinformática conseguem realizar um processamento de volumosos conjuntos de dados experimentais combinados às estruturas moleculares, utilizando métodos estatísticos para a previsão principalmente de atividades biológicas (LIMA, 2015).

As Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J) em Hz.

As multiplicidades no espectro de RMN de 1 H foram indicadas segundo as convenções: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dl (dupleto largo), dd (duplo dupleto), t (tripleto) e m (multipleto).

Os espectros de RMN de 13 C foram obtidos utilizando-se a técnica de APT e BB.

Espectrometria de Massas (EM)

Foi utilizado um espectrômetro de massas de alta resolução da marca Bruker, modelo micrOTOF II utilizando a técnica de Ionização por Eletrospray. Os parâmetros de análise do micrOTOF II foram: capilar 4,0 kV, IES no modo negativo, offset da placa final 500 V, nebulizador 35 psi, gás seco (N2) com fluxo de 8 L/h e temperatura de 300 ºC. Os espectros (m/z 50-1000) foram registados a cada 2 s.

Estudo fitoquímico

Coleta e identificação do material botânico

A utilização da espécie em questão, foi cadastrada na base de dados do Sistema 

Processamento do material vegetal de Varronia leucocephala.

Todo material vegetal foi desidratado em estufa com ar circulante á temperatura de 40 ºC durante 72 horas. Após secagem, foi submetido a um processo de pulverização em moinho mecânico, obtendo-se de material seco 1.230 g das partes aéreas de V. leucocephala.

Obtenção do Extrato Etanólico Bruto (EEB) de Varronia leucocephala.

O material vegetal seco e pulverizado foi submetido à maceração com etanol em um recipiente de aço inoxidável durante 72 horas. Este processo foi repetido por três vezes.

A solução extrativa resultante da maceração foi concentrada em rotaevaporador sob pressão reduzida, a uma temperatura média de 40 °C, sendo obtido 198,3 g de extrato, exibindo rendimento de 16,12%.

Isolamento e purificação dos constituintes químicos de Varronia dardani.

Fracionamento cromatográfico da fase acetato de etila de Varronia dardani.

A fase acetato de etila (3,0 g) foi submetida à cromatografia em coluna utilizando como fase estacionária Sephadex LH-20, e metanol (MeOH) como fase móvel. Foram coletadas 29 frações (VD-FA-1-29). Após secagem à temperatura ambiente, as frações foram reunidas por análise de seus fatores de retenção em cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) utilizando diferentes sistemas de eluição, em ordem crescente de polaridade. Como revelador físico foi utilizado a luz ultravioleta em dois comprimentos de onda (254 e 366 nm). Desta reunião foram obtidas 26 frações, sendo as de maior massa submetidas á Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em escala analítica para desenvolvimento de método.

A fração VD-FA-11-12 (59,7 mg) foi escolhida para separação em CLAE semipreparativo, por apresentar um melhor perfil cromatográfico frente as demais.

Inicialmente, foi preparada uma solução com 1 mg da amostra em metanol grau HPLC, na concentração de 1 mg. mL -1 . Empregou-se como fase móvel água milli-Q acidificada (0,1% de ácido fórmico) e metanol. A análise no cromatógrafo analítico permitiu desenvolver um método eficiente para o isolamento das substâncias presentes na fração. No método mais eficaz, a concentração de metanol variou de 35 á 100% em 130 minutos com fluxo de 0,6 mL.min -1 (Tabela 1).

Na transposição para a escala semi-preparativa, preparou-se uma solução com 58 mg da amostra em 600 µL de metanol grau HPLC. Foram realizadas 6 injeções de 100 µL desta solução. Utilizou-se o mesmo método desenvolvido na fase analítica, no entanto foi empregado um fluxo de 3,5 mL.min -1 . As frações obtidas foram então concentradas sob pressão reduzida á uma temperatura de 40 ºC em rotaevaporador.

Tabela 1 -Método utilizado na cromatografia líquida de alta eficiência da fração VD-FA-11-12 da fase acetato de etila de Varronia dardani. 

Determinação de fenólicos totais.

Para a determinação do teor de fenólicos totais no EEB-VD, utilizou-se o método de Folin-Ciocalteu, com adaptações [START_REF] Cabral | Composição fenólica, atividade antibacteriana e antioxidante da própolis vermelha brasileira[END_REF]. Para a sua realização foi usado o ácido gálico para construir uma curva de calibração e assim determinar a quantidade de fenóis. O método de Folin consiste em adicionar 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteu (10%) a 120 µL da amostra na concentração de 1 mg.mL -1 , após isso, manter a reação em repouso por 8 minutos, sendo adicionado em seguida 400 µL de carbonato de sódio (7,5%) para neutralizar a mistura, em seguida manter as amostras a temperatura ambiente e no escuro por 120 minutos, e transferi-las para placa de 96 poços (200 microlitros/poço) e a absorbância foi medida a 765 nm em espectrofotômetro UV-visível (PowerWave HT, BioTek). As análises foram realizadas em triplicatas (repetidas por três dias).

No teor de fenólicos totais as amostras analisadas devem ser contempladas pelo intervalo de concentração usado para obter a curva de calibração, que foi de 10; 20; 200; 250 e 300 µg.mL -1 , e a partir dela, interpolar as absorbâncias das amostras para obter a quantidade de fenólicos totais sendo expressos em miligramas de equivalente de ácido gálico por grama de amostra (mg EAG / g de amostra), sendo as análises realizadas em triplicatas (repetidas por três dias).

Quantificação do ácido rosmarínico no extrato etanólico bruto de Varronia dardani (EEB-VD)

A quantificação do ácido rosmarínico no EEB-VD foi realizada utilizando o padrão químico: ácido rosmarínico, obtido da Sigma Aldrich, com teor de pureza > 98% (Brasil). A ocitocina foi obtida da União Química (Brasil).

Estas substâncias, exceto o Cremophor ® , foram mantidas em um "freezer" à temperatura de -20 °C. Todas eram solubilizadas e diluídas em água destilada, exceto o AA e o dietilestilbestrol, que foram dissolvidos em álcool etílico absoluto para obtenção da solução-estoque.

A mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2) foi obtida da White Martins (Brasil).

Soluções nutritivas

De acordo com os experimentos realizados eram utilizadas várias soluções nutritivas (ajustadas ao pH 7,4, com uma solução de HCl ou NaOH, 1 N), todas gaseificadas com carbogênio (95% de O2 e 5% de CO2) e mantidas a 37 o C para traqueia de rato, aorta de rato e íleo de cobaia, e a 32 °C para útero de rata, cujas composições estão descritas abaixo:

Composição da solução de Krebs (mM): NaCl (118,0), KCl (4,5), MgSO4

(5,7), KH2PO4 (1,1), CaCl2 (2,5), glicose (11,0) e NaHCO3 (25,0). Outras soluções poderão ser utilizadas a depender dos resultados obtidos.

Composição da solução de

Aparelhos

Para o registro das contrações isotônicas, os órgãos eram suspensos em cubas de banho para órgãos isolados (5 mL) e conectados a uma alavanca isotônica de inscrição frontal acoplados a cilindros esfumaçados de um quimógrafo (DTF, Brasil et al., 2003). Todos os resultados funcionais foram analisados pelo programa GraphPad Prism ® versão 5.01 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, E.U.A.).

Fracionamento por Cromatografia Flash dos extratos etanólicos das espécies de Varronia

Os extratos etanólicos obtidos das partes aéreas de Varronia leucocephala e das raízes e partes aéreas de V. dardani foram submetidos à uma cromatografia flash de fase reversa para obter quatro frações: Fração isopropanol (F-I); Fração isopropanol/metanol (F-IM); Fração metanol (F-M) e Fração aquosa (F-A).

Os extratos secos foram solubilizados em metanol e adicionados a 3 g de Celite ® 545 (Sigma Aldrich, França). Após a homogeneização manual e evaporação completa do solvente, a mistura foi colocada em uma pré-coluna, a qual foi conectada na parte superior de uma coluna PF-C18 (12 g, 15 µm). A purificação foi realizada utilizando um sistema Interchim Puriflash ® PF430, equipado com um coletor automático (10 mL por tubo) com uma fase móvel composta de um gradiente de solventes: A (isopropanol), B (metanol) e C (água). A eluição foi monitorada a 350 nm, utilizando uma vazão fixa (5 mL.min -1 ) e utilizando a programação descrita na Tabela 2. Uma alíquota de 560 mg da fração isopropanol das raízes de Varronia dardani (VD-R-I), considerada a mais ativa no teste de MTT, foi submetida a um fracionamento através da metodologia descrita anteriormente, utilizando a programação descrita na

Tabela 3 e fase móvel composta de um gradiente de solventes: A (ciclohexano) e B (acetato de etila).

Tabela 3 -Programação utilizada para o fracionamento por Cromatografia Flash da fração VD-R-I. As microplacas foram incubadas a 37°C durante 5 minuntos para solubilizar os cristais de formazan e, após esse período, a absorbância foi lida a 550 nm usando um leitor de microplacas FLUOstar Omega (BMG Labtech ® , França). Fotomicrografias após os tratamentos foram obtidas em um microscópio invertido Nikon Eclipse TS100

(ampliação x100) equipado com uma câmera digital.

A porcentagem de inibição do crescimento (IC) foi calculada como IC (%) = 100 -((A550 nm amostra -A550 nm branco) / (A550 nm controle -A550 nm branco)) x 100, onde A550 nm amostra: média da absorbância de 8 poços contendo células e a amostra; A550 nm branco: média da absorbância de 8 poços contendo meio de cultura de células de controle com 1% de DMSO e sem células; A550 nm controle: média da absorbância de 8 poços contendo células cultivadas em meio de cultura de células de controle com 1% de DMSO. Os dados são expressos como IC (%) ± DP (%) de ensaios em triplicata.

Quimioinformática

Os estudos de quimioinformática foram realizados em parceria com o Prof. Dr.

Marcus Tullius Scotti, coordenador do Laboratório de Quimioinformática do PPgPNSB/CCS/UFPB.

Modelo de Predição

Para a construção do modelo de classificação, faz-se necessária a presença de uma série de predição. As moléculas em estudo, tratam-se dos 08 isômeros do composto VD-R-1, a vardanona. A Tabela 4 mostra as estruturas dos compostos em estudo.

Tabela 4 -Estruturas 2D dos isômeros de VD-R-1. 

DA = d + Zσ

Em que d e σ equivalem as distâncias euclidianas e o desvio padrão médio, respectivamente, dos compostos no conjunto de treinamento, e Z representa um valor de corte empírico.

Neste trabalho, o valor de Z utilizado foi 0,5 (ROY, [START_REF] Roy | On a Simple Approach for Determining Applicability Domain of QSAR Models[END_REF].

A avaliação da performance do modelo, sendo as performances dos testes internos e externos do modelo elaborado foram avaliadas quanto a quatro parâmetros, correspondendo a respectivamente: 1) Sensibilidade que equivale a taxa de verdadeiros positivos, ou seja, a taxa de compostos realmente ativos; 2) Especificidade a qual corresponde a taxa de verdadeiros negativos, ou seja, os compostos realmente inativos;

3) Precisão que denota a taxa de previsibilidade geral do modelo. FN: Falso Negativo (variável positiva, classificada como negativa). 

Simulações de

Fracionamento cromatográfico da fração isopropanólica do extrato etanólico da espécie de V. leucocephala

A V. leucocephala foi a segunda espécie mais ativa nos testes citotóxicos, e dentre suas frações, a fração isopropanólica (VL-I) se mostrou mais ativa, sendo assim, foi escolhida para ser submetida a um fracionamento por cromatografia de alta eficiência (CLAE).

A análise no cromatógrafo analítico permitiu desenvolver um método eficiente para o isolamento das substâncias presentes na fração VL-I. Inicialmente, foi preparada uma solução com 1 mg da amostra em acetonitrila (ACN) grau HPLC, na concentração de 1 mg. mL -1 . Empregou-se como fase móvel água ultrapura acidificada (0,1% de ácido fórmico) e ACN. No método mais eficaz, a concentração de ACN variou de 5 a 100% em 60 minutos com fluxo de 0,6 mL.min -1 (Tabela 6).

Na transposição para a escala semi-preparativa, preparou-se uma solução com 350 mg da amostra em 4 mL de ACN grau HPLC. Foram realizadas 20 injeções de 200 µL desta solução. Utilizou-se o mesmo método desenvolvido na fase analítica, no entanto foi empregado um fluxo de 3,5 mL.min -1 . As frações obtidas foram então concentradas sob pressão reduzida à uma temperatura de 40 ºC em rotaevaporador.

Tabela 6 -Método utilizado na CLAE da fração VL-I da fração isopropanólica de V. leucocephala. Figura 8 -Cromatograma da fração VD-FA-11-12 da fase acetato de etila de V. dardani.

Identificação dos compostos isolados da fase acetato de etila do Extrato

Etanólico Bruto de V. dardani

Identificação estrutural de VD-1

Após a análise dos dados espectrais de RMN de 1 H e 13 C e comparação com os dados da literatura, foi possível identificar a substância VD-1 como sendo 5,7-dihidroxi-4'-metoxiflavanona, ou isosakuranetina, isolada pelo presente autor em sua dissertação de mestrado (VELOSO, 2018).

Isosakuranetina (VD-1)

Identificação estrutural de VD-2

A substância VD-2 foi isolada na forma de pó amorfo amarelo-claro com 16 mg.

O 

Identificação estrutural de VD-3

O composto codificado como VD-3, foi obtido como cristais amarelo-claros com massa de 17 mg.

Através dos dados espectrais de RMN de 

Identificação estrutural de VD-4

A substância VD-4 foi isolada na forma de um pó amarelo amorfo com 14 mg.

No espectro de RMN de 1 H ( 400 Os dados obtidos através do espectro de RMN de 13 C corroboraram com a sugestão da presença de uma unidade osídica, pois foram observados deslocamentos entre δC 62,53 e δC 78,39, característicos de uma glicose, onde o sinal em δC 104,27 confirmou a presença de um carbono oximetínico dessa unidade osídica [START_REF] Atay | Secondary metabolites from Sambucus ebulus[END_REF].

No espectro de HMBC (Figuras 24-26, p. 88), foi possível observar a correlação entre os sinais do próton anomérico δH 5,22 (H-1") com o carbono δC 135,59 (C-3), confirmando a inserção da unidade osídica no carbono C-3 do anel C do esqueleto favonoídico.

Após a análise dos dados espectrais de RMN de 1 H e 13 C e comparação com os dados da literatura (Tabela 9), foi possível identificar a substância VD-4 como sendo a quercetina-3-O-β-D-glicopiranosideo, conhecida como isoquercitrina, isolada pela primeira vez na espécie. 

Identificação estrutural de VD-5

O composto VD-5 foi isolado como cristais amarelos com massa de 2 mg. ,55; 116,27; 121,78; 115,19; 116,29; 123,12, 

Teor de compostos fenólicos do Extrato Etanólico Bruto de Varronia dardani (EEB-VD)

Utilizando o método do Folin-Ciocalteau, foi possível construir a equação de regressão linear e o R 2 do padrão, ácido gálico (10; 50; 200; 350; 500 e 650 µg.mL -1 ), encontram-se no Gráfico 1 abaixo. Esta foi feita para posterior interpolação dos dados e para calcularmos o teor de fenóis em mg EAG/g de amostra na concentração de 450 µg.mL -1 (Tabela 12 e Gráfico 1, p. 101).

Gráfico 1 -Curva padrão da quantificação de fenólicos totais empregando ácido gálico como substância de referência. Absorbância = 765 nm.

Tabela 12 -Teor de fenólicos totais em mg EAG/g de amostra por dia (n = 3) na concentração de 450 µg.mL -1 . Os compostos fenólicos estão relacionados, em diversos estudos, com a elevada atividade citotóxica frente à diversas linhagens de células neoplásicas, efeito atribuído principalmente à sua forte atividade antioxidante e à ativação da morte de células apoptóticas [START_REF] Kozyra | Cytotoxic activity of methanolic fractions of different Marrubium spp. Against melanoma cells is independent of antioxidant activity and total phenolic content[END_REF][START_REF] Žitek | The Effect of Polyphenolics in Extracts from Natural Materials on Metabolic Activity of Metastatic Melanoma WM-266-4 Cells[END_REF]KYRIAKOU et al., 2021).

Pesquisas evidenciam também a correlação entre o elevado teor de compostos fenólicos com o efeito antidiarreico, espasmolítico, broncodilatador, vasodilatador, fornecendo a base farmacológica para a etnofarmacologia de diversas espécies (KHAN, [START_REF] Khan | Total phenolic and flavonoid contents and antihypertensive effect of the crude extract and fractions of Calamintha vulgaris[END_REF][START_REF] Imtiaz | The Potential Involvement of an ATP-Dependent Potassium Channel-Opening Mechanism in the Smooth Muscle Relaxant Properties of Tamarix dioica Roxb[END_REF].

Quantificação do ácido rosmarínico no extrato etanólico bruto de Varronia dardani (EEB-VD)

A partir da análise cromatográfica em CLAE, foi possível observar o perfil cromatográfico do EEB-VD (Figura 41), e identificar a presença do ácido rosmarínico a partir do seu padrão. Escolheu-se o ácido rosmarínico, pois este é considerado um dos marcadores quimiotaxonômico da familia Cordiaceae [START_REF] Ganos | Rindera graeca (Boraginaceae) Phytochemical Profile and Biological Activities[END_REF][START_REF] Graikou | Chemical Profile and Screening of Bioactive Metabolites of Rindera graeca (A. DC.) Bois. & Heldr. (Boraginaceae) In Vitro Cultures[END_REF][START_REF] Guan | A Comprehensive Review of Rosmarinic Acid: From Phytochemistry to Pharmacology and Its New Insight[END_REF]. A curva de calibração do padrão ácido rosmarínico forneceu uma equação da reta: y = 24526x + 95806, e um R² = 0,9988 (Gráfico 2, p. 105). A partir dos destes dados foi possível quantificar o AR existente no extrato testado.

Gráfico 2 -Curva de calibração do padrão ácido rosmarínico.

Após a análise dos dados obtidos é possível então observar que para cada 2 mg de EEB de Varronia dardani a quantidade de ácido rosmarínico é 43,0815 ± 2,4174 µg.

Assim sendo, até aqui foi confirmado que a espécie V. dardani é rica em compostos polifenólicos, e que isso poderia justificar a sua utilização pela população como adjuvante principalmente no alívio de cólicas menstruais e distúrbios gastrointestinais. Para isso, foi realizada uma triagem para avaliar a sua atividade espasmolítica em diversos órgãos, cujo resultado será descrito no item a seguir.

Avaliação da atividade espasmolítica

Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por FEN em aorta isolada de rato

O EEB-VD (27; 81; 243 e 729 µg/mL, n = 5) relaxou de maneira equipotente a aorta de rato pré-contraída com 3 x 10 -7 M de FEN tanto na presença (Emax = 75,4 ± 3,5%, CE50 = 238,0 ± 4,7 µg/mL) quanto na ausência (Emax = 94,4 ± 7,8%, CE50 = 236,8 ± 14,8 µg/mL) de endotélio funcional (Figura 43, p. 106 e Gráfico 3, p. 107). A responsividade da aorta à fenilefrina na presença e na ausência de endotélio funcional foi restaurada em 61,2 ± 9,7 e 52,7 ± 7,1%, respectivamente, em 2 horas após a retirada do EEB-VD da cuba.

O tempo médio para que o EEB-VD alcançasse o seu efeito relaxante máximo total era cerca de 2 horas, tanto na presença quanto na ausência de epitélio funcional.

Figura 43 -Registros originais representativos do efeito vasorrelaxante do EEB-VD em aorta isolada de rato pré-contraída com 3 x 10 -7 M de FEN na presença (A) e na ausência (B) de endotélio funcional.

As setas para baixo representam a adição cumulativa do EEB-VD nas concentrações de 27-729 µg/mL. FEN = fenilefrina, ACh = acetilcolina, L = lavagem.

Fonte: Autor, 2022.

Gráfico 3 -Efeito vasorrelaxante do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por 3 x 10 -7 M de FEN na presença (¿) e na ausência (¯) de endotélio funcional em aorta isolada de rato.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5).

Fonte: Autor, 2022.

Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por CCh em traqueia isolada de rato

O EEB-VD (27; 81; 243 e 729 µg/mL, n = 5) relaxou de maneira equipotente e dependente de concentração a traqueia de rato pré-contraída com 10 -5 M de CCh tanto na presença (Emax = 65,3 ± 7,3%, CE50 = 330,3 ± 37,7 µg/mL e R 2 = 0,9925 ± 0,0059) quanto na ausência (Emax = 87,3 ± 6,4%, CE50 = 280,5 ± 12,7 µg/mL e R 2 = 0,9896 ± 0,0049) de epitélio funcional (Figura 44, p. 108 e Gráfico 4, p. 109).

A responsividade da traqueia ao CCh na presença epitélio funcional, foi restaurada em 60,5 ± 5,5%, em 2 horas após a retirada do EEB-VD da cuba.

O tempo médio para que o EEB-VD alcançasse o seu efeito relaxante máximo total era cerca de 3 horas, tanto na presença quanto na ausência de epitélio funcional. Gráfico 4 -Efeito relaxante do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por 10 -5 M de CCh na presença (■) e na ausência (□) de epitélio funcional em traqueia isolada de rato.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5).

Fonte: Autor, 2019.

5.2.9.3. Efeito espasmolítico do EEB-VD em íleo isolado de cobaia 5.2.9.3.1.

Efeito do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por histamina ou por CCh

O EEB-VD (27; 81; 243 e 729 µg/mL, n = 5) antagonizou de maneira dependente de concentração as contrações fásicas induzidas tanto por 10 -6 M de histamina (Emax = 100%, CI50 = 222,6 ± 26,9 µg/mL e R 2 = 0,9660 ± 0,0083) como de CCh (Emax = 100%, CI50 = 123,1 ± 15,4 µg/mL e R 2 = 0,9739 ± 0,0033), sendo cerca de 2 vezes mais potente em inibir as contrações fásicas induzidas pelo CCh (Gráfico 5, p.

111).

A responsividade do íleo à histamina e ao CCh foi restaurada em 33,8 ± 3,8 e 35,0 ± 5,0 minutos após a retirada do EEB-VD da cuba. As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5). *p < 0,05 (Controle vs EEB-VD).

Fonte: Autor, 2022.

Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por KCl, por histamina ou por CCh

O EEB-VD (0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 9; 27; 81; 243 e 729 µg/mL, n = 5) também relaxou de maneira equipotente e dependente de concentração o íleo de cobaia pré-contraído com 40 mM de KCl (Emax = 108,0 ± 2,0%, CE50 = 30,3 ± 2,2 µg/mL e R 2 = 0,9943 ± 0,0024), com 10 -6 M de histamina (Emax = 113,7 ± 4,1%, CE50 = 32,7 ± 5,8 µg/mL e R 2 = 0,9850 ± 0,0017) ou com 10 -6 M de CCh (Emax = 119,1 ± 7,1%, CE50 = 49,0 ± 5,5 µg/mL e R 2 = 0,9785 ± 0,0171) (Figura 45, p. 112 e Gráfico 6, p.

113).

A responsividade do íleo ao KCl, histamina e CCh foi restaurada em 49,0 ± 9,2, 51,3 ± 8,3 e 35,0 ± 5,0%, respectivamente, em 2 horas após a retirada do VD-EtOHF da cuba.

O tempo médio para que o EEB-VD alcançasse o seu efeito relaxante máximo total era cerca de 2 horas para o KCl e histamina e de 1 hora para o CCh.

Figura 45 -Registros originais representativos do efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por KCl (A), por histamina (B) e por CCh (C) em íleo isolado de cobaia.

As setas para baixo representam a adição cumulativa do EEB-VD nas concentrações de 1-243 µg/mL (A), 0,1-729 µg/mL (B e C). KCl = cloreto de potássio, Hist = histamina, CCh = carbacol, L = lavagem.

Fonte: Autor, 2022.

Gráfico 6 -Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por 40 mM de KCl (○), por 10-6 M de histamina (▼) e por 10-6 M de CCh (▲) em íleo isolado de cobaia.

Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5).

Fonte: Autor, 2022.

5.2.9.4. Efeito espasmolítico do EEB-VD em útero isolado de rata 5.2.9.4.1.

Efeito do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por ocitocina ou por CCh

O EEB-VD (9; 27; 81; 243 e 729 µg/mL, n = 5) antagonizou de maneira equipotente e dependente de concentração as contrações fásicas induzidas tanto por 10 -2 UI/mL de ocitocina (Emax = 98,8 ± 1,2%, CI50 = 82,2 ± 14,4 µg/mL e R 2 = 0,9921 ± 0,0023), como por 10 -5 M de CCh (Emax = 100%, CI50 = 80,8 ± 16,3 µg/mL e R 2 = 0,9358 ± 0,0197) (Gráfico 7, p. 115).

A responsividade do útero à ocitocina e ao CCh foi restaurada em 97,5 ± 14,4 e 40,0 ± 5,0 minutos, respectivamente, após a retirada do EEB-VD da cuba.

O tempo médio para que o EEB-VD alcançasse o seu efeito relaxante máximo total era cerca de 4 horas. As colunas e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5). *p < 0,05 (Controle vs EEB-VD).

Fonte: Autor, 2022.

Efeito tocolítico do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por ocitocina ou KCl em rata

O EEB-VD (0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 9; 27; 81; 243 e 729 µg/mL) relaxou de maneira equipotente e dependente de concentração o útero de rata pré-contraído com 10 -2 UI/mL de ocitocina (Emax = 106,4 ± 3,2%, CE50 = 33,3 ± 0,6 µg/mL e R 2 = 0,9122 ± 0,0366) e com 60 mM de KCl (Emax = 101,3 ± 1,9%, CE50 = 27,7 ± 3,1 µg/mL e R 2 = 0,9914 ± 0,0034) (Figura 46, p. 116 e Gráfico 8, p. 117).

A responsividade do útero à ocitocina e ao KCl foi restaurada em 96,0 ± 1,0 e 36,4 ± 6,9%, respectivamente, em 2 horas após a retirada do EEB-VD da cuba. Os símbolos e as barras verticais representam a média e o e.p.m., respectivamente (n = 5).

Fonte: Autor, 2022. 

Quimioinformática

Devida à baixa quantidade isolada da substância VD-R-1, optou-se por realizar um estudo de quimioinformática, utilizando a mesma linhagem celular (A2058) do ensaio citotóxico como banco de dados. Como a substância possui três estereocentros, seguindo a regra do 2 n , resolveu-se utilizar os oito possíveis isômeros. 

5

A) B) C)

Os resultados de RMSD podem ser confirmados pela sobreposição do ligante com a estrutura co-cristalizada, como demonstrado na figura. É possível visualizar a posição espacial dos respectivos ligantes docados em relação ao ligante co-cristalizado e notar uma semelhança na posição dos átomos das duas estruturas.

Consensus Docking

As 08 conformações obtidas de V. dardani (Taroda) Uma segunda análise de consenso foi realizada para identificar compostos com potencial multitarget, que demonstram as probabilidades de serem potenciais ativos para mais de uma proteína, com base no modelo de RF e docking. Nesse caso, foram utilizados todos os resultados da previsão da atividade biológica das conformações em estudo de V. dardani (Taroda) e estes foram combinados com os resultados da docagem.

Essa análise combinada, além de selecionar os compostos ativos, é capaz de selecionar os compostos mais potentes combinando duas importantes metodologias, baseadas no ligante e na estrutura [START_REF] Acevedo | Estudos Quimiotaxonômicos e Triagem Virtual de Sesquiterpenos Lactonizados Isolados Da Família Asteraceae Com Potencial Atividade Leishmanicida e Tripanocida. Dissertação[END_REF][START_REF] Acevedo | In Silico Studies Designed to Select Sesquiterpene Lactones with Potential Antichagasic Activity from an In-House Asteraceae Database[END_REF][START_REF] Barros | Virtual Screening of Secondary Metabolites of the Genus Solanum with Potential Antimicrobial Activity[END_REF]. Para esta análise, foi utilizada a seguinte fórmula: 

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

MTTFigura 8 -FiguraFiguraFigura 21 -FiguraFiguraFigura 34 -FiguraFiguraFigura 46 -FiguraFigura 56 -FiguraFiguraFigura 61 -FiguraFigura 68 -

 8213446566168 Figura 1 -Biomas do Brasil ...................................................................................... Figura 2 -Inflorescência e folhas de V. dardani....................................................... Figura 3 -Inflorescência e folhas de V. leucocephala. ............................................. Figura 4 -Estrutura básica das flavanonas. ............................................................ Figura 5 -Esqueleto básico 9,10-antracenodiona. ................................................... Figura 6 -Estrutura da quinizarina. ....................................................................... Figura 7 -Estruturas químicas do vemurafenibe e dacarbazina. ........................... Figura 8 -Cromatograma da fração VD-FA-11-12 da fase acetato de etila de V. dardani. .............................................................................................................. Figura 9 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) da substância VD-2. ....... Figura 10 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) de VD-2 na região de 2,60 -3,20 ppm. .................................................................................. Figura 11 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) de VD-2 na região de 5,2 -7,4 ppm. ...................................................................................... Figura 12 -Espectro de RMN de 13 C (100 MHz, CD3OD) de VD-2........................ Figura 13 -Espectro de RMN de 1 H (500 MHz, CD3OD) da substância VD-3. ..... Figura 14 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (500 MHz, CD3OD) de VD-3 na região de 6,0 -8,30 ppm. ................................................................................... Figura 15 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (500 MHz, CD3OD) de VD-3 na região de 3,0 -5,3 ppm. ..................................................................................... Figura 16 -Espectro de RMN de 13 C (125 MHz, CD3OD) de VD-3........................ Figura 17 -Expansão do espectro de HMBC (500 e 125 MHz, CD3OD) do composto VD-3 na região de 5,55 -4,90 e 134,1 -136,4 ppm. ......................... Figura 18 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) da substância VD-4. ..... Figura 19 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) de VD-4 na região de 5,0 -8,60 ppm. ................................................................................... Figura 20 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) de VD-4 na região de 3,0 -3,85 ppm. ................................................................................... Figura 21 -Espectro de RMN de 13 C (100 MHz, CD3OD) da substância VD-4. .... Figura 22 -Expansão do espectro de RMN de 13 C (100 MHz, CD3OD) de VD-4 na região de 90 -185 ppm. .....................................................................................

  Quadro 1 -(Continuação).

  Quadro 3 -(Continuação).

Folhas 3 -

 3 O-β-D-glicopiranosil-(1→2)-β-D

  Quadro 4 -Exemplos de naftoquinonas com atividade antiproliferativa frente à células de melanoma humano.Linhagens testadas Substâncias Referências

  Relações quantitativas de estrutura e atividade (QSARs -Quantitative Structure-Activity Relationship) são indiscutivelmente de imensa importância na química e bioquímica atuais (TANDON, CHAKRABORTY & SUHAG, 2019). O QSAR é uma abordagem desenvolvida para correlacionar as moléculas químicas com suas atividades biológicas com base em suas estruturas químicas. Devido ao papel significativo das estratégias de aprendizagem de máquinas na modelagem QSAR, esta área de pesquisa tem atraído atenção de pesquisadores no mundo todo (KEYVANPOUR & SHIRZAD, 2021).Para se realizar uma avaliação farmacológica completa de uma substância isolada, geralmente quantidades elevadas são necessárias. Isso se torna um desafio desde a coleta de plantas endêmicas e com difícil acesso até o baixo rendimento final desse composto que poderá ser isolado[START_REF] Atanasov | Discovery and resupply of pharmacologically active plant-derived natural products: A review[END_REF]. Sendo assim, as pesquisas in silico surgiram como uma boa alternativa na química medicinal para projetar um determinado experimento e encontrar novos medicamentos, por exemplo, gerando com isso resultados bem-sucedidos com baixo custo em um curto espaço de tempo[START_REF] Acevedo | Computer-Aided Drug Design Using Sesquiterpene Lactones as Sources of New Structures with Potential Activity against Infectious Neglected Diseases[END_REF].Um método in sillico utlizado para projetar e analisar compostos baseado em sua estrutura é o Docking Molecular, que simula a interação molecular desses compostos prevendo o modo de ligação e afinidade entre os seus possíveis receptores[START_REF] Fan | Progress in molecular docking[END_REF]. A crescente atenção recebida por esse tipo de estudo, bem como a necessidade de melhorar sua confiabilidade, levou ao desenvolvimento de uma grande quantidade de novos algoritmos de docagem e atualmente, as abordagens de Consensus Docking demonstram melhorar a qualidade dos resultados do docking em comparação com os métodos de docking único (POLI & TUCCINARDI, 2020).

  Contribuir para o conhecimento da família Cordiaceae, bem como do gênero Varronia, através do estudo das espécies V. dardani e V. leucocephala.3.2Objetivos específicos § Extrair, isolar, purificar, identificar e elucidar metabólitos secundários encontrados no extrato etanólico bruto das partes aéreas de V. dardani (EEB-VD); § Determinar o teor de compostos fenólicos no EEB-VD; § Quantificar o ácido rosmarínico no EEB-VD; § Devido ao uso popular da espécie, investigar uma possível atividade espasmoílitica do EEB-VD em útero de rata, aorta e traqueia de rato, íleo de cobaia; § Realizar um isolamento bioguiado compostos bioativos das espécies estudadas, frente às células de melanoma humano (linhagem A2058). § Desenvolver um estudo de quimioinformática para avaliar a atividade do composto isolado, utilizando um banco de dados construído com compostos ativos frente às células de melanoma humano (linhagem A2058).

  exclusão em coluna foi realizada utilizando o Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences), e como fase móvel o metanol p.a. da Sigma-Aldrich. Para as análises das amostras em Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) foram utilizadas cromatofolhas de alumínio-sílica gel 60 PF254 artigo 7749, Merck.As revelações das cromatoplacas foram realizadas por exposição á lâmpada de irradiação ultravioleta (UV) sob os comprimentos de onda 254 e 366 nm, por meio de aparelho Mineralight modelo UVGL-58 e também, por exposição á uma câmara saturada com vapores de iodo. As frações foram reunidas de acordo com seus perfis cromatográficos observados por esta técnica.A etapa de desenvolvimento de método em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi realizada em um cromatógrafo analítico da marca Shimadzu equipado com coluna de fase reversa C-18 da marca Kromasil, bomba LC-20AT, injetor automático SIL-20A HT, e detector UV-VIS-SPD-M20A com arranjo de diodo, como fase móvel foi utilizado água mili-Q acidificada (0,1% de ácido fórmico) e metanol grau HPLC da Merck. E em um cromatógrafo semi-preparativo da marca Shimadzu equipado com coluna de fase reversa C-18 da marca ACE ® , módulo de bombeamento de solvente binário LC-6AD, injetor manual e detector UV-VIS-SPD-M10A. Como fase móvel foi utilizada água mili-Q acidificada (0,1% de ácido fórmico) e metanol grau HPLC da Merck. Este também foi empregado no preparo da amostra. A fase móvel consistiu de uma mistura de metanol (MeOH) e água acidificada com 0,1% de ácido fórmico, na proporção inicial de (35:65) MeOH/H2O acidificada. A eluição foi realizada em método por gradiente e, foram selecionados dois comprimentos de onda para detecção (254 nm e 280 nm). O software LC Solution ® (Shimadzu, Japão) foi utilizado para o controle do equipamento, aquisição e análise dos dados. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1 H e 13 C e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetros das marcas Bruker Ascend, operando a 400 MHz e Varian System, operando a 500 MHz do Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise do Instituto de Pesquisa em Fármacos e Medicamentos da UFPB (LMCA-IPeFarM-UFPB). As amostras para análise foram preparadas dissolvendo-se as mesmas em solventes deuterados: clorofórmio (CDCl3) e metanol (CD3OD), os quais foram utilizados como referência interna.

  Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen-Brasil) sob o protocolo A0E7358. O extrato etanólico bruto e as fases de Varronia dardani (raízes e partes aéreas) foram reaproveitados do estudo da dissertação de mestrado do presente autor (VELOSO, 2018). O material vegetal de Varronia leucocephala foi coletado no município de Maturéia, Paraíba, em julho de 2019. As exsicatas das espécies encontram-se catalogadas no Herbário Prof. Lauro Pires Xavier (JPB) do Centro de Ciências Exatas e da Natureza-UFPB, sob registro JPB 29509 (V. dardani) e JPB 41136 (V. leucocephala) sendo identificadas pelo botânico Prof. Dr. José Iranildo Miranda de Melo.

  Krebs modificado por Sun e Benishin (1994) (mM): NaCl (117,0), KCl (4,7), MgSO4 (1,3), NaH2PO4 (1,2), CaCl2 (2,5), glicose (11,0) e NaHCO3 (25,0). Composição da solução de Locke Ringer por Revuelta, Catabrana e Hidalgo (1997) (mM): NaCl (154,0), KCl (5,6), MgCl2 (2,1), CaCl2 (2,2), glicose (5,6), NaHCO3 (6,0).

Foram

  coletados setenta e nove tubos, cada um contendo 10 mL. As frações foram submetidas à secagem utilizando evaporador rotativo à 45 ºC e logo em seguida foram reunidas em 11 subfrações (VD-R-I-Fr.01 -VD-R-I-Fr.11) de acordo com os perfis cromatográficos analisados por CCDA, utilizando-se placas de sílica gel com suporte de alumínio (Merck ® com indicador F-254, espessura de 200 µm e 20x20 cm de dimensão) adquiridas comercialmente. Após a eluição, as placas foram reveladas por exposição à luz UV nos comprimentos de onda 254 e 366 nm, no aparelho BOIT-LUB01 da marca Boitton.A fração VD-R-I-Fr.02 teve melhor perfil cromatográfico e foi escolhida para ser submetida à uma CCDP utilizando placas preparativas de sílica gel 60 com indicador F-254 (Merck ® ) e uma mistura binária de ciclohexano:acetato de etila (9:1).Após a eluição, as placas foram reveladas por exposição à luz UV nos comprimentos de onda 254 e 366 nm. Foram coletadas quatro manchas (VD-R-I-Fr.02-M1 -VD-R-I-Fr.02-M4), as quais foram analisadas por RMN de 1 H e 13 C.4.6 Atividade antiproliferativa de extratos e frações de Varronia em células de melanoma humanoA atividade antiproliferativa foi estudada utilizando a linhagem celular A2058 (ATCC ® CRL-11147). As células A2058 são células de melanoma aderentes ao epitélio humano e altamente invasivas, derivadas de células linfonodais metastáticas obtidas de um paciente do sexo masculino de 43 anos. São tumorigênicas com 100% de frequência em camundongos nude, contêm a mutação oncogênica BRAF V600E e, portanto, são consideradas resistentes à quimioterapia convencional Todos os experimentos de cultura de células foram realizados a 37°C. As células cresceram até se tornarem confluentes em flasks de 75 cm², em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de solução antibiótica (penicilina-estreptomicina) (Dominique Dutscher, França), em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Os extratos foram solubilizados em DMSO a 10 -3 M e diluídos no meio de cultura celular para se obter soluções com 200 µg.mL -1 . As células confluentes foram tripsinizadas e centrifugadas 1.500 g por 5 minutos. O sobrenadante contendo tripsina foi descartado e o sedimento celular foi ressuspenso em meio de cultura celular para se obter uma suspensão a 4.10 4 células.mL - 1 . No T0, 50 µL das soluções dos extratos foram depositadas em uma microplaca de fundo chato de 96 poços, para obter uma concentração final de 100 µg.mL -1 e 50 µL da suspensão celular foram adicionados. As 2000 células adicionadas foram então cultivadas por 72h no meio de cultura celular contendo os extratos. As concentrações finais de DMSO nos meios de cultura celular foram iguais ou inferiores a 1% e verificadas como não citotóxicas nas células A2058. Depois de 72h, 20µL de uma solução de MTT a 5 g.L -1 foram adicionados a cada poço da microplaca, permitindo que células viáveis, contendo succinato mitocondrial desidrogenase funcional, metabolizassem o MTT formando o sal de formazan (azul) durante 4h. O meio de cultura celular foi então removido utilizando uma micropipeta multicanal (Eppendorf ® , França) e os cristais de formazan foram dissolvidos em 200 µL de DMSO.

O

  desempenho do modelo foi avaliado pela curva Receiver Operating Chacteristic (ROC), este parâmetro avalia a sensibilidade e especificidade e para a avaliação do desempenho global foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Matthews (do inglês, Matthews Correlation Coefficient -MCC), visto que, este parâmetro correlaciona as classificações binárias observadas e preditas, resultando em um valor situado entre -1 e +1, em que +1 indica uma predição perfeita; -1 corresponde a um total desacordo entre o valor predito e o observado; já o 0 demonstra uma previsão aleatória (MATTHEWS, 1975). Este parâmetro é representando pela seguinte fórmula: Em que: TP: Verdadeiro positivo (Variável positiva, classificada como positiva); TN: Verdadeiro Negativo (Variável negativa, classificada como negativa); FP: Falso Positivo (Variável negativa, classificada como positiva);

  Figura 9 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) da substância VD-2.

Foram

  observados também, sinais característicos de uma unidade osídica, que em comparação com a literatura, foi identificada como uma unidade glicosídica (KIM et al., 2004; GHAVAM-HAGHI & DINANI, 2017). A ligação desta unidade ao carbono C-3 do flavonoide, foi confirmada através da correlação observada no mapa de contorno do HMBC (Figura 17, p. 81), entre o hidrogênio anomérico H-1" em δH 5,24 (1H, d, J = 7,5 Hz) e o carbono C-3 em δC 135,41 à três ligações (J3). De acordo com os dados obtidos e em comparação com a literatura, foi possível identificar o composto VD-3 como sendo o canferol-3-O-glicosídeo (Astragalina). Tabela 8 -Dados de RMN de 1 H, 13 C (500 e 125 MHz, CD3OD) de VD-3, canferol-3-O-glicosídeo (astragalina) em comparação aos dados de RMN de 1 H, 13 C (400 e 100 MHz, CD3OD) por GHAVAM-HAGHI & DINANI (2017).

  Figura 13 -Espectro de RMN de 1 H (500 MHz, CD3OD) da substância VD-3.

  MHz, CD3OD) p. 85), foi possível observar três deslocamentos em δH 7,70 (1H, d, J = 2 Hz), δH 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz) e em δH 7,57 (1H, dd, J = 2 e 8,4 Hz), atríbuidos aos hidrogênios aromáticos H-2', H-5' e H-6' respectivamente, presentes no anel B de um sistema ABX de um flavonoide[START_REF] Atay | Secondary metabolites from Sambucus ebulus[END_REF]. Ainda no mesmo espectro, dois deslocamentos essenciais foram observados, um em δH 6,20 (1H, d, J = 2 Hz) e outro em δH 6,39 (1H, d, J = 2 Hz), característicos de flavonoides que possuem anel A 5,7-dissubstituído, sendo estes sinais atribuídos aos hidrogênios H-8 e H-6, respectivamente. Observou-se também a ausência de um sinal característico do próton H-3, sugerindo assim uma substituição nessa região do anel C, e com isso confirmou-se uma estrutura semelhante a um flavonol, especificamente a quercetina. Além disso, foi possível sugerir a presença de uma unidade osídica, através de um conjunto de absorções em δH 3,21 -3,70, típicos de além de um dupleto em δH 5,22 (1H, J = 7,6 Hz) referente ao hidrogênio anomérico.No espectro de RMN de 13 C -BB (100 MHz, CD3OD) (Figuras 21-23, p. 86), foram observados 21 sinais, os quais foram atribuídos a 21 carbonos, destes, 15 foram característicos de um esqueleto favonoídico (C6-C3-C6) e 6 atribuídos à uma unidade glicosídica, contribuindo assim, com a sugestão advinda dos analisados no espectro de RMN de 1 H.As substituições do anel B (sistema ABX) deste favonoide, foram observadas também no espectro de RMN de 13 C, onde notaram-se os deslocamentos em δC 145,92 (C-3') e δC 149,87 (C-4'), característicos de carbonos aromáticos oxigenados. Os sinais em δC 117,54, δC 116,01 e δC 123,07 foram atribuídos aos carbonos aromáticos C-2', C-5' e C-6' respectivamente, corroborando com a sugestão da presença de um anel B em um sistema ABX[START_REF] Atay | Secondary metabolites from Sambucus ebulus[END_REF]. Observaram-se ainda as presenças de deslocamentos atribuídos a um carbono não hidrogenado em δC 159,01 e a um carbono não hidrogenado e oxigenado em δC 135,59, sendo estes sinais condizentes com os carbonos C-2 e C-3 de flavonoides do tipo flavonol (PELTER,[START_REF] Pelter | The Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectra of Flavonoids and related compounds[END_REF][START_REF] Agrawal | Carbon-13 NMR of Flavonoids[END_REF].Ainda no espectro de RMN de 13 C, o deslocamento em δC 179,49, foi atribuído à um carbono de uma carbonila quelada, ou seja, sugerindo a presença de um grupamento hidroxila no carbono C-5 do anel A em ligação de hidrogênio com a carbonila em C-4, pois segundo Tanaka e colaboradores (2014), ocorreria a proteção da carbonila caso não houvesse esta força intramolecular, e poderíamos observar esse deslocamento em cerca de 174 ppm. No mesmo espectro, o anel A (5,7-dissubstituído) foi sugerido através dos deslocamentos em δC 99,94 e δC 94,73, atribuídos aos carbonos metínicos sp 2 C-6 e C-8 respectivamente. As substituições nos carbonos C-5 e C-7 foram sugeridas pelos deslocamentos em δC 163,06 e δC 166,17, respectivamente.

Tabela 9 -

 9 Dados de RMN de 1 H, 13 C (400 e 100 MHz, CD3OD) de VD-4, quercetina-3-O-β-D-glicopiranosideo (isoquercitrina) em comparação aos dados obtidos por ATAY et al. (2015) (600 e 150 MHz, CD3OD).

  Figura 18 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) da substância VD-4.

Figura

  Figura 27 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) da substância VD-5.

  Figura 35 -Espectro de RMN de 1 H (500 MHz, CD3OD) da substância VD-6.

Figura 41 -

 41 Figura 41 -Cromatograma do EEB-VD e identificação por UV do pico referente ao ácido rosmarínico em 15'42''.

Figura 44 -

 44 Figura 44 -Registros originais representativos do efeito relaxante do EEB-VD em traqueia isolada de rato pré-contraída com 10 -5 M de CCh na presença (A) e na ausência (B) de epitélio funcional.

  do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por 10 -6 M de histamina (A) ou de CCh (B) em íleo isolado de cobaia.

  do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por 10 -2 UI/mL de ocitocina (A) ou por 10 -5 M de CCh (B) em útero isolado de rata.

Figura 46 -

 46 Figura 46 -Registros originais representativos do efeito tocolítico do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por 10 -2 UI/mL de ocitocina (A) e por 60 mM de KCl (B) em ratas.

  antiproliferativa de extratos e frações de Varronia em células de melanoma humano A estratégia geral foi a de selecionar extratos e frações das três espécies de Varronia com base na sua atividade antiproliferativa em células de melanoma A2058.As alterações morfológicas das células de melanoma tratadas com os diversos extratos e frações também foram avaliadas por observações microscópicas e comparadas com células de controle não tratadas.Os extratos etanólicos das partes aéreas de V. dardani (VD-EEB) e de suas raízes (VD-R-EEB) induziram respectivamente 84,52 ± 4,58% e 86,13 ± 5,37% de inibição de crescimento e foram consideradas altamente antiproliferativos em células de melanoma quimiorresistentes (Tabela 14, p. 118). Em contrapartida, o extrato etanólico bruto das partes aéreas de V. leucocephala (VL-EEB) induziu uma atividade antiproliferativa baixa a moderada, com 46,33 ± 4,94% de inibição de crescimento celular, embora uma atividade elevada induzida pela sua fração isopropanólica (VL-I) pudesse ser notada (87,09 ± 1,51% de inibição de crescimento).A observação das células tratadas confirmou a citotoxicidade de VD-EEB e VD-R-EEB e citotoxicidade moderada de VG-EEB e VL-EEB (Figura 47, p. 120).Considerando a elevada atividade antiproliferativa demonstrada pelo VD-R-EEB e sua fração mais apolar (VD-R-I), foi selecionada esta última amostra para isolamento de compostos de com possível atividade antimelanoma. Tabela 14 -Inibição de crescimento das células A2058 frente aos tratamentos dos extratos e frações das espécies de Varronia a 100 µg.ml -1 após 48h de tratamento. bruto das raízes de V. dardani (VD-R) e a fração isopropanólica do extrato etanólico bruto das raízes de V. dardani (VD-R-I) (1-100 µg.ml -1 ) reduziram o número de células A2058 viáveis de modo concentração dependente, quando comparado com o grupo controle, exibindo uma CI50 de 19,92 µg.ml -1 e 18,72 µg.ml -1 , respectivamente (Figura 47, p. 120). As células não tratadas exibiram morfologia epitelial regular e tornaram-se sub-confluentes após 72h, indicando uma alta taxa de proliferação. Em contrapartida, tratamentos com Vd-R e Vd-R-I (50 e 100 µg.ml -1 ) provocaram redução da densidade celular, retração e arredondamento celular (setas pretas) (Figura 47, p. 120).

Figura 47 -

 47 Figura 47 -Inibição do crescimento das células A2058 após a exposição às concentrações crescentes (1-100 µM, 72h) do extrato etanólico bruto das raízes de V. dardani (VD-R) e da fração isopropanólica do extrato etanólico bruto das raízes de V. dardani (VD-R-I) (A). Tratamentos com VD-R e VD-R-I provocaram redução na densidade celular, encolhimento das células e arredondamento (setas pretas) (B e C). Os resultados são expressos como média ± desvio padrão, os testes foram feitos em triplicata (n=3).

Figura 48 -

 48 Figura 48 -Espectro de IES-EM do composto VD-R-1.

  Figura 50 -Espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CDCl3) da substância VD-R-1.

Figura 58 -

 58 Figura 58 -Sobreposição dos ligantes redocado (em branco) e pose mais estável (em vermelho). Legenda: A) Colchicina ligante da enzima Complexo de tubulina e colchicina.

  também foram submetidas a uma avaliação de consenso de docking para aumentar a confiabilidade do método e diminuir o número de falsos positivos. Após a realização das simulações de Docking molecular, os resultados foram padronizados para cada função de pontuação usando a fórmula de probabilidade de Docking (ProbDc) (ACEVEDO, 2017; ACEVEDO et al., 2018): Em que ELig é a energia do ligante, EMLig é a energia do ligante com o menor Score e EInib é a energia do inibidor obtida a partir dos dados cristalográficos da proteína de teste. O maior valor em ProbDc é igual a 1. Assim, apenas os compostos que obtiveram valores de energia iguais ou superiores à energia de interação do liganteinibidor cristalográfico foram considerados potencialmente ativos. Em seguida, foi realizada uma média dos resultados padronizados para cada função de pontuação[START_REF] Acevedo | Estudos Quimiotaxonômicos e Triagem Virtual de Sesquiterpenos Lactonizados Isolados Da Família Asteraceae Com Potencial Atividade Leishmanicida e Tripanocida. Dissertação[END_REF][START_REF] Barros | Virtual Screening of Secondary Metabolites of the Genus Solanum with Potential Antimicrobial Activity[END_REF]. Os resultados do consenso de Docking molecular para as três enzimas em estudo, de acordo com os Scores obtidos pelas três funções de pontuação selecionadas, encontram-se demonstrados nas Tabelas19-22 (p. 133-136).

  Os resultados da Tabela 22 mostram que todos os compostos referentes as configurações do extrato de V. dardani(Taroda) apresentaram probabilidades superior a 0.50, além disso, os compostos C01 (p = 0.71), C02 (p = 0.73), C03 (p = 0.68) e C04 (p = 0.71), apresentaram probabilidade superior ao controle positivo Dacarbazina que correspondeu a p = 0.67, indicando dessa forma, a afinidade desses compostos ao complexo de Tubulina. A maior probabilidade para o complexo em estudo foi obtida pelo controle positivo Vemurafenibe (p = 0.97), um potente inibidor utilizado no tratamento de melanoma em estágio avançado. Análise combinada baseada no Ligante (Ligand based) e na Estrutura (Structure based)

onde

  ProbDc é a probabilidade de um composto estar ativo na análise de acoplamento molecular, ESP é o valor da especificidade do modelo de RF e PActivity é o valor de probabilidade de um composto estar ativo no modelo de RF. A probabilidade combinada (ProbComb), baseada no ligante e na estrutura, pode aumentar o poder preditivo dos modelos e diminuir o número de falsos positivos. Para que as moléculas sejam consideradas potencialmente ativas, os valores de probabilidade devem ser iguais ou superiores a 0,5. Quanto maior o valor de ProbComb, maior o potencial da molécula. Os valores de probabilidade combinados foram calculados para todas as conformações e para a probabilidade total no complexo de tubulina em estudo. Os dados referentes a probabilidade combinada entre as abordagens Ligand-based e Structure-based encontram-se na Tabela 23. Tabela 23 -Valores de probabilidade combinada (ProbComb) entre as abordagens Ligand-based e Structure-based para os compostos frente a linhagem celular A2058 e o complexo de tubulina.

5. 2

 2 .12.4. Análise das Interações do composto 03 com os alvos moleculares correspondentes ao receptor de Tubulina Os compostos em estudo apresentaram valores de probabilidade combinada acima de 50%, porém a conformação 3 foi escolhida para avaliação das interações estabelecidas, pois apresentou o maior valor entre os compostos da série. As macromoléculas avaliadas corresponderam ao complexo de Tubulina-Colchicina (PDB: 4O2B) e ao complexo T2R-TTL-Nocodazol (PDB: 5CA1), visto que, nesses alvos a conformação em estudo e os demais compostos apresentaram maior afinidade quando comparado ao controle Dacarbazina. A Figura 59 (p. 140) mostra o acoplamento molecular do Composto 03 (A e B), a Dacarbazina (C), o Vemurafenibe (D) e o complexo de Tubulina-Colchicina (PDB: 4O2B).

Figura

  Figura 59 -Interações 2D e 3D entre o Composto 03 (A e B), a Dacarbazina (C), o Vemurafenibe (D) e o complexo de Tubulina-Colchicina (PDB: 4O2B). As ligações de hidrogênio são destacadas em verde e em azul; as interações hidrofóbicas são destacadas em rosa e as interações estéricas são destacadas em vermelho e em laranja. Resíduos: Asn (Asparagina), Lys (Lisina), Ala (Alanina), Leu (Leucina), Cys (Cisteína), Val (Valina), Met (Metionina), Ile (Isoleucina) e Asp (Ácido Aspártico).

Figura

  Figura 60 -Interações 2D e 3D entre o Composto 03 (A e B), a Dacarbazina (C), o Vemurafenibe (D) e o complexo T2R-TTL-Nocodazol (PDB: 5CA1). As ligações de hidrogênio são destacadas em verde e em azul; as interações hidrofóbicas são destacadas em rosa e lilás e as interações estéricas são destacadas em vermelho. Resíduos: Asn (Asparagina), Lys (Lisina), Ala (Alanina), Leu (Leucina), Cys (Cisteína), Val (Valina), Ile (Isoleucina), Glu (Ácido Glutâmico) e Tyr (Tirosina).

CFigura 63 -

 63 Figura 62 -Espectro de RMN de 1 H (500 MHz, C5D5N) da substância VL-1.

Figura

  Figura 64 -Expansão do espectro de RMN de 1 H (500 MHz, C5D5N) da substância VL-1 na região de 0,6 -4,7 ppm.

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Exemplos de substâncias identificadas e isoladas na família Cordiaceae.

  

	Muitas espécies pertencentes a essa família são utilizadas na medicina popular
	para tratamento de diversas afecções do trato gastrintestinal, urogenital, respiratório,
	cardíaco, vascular, sanguíneo, possuindo propriedades antimicrobianas, anti-
	inflamatória, anti-helmíntica, diurética, analgésica, entre outras. Diferentes classes de
	metabólitos secundários foram isoladas e identificadas em diferentes partes de plantas
	dessa família, incluindo lignanas, naftoquinonas, cromonas, saponinas, terpenoides,
	alcaloides, flavonoides e outros compostos fenólicos (VALE et al., 2012; MATIAS et
	al., 2015) (Quadro 1).		
	Quadro 1 -Espécies	Substâncias	Referências
	V. verbenacea		VELDE et al.
	(Folhas)		
	Cordialina A	Cordialina B	

Boraginaceae, juntamente com Boraginoideae, Ehretioideae, Heliotropioideae e Wellstedioideae. Porém, estudos moleculares recentes elevaram estas subfamílias ao nível de famílias. Em 2016, o Angiosperm Phylogeny Group (APG) reconheceu a ordem Boraginales sendo composta por oito famílias: Codonaceae, Wellstediaceae, Boraginaceae, Hydrophyllaceae, Namaceae, Heliotropiaceae, Cordiaceae e Ehretiaceae, denotando a grande diversidade e a difícil circunscrição do grupo (LEAL-COSTA & AMÉLIA, 2017; MELO et al., 2018). A família considerada monofilética, cosmopolita e provavelmente a mais complexa de Boraginales, apresenta cerca de 350 espécies, sendo 65 delas registradas no Brasil. Cordiaceae inclui três gêneros: Coldenia L., Cordia L. e Varronia P. Br., com distribuição predominantemente tropical, ocorrendo em todos os estados brasileiros, sendo representada na forma de árvores ou arbustos, raramente lianas, com folhas alternas ou opostas, inteiras, flores bissexuadas, simpétalas e frutos do tipo drupa, com quatro lóculos (NIZIO, 2015; DEMÉTRIO, 2017; WATANABE, HIURA e NOGUEIRA, 2017).

  Varronia verbenacea, basiônimo Cordia verbenacea, é uma espécie muito importante desse gênero, pois a partir do seu óleo essencial, foi possível o desenvolvimento do primeiro medicamento fitoterápico totalmente desenvolvido no Brasil, o Acheflan ® , presente tanto na forma de creme como de aerossol e a sua utilização tópica é indicada para o tratamento de dores musculares e tendinites

2.2.1 O Gênero Varronia

O gênero Varronia P. Browne, pertencente à família Cordiaceae, por muito tempo foi descrito como um subgênero de Cordia

[START_REF] Taroda | Taxonomic studies on Brazilian species of Cordia L. (Boraginaceae). Tese (Doutorado em Filogenia) -Universidade de Santo André[END_REF]

, no entanto, após realização de estudos filogenéticos houve a segregação de Varronia dos outros membros de Cordia, sendo classificado assim devido a sua significância morfológica e evidências moleculares, corroborando para que Varronia seja considerado um grupo monofilético distinto, sendo tratada como irmã de Cordia e, portanto, reconhecida a nível genérico. A diferença morfológica principal entre os gêneros Cordia e Varronia consiste nos tipos de hábitos e inflorescências: árvores com panículas abertas ou inflorescências cimosas pertencem ao gênero Cordia e arbustos com inflorescências condensadas, capitadas ou em forma de espigas pequenas e compactas pertencem ao gênero Varronia (MILLER e GOTTSCHLING, 2007). Devido a mudança na filogenia, a nomenclatura de algumas espécies que antes estavam posicionadas dentro do gênero Cordia foi atualizada para Varronia, incluindo espécies como: Varronia curassavica Jacq; Varronia globosa Jacq; Varronia leucocephala (Moric.) J. S. Mill; Varronia dardani (Taroda) J. S. Mill, entre outras, todas distribuídas no Nordeste do Brasil (MELO, 2015). O gênero Varronia inclui aproximadamente 125 espécies neotropicais, com seus principais centros de diversidade no México, nos Andes tropicais e no Brasil (MILLER & GOTTSCHLING, 2007). No Brasil, existem 30 espécies, das quais mais da metade são endêmicas e encontram-se distribuídas nos principais domínios fitogeográficos (Floresta Amazônica, Mata Atlântica, Cerrado e Caatinga). Seis espécies são endêmicas do Nordeste brasileiro: Varronia dardani (Taroda) J.S. Miller, V. harleyi (Taroda) J.S. Miller, V. leucocephala (Moricand) J.S. Miller, V. leucomalloides (Taroda) J.S. Miller, V. mayoi (Taroda) M.Stapf e V. tarodaea J.S. Miller, bem como uma nova espécie Varronia mariana E.C.O.Chagas & Costa-Lima (MELO et al., 2015; CHAGAS & COSTA-LIMA, 2018).

Muitas espécies pertencentes a este gênero são usadas na medicina popular, por apresentarem diversas propriedades como: antiúlcera, antimicrobiana, antifúngica, larvicida, anti-inflamatória e analgésica. Além do uso popular dessas plantas, diversos estudos têm sido realizados a fim de comprovar suas atividades biológicas

[START_REF] Freitas | Estudo químico e farmacológico de Cordia polycephala[END_REF]

. A

Figura 2 -Inflorescência e folhas de V. dardani. Fonte: Josean

  Fechine Tavares (2019).

	anteriormente de V. dardani relataram a presença de algumas classes de metabólitos
	secundários, principalmente terpenoides e flavonoides. Um estudo de prospecção
	fitoquímica para detecção de metabólitos secundários em extratos hidroalcoólicos de No ano seguinte, outro estudo resultou no isolamento de duas naftoquinonas,
	raiz, galhos e folhas, realizado em 2015, mostrou a presença de taninos flabobênicos, Cordiaquinona A e Cordiaquinona B a partir do extrato diclorometânico das raízes
	flavononóis, catequinas, flavanonas e quinonas (DUARTE, 2015). (Quadro 2, p. 25), bem como no isolamento de duas flavonas, 5-hidroxi-7-
	metoxiflavanona (pinostrobina) e 5-hidroxi-7,4'-dimetoxiflavanona (sakuranetina-4'-
	metil éter) a partir da fase diclorometano do extrato hidroalcoólico das folhas de V.
	dardani (DE OLIVEIRA, 2016).
	Em 2018, o estudo realizado por Veloso, possibilitou o isolamento de três
	compostos e duas misturas a partir da fase diclorometânica do extrato etanólico bruto
	das folhas de V. dardani, sendo estes: duas chalconas, pinostrobina chalcona e
	gimnogrameno; e quatro flavanonas, pinocembrina, isosakuranetina, pinostrobina e
	sakuranetina-4'-metil éter. Da atividade biológica testada, o óleo essencial inibiu o
	crescimento de Enterococcus faecalis e Streptococcus salivarius, já o extrato etanólico
	bruto inibiu apenas o crescimento de S. salivarius. A pinocembrina, a pinostrobina
	chalcona e sua mistura com o gimnogrameno apresentaram forte inibição da formação
	do biofilme de E. faecalis na maior concentração testada (VELOSO, 2018).

Varronia dardani (Taroda) J.S. Mill. A espécie Varronia dardani (Taroda) J.S. Mill. (Figura 2, p. 24) tem como basiônimo Cordia dardani, endêmica da caatinga do Brasil, sendo distribuída em Estados do Nordeste do país como: Alagoas, Sergipe, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Rio Grande do Norte (STAPF, 2015). Estudos químicos realizados

Quadro 2 -Alguns compostos isolados da espécie V. dardani. Parte da planta Substâncias Referências

  

				DE
	Raízes			OLIVEIRA
		Cordiaquinona A		(2016)
			Cordiaquinona B	
	Folhas	Gimnogrameno	Pinostrobina chalcona	VELOSO (2018)
		De acordo com a revisão de literatura, alguns flavonoides têm sido relatados na
	espécie em questão, principalmente da classe das flavanonas, como por exemplo, a 5-
	hidroxi-7-metoxiflavanona (pinostrobina) e 5-hidroxi-7, 4'-dimetoxiflavanona (DE
	OLIVEIRA, 2016). Estes metabólitos, principalmente os glicosilados, possuem
	atividade espasmolítica em diversos músculos lisos, além de inibirem as enzimas
	monoaminooxidase A e catecol-O-metiltransferase e alguns flavonoides se ligam ao
	receptor GABAA, sendo responsável por tal ação (HANRAHAN, CHEBIB &
	JOHNSTON, 2011). Sendo assim, observa-se a necessidade da contribuição ao
	conhecimento químico e biológico, principalmente no que se diz respeito à avaliação da
	atividade espasmolítica desta espécie endêmica da Caatinga, a V. dardani (Taroda) J.S.
	Mill, pertencente à uma família com poucos estudos nessa área.	
	2.2			

.1.2 A espécie Varronia leucocephala (Moric.) J.S. Mill.

  

	solos arenosos nos estados do Piauí, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Bahia (TÖLKE et
	al., 2013; MELO, 2015; VIEIRA, MELO & CONCEIÇÃO, 2015).
	Varronia leucocephala (Moric.) J.S. Mill. (Figura 3, p. 26) é endêmica do bioma
	Caatinga, tem como sinonímia Cordia leucocephala, e é frequentemente encontrada em

Figura 3 -Inflorescência e folhas de V. leucocephala. Fonte: Josean

  Fechine Tavares (2019).

	Popularmente essa espécie é conhecida como "moleque-duro" e é vastamente
	utilizada como flor ornamental, devido a sua beleza (DANTAS et al., 2021). Várias
	partes da planta são utilizadas pela população para alívio das dores do reumatismo,
	indigestão, hemorragias, inflamação da garganta e artrite. Além disso, estudos
	mostraram o isolamento de saponinas triterpênicas das folhas de V. leucocephala e com
	raízes, outras pesquisas resultaram no isolamento de naftoquinonas com atividade
	citotóxica (ABRANTES & AGRA, 2004; DINIZ et al., 2008; MARINHO-FILHO et al.,
	2010; CASTRO & CAVALCANTE, 2011; FERNANDES et al., 2019) (Quadro 3, p.

Figura 4 -Estrutura básica das flavanonas. Fonte:

  Autoria própria (2022).

	inflamatória por inibir enzimas da via do ácido araquidônico (COX-1, COX-2, 5-LOX)
	Como as flavanonas fazem parte do grupo dos flavonoides, elas apresentam
	além do efeito antioxidante, diversos efeitos biológicos, como atividade antiviral,
	antimicrobiana e antinflamatória, inibem a agregação de plaquetas, são
	antiulcerogênicas e antialergênicas (GATTUSO et al., 2007).
	Os flavonoides em geral fazem parte de um grande grupo de metabólitos
	naturais bem difundidos em plantas superiores. Eles são responsáveis pela cor das flores
	. Há algumas em angiospermas, mas flavonoides incolores foram relatados. Nos primórdios das
	décadas, estes eram considerados apenas como grupos menores de flavonoides (BOHM, pesquisas com flavonoides, os mesmos foram considerados subprodutos inúteis do
	1994), como chalconas, di-hidrochalconas e auronas. No entanto, durante os últimos metabolismo vegetal, no entanto, várias funções biológicas na planta são exercidas por
	anos, o número total de flavanonas conhecidas aumentou ao ponto de que elas são agora vários membros da série, por exemplo, proteção UV, modulação enzimática e proteção
	consideradas uma das principais classes de flavonoides, assim como as flavonas, contra agentes infecciosos (BUCKINGHAM; MUNASINGHE, 2015)
	isoflavonas, flavonóis e antocianidinas (VEITCH & GRAYER, 2006; KHAN & Estes metabólitos secundários são polifenólicos, derivados da via dos
	DANGLES, 2014). fenilpropanoides e do acetato, baseados em uma estrutura com quinze carbonos
	(C6C3C6) (DORNAS et al., 2007). Possuem dois anéis fenólicos substituídos (A e B) e
	um anel cromano (anel C) acoplado ao anel A. O anel C é heterocíclico com seis
	membros, pode ser encontrado com cinco membros (ex. auronas) ou na sua forma
	acíclica (chalconas) (DI CARLO et al., 1999; SISA et al., 2010). Os anéis (A, B e C)
	recebem a numeração com números ordinários para os núcleos A e C e os mesmos
	números seguidos por uma linha (') para o núcleo B (SIMÕES et al., 2017).
	Diversos estudos mostraram que estes metabólitos promovem várias atividades
	terapêuticas. Eles evitam a formação de radicais livres, exercem atividade anti-

1 Preparação da solução-mãe do EEB-VD para os ensaios farmacológicos

  , estava conectado a um sistema de aquisição digital com o software AQCAD versão 2.1.6 para aquisição dos dados e ANCAD para análise. O sistema contém uma bomba termostática modelo BT-60 que controla a temperatura das cubas.Todos os aparelhos foram adquiridos da AVS Projetos (São Paulo, SP, Brasil).

	Todas as substâncias eram pesadas em balança analítica modelo AG200 e os
	animais em balança semianalítica modelo BG4001, ambas da Gehaka (Brasil).
	Os valores de pH eram verificados através de um pHmetro digital PG 2000
	(GEHAKA, Brasil).
	4.4.1.2 Métodos
	4.4.1.2.
	). A
	temperatura das cubas era controlada com bombas termostáticas (BANHO-MARIA
	AVS-BM, Brasil, ou POLYSTAT 12002, Cole-Palmer, EUA).

Para registrar as contrações isométricas, os órgãos eram suspensos em cubas de banho para órgãos isolados (6 mL) modelo BOI-04 e conectados a transdutores de força isométricos modelo TIM 05 acoplados a um amplificador modelo AECAD04F. Este, por sua vezO extrato foi solubilizado em Cremophor ® e diluído em água destilada para obtenção da solução-estoque (10 mg/mL, 3% Cremophor ® v/v) que era estocada a uma temperatura de 0 °C. A concentração final do Cremophor ® na cuba nunca excedeu 0,01%, nesta concentração o Cremophor ® é desprovido de efeito contrátil ou relaxante significante no órgão estudado, de acordo com dados obtidos em experimentos anteriores.

As concentrações do EEB-VD eram utilizadas em múltiplos de 3, sendo a concentração submáxima 243 e a máxima 729 µg/mL. E era realizada uma curva concentração-resposta completa testando concentrações menores para verificar o zero e o efeito máximo (Emax) do extrato, quando o efeito da concentração submáxima e máxima era superior a 50 e 70%, respectivamente.

4.4.1.2.

2 Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por FEN em aorta isolada de rato

  As preparações eram estabilizadas por um período de 60 minutos, durante o qual eram mantidas sob uma tensão de repouso de 1 grama e gaseificados com carbogênio.

	Durante esse período, a solução nutritiva era renovada a cada 15 minutos para prevenir
	a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).
	Após o período de estabilização era induzida uma contração com 3 x 10 -7 M de
	FEN e durante o componente tônico era adicionado 10 -6 M de ACh para verificar a
	integridade do endotélio (FURCHGOTT; ZAWDZKI, 1980). O endotélio vascular era
	considerado íntegro quando os anéis aórticos apresentassem relaxamento igual ou
	superior a 50%. Em relaxamento igual ou inferior a 10%, os anéis eram considerados
	sem endotélio funcional (AJAYA; GILANI; MUSTAFAA, 2003). Após a lavagem,
	esperou-se 30 minutos e durante o componente tônico de uma segunda resposta ao
	agonista, o EEB-VD era adicionado em preparações diferentes de maneira cumulativa à
	cuba.
	Os ratos eram eutanasiados por anestesia com cetamina 100 mg/kg (i.p.) e
	xilazina 10 mg/kg (i.p.), seguido por método complementar de decapitação com o
	auxílio de uma guilhotina. Um segmento da aorta torácica era retirado e limpo de todo o

tecido conjuntivo e adiposo, em seguida, era seccionado em anéis de 3-5 mm. Para obtenção das respostas isométricas, os anéis eram suspensos individualmente por uma alça de aço inoxidável, em cubas de banho (6 mL) contendo solução de Krebs a 37 °C.

O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração induzida por FEN. Os valores de CE50 foram obtidos por regressão não linear a partir das curvas concentrações-resposta obtidas para o EEB-VD em anéis com e sem endotélio funcional.

Após o relaxamento máximo produzido pelo EEB-VD, o tempo de reversão era observado.

4.4.1.2.

3 Efeito do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por CCh em traqueia isolada de rato Os

  ou superior a 50%. Em relaxamento igual ou inferior a 10%, os anéis eram considerados sem epitélio funcional. Após a lavagem, esperou-se 30 minutos e durante o componente tônico de uma segunda resposta ao agonista, o EEB-

	VD era adicionado em preparações diferentes de maneira cumulativa à cuba
	(TSCHIRHART et al., 1987).
	O relaxamento foi expresso como a percentagem reversa da contração inicial
	induzida por CCh. Os valores de CE50 (concentração de uma substância que produz 50%
	do seu efeito máximo) foram calculados por regressão não linear a partir das curvas
	concentrações-resposta obtidas para o EEB-VD em anéis com e sem epitélio funcional.
	Após o relaxamento máximo produzido pelo EEB-VD, o tempo de reversão era
	observado.
	4.4.1.2.
	dividido em segmentos, contendo de 3 a 4 anéis de cartilagem. Os segmentos eram
	suspensos individualmente através de hastes de aço inoxidável em cubas de banho
	(6 mL), contendo solução nutritiva de Krebs sob tensão de 1 grama. Estes segmentos
	eram mantidos a uma temperatura de 37 °C e permaneceram em repouso durante 60
	minutos, sendo a solução trocada a cada 15 minutos.

ratos, após serem eutanasiados por anestesia com cetamina 100 mg/kg (i.p.) e xilazina 10 mg/kg (i.p.), seguido por método de exsanguinação, tinham a traqueia retirada e limpa, de modo a separá-la de todo o tecido conectivo e adiposo. O órgão era Após o período de estabilização era induzida uma contração com 10 -5 M de CCh, e durante o componente tônico era adicionado 3 x 10 -4 M de AA para verificar a integridade do epitélio. O epitélio era considerado íntegro quando os anéis de traqueia apresentaram relaxamento igual

4 Investigação do efeito espasmolítico do EEB-VD em íleo isolado de cobaia

  por 15 minutos em preparações diferentes, e na presença deste, era induzida uma terceira contração utilizando um dos agonistas acima citados.

	Após cuidadosa dissecação, o segmento do íleo era seccionado em fragmentos de 2 a 3 cm de comprimento, suspensos individualmente em cubas de vidro e deixados em repouso por 30 minutos, tempo necessário para estabilização da preparação, durante este período a solução nutritiva era trocada a cada 15 minutos. Após o período de estabilização, era induzida uma contração com 40 mM de KCl para verificar a funcionalidade do órgão. A preparação era lavada e após 15 minutos duas contrações fásicas de magnitudes similares, com intervalo de 15 minutos entre ambas, eram obtidas comparação das respostas antes (controle) e após a adição do EEB-VD à cuba, sendo sua eficácia expressa como Emax. Os valores de CI50 (concentração da substância que inibe 50% do efeito máximo de um agonista) foram expressos como a média e o e.p.m. (erro padrão da média) dos valores individuais da CI50 obtidos em cada um dos experimentos e calculados por regressão não linear. O tempo de reversão do efeito espasmolítico do EEB-VD era observado após a retirada do mesmo na concentração máxima utilizada. com 10 A inibição da resposta contrátil induzida pelos agonistas foi avaliada por 4.4.1.2.4.2 Efeito do EEB-

4.4.1.2.4.1 Efeito do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por histamina ou por CCh

As cobaias eram mantidas em jejum por um período de 18 horas, tendo acesso à água ad libitum antes do início dos experimentos. Após este período, as cobaias eram eutanasiados por anestesia com cetamina 100 mg/kg (i.p.) e xilazina 10 mg/kg (i.p.), seguido por método de exsanguinação. O abdômen era aberto e um segmento do íleo de aproximadamente 15 cm de comprimento era retirado e colocado em uma placa de Petri contendo solução nutritiva de Krebs modificado a 37 °C gaseificados com carbogênio. -6 M de histamina ou de CCh, concentração submáxima que produz cerca de 80% da resposta máxima, e registradas através de uma alavanca isotônica de inscrição frontal acoplada ao cilindro esfumaçado de um quimógrafo. O EEB-VD era incubado em diferentes concentrações

VD sobre as contrações tônicas induzidas por KCl, por histamina ou por CCh

  

O íleo era montado como descrito no item anterior. Após o período de estabilização, uma contração submáxima, registrada através de transdutores isométricos acoplados a um sistema de aquisição digital, era obtida com 40 mM de KCl ou por 10 -6 M de histamina ou de CCh, e sobre o componente tônico desta contração o EEB-VD era adicionado de maneira cumulativa à cuba em preparações diferentes.

O relaxamento produzido pelo EEB-VD foi expresso como a percentagem reversa da contração produzida pelos agentes contráteis. A potência e a eficácia relaxante do EEB-VD foram calculadas por regressão não linear e avaliadas comparando-se os valores da CE50 e do Emax, respectivamente.

Após o relaxamento máximo produzido pelo EEB-VD, o tempo de reversão era observado.

4.4.1.2.

5 Investigação do efeito espasmolítico do EEB-VD em útero isolado de rata 4.4.1.2.5.1 Efeito do EEB-VD frente às contrações fásicas induzidas por ocitocina ou por CCh

  com cetamina 100 mg/kg (i.p.) e xilazina 10 mg/kg (i.p.), seguido por método complementar de decapitação com o auxílio de uma guilhotina.Após aberta a cavidade abdominal, era feita a dissecação do útero colocando-o em uma placa de Petri contendo solução nutritiva de Locke Ringer a 32 °C e gaseificados com carbogênio. Em seguida, os dois cornos uterinos eram separados por meio de uma incisão, abertos longitudinalmente, e cada um era suspenso verticalmente em cubas de banho para órgãos isolados (5 mL).

	Estes tecidos eram mantidos sob tensão de 1 g e permaneciam em repouso por
	40 minutos, tempo necessário para perfeita estabilização da preparação. Durante este
	período a solução nutritiva era trocada a cada 10 minutos (Adaptado de REVUELTA;

As ratas eram tratadas 24 horas antes com dietilestilbestrol (0,1 mg/kg) por via subcutânea para sincronização hormonal do estro. Decorrido este tempo, as ratas eram eutanasiadas por anestesia CANTABRANA;

[START_REF] Revuelta | Depolarization dependent effect of flavonoids in rat uterine smooth muscle contraction elicited by CaCI2[END_REF]

. Após o período de estabilização, era induzida uma contração com 60 mM de KCl para verificar a funcionalidade do órgão.

Após um período de 15 minutos duas contrações fásicas de magnitudes similares, com intervalo de 15 minutos entre ambas, eram obtidas com 10 -2 UI/mL de ocitocina ou com 10 -5 M de CCh. O EEB-VD era incubado em diferentes concentrações por 15 minutos em preparações diferentes e independentes, e a inibição da resposta submáxima aos agonistas era avaliada por comparação das respostas antes (controle) e após a adição do extrato à cuba (REVUELTA; CANTABRANA;

HIDALGO, 2000)

.

Este efeito foi avaliado por comparação das respostas antes e após a adição do EEB-VD à cuba, sendo sua eficácia expressa como Emax. Os valores de CI50 foram calculados por regressão não linear.

O tempo de reversão do efeito tocolítico do EEB-VD era observado após a retirada do mesmo na concentração máxima utilizada.

4.

4.1.2.5.2 Efeito tocolítico do EEB-VD sobre as contrações tônicas induzidas por ocitocina ou por KCl

  VD foram calculadas por regressão não linear e avaliadas comparando-se os valores da CE50 e do Emax, respectivamente.

	Após o relaxamento máximo produzido pelo EEB-VD, o tempo de reversão era
	observado.
	4.4.1.3 Análise estatística
	Todos os resultados obtidos foram expressos como média e erro padrão da
	média (e.p.m.) e analisados estatisticamente empregando-se o teste "t" (não pareado)
	ou análise de variância "one-way" (ANOVA) seguido do pós-teste de Tukey. A
	hipótese nula foi rejeitada quando p < 0,05. Os valores de CE50 e CI50 foram
	calculados por regressão não linear para todos os experimentos realizados (NEUBIG
	O útero foi montado como descrito no item anterior. Após o período de
	estabilização, uma contração submáxima, registrada através de transdutores isométricos
	acoplados a um sistema de aquisição digital, era obtida com 60 mM de KCl para
	verificação da funcionalidade do órgão. Durante a fase tônica sustentada de uma
	segunda contração induzida por 10 -2 UI/mL de ocitocina ou por 60 mM de KCl, o EEB-

VD era adicionado de maneira cumulativa à cuba em preparações diferentes.

O relaxamento produzido pelo extrato era expresso como a percentagem reversa da contração inicial induzida pelos agentes contráteis. A potência e a eficácia relaxante do EEB-

Tabela 2 -Programação utilizada para o fracionamento por Cromatografia Flash dos extratos etanólicos.

  

	Tempo (minutos)	Tipo de eluição	Concentração
	0 -30	Isocrática	100% de A
	30 -35	Gradiente	100% de A -50% de A e 50% de B
	35 -65	Isocrática	50% de A e 50% de B
	65 -70	Gradiente	50% de A e 50% de B -100% de B
	70 -100	Isocrática	100% de B
	100 -105	Gradiente	100% de B -50% de B e 50% de C
	105 -135	Isocrática	100% de C

Tempo (minutos) Tipo de eluição Concentração

  

	Tabela 3 -(Continuação)		
	60 -70	Isocrática	90% de B
	70 -75	Gradiente	90% até 100% de B
	75 -80	Isocrática	100% de B
	0 -10	Isocrática	5% de B
	10 -15	Gradiente	5% até 10% de B
	15 -25	Isocrática	10% de B
	25 -30	Gradiente	10% até 35% de B
	30 -40	Isocrática	35% de B
	40 -45	Gradiente	35% até 65% de B
	45 -55	Isocrática	65% de B
	55 -60	Gradiente	65% até 90% de B

  curagem de dados do banco em estudo iniciou com a remoção das duplicatas no Programa Microsoft Excel (https://office.live.com/). A etapa de remoção de duplicatas faz-se importante, pois possibilita avaliar a qualidade dos dados experimentais e remover as estruturas químicas com registro duplicado dos em 30 blocos lógicos e abrangem abordagens teóricas diversas (Kode Chemoinformatics (https://chm.kode-solutions.net/products_dragon.php).

	VD07						1S,4aS,9aS
	experimentos, representando assim um dado experimental conflitante que afeta a 4.7.2.2 Modelo de predição e validação estatística
	qualidade do modelo (FOURCHES, MURATOV & TROPSHA, 2010). Após a
	remoção das duplicatas ocorreu a padronização dos valores do pIC50 e a posterior A elaboração do modelo de classificação, como também as análises estatísticas e
	VD08 divisão das moléculas do banco em ativas e inativas. avaliação da sua performance foram realizadas no KNIME 3.4.0 software (KNIME 1R,4aR,9aR
	3.4.0	The	Konstanz	Information	Miner	Copyright,	2003-2018)
	Os SMILES correspondem a representação canônica da estrutura química do (https://www.knime.com/).
	composto, estes foram utilizados como dados de entrada para as etapas posteriores, as
	quais consistiram em: (1) conversão das estruturas em 3D e padronização, realizada no
	software Standardizer program [JChem 17.18.0.1784, 2017, ChemAxon
	4.7.2.1 Descritores moleculares Um outro artifício utilizado na avaliação foi o "Domínio de Aplicabilidade",
	O conjunto de dados referente a linhagem celular A2058 (CHEMBL ID: responsável por analisar os compostos dos conjuntos de testes, avaliando a
	613503) era constituído por 233 compostos em seu total. A fim de melhorar a Os descritores correspondem a uma informação quantitativa sobre a identidade confiabilidade das predições realizadas, como também compreende um espaço químico
	classificação do modelo elaborado, foi colocada uma borda, em que o valor de pIC50 dos química da molécula. O cálculo de descritores foi utilizado para prever as propriedades teórico que abrange os descritores do modelo e a resposta modelada que permite estimar
	compostos retirados compreendeu a faixa de 5.52 a 4.75, totalizando 67 compostos biológicas e físico-químicas das moléculas em estudo. A determinação dos descritores é a incerteza na previsão de um composto no conjunto de treinamento empregado no
	retirados e 166 compostos restantes. Dessa forma, os compostos classificados como possibilitada quando as moléculas são convertidas em uma representação molecular que desenvolvimento do modelo (ROY, KAR & AMBURE, 2015). Este parâmetro é
	ativos, consistiram em um total de 85 compostos e apresentaram pIC50 ≥ 5,52, já os permite o tratamento matemático. calculado de acordo com a fórmula:
	compostos inativos possuíam valores de pIC50 ≤ 4,75 e totalizaram 81 compostos.

Tabela 4 -(Continuação).

4.7.2 Banco de Dados do Modelo e curagem de dados

Foi elaborado um modelo de predição, sendo este referente à linhagem de células A2058 que representam um modelo celular de melanoma. O conjunto de dados para elaboração do modelo de classificação foi obtido a partir da base de dados eletrônica ChEMBL Data Base (https://www.ebi.ac.uk/chembl/). Estes dados tratam-se de compostos químicos testados in vitro, e com atividade inibitória da linhagem celular em estudo em estudo. Os compostos foram classificados de acordo com o valor da pIC50 (-log IC50 (mol/L), a qual representa a concentração necessária para a inibição de 50% da linhagem celular em estudo. A (https://chemaxon.com/)]. O protocolo de padronização incluiu a adição de átomos de Hidrogênio, Aromatização das estruturas e Remoção de sais; e (2) Obtenção dos descritores moleculares. Com relação a padronização das moléculas da série de teste, estas foram desenhadas no Os compostos estudados no presente estudo, foram desenhados no programa Marvin Sketch 22.13 software, ChemAxon (https://chemaxon.com/). Após a obtenção do desenho, os compostos em estudo foram padronizados e convertidos em 3D pelo software Standardizer program [JChem 17.18.0.1784, 2017, ChemAxon (https://chemaxon.com/)]. Neste trabalho foram utilizados os descritores pertencentes ao software Dragon 7.0, o qual apresenta a capacidade de calcular 5.270 descritores moleculares, os quais estão distribuídos

O banco de moléculas importado no software foi particionado pela ferramenta "Partioning" com a opção de "Amostra estratificada", ocorrendo, dessa forma a separação em Treino e Teste, o que representa percentuais de 80% e 20% de todos os compostos em estudo, respectivamente, ocorrendo assim, a seleção aleatória, porém preservando sempre a mesma proporção de substâncias ativas e inativas, em ambos conjuntos de dados sob estudo.

O Random Forest (RF) foi utilizado como algoritmo de cálculo, o qual caracteriza-se como um algoritmo supervisionado que se baseia na combinação de árvores de predição, de uma forma em que cada árvore depende dos valores de um vetor aleatório amostrado de forma independente e mantém-se a mesma distribuição de árvores na floresta

[START_REF] Breiman | Random Forest[END_REF][START_REF] Acevedo | Estudos Quimiotaxonômicos e Triagem Virtual de Sesquiterpenos Lactonizados Isolados Da Família Asteraceae Com Potencial Atividade Leishmanicida e Tripanocida. Dissertação[END_REF]

. A configuração utilizada durante as análises correspondeu a 200 árvores e a uma semente (seed) para a geração de números aleatórios (200-1).

Docking molecular 4.7.2.3.1 Avaliação da interação molecular entre os compostos teste isômeros obtidos no extrato de Varronia dardani, os controles positivos Vemurafenib e Dacarbazina e o alvo molecular receptor de Tubulina.

  

	molecular, com a inserção dos ligantes no programa Molegro Virtual Docker (MVD)
	versão 6.0.1.				
	O programa Molegro Virtual Docker v.6.0.1 (MVD) foi utilizado com os
	parâmetros predefinidos no mesmo software. Os compostos foram importados, para
	analisar a estabilidade do sistema através das interações identificadas com o sítio ativo
	A simulação de docking molecular foi utilizada para investigar o possível da enzima, tomando como referência o valor energético do MolDock Score
	mecanismo de ação dos compostos teste isômeros obtidos no extrato de Varronia (THOMSEN & CHRISTENSEN, 2006). O algoritmo MolDock SE (Simplex Evolution)
	dardani (Taroda) para efeito anticâncer através da afinidade de ligação dos isômeros em foi usado com os seguintes parâmetros: Um total de 10 execuções com um máximo de
	estudo ao alvo molecular receptor de tubulina. As estruturas 3D do receptor de tubulina 1.500 interações usando uma população de 50 indivíduos, 2.000 etapas de minimização
	em estudo foram obtidas na biblioteca Protein Data Bank (PDB) para cada resíduo flexível e 2.000 etapas de minimização global por simulação. As
	funções de pontuação MolDock Score (GRID) e PLANTS Score (GRID) foram usadas
	para calcular os valores de energia de encaixe. Um GRID foi fixado em 0,3 Ǻ e a esfera
	de busca foi fixada em 15 Ǻ de raio. Para a análise da energia do ligante, foram
	Proteína avaliadas as interações eletrostáticas internas, ligações de hidrogênio internas e torções PDB ID Controle Positivo Resolução Referência
	Complexo de sp 2 -sp 2 .	4O2B	vemurafenibe e dacarbazina	2.30 Å	(PROTA et al., 2014)
	tubulina e				
	colchicina				
	Complexo T2R-TTL-4.7.2.3.	5CA1	vemurafenibe e dacarbazina	2.40 Å	(WANG et al., 2016)
	Nocodazol				
	Complexo	5J2T	vemurafenibe e dacarbazina	2.20 Å	(WAIGHT et al.,
	tubulina-				2016)
	vimblastina				
	Na etapa de preparação, os controles positivos Vemurafenibe e a Dacarbazina,
	além dos compostos teste isômeros de V. dardani (Taroda) foram desenhados no
	programa MarvinSketch versão 19.9 (https://chemaxon.com/products/marvin), sendo
	obtida a estrutura 2D que foi salva no formato .sdf. Em seguida, as estruturas foram
	minimizadas pelo método da mecânica molecular, sendo esta etapa realizada no
	programa Spartan versão 14.0 (https://store.wavefun.com/Spartan_Software_s/12.htm).
	Após a inserção neste programa, as moléculas foram imediatamente foram convertidas

(https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)

(BERNSTEIN et al., 1977)

, sob os códigos (PDB ID: 4O2B -Complexo de tubulina e colchicina)

[START_REF] Prota | The Novel Microtubule-Destabilizing Drug BAL27862 Binds to the Colchicine Site of Tubulin with Distinct Effects on Microtubule Organization[END_REF]

; (PDB ID: 5CA1 -Complexo T2R-TTL-Nocodazol) (WANG et al., 2016); (PDB ID: 5J2T -Complexo tubulina-vimblastina) (WAIGHT et al., 2016). Os fármacos antineoplásicos vemurafenibe e dacarbazina (Figura 7, p. 66) foram utilizados como controle positivo na simulação realizada para comparar os resultados de encaixe molecular com os compostos testes obtidos do extrato de Varronia dardani (Taroda) e avaliação da afinidade. Os dois fármacos são antineoplásicos com atividade comprovada no tratamento do câncer. O Vemurafenib é um inibidor da enzima B-Raf, desenvolvido para o tratamento do melanoma em estágio avançado (SHAW & NATHAN, 2013;

[START_REF] Spain | The Combination of Vemurafenib and Cobimetinib in Advanced Melanoma[END_REF]

. Já a Dacarbazina tem como mecanismo de ação a alquilação, por meio da inibição do material genético e consequente formação de íons carbônio

[START_REF] Iradyan | Antitumor Activity of Imidazole Derivatives: Dacarbazine and the New Alkylating Agent Imidazene[END_REF][START_REF] Koprowska | Dacarbazine, a Chemotherapeutic against Metastatic Melanoma and a Reference Drug for New Treatment Modalities[END_REF]

. A descrição das proteínas utilizadas em estudo encontra-se na Tabela 5 (p. 66). Figura 7 -Estruturas químicas do vemurafenibe e dacarbazina. Fonte: Autoria própria (2022). Tabela 5 -Descrição das proteínas selecionadas no estudo. em 3D e foi obtida a conformação mais estável. Os arquivos foram salvos no formato Spartan document e .sdf. Após a preparação dos compostos, foi realizado o Docking

2 Visualização das interações obtidas no acoplamento molecular e obtenção das figuras Para

  

a realização da visualização das interações e obtenção das figuras de acoplamento molecular foram utilizados os programas Discovery Studio Visualizer v20.1.0.19295 -BIOVIA (2020) (https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizerdownload) e UCSF Chimera X 1.4 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/).

Desenvolvimento do método cromatográfico para o isolamento de compostos na fase acetato de etila do Extrato Etanólico Bruto de V. dardani

  

	5. RESULTADOS E DISCUSSÃO	
	5.1. No cromatograma (Figura 8) foi possível observar 9 picos principais. Deste
	processo foram coletadas 9 frações (VD-FA-11-12.1-11-12.9) correspondentes aos 9
	principais picos visualizados no cromatograma analítico. Posteriormente, estas frações
	foram analisadas por RMN de 1 H, 13 C e HMBC para identificação/determinação
	estrutural, sendo possível identificar seis substâncias que foram codificadas como VD-
	1, correspondente à fração com tempo de retenção 66,95; VD-2, correspondente à
	fração em 39,93; VD-3, correspondente à fração com tempo de retenção em 38,58; VD-
	4, correspondente à fração em 30,56; VD-5, correspondente à fração em 84,67 e VD-6,
	Tempo	Comando	Valor
	0,01	Concentração de ACN	5
	50,00	Concentração de ACN	45
	55,00	Concentração de ACN	65
	60,00	Concentração de ACN	100
	70,00	Concentração de ACN	100
	75,00	Concentração de ACN	5
	85,00	Concentração de ACN	5
	85,01	Fim da corrida cromatográfica	
	Legenda: ACN -Acetonitrila.		
	RÉSULTATS ET DISCUSSION

correspondente à fração com tempo de retenção em 35,54.

trihidroxiflavanona (naringenina) em comparação aos dados de RMN de 1 H, 13C (500 e 125 MHz, CD3OD) por SILVA e colaboradores (2013).

  

	O espectro de RMN de 13 C APT (100 MHz, CD3OD) (Figura 12, p. 76) Tabela 7 -(Continuação).
	apresentou 13 sinais que foram atribuídos á 15 carbonos, sendo eles: 7 sinais para 8 5,87 (1H; d; J = 2,4 Hz) 97,18 5,88 (1H; d; J = 2,0 Hz) 97,05
	carbonos não hidrogenados (-C), 7 sinais para carbonos metínicos (-CH), e 1 sinal para
	carbono metilênico (-CH2). Os sinais registrados mais relevantes foram o deslocamento 9 -164,80 -165,40
	do carbono oximetínico C-2 em δC 80,70, do carbono metilênico C-3 em δC 44,25 e da
	carbonila em δC 197,92 indicando a presença de hidroxilação em C-5 devido a formação 10 -101,62 -103,30
	de ligação de hidrogênio intramolecular (OLVEIRA, 2009). A principal diferença da 1' -131,32 -131,00
	substância VD-2 para VD-1, é a ausência do sinal da metoxila em δC 55,75. Os demais
	sinais de RMN de 1 H e 13 C estão compilados na Tabela 7. 2' 7,31 (2H; d; J = 8,4 Hz) 129,25 7,30 (2H; d; J = 8,5 Hz)	129,02
	3'	Após a análise dos dados espectrais de RMN de 1 H e 13 C e comparação com os 6,81 (2H; d; J = 8,4 Hz) 116,55 6,81 (2H; d; J = 8,0 Hz) 116,33
	dados da literatura, foi possível identificar a substância VD-2 como sendo 4',5,7-
	4'	-	159,28	-	159,01
	5'	6,81 (2H; d; J = 8,4 Hz)	116,55	6,81 (2H; d; J = 8,0 Hz)	116,33
	6'				
	C	VD-2		Naringenina	
		δH	δC	δH	δC
	2	5,34 (1H; dd; J=12,8 e 2,8 Hz)	80,70	5,33 (1H; dd, J=13,0 e 3,0 Hz)	80,47
	3	3,11 (1H; dd; J=17,2 e 12,8 Hz)	44,25	3,10 (1H; dd; J=17,0 e 13,0Hz)	44,02
	espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) (Figuras 9-11, p. 75) da substância VD-2,70 (1H; dd; J =17,2 e 2,8 Hz) 2,69 (1H; dd; J =17,0 e 3,0 Hz)
	2 foi bastante semelhante ao espectro da substância VD-1, onde foram observados três 4 -195,40 -197,70
	deslocamentos em δH 5,34 (dd; 1H; J = 12,8 Hz e J = 2,8 Hz), δH 3,11 (dd; 1H; J= 12,8
	Hz e J= 17,2 Hz) e em δH 2,70 (dd; 1H; J = 17,2 Hz e J = 2,8 Hz), característicos dos 5 -165,16 -164,80
	hidrogênios carbinólico e metilênicos de flavanona. Este mesmo espectro mostrou ainda
	dois dupletos, um em δH 7,31 (H-2' e H-6') e outro em δH 6,81 (H-3' e H-5'), ambos 6 5,88 (1H; d; J = 2,4 Hz) 96,41 5,89 (1H; d; J = 2,0 Hz) 96,16
	com integral para dois hidrogênios cada, característico de sistema AA'BB' do anel B de 7 -168,44 -168,30

um flavonoide. Além da ausência de um simpleto integrando para três hidrogênios em δH 3,80 (4'-OCH3), o que diferencia essa substância da VD-1 (OLVEIRA, 2009). trihidroxiflavanona, ou naringenina (SILVA et al., 2013), isolada pela primeira vez na espécie em estudo, porém já relatada no gênero Varronia. Tabela 7 -Dados de RMN de 1 H, 13 C (400 e 100 MHz, CD3OD) de VD-2, 4',5,7-7,31 (2H; d; J = 8,4 Hz) 129,25 7,30 (2H; d; J = 8,5 Hz) 129,02

Dados de RMN de 1 H, 13 C (400 e 100 MHz, CD3OD) de VD-5, ramnocitrina, em comparação aos dados obtidos por BODAKHE et al. (2012) (300 e 75 MHz, CD3OD).

  

	No espectro de RMN de 13 C APT (100 MHz, CD3OD) (Figura 30, p. 93), Tabela 10 -(Continuação).
	foram observados 5 sinais, os quais foram atribuídos a 7 carbonos, sendo eles 6
	7	-	167,16	-	167,07
	carbonos metínicos (-CH) e 1 carbono metoxilíco (-OCH3).	
	8	A inserção da metoxila foi indicada pelo espectro de HMBC (Figuras 31-33, p. 6,59 (1H, d, J = 2 Hz) 92,74 6,49 (1H, d, J = 1,5 Hz) 92,73
	94), onde foi possível observar a correlação entre os sinais dos hidrogênios em δH 3,87 9 -158,30 -158,15
	com o sinal do carbono δC 167,16, deslocamento que também teve correlação com os
	sinais dos hidrogênios δH 6,30 (H-6) e δH 6,59 (H-8), indicando então que o sinal em δC 10 -105,51 -105,46
	167,16 seria do carbono C-7, onde a metoxila estaria inserida. Sendo assim, as posições
	1'	-	123,77	-	123,65
	C-5 (δC 162,34), C-3 (sinal não identificado) e C-4' (δC 177,76) estariam hidroxiladas.
	Os outros sinais dos carbonos que não apareceram no espectro de RMN de 13 C, foram 2' 8,11 (2H, d, J = 8,8 Hz) 130,79 8,07 (2H, d, J = 7,8 Hz) 130,75
	atribuídos de acordo com as correlações observadas no mapa de contorno do espectro de
	HMBC (Figura 34, p. 95). 3' 6,91 (2H, d, J = 8,8 Hz)	116,35	6,87 (2H, dd, J = 7,8 Hz)	116,39
	4'	-	160,78	-	160,83
	5'	6,91 (2H, d, J = 8,8 Hz)	116,35	6,87 (2H, dd, J = 7,8 Hz)	116,39
	6'				
	7-OCH3	3,87 (3H, sl)	56,45	3,83 (3H, s)	56,47
					No
	espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CD3OD) (Figuras 27-29, p. 92), foi possível
	observar dois dupletos, cada um integrando para dois hidrogênios, característicos de um C VD-5 Rhamnocitrin
	anel B de um flavonoide com um sistema AA'BB'. Estes sinais foram δH 8,11 (2H, d, J δH δC δH δC
	= 8,8 Hz) atribuído aos hidrogênios H-2' e H-6' e δH 6,91 (2H, d, J = 8,8 Hz) atribuído
	aos hidrogênios H-3' e H-5'. Além disso foi possível observar no mesmo espectro, dois 2 -148,70 -146.97
	dupletos, um em δH 6,30 (1H, d, J = 2 Hz) e outro em δH 6,59 (1H, d, J = 2 Hz), os quais
	foram atribuídos aos prótons H-6 e H-8 do anel A do possível flavonoide, típico de
	acoplamento meta. Não foi atribuído nenhum sinal característico de hidrogênio H-3, 3 -nd* -136,73
	sugerindo que houvesse uma substituição no carbono C-3, no anel C deste flavonoide. 4 -nd* -177,33
	Um simpleto em δH 3,87 (3H), foi atribuído aos hidrogênios de uma metoxila,
	5	-	162,34	-	162,19
	6	6,30 (1H, d, J = 2 Hz)	98,59	6,23 (1H, d, J = 1,5 Hz)	98,58

corroborando com os dados observados no espectro de RMN de 13 C. Sendo assim, haveria então três possibilidades de inserção desta metoxila, no C-3, no C-4' ou ainda no C-8. Após a análise dos dados espectrais de RMN de 1 H e 13 C e comparação com os dados da literatura (Tabela 10), foi possível identificar a substância VD-5 como sendo 3,4',5-trihidroxi-7-metoxiflavona, ou ramnocitrina

[START_REF] Bodakhe | Anticataract activity of rhamnocitrin isolated from Bauhinia variegata stem bark[END_REF]

, isolada pela primeira vez na espécie Varronia dardani. Tabela 10 -8,11 (2H, d, J = 8,8 Hz) 130,79 8,07 (2H, d, J = 7,8 Hz) 130,75 nd* -não detectado Ramnocitrina (VD-6)

Dados de RMN de 1 H, 13 C (500 e 125 MHz, CD3OD) de VD-6, ácido rosmarínico em comparação aos dados obtidos por ELSBAEY et al. (2022).

  respectivamente. Ainda foram observados os sinais em δC

	Tabela 11 -C	VD-6		Ácido rosmarínico
		δH		δC	δH	δC
	1	-		127,70	-	127,7
	2	7,06 (1H, d, J = 2 Hz)	115,19	7,04 (1H, sl)	115,2
	3	-		146,81	-	146,8
	4	-		149,71	-	149,7
	5	6,79 (1H, d, J = 8,5 Hz)	116,29	6,78 (1H, d, J = 8 Hz)	116,5
	6	6,97 (1H, dd, J = 2 e 8,5 Hz)	123,12	6,95 (1H, dd, J = 8 Hz)	123,1
	7	7,55 (1H, d, J = 16 Hz)	147,60	7,54 (1H, d, J = 16 Hz)	147,5
	8	6,28 (1H, d, J = 16 Hz)	114,54	6,26 (1H, d, J = 16 Hz)	114,6
	9	-		168,50	-	168,5
	1'	-		129,46	-	129,5
	147,60 e 114,54, os quais corresponderam aos carbonos olefínicos C-7 e C-8,
	respectivamente. Os sinais em δC 38,02 e 74,91 foram atribuídos aos carbonos C-7' e C-2' 6,77 (1H, d, J = 2 Hz) 117,55 6,75 (sl) 117,6
	8', respectivamente. Os demais sinais estão compilados na Tabela 11 (p. 96). 3' -146,15 -	146,1
	4'	Após comparação dos dados de RMN de 1 H e de 13 C de VD-6 com os dados -145,25 -145,2
	descritos na literatura (ELSBAEY et al., 2022), foi possível definir que VD-6 se tratava
	do ácido rosmarínico, isolado pela primeira vez na espécie Varronia dardani. 5' 6,71 (1H, d, J = 8 Hz) 116,27 6,69 (1H, d, J = 8 Hz)	116,3
	6'	6,63 (1H, dd, J = 2 e 8 Hz)	121,78	6,62 (1H, dd, J = 8 Hz)	121,8
	7'	3,11 (1H, dd, J = 14,5 e 4,5 Hz) 3,02	38,02	3,10 (1H, dd)	38,1
		(1H, dd, J = 14,5 e 8,5 Hz)		
					3,00 (1H, dd)
					5,12 (1H, dd)
	8'	5,19 (1H, dd, J = 4 e 8,5 Hz)	74,91		74,6
					-
	9'	-		173,87		168,5

  No espectro de RMN de 1 H (400 MHz, CDCl3) (Figuras 50-52, p. 124) observaram-se dois sinais mais desprotegidos, um em δH 12,38 e δH 11,49, cada um integrando para um hidrogênio, sendo já conhecidos como hidrogênios quelados com carbonilas de um núcleo básico de antraquinonas e naftoquinonas (BORGATI, DE

	21,64) e C-4a (δH 1,16 e δC 19,78). As posições das hidroxilas queladas foram
	estabelecidas através das correlações entre os sinais em δH 11,49 (5-OH) e δC 204,40
	(C-10); e δH 12,38 (8-OH) e δC 206,27 (C-9) à quatro ligações (WISETSAI,
	LEKPHROM & SCHEVENELS, 2019; JI et al., 2022).Com base nesses dados e em
	SOUZA & DE OLIVEIRA, 2019; PROCHÁZKOVÁ et al., 2020). Ainda o espectro de comparação com estruturas semelhantes encontradas na literatura (Tabela 15), foi
	RMN de 1 H foi observado apenas um sinal na região de próton aromático, integrando possível a elucidação estrutural da substância VD-R-1, a qual recebeu o nome de
	para um hidrogênio, em δH 6,62 (s). Os dados espectroscópicos revelaram também a vardanona.
	presença de um anel aromático 1,2,3,4,6-pentassubstituído. Foi observado um simpleto
	em δH 3,93, integrando para três hidrogênios, o qual foi relacionado à presença de uma
	metoxila. Assim sendo, pelo espectro de RMN de 1 H, foi possível sugerir que o Tabela 15 -Dados de RMN de 1 H, 13 C (400 e 100 MHz, CDCl3) de VD-R-1,
	5,8-dihidroxi-6-metoxi-1,4a-dimetil-1,2,3,4,4a,9,9a,10-esqueleto da substância VD-R-1 se assemelhava ao de uma antraquinona, metoxilada (JI octahidroantraceno-9,10-diona (vardanona).
	et al., 2022).					
	Posição	δH	δC	Posição	δH	δC
	O espectro de RMN de 13 C APT (100 MHz, CD3OD) (Figura 53, p. 126) do
	composto VD-R-1 apresentou 17 sinais que foram atribuídos a 17 carbonos, sendo eles: 1 2,05 (1H, m) 27,07 8a -105,22
	8 sinais para carbonos não hidrogenados (-C), 3 sinais para carbonos metínicos (-CH), 3 2 1,67 (1H, m) 34,80 9a 2,59 (1H, d, J = 10,8 Hz) 59,22
	sinais para carbonos metilênicos (-CH2), 2 sinais para carbonos metílicos (-CH3) e 1
	sinal para carbono metoxilíco (-OCH3). Os três deslocamentos característicos de 3 1,48 (1H, m) 20,14 9 -206,27
	carbonos metilênicos, δC 34,80, δC 20,14 e δC 32,42, foram atribuídos respectivamente 0,95 (1H, m)
	aos carbonos C-2, C-3 e C-4, do anel "A", o que indicou a ausência de insaturação do
	mesmo. Os outros carbonos do mesmo anel foram sugeridos através dos sinais em δC 4 2,05 (1H, m) 32,42 10 -204,40
	27,07, δC 48,16 e δC 59,22, os quais foram atribuídos aos carbonos C-1, C-4a e C-9a. 1,80 (1H, dd, J = 3,6 e 14 Hz)
	No mesmo espectro, foram observados sinais de carbonos aromáticos não hidrogenados 4a -48,16 11 1,17 (3H, s) 21,64
	em δC 115,19, δC 144,07, δC 156,42, δC 158,08 e δC 105,22, os quais foram atribuídos
	respectivamente aos carbonos C-5a, C-5, C-6, C-8 e C-8a do anel "C". O carbono C-7 5 -144,07 12 1,16 (3H, d, J = 6,9 Hz) 19,78
	do mesmo anel foi sugerido pelo sinal em δC 106,00. Ainda no espectro de RMN de 13 C
	foram observados dois sinais característicos de carbono de carbonila, um em δC 206,27 5a -115,19 6-OMe 3,93 (3H, s) 56,50
	e outro em δC 204,40, atribuídos aos carbonos C-9 e C-10, respectivamente (BORGATI, 6 -156,42 5-OH 11,49 (1H, s) -
	DE SOUZA & DE OLIVEIRA, 2019; PROCHÁZKOVÁ et al., 2020; JI et al., 2022).
	7	6,62 (1H, s)	106,00	8-OH	12,38 (1H, s)	-
	No mapa de contorno do espectro de HMBC (Figuras 54-56, p. 126), foi
	possível observar a correlação entre os sinais dos hidrogênios em δH 3,93 com o sinal do
	carbono δC 156,42, indicando que a metoxila estaria inserida no carbono C-6, no anel
	"C" (LI, LI & WANG, 2018). Ainda no mesmo mapa de contorno, foram observadas
	correlações, que indicaram a inserção de uma metila nos carbonos C-1 (δH 1,17 e δC

Tabela 16 -Resumo dos parâmetros correspondentes aos resultados obtidos para o modelo elaborado com os descritores Dragon 7.

  

		.2.12.1. Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR)		
		Para realizar a triagem virtual baseada no ligante (Ligand Based), um modelo de
	predição foi construído usando o algoritmo Random Forest (RF). Para a construção
	desse modelo, foram calculados descritores moleculares para o banco de moléculas com
	atividade inibitória conhecida para a linhagem de células A2058, obtido através do
	banco de dados ChEMBL.							
		O modelo de RF foi avaliado quanto ao seu poder preditivo, utilizando os
	parâmetros de especificidade, sensibilidade, precisão, exatidão (AUC), valor predito
	positivo (PPV) e valor predito negativo (NPV), além de desempenho e robustez, como
	também pela curva Receiver's Operating Characteristic (ROC) e coeficiente de
	correlação de Mathews (MCC). A Tabela 16 descreve as características dos modelos,
	em termos de poder preditivo e robustez, e a Figura 57 (p. 129) mostra o desempenho
	do modelo. De acordo com os resultados, foi observado que o modelo apresentou uma
	ótima classificação, desempenho e robustez.					
	Linhagem Validação Specificidade	Sensibilidade Acurácia PPV NPV MCC AUC
	A2058	Test	0.78	0.70	0.74	0.76	0.70	0.53	0.84
		Cross	0.70	0.76	0.73	0.72	0.75	0.51	0.83

Figura 57 -Curva Receiver operating characteristic (ROC) gerada para o modelo Random Forest (RF) com os descritores Dragon 7. Legenda: (A) Teste e (B) Cross Validation.

  Após a validação do modelo, o conjunto de isômeros do extrato de V. dardani(Taroda) foi analisado quanto à atividade na linhagem celular A2058, utilizando o modelo de predição elaborado. Como o modelo elaborado demonstrou um bom

	Tabela 17 -
	desempenho, este foi utilizado para selecionar a conformação potencialmente ativa para
	a linhagem celular A2058.
	O algoritmo RF possibilitou selecionar compostos com potencial ativo, que
	apresentassem probabilidades ≥50% para a linhagem celular A2058 (Tabela 17, p. 129).
	Dessa forma, todas as configurações em estudo apresentaram probabilidades acima de
	50%, sendo possível classificá-las como potencialmente ativas, visto que, as
	probabilidades obtidas variaram entre 54% e 60%, tendo o composto 08 obtido a
	probabilidade mais alta (60%). Além disso, o domínio de aplicabilidade foi confiável
	para todas as conformações em estudo, demonstrando que os compostos se encontram
	no espaço químico do modelo elaborado. Dessa forma, segundo os resultados
	demonstrados, as conformações obtidas no extrato de V. dardani (Taroda) são
	potencialmente ativas para a linhagem celular A2058.

Probabilidade de atividade dos isômeros de V. dardani (Taroda) contra a linhagem de células A2058 avaliadas pelo algoritmo Random Forest (RF). Em negrito encontram-se destacados os compostos considerados ativos pelo modelo.

  

	estruturas de partida e os resultados da validação de redocking são mostradas na Tabela
	18.			
	Composto Tabela 18 -	Probabilidade (%)	Aplicabilidade (DA) Domínio de	Predição
	01	56	Confiável	Ativo
	02	54	Confiável	Ativo
	03	58	Confiável	Ativo
	04	54	Confiável	Ativo
	05	55	Confiável	Ativo
	06	55	Confiável	Ativo
	07	57	Confiável	Ativo
	08	60	Confiável	Ativo
	Legenda: Em negrito, compostos com probabilidade acima de 50%. Em vermelho, composto com
	probabilidade mais alta.			
	5.2.12.2. Docking molecular		
	Os isômeros de V. dardani (Taroda) foram submetidos ao rastreio por meio de
	Docking molecular em 3 proteínas correspondentes ao receptor de tubulina. Os
	resultados de docking foram gerados usando três funções de pontuação, o MolDock
	Score, o Rerank Score e o PLANTS Score. Valores mais negativos indicaram melhores
	previsões para a maioria das funções de pontuação. A proteína em que o composto
	obteve valores de energia de ligação menor ou próximo aos controles positivos em pelo
	menos uma função de pontuação foi considerada ativa.	
	Os resultados de docking gerados pelas três funções de pontuação foram
	validados pelo redocking do ligante cristalográfico com as três proteínas investigadas.
	Os desvios da raiz quadrada média (RMSDs) das poses de ajuste obtidas foram
	calculados em comparação com a estrutura cristalina. Os valores RMSD inferiores a 2
	Å indicam um grau ideal de confiabilidade de triagem. As informações sobre as

Valores de RMSD para as proteínas selecionadas no estudo.

  

	Proteína (PDB)	Ligante PDB	Score Ligante	Score Redocking	RMSD
	Complexo de tubulina e	Colchicina	-132.624	-132.546	0.19
	colchicina (PDB: 4O2B)				
	Complexo T2R-TTL-	Nodoconazol	-116.528	-118.812	0.27
	Nocodazol (PDB: 5CA1)				
	Complexo tubulina-	Vimblastina	-138.838	-141.864	0.34
	vimblastina (PDB: 5J2T)				
	Docking.				
	A posição espacial dos ligantes redocados com as respectivas enzimas, como
	também a posição destes co-cristalizados com as enzimas encontra-se ilustrados na
	Figura 58 (p. 132).				

Durante a análise de redocking, todos os valores RMSD estavam abaixo de 2,0 Å, ou seja, as poses geradas posicionaram o ligante corretamente no local ativo. Dessa forma, o programa forneceu valores considerados satisfatórios para a validação do

Tabela 19 -Valores de pontuação e probabilidade de atividade dos compostos em estudo para a enzima complexo Tubulina-Colchicina (PDB: 4O2B).

  

	Tabela 20 -							
	Composto	Moldock Score	(p) Moldock Score	Rerank Score	(p) Rerank Score	PLANTS Score	(p) PLANTS Score	(p) Enzima
	01	-87.358	0.67	-64.314	0.59	-425.577	0.93	0.73
	02	-88.166	0.68	-53.779	0.50	-428.372	0.94	0.70
	03	-96.172	0.74	-69.497	0.64	-434.019	0.95	0.78
	04	-91.805	0.71	-73.537	0.68	-428.937	0.94	0.78
	05	-88.469	0.68	-54.105	0.50	-427.626	0.93	0.71
	06	-84.900	0.66	-14.714	0.13	-397.769	0.87	0.55
	07	-87.241	0.67	-52.554	0.48	-399.551	0.87	0.68
	08	-86.367	0.67	-49.228	0.45	-407.983	0.89	0.67
	Dacarbazina	-76.805	0.59	-56.636	0.52	-250.925	0.55	0.55
	Vemurafenibe	-128.483	1	-107.396	1	-455.299	1	1
	Legenda: Em negrito, os compostos com maior afinidade que o controle positivo, em vermelho encontra-
	se o melhor resultado.						
	Os resultados demonstrados na Tabela 19, informam que todos os compostos em
	estudo apresentaram Score negativo, indicando que ocorreu interação com o alvo em
	estudo. A maior afinidade foi obtida pelo controle positivo Vemurafenibe, o qual obteve
	a maior probabilidade em todos os algoritmos em estudo, como também obteve a maior
	probabilidade total na enzima, resultando em 1. Em relação ao controle positivo
	Dacarbazina, os compostos em estudo apresentaram maior afinidade, visto que, a
	probabilidade total obtida para este composto correspondeu a 0.55, enquanto que sete
	conformações apresentaram valores totais superiores, correspondendo a: C08 (p = 0.67),
	C07 (p = 0.68), C02 (p = 0.70), C05 (p = 0.71), C01 (p = 0.73) e C03 e C04 (p = 0.78).
	O Composto 06 apresentou probabilidade total igual ao valor obtido pelo controle
	Dacarbazina. Isso demonstra uma maior afinidade dos compostos em estudo quando
	comparado ao controle positivo Dacarbazina. A Tabela 20 (p. 134) mostra os resultados
	obtidos para o Complexo T2R-TTL-Nocodazol (PDB: 5CA1).		

Valores de pontuação e probabilidade de atividade dos compostos em estudo para a enzima Complexo T2R-TTL-Nocodazol (PDB: 5CA1).

  

	Tabela 21 -							
	Composto	Moldock Score	(p) Moldock Score	Rerank Score	(p) Rerank Score	PLANTS Score	(p) PLANTS Score	(p) Enzima
	01	-93.689	0.67	-58.258	0.63	-422.181	0.84	0.71
	02	-100.75	0.72	-79.477	0.87	-453.846	0.90	0.83
	03	-101.851	0.72	-38.915	0.42	-423.294	0.84	0.66
	04	-103.078	0.73	-63.657	0.69	-427.217	0.85	0.76
	05	-91.215	0.65	1.631	0	-436.063	0.86	0.50
	06	-91.089	0.65	-4.287	0.04	-435.117	0.86	0.52
	07	-93.304	0.66	-3.100	0.03	-436.23	0.87	0.52
	08	-95.849	0.68	-23.188	0.25	-445.557	0.88	0.60
	Dacarbazina	-95.366	0.68	-61.226	0.67	-299.338	0.59	0.65
	Vemurafenibe	-139.65	1	-91.206	1	-501.25	1	1
	Legenda: Em negrito, os compostos com maior afinidade que o controle positivo, em vermelho encontra-
	se o melhor resultado.						
	Para o Complexo T2R-TTL-Nocodazol (Tabela 20), os resultados demonstrados,
	informam que a maioria dos compostos em estudo apresentou Score negativo, indicando
	que ocorreu interação com o alvo em estudo. A maior afinidade foi obtida pelo controle
	positivo Vemurafenibe, o qual obteve a maior probabilidade em todos os algoritmos em
	estudo, como também obteve a maior probabilidade total na enzima, resultando em 1.
	Em relação ao controle positivo Dacarbazina, três compostos em estudo apresentaram
	maior afinidade, visto que, a probabilidade total obtida para este composto
	correspondeu a 0.65, enquanto que três conformações apresentaram valores totais
	superiores, correspondendo a: C03 (p = 0.66), C01 (p = 0.71), C04 (p = 0.76) e C02 (p
	= 0.83). Isso demonstra uma maior afinidade dos compostos em estudo quando
	comparado ao controle positivo Dacarbazina. A Tabela 21 (p. 136) mostra os resultados
	obtidos para o Complexo tubulina-vimblastina (PDB: 5J2T).		

Valores de pontuação e probabilidade de atividade dos compostos em estudo para a enzima Complexo tubulina-vimblastina (PDB: 5J2T).

  

	Tabela 22 -							
	Composto	Moldock Score	(p) Moldock Score	Rerank Score	(p) Rerank Score	PLANTS Score	(p) PLANTS Score	(p) Enzima
	01	-44.542	0.63	-34.122	0.73	-214.103	0.70	0.68
	02	-42.506	0.60	-30.823	0.66	-211.982	0.69	0.65
	03	-40.475	0.57	-26.441	0.56	-217.866	0.71	0.61
	04	-37.229	0.52	-25.12	0.53	-217.876	0.71	0.59
	05	-41.419	0.58	-31.821	0.68	-217.418	0.71	0.66
	06	-49.802	0.70	18.224	0	-208.557	0.68	0.46
	07	-51.641	0.73	13.673	0	-210.239	0.69	0.47
	08	-49.824	0.70	17.853	0	-209.224	0.68	0.46
	Dacarbazina	-68.113	0.96	-46.598	1	-133.845	0.44	0.80
	Vemurafenibe	-70.5269	1	-37.224	0.79	-303.969	1	0.93
	Legenda: Em negrito, os compostos com maior afinidade que o controle positivo, em vermelho encontra-
	se o melhor resultado.						
	Para o Complexo Complexo tubulina-vimblastina, os resultados demonstrados
	na Tabela 21, informam que a maioria dos compostos em estudo apresentou Score
	negativo, indicando que ocorreu interação com o alvo em estudo. A maior afinidade foi
	obtida pelo controle positivo Vemurafenibe, o qual obteve a maior probabilidade total
	na enzima, resultando em 0.93. Os isômeros em estudo, não apresentaram afinidade
	maior que os controles positivos selecionados para este alvo, visto que a Dacarbazina
	apresentou a segunda maior probabilidade correspondendo a 0.80. Dessa forma, pode-se
	perceber que os isômeros do extrato de V. dardani apresentam uma maior probabilidade
	de afinidade para os alvos complexo Tubulina-Colchicina e Complexo T2R-TTL-
	Nocodazol.							
	Como todos os alvos em estudo correspondem a receptores de Tubulina, então
	foi realizado o cálculo da média total para esse receptor, por meio da soma da

probabilidade obtida para cada uma das enzimas e divisão pelo número de alvos em estudo. Os resultados encontram-se na Tabela 22 (p. 136).

Valores de probabilidade de atividade dos compostos em estudo para o Complexo de tubulina.

  

		(p)		(p)	
	Composto	Complexo Tubulina-Colchicina	(p) Complexo T2R-TTL-Nocodazol (PDB: 5CA1)	Complexo tubulina-vimblastina	(p) Total Complexo de Tubulina
		(PDB: 4O2B)		(PDB: 5J2T)	
	01	0.73	0.71	0.68	0.71
	02	0.70	0.83	0.65	0.73
	03	0.78	0.66	0.61	0.68
	04	0.78	0.76	0.59	0.71
	05	0.71	0.50	0.66	0.62
	06	0.55	0.52	0.46	0.51
	07	0.68	0.52	0.47	0.56
	08	0.67	0.60	0.46	0.58
	Dacarbazina	0.55	0.65	0.80	0.67
	Vemurafenibe	1	1	0.93	0.97
	Legenda: Em negrito, os compostos com maior afinidade que o controle positivo, em vermelho encontra-
	se o melhor resultado.				

µg/mL (A), 0,1-729 µg/mL (B). OCI = ocitocina, KCl = cloreto de potássio.Fonte: Autor, 2022.

-158,08

para os diferentes agonistas testados, apresentando maior potência no útero de ratos. Da fração acetato de etila do EEB-VD foi possível o isolamento e identificação de cinco flavonoides, sendo três agliconas (isosakuranetina, naringenina e ramnocitrina) e dois glicosilados (astragalina e isoquercitrina), de quimioinformática, onde o conjunto de isômeros dessa substância foi analisado quanto à atividade na linhagem celular A2058 e foram observadas algumas interações entre resíduos de aminoácidos, comparando com o controle positivo dacarbazina e vemurafenibe, drogas utilizadas V. leucocephala, de onde foi possível isolar uma saikosaponina, já isolada ateriormente na espécie.

ANNEXES

ANNEXE 2 -Article "Flavonoids from Varronia dardani (Taroda) J.S. Mill (Cordiaceae) and the evaluation of spasmolytic activity of its crude ethanolic extract (2020)"