chim.anal
Cavalcante Ferreira 
  
Junior Genildo 
  
Merci À Laura 
  
Dra Minjie Zhao 
  
Meus Sinceros 
  
Prof. Dr Nascimento Ticiano 
  
Gomes Por Sua 
  
Sônia Diane 
  
Mamandou, Kamar, Randa, Yasmine, Ikram Justine E Ye 
  
Professora Dra 
  
Cristina Maria 
  
Delgado 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
Keywords: Produits avancés de glycation, carboxymethyllisine, pentosidine, pyrralina, colonne SPE échange Advanced glycation endproducts, carboxymethyllysine, pentosidine, pyrraline. ion exchange SPE column, LC-MS Produtos de glicação avançada, carboximetilina

Analyse simultanée de carboxymethyllysine, pentosidine et pyrraline dans les produits laitiers par LC-MS/ESI (Q-TOF) après purification et concentration en phase solide (SPE) par échange d'ions

Résumé Les produits de réaction de Maillard apportent des caractéristiques organoleptiques souhaitables aux aliments (couleur, odeur et le goût), contribuant ainsi à leur acceptabilité par le consommateur. Toutefois, plusieurs effets délétères physiopathologiques (vieillissement, diabètes) ont été attribués aux produits de glycation avancés (AGE). Le but de ce travail a concerné la détermination simultanée par LC-MS/ESI (Q-ToF) des carboxyméthyllysine (CML), pentosidine (Pen) et pyrraline (Pyr) dans des échantillons de lait chauffés ou non, après purification et concentration en phase solide (SPE) par échange d'ions. Les échantillons de lait en suite ont été soumis à une hydrolyse acide avec HCl à 37%, une précipitation des protéines avec un mélange méthanol/acétone et une digestion enzymatique des protéines pendant 30 heures à 37°C. Après l'étape d'extraction, les échantillons ont été concentrés/purifiés par SPE avec cartouches échangeuses d'ions puis analysés par LC-MS/ESI (Q-ToF). Les cartouches d'échange d'ions ont permis d'obtenir une excellente récupération des AGEs (89%, 95% et 117% pour la CML, Pen et Pyr, respectivement), valeurs bien plus élevées que celles qui ont pu être obtenues avec des cartouches de type C18. La concentration/purification par SPE est une étape qui mérite une attention particulière pour la détermination et quantification des AGEs. Parmi les AGEs analysés, seule la Pyr a pu être retrouvée dans des échantillons de lait et celà à des valeurs comprises 0,021 ng/mg de protéines (lait écrémé) et 8,367 ng/mg (lait stérilisé).

Introduction

Les produits finaux de glycation avancée (AGEs) peuvent être formés dans les aliments lors d'un traitement thermique et/ou lors de leur stockage. Ces produits ont été signalés avec nombreux effets pathologiques. Parmi ces molécules, certaines sont bien caractérisées dans les aliments et ont fait l'objet de plusieurs publications dans la littérature scientifique. Il s'agit essentiellement des N-ɛ-(carboxymethyl)lysine (CML), pentosidine (Pent) et pyrraline (Pyr) (Zhang et al., 2011;[START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF].

Pour quantifier ces AGEs dans les aliments, des techniques chromatographiques, telles que GC/MS, LC/UV ou LC/MS ont été largement utilisées [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF].

En préalable à l'analyse chromatographique, les échantillons doivent être purifiés par extraction en phase solide (SPE). La cartouche SPE la plus propsée dans la littérature est constituée d'une phase inverse, le plus souvent de type C18. 

Traitement des échantillons de lait

Les AGEs se trouvent soit sous forme libre soit sous une forme conjuguée avec des protéines présentes dans le lait en poudre. Afin de quantifier ces différentes formes des AGEs, les échantillons de lait ont été soumis à différentes méthodes de préparation des échantillons:

-Une hydrolyse acide avec de l'HCl à 37% pendant 24 heures et à 110°C, destinée à quantifier la totalité des AGEs (libres + conjugués).

-Une précipitation des protéines alimentaires avec un mélange méthanol/acétone (v:v) pendant 1 heure à -20°C, afin de quantifier uniquement les AGEs libres.

-Une digestion enzymatique à l'aide d'un mélange de pepsine, de pronase E, de leucine aminopeptidase et de prolidase, pendant 30 heures à 37°C, en vue de quantifier les AGEs totaux (libres + conjugués).

A la fin de chaque traitement, les différents échantillons ont été purifiés et concentrés par SPE.

Les échantillons ont été soumis à une étape de concentration et de purification, en utilisant des cartouches de deux types : C18 (Oasis HLB 6cc, 200 mg, Waters, Milford, MA, USA) et échange d'ions (Polyclean 30HCX,Interchim,Montluçon,Fr).

La cartouche C18 a été préconditionnée avec 4 mL de MeOH, puis 4 mL d'acide nonafluoropentanoique (ANFP, 10 mM) avec un débit de 2 mL/min. Les échantillons ont alors été déposés sur la cartouche à un débit de 0.5 ml/min. Celle-ci a été lavée successivement avec une fraction aliquote de 4 mL d'ANFP (10 mM) et avec 4 mL d'un mélange d'ANFP (10 mm)/MeOH (v/v; 95%:5%). Enfin, les fractions contenant AGEs ont été éluées avec 4 mL d'un mélange MeOH/ANFP 10 mM (v/v; 90%:10%) avec un débit de 0,5 mL/min. La cartouche 30HCX a été préconditionnée avec 3 mL de MeOH, puis 3 mL d'eau milliQ acidifiée avec de l'acide formique à 0,1%. Un millilitre (1 mL) de l'échantillon a été déposé sur la cartouche à un débit de 0. 5 mL/min. Celle-ci a été lavée avec 3 mL d'eau milliQ acidifiée avec acide formique à 0,1% et 3 mL d'acetronitrile. Enfin, les composés cibles ont été élués avec 3 mL d'un mélange acétronitrile/ammoniaque (v/v; 95%:5%), puis avec 3 mL d'un mélange MeOH/ammoniaque (v/v ; 95%:5%) avec un débit de 0.5 mL/min. Après l'étape SPE, les échantillons ont été évaporés à sec à l'aide d'un léger flux d'azote et le résidu obtenu a été reconstitué avec une solution aqueuse à 0,1% d'acide trifluoroacétique (TFA) et filtré avec un filtre (0,45 μm). Les filtrats ainsi obtenus ont été analysés par UPLC-ESI-Qq-TOF.

Analyse des AGEs par UPLC-ESI-Qq-TOF

iii Le chromatographe utilisé est de marque Waters (Aquity, UPLC). Il a été couplé avec un spectromètre de masse Qq-ToF de marque Bruker (μ-ToF). La séparation chromatographique a été réalisée avec une colonne Waters, ACQUITY UPLC HSS T3 (150 mm x 2,1 mm, 100 Å, 1,8 μm). La phase mobile était constituée de (A) eau MilliQ acidifiée avec 0,1% d'acide formique et de (B) acétonitrile acidifié avec 0,1% d'acide formique. Elle circulait avec un débit de 0,3 mL/min. L'élution a eté réalisée à l'aide d'un gradient décrit comme suit: 1-8% (0-3 min), 8-30% (3-8 min), 30% (8-13 min), 30-1% (13-13,5 min) et 1% (13,5-18 min). Le volume d'injection était de 2 μL. La détection en masse a été réalisée en mode positif (ESI).

Les autres conditions de masse ont été comme suit: tension du capillaire, 4,5 kV ; gaz de nébulisation (N 2 ), 2,8 bar ; gaz séchant (N 2 ), 9,0 L/min à 200 °C. Les spectres de masse ont été enregistrés entre m/z 100-600.

Les Pent et Pyr sont instables dans la source (Zhang et al., 2011, Troise et al., 2014). Les essais d'optimisation des conditions d'introduction et d'ionisation n'ont pas permis d'obtenir les ions moléculaires majoritaires. Par conséquent, le fragment d'intensité la plus importante a été choisi pour chaque composé. Il s'agissait des m/z 135,65 pour Pent et m/z 175,12 pour Pyr. En revanche, CML est stable dans la source et l'ion moléculaire m/z 205,12 a pu être utilisé pour la quantification. Un étalon interne (E.I.), la théophylline, a été utilisé pour minimiser les erreurs produites lors de l'étape de purification et aussi lors de la détection par spectrométrie de masse. En effet, cet étalon interne a été ajouté juste avant l'étape de SPE. L'ion moléculaire m/z 181,07 a été suivi (Fig. 1).

Temps de rétention (min)

Figure 1. Chromatogramme reconstruit des ions correspondant à CML m/z 205,12 (1,3 min); Pent m/z 135,65 (3,8 min); Pyr m/z 175,12 (5,7 min) et E.I. m/z 181,07 (6,8 min) d'une solution contenant un mélange des trois composés de référence. Selon [START_REF] Assar | Determination of Ne-(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[END_REF] et Zhang et al. (2011), en raison de la forte polarité des 3 AGEs, l'utilisation de colonnes de phase inverse telle que C18 nécessite d'un ajout de contre-ions, tel que l'ANFP dans la phase mobile. Cependant, la forte acidité de l'ANFP peut entraîner une détérioration rapide des colonnes de chromatographie [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF]. De plus, nos expériences au laboratoire ont prouvé que l'utilisation de l'ANFP dans la phase mobile génèrait une très forte contamination du 

Purification et concentration des AGEs par SPE

Deux types de cartouches SPE ont été testés pour la purification et la concentration des trois AGEs cibles à partir des échantillons de lait hydrolysés et digérés comme décrit dans le paragraphe concernant le traitement des échantillons.

Il s'agissait des cartouches de type phase inverse C18, et de type échangeur d'ion, polyclean 30HCX.

Les cartouches les plus utilisées dans la littérature pour purifier et concentrer les AGEs sont du type phase inverse C18. En raison de la forte polarité de ces AGEs, l'acide nonafluoropentanoïque (ANFP) est fréquemment ajouté dans la phase d'élution afin de former des sels entre ANFP et AGEs et ainsi augmenter l'affinité visà vis de la phase stationnaire [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF][START_REF] Assar | Determination of Ne-(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[END_REF]Niquet-Léridon & Tessier, 2011). Nous avons utilisé dans un premier temps ce type Nous avons ensuite testé les cartouches du type 30HCX, échangeur d'ions (cations). Ce type de phase stationnaire est spécifique pour retenir des composés cationiques tels que les 3 AGEs en milieu acide [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF]. Pendant le développement de la technique avec ces cartouches 30HCX avec une phase mobile methanolique, nous avons observé que le pic de la Pyr (tr = 5,7 min) a complètement disparu du le chromatogramme de la solution des standards ayant été soumis à l'étape de SPE, et qu'un nouveau pic est apparu (tr = 7,5 min) (Figure 2). L'analyse du spectre de masse de ce nouveau pic et sa comparaison avec le spectre de masse de la Pyr standard, nous a conduit à comprendre que ce nouveau pic correspondait à l'ester méthylique de la Pyr. Le spectre de masse du nouveau pic à tr = 7,5 min La teneur en pyralline dans le lait est exprimée en (µg d'AGEs/mg de protéines) :

𝑇𝑒𝑛𝑒𝑢𝑟 (µ𝑔/𝑚𝑔) = S2 S4 ⁄ S1 S3 ⁄ x C1 x 0,2 M V1 x V2
S 1 : surface du pic du standard de la pyrraline S 2 : surface du pic de la pyrraline dans le lait 

Conclusion générale

Il a été possible de développer une méthode d'analyse qui permet d'extraire, de purifier et de concentrer sur une phase solide les trois AGEs d'intérêt (CML, Pen et Pyr). Ces trois composés ont, de plus, pu être séparés et quantifiés de façon indépendante par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse à haute résolution (UPLC-ESI-Qq-ToF).

Les cartouches échangeuses de cations nous ont permis d'obtenir des taux de recouvrements très corrects lors de l'analyse des AGEs, puisqu'ils étaient bien supérieurs à ceux qui ont pu être obtenus avec des cartouches de type C18, habituellement utilisées pour la quantification des AGEs dans les aliments.

Cependant, il convient de faire preuve de beaucoup de prudence lors de l'élution de ces composés hors des cartouches de purification essentiellement lors de la Hegele, J., Buetler, T., [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF]. Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products. analytica chimica acta, 617, 85-96.

Niquet-Léridon, C., Tessier, F. J. ( 2011). Quantification of Ne-carboxymethyl-lysine in selected chocolateflavoured drink mixes using high-performance liquid chromatography-linear ion trap tandem mass spectrometry. Food Chemistry,126, 655-663.

Sun, X., Tang, J., [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF]. Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions.

Food Chemistry, 172, 802-807. [START_REF] Friedman | Food browning and its prevention: an overview[END_REF].

Os produtos da reação de Maillard correspondem a um grupo heterogêneo de compostos químicos, com ampla variação no peso molecular, formados em alimentos e em sistemas biológicos [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Nguyen | Toxicity of the AGEs generated from the Maillard reaction: On the relationship of food-AGEs and biological-AGEs[END_REF][START_REF] Charissou | Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples[END_REF]. Os compostos representativos dessa reação, que são encontrados em alimentos e em sistemas biológicos são: hidroximetilfurfural, furosina, carboximetilisina, pentosidina, carboxietilisina, pirralina, vesperlisina A, dímero de glioxal-lisina, dímero metilglioxal-lisina, glicosepana [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Nguyen | Toxicity of the AGEs generated from the Maillard reaction: On the relationship of food-AGEs and biological-AGEs[END_REF][START_REF] Xanthis | Advanced glycosylation end products and nutrition: a possible relation with diabetic atherosclerosis and how to prevent it[END_REF].

Os carbonilos reativos são compostos que contêm dois ou mais grupos carbonilo, sendo os mais comuns os dicarbonilos metilglioxal e o glioxal. Os carbonilos reativos também podem reagir com as proteínas gerando os produtos finais de glicação avançada -AGEs, do inglês Advanced Glycation end Products [START_REF] Wang | Phytochemicals from berries and grapes inhibited the formation of advanced glycation end products by scavenging reactive carbonyls[END_REF]. Esses carbonilos reativos podem ser formados no corpo humano ou nos alimentos [START_REF] Wang | Phytochemicals from berries and grapes inhibited the formation of advanced glycation end products by scavenging reactive carbonyls[END_REF]. A reação de glicação avançada pode ocorrer in vivo, pela via do estresse carbonílico, na qual a oxidação de lipídeos ou de açúcares gera compostos dicarbonílicos intermediários altamente reativos.

A glicólise e a autoxidação de glicose, por exemplo, produzem metilglioxal e glioxal, os quais interagem com aminoácidos para formar produtos finais dessa reação [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Monnier | Dietary advanced lipoxidation products as risk factors for human health: a call for data[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF] [START_REF] Charissou | Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples[END_REF][START_REF] Uribarri | Advanced glycation end products in foods and a practical guide to their reduction in the diet[END_REF]. No caso do leite, em se tratando de uma matriz complexa, etapa de purificação usando extração em fase sólida (SPE -Solid Phase Extraction) é de suma importância para análise de AGEs.

(
A utilização do leite na dieta alimentar ocorre, principalmente pelo fato deste produto ser fonte de nutrientes essenciais à promoção do crescimento e da manutenção da vida. Devido à essa riqueza de nutrientes, associado ao processo tecnológico de beneficiamento, o leite se torna um excelente substrato para a formação de produtos finais da reação de Maillard. Pacientes portadores de doenças crônicas não transmissíveis como os diabéticos, podem ter seu estado de saúde agravado, uma vez que os AGEs contribuem para o aumento dos danos oxidativos nas células. Portanto, a correta quantificação do conteúdo desses produtos nos alimentos, principalmente no leite e seus derivados, é de suma importância para os indivíduos portadores de doenças crônicas não transmissíveis, umas vez que o pool endógeno de AGEs nestes indivíduos, podem ser aumentados por alimentos processados em altas temperaturas.

Ainda que, grande número de estudos tenham sido desenvolvidos com AGEs, e considerando a importância desses produtos para a saúde humana, bem como a dificuldade de quantificação simultâneas de um grande número de AGEs, este trabalho visa contribuir na otimização de métodos de quantificação simultânea de carboximetilisina, pentosidina e pirralina, com o uso de cartuchos de troca iônica, usando o leite como matriz de estudo.

OBJETIVOS

Geral

Estabelecer um método de analise completa (extração, purificação, separação e detecção) de três AGEs mais comum encontrados nos alimentos submetidos ao aquecimento (carboximetilisina, pentosidina e pirralina), usando o leite como matriz de estudo.

Específicos

 Desenvolver um método concentração e purificação de AGEs, em extração em fase sólida (SPE) por troca iônica;

 Comparar a influência de cartuchos C18 e 30HCX na taxa de recuperação de CML, Pen e Pyr.

 Desenvolver uma metodologia para análise de AGEs por LC-MS/ESI/Q-TOF;

 Identificar e quantificar de forma simultânea carboximetilisina, pentosidina e pirralina de leite em pó (integral, semidesnatado e desnatado), cru e esterelizado;

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA [START_REF] Nagai | Advanced Glycation End Products and Their Receptors as Risk Factors for Aging[END_REF][START_REF] Bastos | Maillard Reaction Products in Processed Foods: Pros and Cons[END_REF].

Através do ataque nucleofílico do grupo α-carbonílico de um açúcar redutor, por exemplo, ao grupamento amina das proteínas, inicia-se essa reação [START_REF] Finot | Historical perspective of the Maillard reaction in food science[END_REF][START_REF] Nunes | Implicações da reação de Maillard nos alimentos e nos sistemas biológicos[END_REF][START_REF] Nunes | Implicações da reação de Maillard nos alimentos e nos sistemas biológicos[END_REF]. A reação pode ser dividida em duas partes: a primeira parte ocorre até o rearranjo de Amadori, e a segunda metade envolve a formação de AGEs, por meio de reações de oxidação, desidratação, e condensação [START_REF] Nagai | Advanced Glycation End Products and Their Receptors as Risk Factors for Aging[END_REF]. Na figura 1, pode ser observado o esquema apresentado das principais etapas da reação de Maillard.

A reação de Maillard inicia-se com a formação da base de Schiff, composto instável, gerado pela condensação de grupamento carbonila de açúcar redutor com um grupamento amina, oriundo, por exemplo, do aminoácido lisina, composto especialmente susceptível à reação. Na seqüência, a base de Schiff sofre rearranjos, resultando nos produtos de Amadori, conhecidos hoje como produtos iniciais da reação de Maillard que apresentam estrutura mais estável. Os produtos de Amadori apresentam grupos carbonilas reativos, que se condensam com grupos aminas primários acessíveis, dando origem aos produtos avançados da reação de Maillard através de reações como oxidação, desidratação e condensação (HODGE, 1953;[START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF].

Figura 1. Reação de Maillard.

Baseado em [START_REF] Nagai | Advanced Glycation End Products and Their Receptors as Risk Factors for Aging[END_REF].

No organismo vivo a hemoglobina glicada A1c (HbA1c ) foi identificada pela primeira vez na década de 1970, e investigações posteriores revelou esta molécula, como sendo um produto de rearranjo de Amadori de glicose combinada com resíduo de aminoácido N-terminal de valina na hemoglobina cadeia β. Enquanto HbA1c é usado globalmente como um marcador para diabéticos no controle glicêmico, a aplicação clínica de produtos AGEs é limitada pelo grande número de estruturas de que esses compostos apresentam, e pelo fato de existirem diferentes métodos para identificação dessas estruturas [START_REF] Nagai | Advanced Glycation End Products and Their Receptors as Risk Factors for Aging[END_REF].

A identificação da hemoglobina glicada em pacientes diabéticos foi o marco para os estudos desse processo de glicação no organismo e suas implicações para a saúde. A reação pode ocorrer in vivo, pela via do estresse carbonílico, na qual a oxidação de lipídeos ou de açúcares gera compostos dicarbonílicos intermediários altamente reativos [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Monnier | Dietary advanced lipoxidation products as risk factors for human health: a call for data[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF]. A glicólise e a autoxidação de glicose, por exemplo, produzem metilglioxal e glioxal, os quais interagem com aminoácidos para formar produtos finais dessa reação. Esses compostos dicarbonílicos chegam a ser 20 mil vezes mais reativos do que a glicose e estão presentes tanto in vivo quanto nos alimentos. A velocidade da glicação é maior em estados de hiperglicemia, em que a glicose se liga a proteínas de tecidos independentes de insulina e de longa vida (NUNES; [START_REF] Nunes | Implicações da reação de Maillard nos alimentos e nos sistemas biológicos[END_REF][START_REF] Monnier | Dietary advanced lipoxidation products as risk factors for human health: a call for data[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF][START_REF] Shibao | Produtos da reação de Maillard em alimentos: implicações para a saúde[END_REF].

A glicação em organismos vivos tem outras vias que estão ligadas ao metabolismo da glicose e da peroxidação lipídica, cujos produtos são denominados produtos finais de lipoxidação avançada (ALE) [START_REF] Goldberg | Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[END_REF][START_REF] Nass | Advanced glycation end products, diabetes and ageing[END_REF]. As reações de Maillard ocorrem ao longo de toda a vida, visto que os carboidratos são nutrientes indispensáveis para a produção de energia e o organismo usa estes compostos ao longo de sua vida. Resíduos de lisina e arginina podem ser modificados pelos AGEs, aumentando a carga negativa das proteínas e promovendo a formação de ligação cruzada (Fig. 2). Além disso, diversas enzimas podem ser inativadas por conta dos AGEs [START_REF] Nagai | Advanced Glycation End Products and Their Receptors as Risk Factors for Aging[END_REF].

A formação de AGEs in vivo pode, adicionalmente, envolver neutrófilos, monócitos e macrófagos, os quais, após estímulo inflamatório, produzem mieloperoxidase e enzimas NADPH oxidase, que induzem a formação de AGEs por meio da oxidação de aminoácidos [START_REF] Huebschmann | Diabetes and glicoxidation end products[END_REF]. 

Produtos de glicação avançada e de reação de Maillard

Os produtos da reação de Maillard correspondem a um grupo heterogêneo de compostos químicos, com ampla variação no peso molecular, formados em alimentos e em sistemas biológicos [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Nguyen | Toxicity of the AGEs generated from the Maillard reaction: On the relationship of food-AGEs and biological-AGEs[END_REF][START_REF] Charissou | Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples[END_REF]. Os compostos representativos dessa reação, tanto nos alimentos como nos sistemas biológicos são: hidroximetilfurfural, furosina, carboximetilisina, carboxietilisina, pentosidina, pirralina, vesperlisina A, dímero de glioxal-lisina, dímero metilglioxal-lisina, glicosepana [START_REF] Barbosa | Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes[END_REF][START_REF] Nguyen | Toxicity of the AGEs generated from the Maillard reaction: On the relationship of food-AGEs and biological-AGEs[END_REF][START_REF] Xanthis | Advanced glycosylation end products and nutrition: a possible relation with diabetic atherosclerosis and how to prevent it[END_REF].

Hidroximetilfurfural

O Hidroximetilfurfural (HMF) é um composto intermediário formado durante a reação de Maillard e pela degradação de hexoses a temperaturas elevadas em condições ácidas (Fig. 3) (ARRIBAS -LORENZO; MORALES, 2010). A furosina é o indicador mais importante e específico da fase inicial da reação de Maillard. A pesquisa da furosina é amplamente utilizada na análise de produtos de cereais, uma vez que a lisina é o aminoácido limitante deste produto e, assim, a presença de furosina é um importante marcador da perda do valor biológico das proteínas. A monitorização da formação de furosina ajuda a adaptar as condições de processamento, a fim de garantir a manutenção do valor nutritivo dos alimentos (RUFIAN-HENARES et al., 2004a, 2006;[START_REF] Resmini | Accurate quantification of furosine in milk and dairy products by a direct HPLC method[END_REF].

A furosina contida no leite depende da intensidade do tratamento térmico aplicado. No leite cru, a quantidade aproximada varia entre 3 a 5 mg/100g de proteína, enquanto que no leite pasteurizada essa quantidade por variar de 4 a 7 mg/100g de proteína, no leite UHT (ultra high temperature) 50 a 300 mg/100g de proteína, e no esterilizado esses valores pode chegar a 450 mg/100g de proteína (RESMINI; PELLEGRINO, 1991). Além da composição química dos alimentos a formação dos produtos de reação de Maillard depende de alguns outros fatores, como: temperaturas elevadas (acima de 40ºC), atividade de água na faixa de 0,4 a 0,7, pH na faixa de 6 a 8

3.1.2.3. N ε -Carboximetilisina A N ε -carboximetilisina (CML)
(preferencialmente alcalino), umidade relativa de 30% a 70%, presença de íons de metais de transição como Cu 2+ e Fe 2+ , que podem catalisar a reação [START_REF] Kwak | The effect of sugar, amino acid, metal ion, and NaCl on model Maillard reaction under pH control[END_REF]HODGE, 1953). (1989). Ainda no estudo de Dyer et al. (1991), foi observado que a formação da pentosidina era abundante em sistemas modelo, como as reações de pentoses com lisina e arginina, embora também fosse observada a partir da glicose, frutose, ascorbato, compostos Amadori, 3-deoxiglicosona, e de outros açúcares. Todavia, a pentosidina não se formou a partir do malondialdeído, nem de ácidos graxos poliinsaturados resultantes da peroxidação lipídica (DYER et al., 1991). A formação da pentosidina, por reação de açúcares, fora inibida em condições anaeróbicas, bem como na presença de aminoguanidina, sendo este último composto um conhecido inibidor da glicação avançada e das reações de escurecimento (DYER et al., 1991).

Portanto, a formação de pentosidina envolve a reação de intermediários de açúcares em condições reacionais oxidativas [START_REF] Saraiva | Espectrometria de massa aplicada ao estudo da reacção de Maillard[END_REF]. Um novo mecanismo para a formação da pentosidina (Fig. 6b) foi proposto por Chellan e 3.1.2.5. Pirralina A pirralina ((2-amino-6-(2-formyl-5-hydroxymethyl-1-pyrrolyl)-hexanoic acid) é um produto avançado da reação de Maillard, formado entre grupo ɛ-amino da lisina e 3-deoxiglicosilose que é um produto de degradação de carboidratos reduzidos e aminocetoses [START_REF] Nakayama | Formation of e-(2-formyl-5-hydroxymethylpyrrol-1-yl)-L-norleucine in the Maillard reaction between D-glucose and lysine[END_REF][START_REF] Rufian-Henares | Pyrraline content in enteral formula processing and storage and model systems[END_REF].

Identificada e caracterizada com um composto formado durante o browning nãoenzimático, em condições fisiológicas, a pirralina tem na sua origem a reação de grupos amina livres das proteínas com a glicose, e com a formação do intermediário 3-deoxiglicosona, o qual se pensa provir da degradação do produto Amadori (Fig. 7) NJOROGE et al. 1987), sendo lábil à hidrólise ácida, anteriormente tinha sido observado a formação de um derivado da pirralina em misturas reativas de butilamina e glicose, e de ɛ-amino lisina e glicose, a 100ºC (KATO, 1966;KATO;FUJIMAKI, 1970;KATO et al., 1977;NAKAYMA et al., 1980;HAYASE;KATO, 1985).

(
Posteriormente, Nissl et al. (1995) identificaram a formação de pirralina na reação da glicose com modelos composto por amina, propilamina, Nα-acetil-L-lisina, e também com a albumina do soro bovino. [START_REF] Nagaraj | Pyrraline Ether Crosslinks as a Basis for Protein Crosslinking by the Advanced Maillard Reaction in Aging and Diabetes Arch[END_REF] verificaram que, quando da purificação da pirralina, o composto obtido, na reação da lisina com a glicose, sofria degradação quando armazenado sob refrigeração, ou simplesmente quando exposto a temperatura ambiente. Na tentativa de identificação de possíveis produtos de degradação da pirralina, um dos produtos formados fora purificado. Com a elucidação da natureza estrutural deste produto de degradação, [START_REF] Nagaraj | Pyrraline Ether Crosslinks as a Basis for Protein Crosslinking by the Advanced Maillard Reaction in Aging and Diabetes Arch[END_REF] concluíram que se tratava de uma dipirralina, com uma ligação éter entre duas moléculas de pirralina (Fig. 7). Esta descoberta levou os investigadores a estudar a reatividade da pirralina com tio e hidroxi-aminoácidos [START_REF] Nagaraj | Pyrraline Ether Crosslinks as a Basis for Protein Crosslinking by the Advanced Maillard Reaction in Aging and Diabetes Arch[END_REF]. Deste modo, verificou-se que os hidroxi-aminoácidos, em geral, não eram reativos para com a pirralina. Porém, a reação da cisteína com a pirralina resultou na formação de dois tio-éteres distinto [START_REF] Nagaraj | Pyrraline Ether Crosslinks as a Basis for Protein Crosslinking by the Advanced Maillard Reaction in Aging and Diabetes Arch[END_REF]. Assim sendo, os resultados obtidos por [START_REF] Nagaraj | Pyrraline Ether Crosslinks as a Basis for Protein Crosslinking by the Advanced Maillard Reaction in Aging and Diabetes Arch[END_REF] presentes (Fig. 8). A interação AGE-RAGE modula vias pró-inflamatória com ativação transcricional e expressão alterada de vários mediadores inflamatórios, como as citocinas, desencadeando reações inflamatórias [START_REF] Tan | Advanced glycation end products and endothelial dysfunction in type 2 diabetes[END_REF][START_REF] Sasaki | Advanced glycation end products in Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases[END_REF]. A ligação de AGE a tecidos como a retina, endotélio, mesênquima e células renais, favorece a disfunção endotelial, prejudicando a vasodilatação devido à diminuição da produção de monóxido de nitrogênio -NO, a ativação acelerada de macrófagos para as células espumosas, a diminuição da flexibilidade das células musculares lisas, comprometendo a complacência arterial, e torna a fração LDLcolesterol (Low Density Lipoprotein) mais susceptível à oxidação [START_REF] Tan | Advanced glycation end products and endothelial dysfunction in type 2 diabetes[END_REF][START_REF] Sasaki | Advanced glycation end products in Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases[END_REF]. Os AGE estão associados a complicações renais, disfunções endoteliais e patologias neurodegenerativas, processo em que se observa elevada concentração desses compostos, o que possivelmente se relaciona à disfunção neuronal e, ainda, a fatores de risco do desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Fig. 9), [START_REF] Kim | Receptor for advanced glycation end products and its ligands: a journey from the complications of diabetes to its pathogenesis[END_REF][START_REF] Rojas | Advanced glycation and endothelial functions: a link towards vascular complications in diabetes[END_REF][START_REF] Rojas | Advanced glycation and endothelial functions: a link towards vascular complications in diabetes[END_REF][START_REF] Uribarri | Diet-Derived Advanced Glycation End Products Are Major Contributors to the Body's AGE Pool and Induce Inflammation in Healthy Subjects[END_REF].

Figura 9. Efeitos biológicos dos produtos de reação de Maillard (PRM) e produtos finais de glicação avançado (AGEs).

Adaptado de Somoza (2005). Redução da disponibilidade de aminoácidos e minerais tecidos intersticiais da pele). A catarata e aterosclerose, em alguma extensão, são patologias resultantes da glicação entre a glicose sanguínea com proteínas de longa duração presentes nesses tecidos [START_REF] Uribarri | Advanced glycation end products in foods and a practical guide to their reduction in the diet[END_REF][START_REF] Glenn | The role of advanced glycation end products in retinal ageing and disease[END_REF][START_REF] Glenn | The role of advanced glycation end products in retinal ageing and disease[END_REF].

Como a formação de AGEs ocorre vagarosamente sob condições fisiológicas, as moléculas de meia-vida longa, como o colágeno, são diretamente afetadas por esses compostos, contribuindo dessa forma no processo de envelhecimento [START_REF] Forbes | Below the Radar: Advanced Glycation end Products that Detour "around the side": Is HbA1c not an accurate enough predictor of long term progression and glycaemic control in diabetes?[END_REF].

Ação dos AGEs em diabéticos

Indivíduos diabéticos, em especial, apresentam diversas complicações devido aos processos de glicação. Atualmente, recomenda-se que a dieta desses pacientes seja controlada quanto aos teores de PRM. Apesar de não haver consenso sobre os limites de ingestão segura, a redução de 50% na ingestão de PRM na dieta de indivíduos diabéticos resulta em um decréscimo de 30% dos teores plasmáticos desse composto, em apenas um mês de intervenção. Observou-se também redução do peso corporal e melhora do prognóstico da doença, embora o nível de hemoglobina glicada (HbA1c) não tenha sido modificado [START_REF] Uribarri | Diet-Derived Advanced Glycation End Products Are Major Contributors to the Body's AGE Pool and Induce Inflammation in Healthy Subjects[END_REF]TEIXIDÓ et al., 2008). Estima-se que os indivíduos que consomem maiores proporções de PRM estejam expostos a maior risco de desenvolver complicações do diabetes, como disfunções vasculares e renais [START_REF] Uribarri | Advanced glycation end products in foods and a practical guide to their reduction in the diet[END_REF]TEIXIDÓ et al., 2008;[START_REF] Sandu | Insulin resistance and type 2 diabetes in high-fat-fed mice are linked to high glycotoxin intake[END_REF], e que o consumo seguro de PRM para esses pacientes, seja de no máximo 16 mil unidades por dia (medida relativa à carboximetilisina) [START_REF] Kim | Receptor for advanced glycation end products and its ligands: a journey from the complications of diabetes to its pathogenesis[END_REF][START_REF] Koschinsky | Orally absorbed reactive glycation products (glycotoxins): an environmental risk factor in diabetic nephropathy[END_REF].

Estudos com ratos mostraram que os animais que receberam dietas com altos teores de PRM por seis meses desenvolveram diabetes mellitus tipo 2, enquanto os animais do grupo-controle (dieta equivalente em composição e valor energético, mas com teores de PRM reduzidos) não desenvolveram a doença e apresentaram menores níveis de glicemia [START_REF]Reduction of advanced glycation end product levels by online hemodiafiltration in long-term hemodialysis patients[END_REF]. Atenção especial tem sido dada ao estudo de melanoidina em café e na crosta de pães. Assim, pronil-lisina, um aminácido glicado de baixo peso molecular, tem demonstrado exercer atividade antioxidante e indução enzimática quimiopreventiva em modelo de cultura de celular, sobre células intestinais humanas (LINDENMEIE et al., 2002). Além disso, Borrelli e Fogliano (2005) revelaram o potencial de melanoidina da crosta de pães como ingredientes prebióticos, aumentando o crescimento das bifidobactérias de forma seletiva. [START_REF] Del | In vitro release of angiotensin-converting enzyme inhibitors, peroxyl-radical scavengers and antibacterial compounds by enzymatic hydrolysis of glycated gluten[END_REF], relataram que a fração de baixo peso molecular derivado da hidrólise enzimática de glúten glicado é rica em peptídeos anti-hipertensivos, enquanto que a fração de peso molecular elevado contém catadores de radicais peroxil e inibidores de crescimento bacteriana.

Análise de produtos de reação de Maillard

Muitos autores têm destacado os benefícios e riscos para a saúde dos produtos da reação de Maillard presente nas dietas. Por esse motivo, é de grande importância caracterizar e quantificar esses produtos nos alimentos, como forma de se obter um melhor equilíbrio entre os benefícios e riscos potenciais, e em seguida, no estabelecendo de diretrizes para a saúde alimentar [START_REF] Delgado-Andrade | Colour and fluorescence measurement as unspecific markers for the Maillard reaction[END_REF].

A partir do desenvolvimento de técnicas sofisticadas de análise, foi possível isolar, caracterizar, e quantificar vários compostos da reação de Maillard e de glicação avançada formadas in vitro e in vivo, tanto no estágio inicial como avançado, como os compostos de Amadori (indiretamente analisados como furosina), carboximetilisina (CML), e alguns derivados intermediários da reação, tais como hidroximetilfurfural [START_REF] Bastos | Maillard Reaction Products in Processed Foods: Pros and Cons[END_REF]. A medição de compostos fluorescentes (CF) formados durante a reação é também uma ferramenta confiável para avaliar a extensão e proporção de perda nutricional devido ao processamento térmico dos alimentos [START_REF] Delgado-Andrade | Colour and fluorescence measurement as unspecific markers for the Maillard reaction[END_REF][START_REF] Friedman | Food browning and its prevention: an overview[END_REF].

Tradicionalmente, a monitorização da reação de Maillard no processamento de alimentos foi baseada na avaliação espectrofotométrica de desenvolvimento de cor a 420 nm. Mais recentemente, a avaliação de compostos fluorescentes gerados pelo rearranjo dos produtos de Amadori se tornou habitual. Além do seu uso em alimentos, a medição de fluorescência também é empregada para avaliar a reação de Maillard em condições fisiológicas, correlacionando a geração de AGEs com o desenvolvimento de patologias [START_REF] Delgado-Andrade | Study on fluorescence of Maillard reaction compounds in breakfast cereals[END_REF].

Os compostos fluorescentes são precursores de pigmentos castanhos formados na reação de Maillard, que apresentam diferentes estruturas químicas. A avaliação das alterações na intensidade da fluorescência ajuda a avaliar, a extensão da reação de Maillard em produtos alimentícios e sistemas biológicos (MORALES; [START_REF] Morales | A study on advanced Maillard reaction in heated casein/sugar solutions: colour formation[END_REF]RUFIAN-HENARES;DELGADO-ANDRADE, 2009). A fluorescência foi primeiro utilizado para avaliar a formação de produtos de reação de Maillard em leite, e agora é também utilizada para monitorar a transformação de cereais, biscoitos, soja, fórmula infantil, salmão cozido e produtos de panificação [START_REF] Bastos | Maillard Reaction Products in Processed Foods: Pros and Cons[END_REF].

Dependendo do produto de reação de Maillard a ser analisado, diferentes metodologias podem ser adotadas. Entre essas metodologias se destaca os métodos espectrofotométricos, geralmente utilizados para determinar hidroximetilfurfural em alimentos e os métodos cromatográficos (cromatografia líquida ou gasosa de alta resolução) que são mais precisos e sensíveis para este propósito (ERBERSDOBLER; [START_REF] Erbersdobler | Forty years of furosine-Forty years of using Maillard reaction products as indicators of the nutritional quality of foods[END_REF][START_REF] Morales | Chromatographic determination of bound hydroxymethylfurfural as an index of milk protein glycasylation[END_REF]RUFIAN -HENARES et al., 2001[START_REF] Bastos | Maillard Reaction Products in Processed Foods: Pros and Cons[END_REF].

Em 1992, uma metodologia baseada em pareamento de íons por HPLC (High Performance Liquid Chromatography) foi proposto e aplicado com sucesso numa série de estudos na análise de furosina. Em 1996 a HPLC de fase reversa tornou-se o método de escolha para análise de furosina, quando seu padrão se tornou disponível comercialmente. Devido à possibilidade de transformação de CML em furosina durante o aquecimento é necessária uma hidrólise ácida em uma atmosfera inerte (ERBERSDOBLER; [START_REF] Erbersdobler | Forty years of furosine-Forty years of using Maillard reaction products as indicators of the nutritional quality of foods[END_REF][START_REF] Bastos | Maillard Reaction Products in Processed Foods: Pros and Cons[END_REF].

Para análise de CML em alimentos, [START_REF] Charissou | Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples[END_REF], propõem três metodologias principais: 1) RP-HPLC (Reverse Fase/ High Performance Liquid Chromatography), 2) GC/MS (Cromatografia gasosa ligada a espectrometria de massa) seguida pela metilação do grupo carboxílico e acilação do grupo amina, 3) ensaio de imunoabsorção (ELISA) ligado a enzima com base numa anticorpo monoclonal anti-CML. De acordo com [START_REF] Goldberg | Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[END_REF], este ensaio é adequado para a análise quantitativa CML, tanto em amostras biológicas como de alimentos.

Solid Phase Extraction (SPE)

A extração em fase sólida (SPE) na sua forma moderna tem mais de 25 anos, e representa um método rápido de preparação de amostras, em que uma fase estacionária sólida, é tipicamente acondicionada em um interior de um cartucho, usado seletivamente para extrair, concentrar, e purificar analitos alvos, antes de serem analisados por HPLC ou GC.

A SPE tem se tornado uma das mais comuns técnicas de concentração e cleanup de amostra usada pelos químicos analíticos. Ao longo do tempo, o uso da SPE tem crescido devido ao fato de que essa técnica atende as necessidades dos analistas em relação aos procedimentos de preparo da amostra, apresentando-se simples, relativamente barata, com boa recuperação dos analitos e adequada seletividade, reduzido uso de solventes orgânicos e capacidade de automação (MAJORS, 2001). Esta técnica tem sido muito utilizada para remover ou concentrar substâncias de matrizes líquidas presentes em pequenas quantidades. Pode ser considerado como um meio de purificação de amostras antes da análise por cromatografia líquida, a fim de eliminar outras substâncias que compõem a matriz, a SPE depende de alguns fatores para o sucesso do processo de purificação. Esses fatores incluem: o tipo de resina utilizada, a concentração do analito, o volume da amostra e o fluxo com que a amostra atravessa o sorvente.

A SPE é um processo onde normalmente recupera-se quase todo o analito da matriz em uma única extração. Esta é uma técnica bastante aplicada em matrizes complexas e utiliza os mesmos materiais adsorventes usados na cromatografia líquida, dentre os quais se destacam os derivados de sílica C8, C18 e CN [START_REF] Silva | Determinação de compostos fenólicos por HPLC[END_REF]. Uma grande variedade de adsorventes pode ser utilizada, desde fases de sílica modificadas de C8 a C18 (fases reversas), resinas poliméricas, alumina, carvão, sílica e ciano e outras [START_REF] Queiroz | Methods of extraction and/or concentration of compounds found in biological fluids for subsequent chromatographic determination[END_REF]. Os mecanismos de retenção na SPE assemelham-se aqueles envolvidos na cromatografia líquida em coluna [START_REF] Poole | Contributions of theory to method development in solid-phase extraction[END_REF], e dependendo do adsorvente e do modo como é utilizada, a SPE é dividida em modo reverso, modo normal e troca iónica. Nos casos das fases reversas (C8, C18 e CN), a retenção do analito acontece devido, primeiramente, às interações de van der Waals não polares, entre as ligações carbono-hidrogênio do analito com os grupos funcionais da superfície da sílica. Já no modo normal, as principais interações são entre grupos polares do analito e da fase extratora através de ligações de hidrogênio, interações 𝜋 -𝜋 e dipolo-dipolo [START_REF] Silva | Determinação de compostos fenólicos por HPLC[END_REF].

No modo troca iónica, interações eletrostáticas são as responsáveis pela extração seletiva do analito [START_REF] Snyder | LPratical HPLC method development[END_REF]. A SPE conta com uma grande variedade de adsorventes disponíveis, que podem ser utilizados com os mais diversos tipos de matrizes e classes de compostos [START_REF] Queiroz | Methods of extraction and/or concentration of compounds found in biological fluids for subsequent chromatographic determination[END_REF]. A extração com resinas poliméricas ocorre devido à adsorção dos analitos por meio de forças de van der Waals, que permitem uma dessorção fácil. As resinas poliméricas mais comumente utilizadas são as do copolímero poliestireno-divinilbenzeno (JUNKER-BUCHHEIT e WITZENBACHER, 1996). Atualmente, a SPE tem ganhado aplicações específicas com o desenvolvimento de fases mais seletivas. Vários são os dispositivos utilizados para SPE dentre eles os mais utilizados são os cartuchos e os discos de extração. Em ambos dispositivos, a amostra é forçada a passar pelo material extrator pela aplicação de pressão em uma das extremidades do cartucho ou disco. Para realizar a análise simultânea de várias amostras e extrações mais rápidas, geralmente são utilizados sistemas extratores com vácuo (Fig. 10) [START_REF] Hagen | Membrane approach to solid-phase extractions[END_REF]. 1999). Durante os últimos cinco ou seis anos tem crescido o desenvolvimento com melhoria do formato, automação e com a introdução de novos sorventes com capacidade de melhorar a extração de analitos polares (PICHON, 2000).

Os cartuchos disponíveis comercialmente em geral, possuem reservatórios (região destinada ao acondicionamento das amostras, acima do sorvente e dos filtros) de 0,5 a 10 mL e recheios que variam de 35 mg a 2 g [START_REF] Snyder | LPratical HPLC method development[END_REF].

A resina poliamida é usada para adsorver os compostos polares (grupos-OH, os compostos fenólicos) de soluções aquosas ou metanólicas no âmbito do mecanismo de fase reversa através de ligações fortes de hidrogénio entre o composto de grupos hidroxilo e grupos de amida da resina, sendo útil para extração de taninos, clorofila, IV) Lavagem: a fase sólida é lavada com um solvente apropriado, retirando os interferentes da matriz ou parte delas, sem eliminar os analitos de interesse (no caso 3a), no caso 3b a fase sólida não precisa ser lavada com um solvente apropriado para a remoção dos interferentes;

V) Eluição do analito de interesse do sorvente com um solvente apropriado. O procedimento geral é transportar a solução que contém o analito por uma resina ou sorvente pré-condicionado que possui afinidade com o analito que se quer analisar. Os analitos são retidos na resina e de seguida por meio de uma solução extrai-se os analitos praticamente sob a forma concentrada.

Liquid Chromatography Electro Spray Ionization Tandem Mass

Spectrometry (LC-ESI-MS-MS)

A cromatografia líquida é um método de separação física baseado na distribuição dos analitos entre duas fases. A primeira é a fase estacionária e a segunda, é uma fase líquida que se move através da fase estacionária em uma direção precisa. Muitos detectores são usados juntamente com a cromatografia líquida, tais como UV, fluorescência, condutividade, e espectrometria de massa. A espectrometria de massa permite a diferenciação de compostos que têm um tempo A: peso molecular da adicionada (1 para hidrogênio H + , 18 para íon amônia NH + 4 e 23 para sódio Na + ). n: número de cargas que são transportadas pelo íon.

Os íons são gerados fora do analisador de massa e são então direcionados para sua entrada. O triplo quadrupolo é o analisador de massa mais utilizado em MS/MS. Ele consiste em três conjuntos de barras quadrupolares: dois analisadores de massa, MS1 e MS3 (Q1 e Q3), e a célula de colisão (Q2) [START_REF] Ardrey | Liquid chromatography mass spectrometry: An Introduction[END_REF]. O Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) é um espectrômetro de massas com alta resolução e exatidão de massa, possuindo um quadrupolo como "filtro de massa" e uma célula de colisão para experimentos de MS/MS. A figura 12 ilustra a montagem de um triplo espectrômetro de massa em tandem quadrupolar.

O íon molecular [M+H] + (íon precursor) é selecionado no primeiro analisador de massa (Q1), sendo então transmitida para a célula de colisão (Q2), onde a fragmentação é realizada. Na célula de colisão, os íons colidem com uma parede de moléculas de gás, geralmente nitrogênio, que é chamado gás de colisão. Os íons fragmentos gerados f+1, f+2, f+3, f+4 (produtos dos íons) são focados no segundo analisador de massa (Q3), onde normalmente apenas os produtos dos íons de mais altas intensidade são escolhidos e monitorados (f+1,f+3). Esta técnica é chamada de monitoração de reação selecionada (SRM), porque monitora a fragmentação de um íon precursor selecionado para um íon produto selecionado. É considerado como uma das experiências MS/MS mais amplamente utilizadas.

O termo reações múltiplas monitoramento (MRM) refere-se à monitoração simultânea de vários pares de produtos íons e íons precursores derivados de diferentes analitos [START_REF] Zimmer | Introduction to quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS)[END_REF]. Outras experiências MS-MS amplamente utilizadas são o produto íon-scan, o íon-scan precursor e a varredura de perda neutra constante. Um único íon produto é normalmente inadequado para identificar o analito de interesse. Se a cromatografia estiver envolvendo a combinação do tempo de retenção e de um único íon produto, pode ser considerado adequado, especialmente se esse íon é gerado por técnica de ionização suave. No entanto, a fim de assegurar a identidade do analito, recomenda-se para monitorizar pelo menos dois íons de produto da substância a analisar [START_REF] Ardrey | Liquid chromatography mass spectrometry: An Introduction[END_REF]. Nesses casos, o produto que dá um pico cromatográfico com a maior intensidade é chamado o fragmento quantificador (f+3), porque é usado para quantificação. Os outros fragmentos são usados para confirmar a identidade do analito e é chamado o qualificador fragmentos (f+1). A espectrometria de massa é comumente utilizada para a quantificação de moléculas de peso molecular abaixo de 1000-2000 Da [START_REF] Zimmer | Introduction to quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS-MS)[END_REF].

Figura 12. Ilustração esquemática da espectrometria de massa em tandem no modo MRM.

Adaptado de Zimmer, 2003.

AGEs em leite e derivados

A utilização do leite na dieta alimentar ocorre, principalmente pelo fato deste produto ser fonte de nutrientes essenciais à promoção do crescimento e da manutenção da vida. A composição média do leite em termos percentuais é de 87,5% de água, 4,9% lactose, 3,9% gordura, 3,5% proteínas e 0,9% de sais minerais. Assim, infere-se que 1L de leite fornece 35 g de proteína, 39 g de gorduras, 49 g de lactose e 9 g de sais minerais. Cada um destes componentes apresenta fundamental importância em termos de necessidades diárias do organismo [START_REF] Magalhães | [END_REF][START_REF] Referencias Aguilar | Perfil dos consumidores de leites pasteurizado tipo C e esterilizado (UHT) de Janaúba-MG[END_REF].

De acordo com [START_REF] Martins | Evolução do índice proteolítico e do comportamento lógico durante a vida de prateleira de leite UAT/UHT[END_REF], nos últimos anos a população brasileira, vem se preocupando mais, com a qualidade dos alimentos que chegam à sua mesa.

No caso do leite, além das preocupações com as características organolépticas (sabor, odor, cor) as questões sanitárias e o tempo de vida de prateleira do produto também são observados.

Diante dos riscos sanitários, inerentes à ingestão de leite obtido e processado em condições insatisfatórias, se faz necessário à aplicação de um tratamento térmico eficiente para a destruição dos microrganismos. O processo de conservação de alimento é baseado na eliminação total ou parcial dos agentes que podem alterar os produtos, tais como: microrganismos, enzimas, oxigênio, água, luz e calor [START_REF] Referencias Aguilar | Perfil dos consumidores de leites pasteurizado tipo C e esterilizado (UHT) de Janaúba-MG[END_REF]. Os métodos de conservação que utilizam calor visam principalmente a eliminação de microrganismos indesejáveis, que se encontram no alimento e que podem causar transtornos à saúde humana. Existem vários métodos e técnicas de conservação de alimento pelo calor que incluem a pasteurização, tindalização, branqueamento, esterilização, entre outros métodos [START_REF] Silva | Tópicos da tecnologia dos alimentos[END_REF].

O tratamento térmico empregado na produção de leite e derivados tem a finalidade de garantir a segurança do leite e de seus derivados, aumentando a vida útil e conferindo qualidades sensoriais desejáveis. Entretanto, esse mesmo tratamento pode afetar a segurança e valor nutricional do produto, devido aos danos oxidativos gerados pela temperatura nas moléculas de proteínas e de lipídeos.

Devido às modificações que ocorrem no leite durante o tratamento térmico, vários marcadores químicos são comumente utilizados para avaliar essas modificações, como a avaliação da oxidação de lipídeos, que são umas das principais causas de deterioração da qualidade durante o processamento e armazenamento de produtos à base de leite. Neste monitoramento é analisada a presença de produtos de oxidação de lipídeos, tais como o malondialdeído (MDA) ou aldeídos saturados voláteis, como o hexanal [START_REF] Cesa | Malondialdehyde contents in infant milk formulas[END_REF][START_REF] Fenaille | Comparison of analytical techniques to quantify malondialdehyde in milk powders[END_REF][START_REF] Giammarioli | Preliminary study on lipid oxidation in infant formulas during storage[END_REF][START_REF] Fenaille | Comparison of mass spectrometry-based electronic nose and solid phase MicroExtraction gas chromatography mass spectrometry technique to assess infant formula oxidation[END_REF][START_REF] Romeu-Nadal | Headspace gas chromatographic method for determining volatile compounds in infant formulas[END_REF][START_REF] Ulberth | Monitoring of oxidative deterioration of milk powder by headspace gas chromatography[END_REF][START_REF] Ulberth | Monitoring of oxidative deterioration of milk powder by headspace gas chromatography[END_REF][START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF].

Ao analisar a presença de carboximetilisina (CML) em 36 amostras de leite e derivados coletados na França e na Suíça, [START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF] observaram valores de CML que variaram de 16,3 ng/mg -1 (leite pasteurizado) a 212,4 ng/mg -1 (leite hipoalergênicos). O estudo realizado por esses pesquisados, apesar de importante, não retrata a realidade da indústria do leite no Brasil, pois além da legislação que regulamenta a produção e processamento do leite no Brasil ser diferente, o volume de leite processado no país é bem maior que nos países que [START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF] fizeram a pesquisa. Além disso, deve-se levar em consideração as variações que o processamento do leite sofre nas diferentes regiões do Brasil.

Tipos de tratamentos térmicos aplicados no processamento do leite

Devido à composição físico-química e microbiológica, o leite é um alimento altamente perecível e por isso deve ser submetido, logo após sua obtenção, a um processo com a finalidade de evitar a multiplicação de microrganismos patogênicos e deteriorantes. A escolha do tratamento vai depender do produto que se deseja obter, do prazo de validade requerido, do tipo de alteração que pode causar e do grau bacteriano que se deseja destruir [START_REF] Tronco | Manual para Inspeção da Qualidade do Leite[END_REF]. Entre os métodos de conservação utilizados pelas indústrias de beneficiamento de leite, destaca-se a pasteurização (lenta e rápida), a esterilização e a desidratação.

Pasteurização

A pasteurização é um tratamento térmico que tem como objetivo a obtenção de um leite saudável e com a vida útil prolongada. O processo de pasteurização consiste na aplicação de um tratamento térmico no leite, com a finalidade de destruir os microrganismos patogênicos e parte da flora banal do leite, evitando a disseminação de doenças, preservando as características físico-químicas pela destruição quase total de sua microbiota normal ou saprófita conjuntamente com a inativação de algumas enzimas. Com relação ao tempo e a temperatura a ser utilizado, o processo pode ser realizado de duas formas: a baixas temperaturas Os cuidados no tempo e temperatura utilizados na pasteurização rápida são imprescindíveis para manutenção da qualidade do leite, visto que erros no processo pode resultar em vários problemas, como redução da funcionalidade, mudança na viscosidade, aumento da desnaturação das proteínas e vitaminas, implicações higiênico-sanitárias, coloração indesejável, odor e sabor indesejável, além da produção excessiva de AGEs.

Esterilização

De acordo a Portaria nº370, de 04 de setembro de 1997, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1997), leite esterilizado ou UHT é o leite homogeneizado submetido, durante 2 a 4 segundos, a uma temperatura entre 130ºC a 150ºC, mediante um processo térmico de fluxo contínuo, imediatamente resfriado a uma temperatura inferior a 32ºC e envasado sob condições assépticas em embalagens estéreis e hermeticamente fechadas.

A esterilização comercial tem por objetivo aumentar significativamente a vida de prateleira do produto, por destruição dos microrganismos (tanto patogênicos como deteriorantes) na forma vegetativa. Com esse processo térmico, a vida de prateleira do leite aumenta em até 180 dias. Além disso, o processo evita a oxidação das gorduras, pois o ar é retirado no processo de envase, assim, o produto é comumente chamado de leite longa vida [START_REF] Tronco | Manual para Inspeção da Qualidade do Leite[END_REF].

No sistema convencional de esterilização, o leite é devidamente embalado em um recipiente hermeticamente fechado, impermeável aos líquidos e aos microrganismos e esterilizado depois de envasado por meio do calor, que deve destruir as enzimas e os microrganismos patógenos. A esterilização se realiza a uma temperatura de 109°C a 120°C por um período de 15 a 40 minutos. Este método, apesar de ser pouco utilizado, ainda é usado por algumas indústrias. Entre os tratamentos térmicos, esse é o que mais contribui para a formação de AGEs no leite.

Desidratação

No processamento do leite em pó, após a pasteurização é realiza a concentração do leite, sempre em equipamentos a vácuo, com o objetivo de baixar a temperatura de ebulição e evitar modificações profundas na estrutura do leite. A desidratação é realizada mediante ação do calor sobre cilindros ou pulverização em uma câmara (sistema spray). No sistema de cilindros, o leite é uniformemente distribuído em forma de uma fina camada sobre a superfície de dois cilindros que giram em sentido contrário em torno de 14 a 19rpm (rotação por minutos) e aquecidos por vapor internamente, a temperatura de 130ºC a 160ºC. Nas partes superiores dos cilindros, são adaptados raspadores especiais para remover a película seca do leite, caindo esta em uma rosca sem fim, sendo transportada para moinhos especiais para dar textura desejada no leite em pó [START_REF] Ordonez | Alimentos de origem animal -1 a[END_REF].

No sistema spray, o leite concentrado é pulverizado no interior de uma câmara, em formas de diminutas gotas, cujo tamanho deve ser o mais uniforme possível, entrando em contato com uma corrente de ar filtrado e quente a temperatura de 160ºC a 200ºC (ORDONEZ, 2005).

Efeitos do tratamento térmico sobre o leite

Durante o tratamento térmico do leite, muitas reações podem envolver apenas proteína ou proteína com os outros macronutrientes. Estas reações incluem:  Reações de proteínas: A lisinoalanina (LAL) é formada pela reação de lisina com dehidroalanina. Este último é produzido pela β-eliminação de cisteína e serina [START_REF] Mauron | Influence of processing on protein quality[END_REF]. O conteúdo de LAL em leite esterilizado e condensado é 13 e 18 vezes maior do que o teor em leite fresco [START_REF] Haagsma | Evaluation of lysinoalanine determinations in food proteins[END_REF][START_REF] Haagsma | Evaluation of lysinoalanine determinations in food proteins[END_REF].

 Interações lipídeos-oxidados proteínas: Durante essas reações, lipídios insaturados são oxidados resultando em produtos diferentes. Estes produtos podem ser classificados em produtos primários (hidroperóxido), produtos secundários (aldeído, cetona, carbonilos) e produtos estáveis como ácidos carboxílicos. A metionina é rapidamente oxidada por hidroperóxidos em sulfóxido de metionina, enquanto a lisina reage com os produtos secundários como aldeído e cetona numa reação de tipo Maillard [START_REF] Nielsen | Reactions of Proteins with Oxidizing Lipids Analytical Measurements of Lipid Oxidation and of Amino-Acid Losses in a Whey-Protein Methyl Linolenate Model System[END_REF].

 Interações proteína-polifenol: Esses processos incluem a reação de lisina ou metionina com quinonas para formar adutos de lisina-quinonas e metionina sulfoxido, respectivamente [START_REF] Mauron | Influence of processing on protein quality[END_REF]. Tal reação pode ser produtos de tipo chocoleite.

 Reações de proteína-lactose: Esta reação é chamada de reação de Maillard ou glicação protéica e é considerada como a reação mais frequente no leite durante o processamento.

 Oxidação de proteínas: Em paralelo à glicação, as proteínas do leite são submetidas a várias reações de oxidação sob condições de processamento [START_REF] Mauron | Influence of processing on protein quality[END_REF]. Nos produtos lácteos, triptofano, metionina e cisteína são particularmente sensíveis à modificação oxidativa. Por exemplo, a oxidação do triptofano pode levar a um número importante de derivados gerados pela abertura do anel indol. A oxidação converte metionina em sulfóxido de metionina [START_REF] Guy | Contribution of mass spectrometry to assess quality of milk-based products[END_REF][START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF]. A cisteína pode ser oxidada em ácido cisteína sulfênico [START_REF] Meltretter | Site-specific formation of Maillard, oxidation, and condensation products from whey proteins during reaction with lactose[END_REF][START_REF] Meltretter | Site-specific formation of Maillard, oxidation, and condensation products from whey proteins during reaction with lactose[END_REF]. Outros resíduos, tais como lisina, prolina, arginina, histidina e tirosina também podem ser sujeita a oxidação. A oxidação desses últimos aminoácidos é frequentemente caracterizada pela formação de grupos carbonilo dentro de suas estruturas [START_REF] Guy | Contribution of mass spectrometry to assess quality of milk-based products[END_REF][START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF]. A formação de carbonilo é também um resultado da reação entre o grupo amino e os compostos de dicarbonilo reativos gerados a partir da reação de Maillard e/ou oxidação de lipídeos. Além disso, o radical livre produzido pela oxidação catalisada por metal em fórmulas para lactentes pode produzir grupos carbonilo. Portanto, o teor de proteína carbonila é usado como indicador para a oxidação de proteínas (FENAILLE;[START_REF] Fenaille | Carbonylation of milk powder proteins as a consequence of processing conditions[END_REF]. A lisina aldeído é um exemplo para de um produto carbonilo formado em proteínas de leite durante o tratamento térmico [START_REF] Meltretter | Site-specific formation of Maillard, oxidation, and condensation products from whey proteins during reaction with lactose[END_REF][START_REF] Meltretter | Site-specific formation of Maillard, oxidation, and condensation products from whey proteins during reaction with lactose[END_REF].

 Desnaturação: O tratamento térmico pode alterar estruturas secundárias e terciárias de proteínas do leite, principalmente proteínas de soro de leite que causam desnaturação [START_REF] Mauron | Influence of processing on protein quality[END_REF]. A ordem de estabilidade ao calor da proteína de soro de leite é: α-LA> β-LG> BSA> IgG [START_REF] Mortier | Intrinsic indicators for monitoring heat damage of consumption milk[END_REF].

Durante a desnaturação, os grupos sulfidrilo são clivados, especialmente em β-LG, levando à formação de compostos de enxofre, como sulfureto de metilo, que contribuem para o sabor característico do leite [START_REF] Calvo | Flavour of heated milk. A review[END_REF].

Todas essas interações promovem à degradação de aminoácidos essenciais, bem como a uma diminuição da digestibilidade das proteínas do leite.

MATERIAIS E MÉTODOS

Reagentes

Metanol para uso em HPLC (MeOH), clorofórmio, ácido fórmico, n-hexano, acetona, ácido clorídrico HCl 37%, borato de sódio, borohidreto de sódio, tampão Tris, solução de hidróxido de amônia (NH 4 OH) e acetronitrila (ACN), ácido nonafluorpentanoíco (NFPA) 97%, ácido trifluoracético (TFA), pepsina, pronase E, leucina aminopeptidase e prolidase foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St Louis, MO). CML, pentosidina (Pen), pyrralina (Pyr) e teofilina, usada como padrão interno (IS) foram adquiridas da Polypeptide Groupe (Strasbourg, Fr).

Amostras de leite

Foram utilizadas amostras de leite em pó integral, semidesnatado e desnatado, além de amostras de leite cru e esterilizado. Todas as amostras foram adquiridas em supermercados da cidade de Estrasburgo, França. As amostras em pó foram diluídas conforme as recomendações dos fabricantes, a de leite cru também foi adquirida em supermercados locais, visto que a legislação francesa permite a comercialização do leite cru ultrafiltrado. O leite esterilizado foi preparado a partir do leite em pó integral, aquecido em autoclave a 121°C por 15 minutos.

Preparação das amostras

Para extração dos AGEs, as amostras passaram pelo processo de precipitação proteica, digestão enzimática e hidrólise ácida com ácido clorídrico 37%. Após a extração, as amostras foram submetidas a um processo de purificação por extração em fase sólida (SPE). Todos os métodos utilizados para extração dos compostos alvos, estão simplificados na figura 13. Igual volume de n-hexano (1,4 mL) também foi adicionado e agitado vigorosamente, com o objetivo de eliminação dos resíduos de lipídeos. Após, a mistura foi novamente centrifugada a 5000 rpm por 5 min. A fase com n-hexano fui cuidadosamente removida com um auxílio de uma pipeta Pasteur. Um microlitro (1 mL) da fase aquosa restante, foi purificada por extração em fase sólida (SPE). Antes da etapa SPE, a fase aquosa foi suplementada com 200 µL de uma mistura dos padrões, contendo as seguintes concentrações: CML (3 µg/mL, 30 ppm), Pen (0.45 µg/mL, 4,5ppm) e Pyr (0.6 µg/mL, 6ppm) e teofilina (0,3 µg/mL, 3 ppm), usada como padrão interno (IS). Amostras de leite não contaminada, também foram purificadas para a determinação de AGEs.

O método de extração por precipitação protéica, limita-se a extrair apenas os AGEs que estão livres na amostra, ou seja, não ligados às proteínas.

Figura 14. Fluxograma da precipitação protéica. 

Hidrólise Ácida

Alíquotas de 100 mg de proteínas das amostras de leite foram diluídas em água (volume final de 10 mL). De acordo com o tipo de leite, as alíquotas com 100mg de proteínas variaram de volume. Os valores de proteínas indicados pelos fabricantes, bem como o volume das amostras de leite contendo 100 mg de proteínas, são apresentados na tabela 2. Porções com 2 mg de proteínas (200 µL do volume final) foram adicionadas à tubos de vidro com roscas, resistentes a altas temperaturas (Fig. 15), contendo 1,5 mL de borato de sódio 0,2M (pH 9,5) e 1,0 mL de borohidreto de sódio 1,0 M em NaOH 0,1 M, sendo incubadas em seguida por 4 horas a temperatura ambiente. Após esse período, foi adicionado aos tubos 2,6 mL de HCl 37% e as amostras foram hidrolisadas a 110°C por 24 h. O hidrolisado foi evaporado até à secura com N 2 e reconstituídos em 1380 µL de um tampão constituído por: 37,6 mL de HCl 0,02 N, 11,7 mL de tampão Tris 2 M (pH 8,2) e 725 µL de água [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF]. Utilizou-se uma alíquota de 1 mL contaminada com 200 µL da mesma mistura dos padrões utilizada na precipitação protéica, para a purificação em SPE (Fig. 16). Amostras de leite não contaminada, também foram purificadas para a determinação de AGEs.

O método de extração por hidrólise ácida limita-se a extrair somente a CML, tanto as que estão livres, como as que se apresentam ligadas às proteínas.

Tabela 2. Conteúdo de proteínas e valores utilizados das amostras de leite utilizadas para análise de AGEs. (pH 8,2) e subsequentemente digeridas com pronase E. O tratamento com pronase E, foi repetido duas vezes, sendo adicionado a cada tratamento 15 µL de uma solução de pronase E (1 mg/mL -1 em tampão Tris 2 M) e incubada por 1h a 37°C, em cada repetição. Por fim, foi adicionado nas amostras 20 µL de uma solução de leucina aminopeptidase (0,295 mg/mL -1 ou 7,08 U/mL -1 em água) e 10 µL de uma solução de prolidase (1mgmL -1 ou 105UmL -1 em tampão Tris 2M) e incubadas por 24h a 37°C. Finalmente, realizou-se um terceiro tratamento com pronase E, aplicando as mesmas condições descritas acima (15 µL de pronase E, incubação por 1h a 37°C). Uma alíquota de 1 mL da solução resultante foi contaminada com 200 µL da mesma mistura dos padrões utilizada na precipitação protéica para purificação e concentração em SPE (Fig. 17).

Amostras de leite não contaminada, também foram purificadas para a determinação de AGEs. 

Purificação e concentração por SPE

O método de purificação é imprescindível para a eliminação de interferentes da amostra, de tal modo que os analitos alvos sejam determinados com precisão e exatidão pelo LC-MS. O desenvolvimento do método de purificação incluíram dois cartuchos, um usualmente utilizado C18, e outro ainda pouco relatado na literatura para análise de AGES, cartuchos de troca iônica. Nos dois tipos de cartuchos foram testado apenas a mistura dos padrões (200 µL), nas mesmas concentrações utilizadas no processo de contaminação das amostras (CML 3 µg/mL, Pen 0,45 µg/mL, Pyr 0,6 µg/mL e IS 0,3 µg/mL), bem como as amostras de leite contaminadas e não contaminadas.

As amostras provenientes da precipitação protéica foram purificadas utilizando cartuchos C18 Oasis HLB 6cc, 200 mg (Waters, Milford, MA, USA) e com troca iônica (Polyclean 30HCX, Interchim, Montluçon, Fr). As amostras provenientes da digestão enzimática foram submetidas à etapa de purificação, utilizando apenas cartuchos 30HCX, enquanto que as amostras submetidas à hidrólise ácida foram submetidas apenas a purificação com os cartuchos C18. Após a otimização dos métodos de purificação, todas as amostras foram analisadas em triplicada.

Cartucho C18

Antes de serem testadas com o cartucho C18, todas as amostras foram contaminadas 100 µL de NFPA. O cartucho C18 foi pré-condicionado com 4 mL de MeOH, seguido por 4 mL de NFPA (10mM) com uma taxa de fluxo de 2 mL/min. Em seguida, as amostras foram acondicionadas no cartucho C18 com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, em sequencia o cartucho foi lavado com uma alíquota de 4 mL de NFPA (10mM) e outra com 4 mL de NFPA (10mM)/MeOH (v/v, 95%:5%).

Finalmente, as frações contendo AGEs, foram eluídas com 4 mL de MeOH/NFPA 10 mM (v/v; 90%:10%), com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As frações foram evaporadas até a secura em uma corrente de gás de nitrogênio a 40°C, sendo resuspendidas em 200 µL de ácido trifluoroacético 0,1%, e filtradas através de um filtro de 0,22 μm antes da análise cromatográfica. Dois microlitros (2 µL) foram injetados em um sistema UPLC/ESI/Q-TOF.

Cartucho Polyclean 30HCX

O principio de condicionamento, equilíbrio, acondicionamento das amostras, lavagem e eluição, são os mesmos nos dois tipos de cartuchos, sendo modificados os solventes utilizados nessas etapas. O pré-condicionamento do cartucho 30HCX, foi realizado com 3 mL de MeOH, seguido por 3 mL de água MilliQ/ácido fórmico 0.1%. Um microlitro (1 mL) da amostra foi acondicionada no cartucho précondicionado com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Em sequencia, os cartuchos foram lavados com 3 mL de água MilliQ/ácido fórmico 0.1% e 3 mL de ACN.

Finalmente, os compostos alvos foram eluídos com 3 mL de acetronitrila/amônia (v/v; 95%:5%), e depois 3 mL de MeOH/amônia (v/v; 95%:5%) com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As frações foram evaporadas em uma corrente de gás de nitrogênio a 30°C até a secura, sendo resuspendidas em 200 µL de ácido trifluoroacético 0,1%, e filtradas através de um filtro de 0,22 μm antes da análise cromatográfica. Dois microlitros (2 µL) foram injetados em um sistema UPLC/ESI/Q-TOF.

Os métodos de extração em fase sólidas (SPE) supracitados forram a versão final de um processo de otimização realizado ao longo da pesquisa. Na tabela 3, é simplificado todos os métodos SPE testados. Ao longo do processo de otimização das etapas SPE foram avaliados concomitantemente a influência da temperatura de evaporação em gás de nitrogênio, bem como a influência do equipamento usado para a evaporação. Os equipamentos utilizados e testados para a evaporação das amostras foram do tipo Turbovap, na qual o nitrogênio é injetado individualmente nos tubos e a temperatura é controlada através do banho-maria associado, e o outro sistema foi do tipo SpeedVac (Fig. 18), associado com a centrifugação e uma bomba de vácuo, apresentando também controle de temperatura.

Figura 18. Speedvac (a) e Turbovap (b) utilizados para evaporação de amostras.

Fonte: Labcare, UK.

Análise LC-MS/ESI (Q-ToF)

As análises em cromatografia líquida foram realizadas em UPLC-ESI/Q-TOF (Waters, França) acoplado a um Bruker Q-TOF detector de massa (Bruker, Germany). A separação cromatográfica dos AGEs, foi realizada com o uso de uma coluna Acquity HSS C18 SB column (150 mm x 2,1 mm, 1,8 µm; Waters Inc.) e com fase móvel composta por água/ácido fórmico 0.1% (fase móvel A) e ACN/ácido fórmico 0.1% (fase móvel B), com taxa de fluxo de 0,3 mL/min, com gradiente de concentração modificando conforme a seguir: 0-3 min, 1-8% B; 3-8 min, 8-30% B; 8-13 min, 30% B; 13-13.5 min, 30-1% B; 13.3-18 min, 1% B, sendo injetado um volume de 2 µL das amostras. Os AGEs foram determinados de acordo com a sua área de pico dos íons selecionados nos cromatogramas, obtidos de um total de íons As soluções estoques de AGEs, foram preparadas com TFA 0,1%, conforme as recomendações do fabricante e armazenadas a -20°C. A partir dessas soluções foi preparado uma mistura de AGEs, nas concentrações de 30 ppm (3 µg/mL), 4,5 ppm (0,45 µg/mL), 6 ppm (0,6 µg/mL) e 3 ppm (0,3 µg/mL), de CML, Pen, Pyr e IS, respectivamente. Essa diluição foi utilizada como base para a otimização das condições de análise no UPLC/ESI/Q-TOF e da etapa de concentração e purificação por SPE. O equipamento foi operado em modo positivo, com fase móvel de água/ácido fórmico 0,1% (fase móvel A) e ACN/ácido fórmico 0,1% (fase móvel B) -.

O tempo de retenção obtido para os AGEs foi de 1.3 min, 3.8 min, 5.7 min, e 6.8 min para CML, Pen, Pyr e IS, respectivamente (Fig. 19). [START_REF] Teerlink | Measurement of Ne-(carboxymethyl)lysine and Ne-(carboxyethyl)lysine in human plasma protein by stable-isotope-dilution tandem mass spectrometry[END_REF]ZHANG et al., 2011). A quantificação dos AGEs das amostras, foi comparado com o padrão interno em termos de tempo relativo de retenção e abundância relativa dos três analitos alvos. espectro, podem ser analisados por um detector que funciona nesta região do espectro, sendo chamado de detector de absorção no visível [START_REF] Patonay | HPLC Detection: Newer methods[END_REF].

Como a carboximetilisina, não absorve energia pelos detectores UV (Fig. 22), somente a pentosidina e pirralina apresentaram absorção de energia nos comprimentos de onda 325 nm e 298 nm, respectivamente. Desta forma, a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi uma técnica bastante útil para determinar os 3 AGEs de forma simultânea num mesmo método cromatográfico.

Fase móvel

Conforme Schettegen et al. ( 2007) e Zhang et al. (2011), a análise de CML por HPLC de fase reversa sem derivatização (derivado fluorescente, por exemplo) é difícil, devido à sua elevada polaridade, sendo pouco recuperado em colunas de fase reversa, além dos efeitos de supressão de íons da coeluição de componentes da matriz polar, que afeta significativamente a sensibilidade da análise. Além de resultar numa rápida deterioração da coluna [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF]. O uso de ácido nonafluorpentanoíco na acidificação da fase móvel para análise de AGEs é observada em vários trabalhos (ZHANG et al., 2011;TROISE et al., 2014[START_REF] Assar | Determination of Ne-(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry[END_REF], mas seus efeitos para o equipamento não são relatados.

A entrada de uma fase móvel com elevada acidez pode contaminar a fonte de íons do espectrômetro de massa. A utilização do NFPA na fase móvel gera um nível muito elevado de contaminação em todo o sistema cromatográfico, permanecendo durante vários meses no equipamento e gerando grandes ruídos de fundo quando utilizado em modo ESI negativo. A eliminação completa do NFPA é muito difícil, dispendioso, e demorado. No entanto, apesar do NFPA não ser um reagente de emparelhamento iónico ideal devido à sua forte acidez (pH 2,0), a resolução e sensibilidade do equipamento pode ser melhorada significativamente quando utilizado na fase móvel (ZHANG et al., 2011).

Depois de estabelecida as condições UPLC/ESI/Q-TOF, foi observado que mesmo sem o uso de NFPA na fase móvel, foram obtidos resultados satisfatórios, (mostrado na figura 19) utilizando a fase móvel água/ácido fórmico 0,1% e ACN/ácido fórmico 0,1% (pH 2,7), com picos e tempo de retenção bem definidos.

Dessa forma, eliminou-se o problema de contaminação da fonte. Outras fases móveis foram testadas (bicarbonato de amônia 5 mM, formato de amônia e ácido acético), mas não apresentaram bons resultados, sendo, portanto descartadas (Fig. 23). [START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF] também observou resultados satisfatórios para determinação de CML com a fase móvel água/ácido fórmico 0,1% e ACN/ácido fórmico 0,1%. min (Fig. 19), observa-se nos cromatogramas acima, que esse tempo de retenção é deslocado para 8.9 min, quando utilizado a fase móvel bicarbonato de amônia 5mM (pH 7.9), com formato de amônia (pH 3.9) o tempo de retenção é reduzido para 2.0 Apesar do uso de NFPA na fase móvel para determinação de AGEs, ser quase um consenso, outras fases móveis também foram utilizadas por outros pesquisadores, como o uso de MeOH/ acetato de amônia 2 mM/ ácido fórmico 0,1% (fase móvel A) e água/acetato de amônia 2 mM/ ácido fórmico 0,1% (fase móvel B), utilizada por [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF] e ACN (fase móvel A) e água (fase móvel B), utilizada por [START_REF] Kuang | Quantitative determination of ɛ-N-carboxymethyl-L-lysine in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[END_REF].

Método SPE

Um método adequado de concentração e purificação por SPE, é essencial para a determinação de AGEs. Protocolos de extração que incluem precipitação protéica, digestão enzimática e hidrólise ácida, são bem definidos e fundamentados na literatura [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF][START_REF] Fenaille | Modifications of milk constituents during processing: A preliminary benchmarking study[END_REF][START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF], mas o processo de concentração e purificação por SPE são quase sempre realizados com cartuchos C18 [START_REF] Hegele | Comparative LC-MS/MS profiling of free and protein-bound early and advanced glycation-induced lysine modifications in dairy products[END_REF]. Porém, os resultados obtidos neste trabalho com os cartuchos C18 não foram satisfatórios, sendo testado alternativamente o cartucho de troca iônica (30HCX), que apresentou boas taxas de recuperação. O uso desse tipo de cartucho para determinação de AGEs, já é relatado na literatura [START_REF] Sun | Formation of advanced glycation endproducts in ground beef under pasteurisation conditions[END_REF]ZHANG et al., 2011). No entanto, seu uso para determinação de AGEs em derivados lácteos, é restrito, e em particular para concentração e purificação de pirralina.

Sorbentes SPE são mais comumente classificados pela natureza de sua interação primária ou mecanismo de retenção com o analito de interesse. Os mecanismos de extração mais utilizados na SPE são a fase reversa, fase normal e troca iônica.

Cartuchos C18

As extrações de fase reversa são comumente utilizadas para extrair hidrofóbicos ou mesmo os analitos orgânicos polares de uma amostra/matriz observou-se a presença de pirralina nas amostras de leite integral submetida tanto ao procedimento de precipitação protéica e de digestão enzimática (Fig. 29). 

Quantificação de AGEs

A quantificação de AGEs, foi realizada com as amostras submetidas a digestão enzimática e precipitação protéica. As amostras submetidas à hidrólise Leite Cru 0,023 ± 0,00707 nd Leite integral em pó 0,035 ± 0,00513 1,467 ± 0,05774

Leite semidesnatado em pó 0,059 ± 0,00889 0,150 ± 0,21213

Leite desnatado em pó 0,021 ± 0,00071 0,967 ± 0,11547 Leite esterilizado 0,072 ± 0,00643 8,367 ± 0,70946 nd.: não detectado Nas amostras de leite cru (isto é, sem aquecimento), sujeito a digestão enzimática, nenhum vestígio de Pyr foi detectado. As mesmas amostras, quando submetido à precipitação das proteínas, revelaram a presença de 0,023 ng/mg - 1 proteínas do leite -1 de Pyr livre . Esta concentração encontrada no leite cru com certeza é da Pyr, pois este valor foi muito próximo do LoQ (não determinado pelos critérios da ICH neste trabalho), mas permaneceu em todas as amostras, superior a 10 vezes ao ruído de fundo encontrado nos cromatogramas relacionados com a análise das amostras de leite cru.

O tratamento térmico aplicado ao leite certamente é a causa do aumento dos níveis de Pyr, observado no leite esterilizado, pois essas amostras foram provenientes do leite em pó integral, diferindo apenas pela aplicação da temperatura. Esse aumento foi observado tanto nas amostras de leite esterilizado submetidas à precipitação como a digestão enzimática, onde os valores para Pyr encontrados variaram de 0,072 a 8,367 ng/mg -1 proteínas do leite -1 de Pyr livre e

Pyr conjugada , respectivamente.

Para os cálculos de quantificação, usou-se a seguinte fórmula:

𝑄𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (µ𝑔/𝑚𝑔) = S2 S4 ⁄ S1 S3 ⁄ x C1 x 0,2 M V1 x V2
S 1 : área do pico da pyr com o padrão.

S 2 : área do pico da pyr no leite contaminado. A presença de pirralina foi observada em todas as amostras analisadas, leite em pó integral, semidesnatado, desnatado, leite cru microfiltrado e esterilizado, sendo mais proeminente nas amostras de leite esterilizado, comprovando dessa forma, que o tratamento térmico contribui significativamente para o aumento de Pyr no leite. Os valores quantificados nas amostras submetidas à precipitação protéica, variaram entre 0,021 (leite desnatado) a 0,072 Pyr livre ng/mg -1 proteínas do leite -1 (leite esterilizado). E nas amostras submetidas à digestão enzimática esses valores foram de 0,150 (leite semidesnatado) a 8,367 Pyr conjugada ng/mg -1 proteínas do leite -1 (leite esterilizado). Pôde-se observar que a CML foi degradada durante as etapas de digestão, sugerindo que estudos de melhoria desse procedimento sejam realizados, a fim de reduzir o tempo de digestão, evitando assim a degradação de CML.

Por falta de tempo, o método de análise proposto não pôde ser validado pelos critérios do ICH (Harmonised Tripartite Guideline).

PERSPECTIVAS

Para concluir este estudo, devemos atingir a completa validação do método analítico desenvolvido com amostras biológicas e de alimentos, em particular, para os produtos lácteos. Também deve ser colocado em prática um estudo abrangente para aperfeiçoar a etapa de hidrólise enzimática. Na verdade, esta hidrólise requer o domínio de numerosos parâmetros, tais como temperatura, pH, força iônica, concentração de enzimas, coquetéis enzimáticos, e a ordem na qual elas devem estar para obtenção do sucesso do método.

Para realizar esse estudo é necessário estabelecer uma verdadeira reflexão com base na avaliação quimiométrica do design da matriz multidimensional, design experimental e análise estatística dos resultados dos componentes principais.

  Cependant, cette phase apolaire n'est pas sélective ni affine pour des composés aussi polaires que le sont les AGEs, et cela même si des agents d'appariement d'ions sont ajoutés dans le solvant d'élution. Le but de ce travail a concerné la mise au point d'une méthode d'analyse complète (extraction, purification, séparation et détection) des trois AGEs les plus souvent retrouvés dans les aliments soumis à un traitement thermique (CML, Pent et Pyr) et faisant partie des produits finaux de glycation avancée. Nous avons choisi d'étudier une matrice riche en protéine et en sucres, à savoir le lait en poudre, très consommé tant en France qu'au Brésil et représentant de ce fait une importante source d'exposition de la population à ces composés potentiellement toxiques.

  .d: EIC 205.1100±0.01 +All MS G7-ok_2µl_3249.d: EIC 135.5800±0.01 +All MS G7-ok_2µl_3249.d: EIC 175.1200±0.01 +All MS G7-ok_2µl_3249.d: EIC 181.0700±0.01 +All MS

  Fig.1.

  de cartouche et d'éluant pour purifier et concentrer les 3 AGEs. Il est en effet envisageable d'utiliser l'ANFP en tant que contre-ion pendant l'étape de purification par SPE puisque ce composé ne sera retrouvé qu'en très faibles quantités dans l'échantillon. S'il était utilisé comme contre-ion en chromatographie, il serait injecté en continu dans la phase mobile et serait alors à même d'induire les importantes contaminations déjà citées précédement. Les résultats obtenus sont présentés dans v le tableau 1. Nous observons que les rendements obtenus pour les 3 AGEs sont d'environ 65%, donc très loin d'être satisfaisants. En effet, malgré utilisation de plusieurs contre-ions (dont l'ANFP), une partie des AGEs a été éluée pendant l'étape de lavage destinée à éliminer les composés interférants.

Figure 2 .Figure 3 .

 23 Figure 2. Chromatogramme reconstitué de l'ion m/z 175,12 qui présente deux pics, respectivement celui de la Pyr (tr 5,7 min) et celui de son ester (tr = 7,5 min) (a), et spectres de masse correspondant à tr = 5,7 min (b) et tr = 7,5 min (C).

S 3 :

 3 surface du pic du standard de la théophylline S 4 : surface du pic de la théophylline dans le lait C 1 : concentration de la solution du standard en µg/mL M : prise d'essai en mg V1 : Volume total de la solution obtenue avant l'étape de SPE en mL V2 : Volume déposé sur cartouche SPE en mL

Figure 4 .

 4 Figure 4. Chromatogramme reconstruit de l'ion m/z 175,12, montrant la présence de Pyr libre dans le lait frais soumis à une analyse comprenant une précipitation des protéines

Figura 2 .

 2 Figura 2. Geração de aldeídos intermédiarios e degeneração de proteína envolvidos na formação de produtos AGEs

Figura 3 .

 3 Figura 3. Estrutura do Hidroximetilfurfural (HMF).

Figura 4 .

 4 Figura 4. Estrutura da Furosina.

  é o produto de reação de Maillard mais estável, apresentando baixa reatividade, podendo ser produzida por degradação de produtos de Amadori, tal como N ε -(frutosil)lisina, que sofre oxidação para formar N εcarboximetilisina.Neglia et al. (1985) observaram, por espectroscopia RMN 13C, que as estruturas e as conformações de equilíbrio de aductos Amadori, nas proteínas, eram idênticas às obtidas para o composto Amadori modelo, Nα-formil-N Ɛ -frutoselisina (fFL). Pouco tempo depois,Ahmed et al. (1986) estudaram as reações de fFL e verificaram que o composto, N Ɛ -carboximetillisina (CML), corresponde ao produto maioritário, formado na degradação oxidativa do fFL, sendo também observada a formação de ácido eritronico (EA) (Fig.5). Esses pesquisadores mostraram que o composto CML é formado ao nível das proteínas, nas condições vulgarmente usadas na glicação in vitro, verificando também, que CML é detectado no colágeno e ao nível das proteínas do cristalino humano. Em concordância com a formação do composto CML, resultante da clivagem oxidativa entre as posições C-2 e C-3 da cadeia do açúcar coordenado do produto Amadori fFL[START_REF] Saraiva | Espectrometria de massa aplicada ao estudo da reacção de Maillard[END_REF].Ahmed et al. (1988) identificaram posteriormente uma nova série de produtos formados na clivagem oxidativa de fFL, entre as posições C-3 e C-4 da cadeia do açúcar do produto Amadori, como sendo, os compostos ácido láctico 3-( N Ɛ -lisina) (LL) e ácido D-glicérico (Fig.5

  Nagaraj (2001) (Fig.6b). Os investigadores sugeriram que duas ou três moléculas de carboidratos (gliceraldeído), eventualmente formadas durante a clivagem oxidativa de produtos iniciais da reação de Maillard, estão envolvidas na formação da pentosidina(CHELLAN;NAGARAJ, 2001). Em relação à formação da pentosidina in vivo,Odetti et al. (1992) constataram que os níveis de pentosidina nas proteínas do plasma eram elevados em estados de uremia, em comparação com a diabetes, apesar de não se notar um aumento dos níveis de açúcar no sangue. No entanto, Chatterjee e Banerjee (1979), observou aumento dos níveis de ascorbato em indivíduos urêmicos, o que suporta a evidência de que a formação da pentosidina pode resultar da reação de outros açúcares, e não unicamente de pentoses, como a ribose.Bailey et al. (1995), também constataram que cross-links fluorescentes adicionais podem ser observados nas reações da glicose e ribose com o colágeno.

Figura 6 .

 6 Figura 6. Mecanismos de formação da pentosidina, através de pentoses (a) e de gliceraldeído (b).

Figura 8 .

 8 Figura 8. Interação AGE-RAGE.

  3.2.3. Ação benéfica sobre a saúde associada aos AGEs Apesar de grande parte dos estudos se concentrarem nos potenciais efeitos nocivos dos PRM, existem evidências de efeitos benéficos destes compostos sobre o organismo. Esses efeitos positivos têm despertado interesse na investigação dos mecanismos de ação e dos produtos específicos responsáveis por esses efeitos. De todos os PRM formados durante o processamento de alimentos, os compostos finais, melanoidina, foram mais fortemente associados com efeitos biológicos positivos (DELGADO-ANDRADE, 2013).

Figura 10 .

 10 Figura 10. Representação do dispositivo com sistema extrator a vácuo utilizado na SPE.

  ácidos húmicos, terpenóides farmacologicamente ativos, flavonóides, ácido gálico, ácido protocatecuico A-catecol e floroglucinol[START_REF] Silva | Determinação de compostos fenólicos por HPLC[END_REF]. Também é útil para a extracção de ácidos carboxílicos aromáticos, compostos nitroaromáticos e irreversivelmente retém quinonas.As vantagens de extração por SPE estão na capacidade de suportar amostras em condições fortemente ácidas ou básicas e no seu baixo custo. Um problema associado à SPE é o fato da fase ser uniforme, de modo, a evitar baixa eficiência. Neste método o efeito de matriz pode se antever devido à competição que possa ocorrer entre o analito desejado e os demais componentes da matriz. Em geral, as principais desvantagens da SPE são o maior tempo de execução e complexidade operacional quando realizada de forma manual. Além disso, destaca-se o custo adicional dos cartuchos e discos que são utilizados geralmente uma única vez (LORD; PAWLISZYN, 2000; SILVA, 2012). 3.4.1. Processo de purificação e concentração em fase sólida O processo da extração em fase sólida (SPE) pode ser descrita como sendo um processo cromatográfico simplificado, com o sorvente atuando como fase estacionária. A fase móvel é a água da amostra aquosa durante a etapa de extração ou o solvente orgânico durante a etapa de dessorção (eluição). Altos valores de recuperação são obtidos quando os analitos são fortemente retidos pelo sorvente na presença de água e quando eles têm baixa retenção com o solvente orgânico usado para dessorção. Para a realização da SPE, utilizando-se, por exemplo, C18 ou cartucho de troca iônica, são necessárias quatro etapas, as quais estão demonstradas na figura 11. Elas devem ser otimizadas de forma a obter-se uma recuperação máxima (SIMPSON; WELLS, 2000; WELLS, 2000). A fase líquida é eluída sob pressão ou vácuo e o processo consiste em: I) Condicionamento do sorvente através da passagem de um solvente que condicione a superfície do sólido, removendo quaisquer substâncias que estejam presas; II) Equilíbrio com a remoção do solvente responsável pela ativação; III) Acondicionamento da amostra no cartucho: a) O analito de interesse e os interferentes ficam retidos na fase sólida; b) O analito de interesse fica retido e parte dos interferentes passa pela fase sólida; c) O analito de interesse passa pelo sólido e os interferentes ficam retidos na fase sólida, neste caso a fração de interesse é imediatamente coletada;

Figura 11 .

 11 Figura 11. Ilustração da extração em fase sólida

(

  pasteurização lenta) denominado LTLT (Low Temperature Long Time), realizado em temperaturas próximas de 63°C por 30 minutos e a altas temperaturas (pasteurização rápida), esse processo é denominado HTST (High Temperature Short Time) realizado a 72°C por 15 segundos (SILVA, 2000). Segundo o regulamento técnico de identidade e qualidade de leite pasteurizado, da Instrução Normativa nº51 de 2002 (BRASIL, 2002), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o leite pasteurizado é o fluído elaborado a partir do leite cru refrigerado na propriedade rural, que apresente as especificações de produção, de coleta e de qualidade dessa matéria-prima contidas em regulamento técnico próprio e que tenha sido transportado a granel até o estabelecimento processador, submetido ao tratamento térmico de 72-75ºC durante 15-20 segundos, em equipamento de pasteurização a placas, dotado de painel de controle com termo-registrador e termo-regulador automáticos, válvula automática de desvio de fluxo, termômetros e torneiras de prova, seguindo-se resfriamento imediato em aparelhagem a placas até temperatura igual ou inferior a 4ºC e envase em circuito fechado no menor prazo possível, sob condições que minimizem contaminações, garantindo que a pasteurização seja eficiente. A pasteurização lenta, não é permitida em estabelecimentos sob Inspeção Sanitária Federal, (SIF) de acordo com o regulamento técnico de identidade e qualidade de leite pasteurizado. A vantagem da pasteurização lenta se dá pelo fato desse tratamento térmico conservar as propriedades do leite o mais próximo do seu estado in natura, principalmente a cor e o sabor (TRONCO 2008).

Figura 13 .

 13 Figura 13. Esquema geral de análise dos AGEs.

Figura 15 .

 15 Figura 15. Hidrólise ácida, preparação das amostras.

Figura 17 .6ª

 17 Figura 17. Fluxograma da digestão enzimática.

Tabela 4 .

 4 (m/z 100-600) em comparação com os obtidos com os padrões de AGEs. O m/z usado para cada AGEs e IS foram de 205,12, 135,65, 175,12 e 181,07 para CML, Pent, Pyr e IS, respectivamente. O sistema UPLC empregado, foi otimizado usando um interface "electrospray" ESI/Q-TOF usando um tensão capilar de 4.5 kV, em modo positivo ESI, e com uma temperatura de dessolvatação do gás a 200°C com um fluxo de 9 L/min, com monitoramento de reação múltipla (MRM). Inicialmente foram estabelecidas as condições cromatográficas dos padrões de CML, pentosidina e pirralina, além da escolha do padrão interno (IS) a ser utilizado (teofilina) durante o desenvolvimento do trabalho. As características principais desses compostos são apresentadas na tabela 4: Características cromatográficos dos padrões.

Figura 19 .Figura 20 .

 1920 Figura 19. Cromatograma com os 205,12 (CML), 135,65 (Pen), 175,12 (Pyr) e 181,07 para IS.

Figura 21 .Figura 22 .

 2122 Figura 21. Produtos de fragmentação iônica de CML (a) Pen (b) e Pyr (c).

Figura 23 .

 23 Figura 23. Comportamento da Pyr mediante diferentes fases móveis. (a) Bicarbonato de amônia 5mM; (b) Formato de amônia; (c) Ácido acético.

  com ácido acético (pH 3.4) esse tempo aumenta para 7.2 min. No entanto, cabe ressaltar que além da mudança do tempo de retenção, verificou-se o surgimento de picos secundários quando se testaram esses solventes como fase móvel (Fig.23).

Figura 27 .

 27 Figura 27. Cromatograma da extração de íons m/z 175,12, correspondendo a um fragmento de Pyr. a) Sobreposição do cromatograma do padrão de Pyr (azul) sobre o mesmo padrão após SPE (vermelho) utilizando MeOH como eluente. (b) Espectro de massa correspondente ao tr = 5.7 min e 7.5 min (c), pós-éster.

  da matriz sobre os AGEs, observou-se o mesmo comportamento para pirralina, nas amostras de leite contaminadas. Nessas amostras a eluição com metanol, também promoveu a formação de éster de metanol. Quando o metanol foi substituído por ACN, o pico de pirralina permaneceu com o tempo de retenção em 5.7 min (Fig.28).

Figura 28 .

 28 Figura 28. Cromatograma da extração de íons m/z 205,12, 135,65, 175,12 e 181,07 (IS), correspondendo aos fragmentos de CML, Pen, Pyr e IS, respectivamente. a) Padrões dos AGES, (b) leite contaminado com os padrões e eluídos com ACN/amônia 5%, e (c) leite contaminado com os padrões e eluídos com MeOH/amônia 5%.

Figura 29 .

 29 Figura 29. (a) Sobreposição dos cromatogramas da extração de íons m/z 175,12 (Pyr) do padrão da Pyr e da amostra de leite integral. (b) Sobreposição dos cromatogramas do leite integral contaminados com AGEs, submetido a SPE (vermelho) e dos padrões de AGEs (preto). A concentração dos padrão e no leite contaminado CML 3,0 µg/mL, Pen 0,45 µg/mL, Pyr, 0,6 µg/mL and I.S. 0,3 µg/mL.

5. 4 .Figura 30 .

 430 Figura 30. Coeficientes de correlação (r2) e intersecção obtidos através da regressão linear das curvas analítica de CML (a), Pen (b) e Pyr (c).

Figura 31 .Figura 32 .Figura 33 .

 313233 Figura 31. Cromatogramas dos AGEs contaminados no leite submetido a digestão enzimática. (a) Amostras contaminadas antes do procedimento de digestão, (b) sobreposição do cromatograma dos padrões (vermelho) sobre o cromatograma das amostras contaminadas antes da digestão (preto).

S 3 :

 3 área do pico da teofilina (I.S.) com o padrão. S 4 : área do pico da teofilina (I.S.) no leite contaminado.C 1 : concentração da solução padrão da pyr em µg/mL. M : massa de proteina de leite utilizada para a precipitação e/ou digestão em mg.V1 : Volume total da solução obtida antes da etapa SPE em mL.V2 : Volume depositado no cartucho SPE em mL.Entre os AGEs utilizados neste trabalho, a pirralina foi o composto que apresentou maior instabilidade. Aproximadamente 30 dias após a sua diluição e armazenamento a -20°C foi observado uma mudança de coloração, após o descongelamento. Problemas de degradação de Pyr, também foram relatados porNajaraj et al. (1996), que observaram coloração de cor rosa no padrão de Pyr diluído, com diminuição de sua forma nativa.O desenvolvimento desse protocolo com a utilização de cartuchos de troca iônica para concentração e purificação na etapa SPE, exigiu muito tempo, portanto, não sendo possível concluir as etapas de validação. No entanto, os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o protocolo desenvolvido, mostrou-se seletivo, linear e com boa recuperação para a determinação de CML, pentosidina e principalmente, pirralina. A obtenção dos coeficientes de correlação (r2) e intersecção obtidos através da regressão linear das curvas analíticas, bem como as taxas de recuperação, são parâmetros de pré-validação, que auxiliará em uma posterior etapa de validação.Cabe salientar que há necessidade de realizar uma otimização do método de digestão enzimático proposto na literatura e utilizado nesse trabalho. Além de ser um método longo (aproximadamente 30 horas) e com várias etapas de tratamento enzimático, observou-se que a CML é degradada ao longo da digestão. Portanto, há necessidade de realizar outros experimentos para comprovar em qual etapa específica dos tratamentos enzimáticos ocorre essa perda.6. CONCLUSÃOFoi possível desenvolver um método completo (extração, purificação e concentração em fase sólida) de quantificação simultâneas dos três AGEs em estudo neste trabalho. Os cartuchos de troca iônica permitiram obter uma correta recuperação na análise dos AGEs, com taxas de recuperação bem mais elevada que aquelas obtidas com cartuchos do tipo C18, normalmente utilizado para quantificação de AGEs em alimentos. No entanto, deve-se ter um cuidado especial durante a eluição desses compostos. O correto procedimento de eluição é fundamental para a quantificação de AGEs com os cartuchos de troca iônica.

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

Les échantillons Pyrraline Pyr libre ng/mg -1 protéines du lait -1 Pyr totaux ng/mg -1 protéines du lait -1

  observée dans les échantillons soumis à la précipitation et la digestion enzymatique, où les valeurs de Pyr retrouvées étaient de 0,072 et 8,367 ng respectivement. Ces chiffres indiquent clairement le fait que la majorité de la Pyr retrouvée est sous forme liée aux protéines du lait. Nous avons tous regretté l'impossibilité de valider cette méthode d'analyse selon les critères de l'ICH. Une telle validation requiert en effet beaucoup de temps dont nous ne disposions pas. Par contre, elle aurait permis d'assoir nos résultats sur une base sure. Corroborant ces résultats, Hegele et al. (2008) ont également observé la présence de Pyr dans des échantillons de lait cru soumis à la précipitation des protéines. Ils ont observé des valeurs moyennes pour Pyr de 55,0 nmol/µmol -1 Lys -1 . Zhang et al. (2011) ont

					ix
	Les teneurs en protéines du lait (exprimées en mg), ont été obtenues selon les
	informations contenues sur l'étiquetage des échantillons analysés.
	Les concentrations de Pyr mesurées augmentaient lorsque des procédés
	thermiques étaient appliqués au lait préalablement à leur analyse (Tableau 2).
		Tableau 2. Quantification de la Pyr libre et totale dans le lait
					Pyr dans le lait
	Lait cru			0,023 ± 0,00707	nd
	Lait entier en poudre		0,035 ± 0,00513	1,467 ± 0,05774
	Lait	demiécrémé	en	0,059 ± 0,00889	0,150 ± 0,21213
	poudre				
	Lait écrémé en poudre		0,021 ± 0,00071	0,967 ± 0,11547
	Lait stérilisé		0,072 ± 0,00643	8,367 ± 0,70946
	Nd. non détecté			
	Pyr				

libre : lait soumis a une precipitation des protéines Pyr total : lait soumis a une digestion enzymatique Dans les échantillons de lait cru (donc non chauffés), soumis à une digestion enzymatique, aucune trace de Pyr n'a pu être détectée. Les mêmes échantillons, lorsque soumis à une précipitation des protéines, ont révélés la présence de 0,023 ng de Pyr libre par mg de protéine de lait. Cette concentration retrouvée dans le lait cru n'est pas sans poser de questions. Cette valeur est très proche de la LoQ (non déterminée selon les critères de l'ICH dans ce travail), mais reste toutes fois supérieure à 10 fois le bruit de fond retrouvé dans les chromatogrammes afférents à cette analyse des échantillons de lait crus (figure

4

).

Le traitement thermique appliqué au lait est certainement la cause la plus probable de l'élévation du niveau Pyr observé dans le lait stérilisé. Cette x augmentation a été également rapporté la présence de Pyr dans les échantillons de amandes grillées, Ils ont observé 1,1 mg/kg pour la Pyr libre et 12,6 mg/kg pour la Pyr totaux. Il importe à le lecture de ces chiffres, de noter que nos résultats sont exprimés en ng d'AGEs par mg de protéine alors que ceux Hegele et al le sont en nmol d'AGEs par µmole de lysine, ce qui est très différent.

Pyr dans le lait Pyr Standard 6.0 µg/mL xi possède

  une zone de linéarité intéressante et permet d'obtenir des taux de recouvrement très élevés, proches de 100%, pour les trois AGEs recherchés (carboxyméthillysine, pentosidine et pyrraline). Malheuresement, le temps disponible nous a interdit de réaliser la validation de cette méthode selon les critères de l'ICH.Lors de notre travail, nous avons déjà pu déterminer un certain nombre de paramètres de prévalidation de ce protocole, tels que les pentes des droites de linéarité, leurs coefficients de corrélation, leurs ordonnées à l'origine ainsi que les valeurs des taux de recouvrements. Il s'agit là d'une bonne partie du travail de validation et ces déterminants représentent une valeur ajoutée indéniable à la caractérisation de ce protocole et montre que la validation complète de ce protocole

purification/concentration par SPE sur une cartouche échangeuse de cations. Cette étape est fondamentale car elle permet de séparer les AGEs du reste des protéines alimentaires. Nos résultats démontrent bien que ce protocole est sélectif, qu'il sera facilitée et réalisable avec succès. Par contre, la méthode de digestion enzymatique demande encore à être optimisée en terme de durée. Elle dure en effet 30 heures aujourd'hui, elle est complexe (elle nécessite 4 étapes d'hydrolyse) et présente encore l'inconvénient de dégrader la caboxyméthyllysine dont la surface des pics chromatographiques diminue lors de l'application de cette hydrolyse enzymatique.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

  Reação de Maillard. ................................................................................. Geração de aldeídos intermediarios e degeneração de proteína envolvidos na formação de produtos AGEs ............................................................. Estrutura do Hidroximetilfurfural (HMF). ................................................... Estrutura da Furosina. .............................................................................. Via envolvidas na formação de carboximetilisina (CML). ......................... Ácido acético. .................................................................................................................... . ........................................................................................... Extração em Fase Sólida (SPE) ............................................................... Características cromatográficos dos padrões. ......................................... Eluição de CML na SPE com C18 ........................................................... Taxa de recuperação de CML após SPE com C18 .................................. Diferentes condições testadas com o cartucho 30HCX ............................ Taxa de recuperação de CML, pentosidina e pirralina, em amostras de leite contaminadas. .................................................................................................. Taxa de recuperação dos padrões de CML, pentosidina e pirralina. ........ Níveis de concentração dos AGEs para contrução da curva de calibração ................................................................................................................ .................................................................. 1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 2.1. Geral ............................................................................................................. 2.2. Específicos....................................................................................................

	LISTA DE FIGURAS Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 19. Cromatograma dos padrões de AGEs, m/z 205,12 (CML), 135,65 (Pyr) do padrão da Pyr e da amostra de leite integral. (b) Cromatogramas do leite integral submetido a SPE contaminado com AGEs (vermelho), e dos padrões de AGEs (preto). A concentração dos padrões e no leite contaminado, CML 3,0 µg/mL, Pen 0,45 µg/mL, Pyr, 0,6 µg/mL and I.S. 0,3 µg/mL. .................................... Figura 30. Coeficientes de correlação (r2) e intersecção obtidos através da regressão linear das curvas analítica de CML (a), Pen (b) e Pyr (c). ........................ Figura 31. Cromatogramas dos AGEs contaminados no leite submetido a digestão enzimática. (a) Amostras contaminadas antes do procedimento de digestão, (b) sobreposição do cromatograma dos padrões sobre o cromatograma das amostras contaminadas antes da digestão........................................................ Figura 32. Cromatogramas da sobreposição do padrão de Pyr com as picos encontrados nas amostras de leite submetidas à precipitação protéica. (a) Leite Figura 34. Observação de traços de pentosidina. (a) Cromatograma da LISTA DE TABELAS protéica (Pyr livre ) e digestão enzimática (Pyr conjugada ). ............................................... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS HbA1c -Hemoglobina glicada A1c HPLC -High Performance Liquide Chromatography HTST -High Temperature Short Time LAL -Lisinoalanina LDL -Low Density Lipoprotein LL -Ácido láctico 3-(Nɛ-lisino) LTLT -Low Temperature Long Time MDA -Malondialdeído MeOH -Metanolo MRM -Monitoramento de reação múlitpla m/z -Razão massa/carga (mass to charge ratio) NFPA -Nonafluoropentanoic acid RAGE -Receptor de Produtos da Glicação Avançada SUMÁRIO (Pen), 175,12 (Pyr) e 181,07 para IS. Figura 23. Fases móveis testadas. Comportamento da pirralina, com as fases sobreposição do padrão de Pen com o pico encontrado nas amostras de leite submetidas à digestão enzimática, (b) extração de íons na amostra de leite m/z RP-HPLC -Reverse Fase/ High Performance Liquide Chromatography RI -Resistência à insulina móvies: (a) Bicarbonato de amônia 5mM; (b) Formato de amônia; (c) Figura 24. Método SPE com cartucho C18 ............................................................. Figura 25. SPE com o cartucho 30HCX de acordo com as recomendações do fabricante ................................................................................................................. Figura 26. Condição SPE com o cartucho 30HCX, substituindo MeOH por ACN .... Figura 27. Cromatograma da extração de íons m/z 175,12, correspondendo a um fragmento de Pyr. a) Sobreposição do cromatograma do padrão de Pyr (azul) sobre o mesmo padrão após SPE (vermelho) com MeOH como eluente. Espectro de massa correspondente ao tr = 5.7 min (b) e 7.5 min (c), pós-éster...................... Figura 28. Cromatograma da extração de íons m/z 205,12, 135,65, 175,12 e 181,07 (IS), correspondendo aos fragmentos de CML, Pen, Pyr e IS, respectivamente. a) Padrões dos AGES, (b) leite contaminado com os padrões e eluídos com ACN/amônia 5%, e (c) leite contaminado com os padrões e eluídos com MeOH/amônia 5%Figura 29. (a) Sobreposição dos cromatogramas da extração de íons m/z 175,12 135,59 correspondendo a um fragmento de Pen, (c) extração de íons na amostras de leite m/z 167,10 correspondendo ao outro fragmento de Pen. ............................ 80 Tabela 1. Teor de Produtos da Reação de Maillard (PRM) em alguns alimentos. ... Tabela 2. Conteúdo de proteínas e valores utilizados das amostras de leite utilizadas para análise de AGEs............................................................................... CF -Compostos Fluorescentes CLAE -Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CML -N ε -carboximetilisina/Carboximetilisina DM2 -Diabetes Mellitus tipo 2 ELISA -Enzyme Linked Immunosorbent Assay ESI -Ionização por eletro pulverização fFL -Na-formil-Nɛ-frutoselisina GC/MS -Cromatografia Gasosa ligada a Espectrometria de Massa HCl -Ácido clorídrico HMF -Hidroximetilfurfural TFA -Ácido trifluoroacético UHT -Ultra High Temperature UPLC -Ultra Performance Liquid Chromatography UV -Radiação utlravioleta Tabela 3. Tabela 4. Tabela 5. Tabela 6. Tabela 7. Tabela 8. Tabela 9. Tabela 10. Tabela 11. Quantificação de Pyr em amostras de leite, submetidos à precipitação ACN -Acetonitrila RPM -Rotação por minutos RÉSUMÉ .................................................................................................................. i AGEs -Advanced Glycation End Products SIF -Inspeção sanitária federal LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... ALE -Produtos Finais de Lipoxidação SRM -Monitoramento de reação selecionada APCI -Ionização química de pressão atmosférica SPE -Solid phase extraction LISTA DE TABELAS ...............................................................................................
	integral, (b) leite semidesnatado, (c) leite desnatado e (d) leite esterilizado. ............ NO -Monóxido de oxigênio
	Figura 33. Cromatogramas da sobreposição do padrão de Pyr com as picos PRM -Produtos da Reação de Maillard
	encontrados nas amostras de leite submetidas à digestão enzimática. (a) Leite PEN -Pentosidina
	integral, (b) leite semidesnatado, (c) leite desnatado e (d) leite esterilizado. ............ PYR -Pirralina
	Q-TOF -Quadruplo time-of-flight

Figura 6. Mecanismos de formação da pentosidina, através de pentoses (a) e de gliceraldeído (b). ...................................................................................................... Figura 7. Mecanismo de reação para a formação do AGE pirralina (a), e para a formação de outros cross-links pirralina (b). .............................................................

Figura 8. Interação AGE-RAGE..............................................................................

Figura 9. Efeitos biológicos possíveis dos produtos de reação de Maillard (PRM) e produtos finais de glicação avançado (AGEs). ...................................................... Figura 10. Representação do dispositivo com sistema extrator a vácuo utilizado na SPE. .................................................................................................................... Figura 11. Ilustração da extração em fase sólida. ................................................... Figura 12. Ilustração esquemática da espectrômetro de massa em tandem no modo MRM. ............................................................................................................. Figura 13. Esquema geral de análise dos AGEs. .................................................... Figura 14. Fluxograma da precipitação protéica. ..................................................... Figura 15. Hidrólise ácida, preparação das amostras. ............................................. Figura 16. Fluxograma da hidrólise ácida. ............................................................... Figura 17. Fluxograma da digestão enzimática. ......................................................

Figura 18. Speedvac (a) e Turbovap (b) utilizados para evaporação de amostras. . ......................................................................

Figura 20. Modo de operação positvo/negativo do electrospray. ............................. Figura 21. Produtos de fragmentação iônica de CML (a) e pirralina (b). .................. Figura 22. Perfil m/z e UV de CML (a), pentosidina (b) e pirralina (c) ......................

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

  ......................................................................... 3.1. Produtos de glicação ..................................................................................... 3.1.1. Formação de produtos de glicação e reação de Maillard ......................... 3.1.2. Produtos de glicação avançada e de reação de Maillard ......................... 3.1.2.1. Hidroximetilfurfural ................................................................................ Ação dos AGEs em diabéticos ................................................................. 3.2.3. Ação benéfica sobre a saúde associada aos AGEs ................................. 3.3. Análise de produtos de reação de Maillard ................................................... AGEs em leite e derivados ............................................................................ 3.7. Tipos de tratamentos térmicos aplicados no processamento do leite ............ 3.7.1. Pasteurização ........................................................................................

	3.1.2.2. Furosina ................................................................................................ 3.1.2.3. N ε -Carboximetilisina .............................................................................. 3.1.2.4. Pentosidina ........................................................................................... 3.1.2.5. Pirralina ................................................................................................ 3.2. Implicações para a saúde dos AGEs nos alimentos ...................................... 3.2.1. Ação dos AGEs no processo de envelhecimento, catarata e aterosclerose.. ................................................................................................... 3.2.2. 3.4. Solid Phase Extraction (SPE) ........................................................................ 3.4.1. Processo de concentração e purificação em fase sólida..........................35 3.5. Liquid Chromatography Electro Spray Ionization Tandem Mass Spectrometry (LC-ESI-MS-MS) ................................................................................................... A reação de Maillard se caracteriza por interações amino-carbonilo de natureza não enzimática entre açúcares redutores ou lipídios oxidados a proteínas, aminofosfolipídeos ou a ácidos nucléicos (MONARO, 2012). Na tecnologia de alimentos, os produtos da reação de Maillard (PRM) têm chamado à atenção, uma vez que seus produtos adicionam características desejáveis nos alimentos, como 3.6. 1. INTRODUÇÃO cor, odor e sabor

  ). Por cromatografia gasosa, os investigadores verificaram a detecção de LL em proteínas glicadas in vitro, e constataram, igualmente, que LL é um produto natural, existente nas proteínas do cristalino humano e na urina(AHMED et al., 1986). Com resultados obtidos da clivagem oxidativa do produto de arranjo de Amadori, fFL, em que a formação dos compostos CML e LL fora observada, conjuntamente com o fato de CML e LL terem sido observados in vitro e in vivo, é possível concluir que a degradação do produto de Amadori, nas proteínas, constitui uma importante via reacional nos processos de glicação in vivo[START_REF] Saraiva | Espectrometria de massa aplicada ao estudo da reacção de Maillard[END_REF]. Teor de Produtos da Reação de Maillard (PRM) em alguns alimentos.

		Tabela 1. Alimento	Carboximetilisina	Alimento	Carboximetilisina
				(KU/100g)*		(KU/100g)*
	Óleos		Manteiga Margarina	26.480 17.520	Molho para salada Semente de abóbora	740 1.853
	de		Maionese	9.400	Pistache	380
	Grupo		Óleo de oliva Amendoim	11.900 6.447	Cream cheese Amêndoa	10.883 5.650
			Carne bovina grelhada	7.479	Ovos fritos	2.749
	Glomb e Monnier (1995) estabeleceram a hipótese de que um mecanismo reacional que envolvesse a formação de glioxal e de glicolaldeído poderia contribuir Grupo das Carne bovina cozida 2.687 Bacon 91.577 Carne de frango grelhada 6.639 Atum enlatado com óleo 5.113 Carne de frango cozida 1.210 Queijo parmesão 16.900 Peixe assado 1.212 Queijo cheddar 5.523 Proteínas Peixe frito 3.083 Lingüiça de porco 5.943
			Ovos cozidos	90	Camarão frito	4.328
	Grupo dos	Carboidratos	Panquecas Pães Biscoitos Flocos de milho	2.263 133 1.647 233	Croissant Granola Waffle Macarrão	1.113 427 2.870 242
	(2003) em seu trabalho sobre glicoxidação como uma ameaça aos diabéticos e
	sobre o envelhecimento, quantificou a quantidade de carboximetilisina em diversos
	grupos de alimentos (Tab. 1).			

para a formação de CML e para o cross-linking de proteínas, em condições fisiológicas. Assim, estes investigadores concluíram que a clivagem em C-2 da cadeia de açúcar de produtos precursores do produto Amadori (base de Schiff), constituía uma via reacional para a reação de Maillard, podendo ter um papel importante na formação de CML e no cross-linking de proteínas. A peroxidação lipídica é outra rota para a CML, e o glioxal, tem sido sugerido como um intermediário. A CML é um dos marcadores mais importantes de produtos bioativos da reação de Maillard e seu conteúdo geralmente representa riscos para a saúde, em particular, pela ingestão de alimentos tratados termicamente

[START_REF] Charissou | Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples[END_REF]

. O composto CML pode ser formado in vitro por três vias reacionais distintas: I) clivagem oxidativa de produtos Amadori, como referido anteriormente; II) clivagem oxidativa de precursores de produtos Amadori, bases de Schiff; III) modificação pelo glioxal formado, durante a degradação/autoxidação da glicose

(UNNO et al., 2002)

.

Figura 5. Via envolvidas na formação de carboximetilisina (CML).

Adaptado

de Ahmed et al., (1988)

.

Entre os produtos da reação de Maillard, a CML é o melhor produto de glicação avançada caracterizado, sendo empregado nas pesquisas como marcadores de AGEs e lipoxidação avançada

[START_REF] Goldberg | Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods[END_REF]

. Vlassara et al., *Carboximetilisina determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA). Adaptado de

[START_REF] Vlassara | Glycoxidation: the menace of diabetes and aging[END_REF]

.

3.2. Implicações para a saúde dos AGEs nos alimentos

  

	Diversas doenças tem sido relacionadas com a presença de AGEs no
	organismo, o acúmulo destes compostos não se dá apenas pela alimentação ou
	devido a anormalidades do metabolismo do açúcar, mas também pelo estresse
	oxidativo elevado.
	Em 1949, surgiu o primeiro trabalho indicando que os produtos de reação de
	Maillard poderiam ser prejudiciais aos processos biológicos. Foram avaliados os
	efeitos fisiológicos desses compostos na inibição do crescimento celular, redução da
	digestibilidade, absorção de proteínas, hipertrofia de órgãos, mutações celulares,
	redução das atividades de enzimas pancreáticas, intestinais, hepáticas e formação
	de complexos com metais (FINOT, 2005).

Os AGEs podem causar danos aos tecidos por: modificação da função da proteína devido a alterações em sua estrutura/configuração, modificação do tecido, devido às ligações cruzadas (cross-links) inter e intramolecular, formação de radicais livres, e indução de respostas inflamatória após ligar-se a receptores específicos RAGE (Receptor de Produtos da Glicação Avançada), receptores de membrana celular, cuja atividade aumenta proporcionalmente à concentração de AGEs

os AGEs Efeitos sobre o envelhecimento Doenças neurodegenerativas, aterosclerose e diabetes Efeitos sobre o Intestino

  

	3.2.1. Ação dos AGEs no processo de envelhecimento, catarata e aterosclerose
	Os produtos de glicação avançada (AGE), por sua vez, são implicados no

envelhecimento e na perda de funcionalidade de tecidos que não são dependentes de insulina e, por isso, encontram-se expostos a concentrações elevadas de glicose (como o cristalino, a membrana basal das arteríolas, as células nervosas e

Tipo de leite Conteúdo de proteína indicado no rótulo/100 mL Diluição do leite contendo 100 mg de proteínas

  

	Leite em pó integral	26 g	2,47 mL
	Leite em pó semidesnatado	31 g	2,63 mL
	Leite em pó desnatado	36 g	2,49 mL
	Leite esterilizado integral	26 g	2,47 mL
	Leite cru ultrafiltrado	32 g	3,12 mL

Tabela 3 .

 3 Extração em Fase Sólida (SPE) 

	Etapas	Cartucho C18		Cartucho polyclean 30HCX	
			Método 1	Método 2	Método 3	Método 4
	Condicionamento	4 mL de MeOH 3 mL de MeOH 3 mL de MeOH	3 mL de	3 mL de
					MeOH	MeOH
	Equilíbrio	4 mL NFPA	3 mL H 2 O	3 mL H 2 O/ácido	3 mL H 2 O/	3 mL H 2 O/
		(10mM)		fórmico 2%	ácido fórmico	ácido fórmico
					0,1%	0,1%
	1ª -Lavagem	4 mL NFPA	3 mL H 2 O	3 mL H 2 O/ácido	3 mL H 2 O/	3 mL H 2 O/
		(10mM)		fórmico 2%	ácido fórmico	ácido fórmico
					0,1%	0,1%
	2ª -Lavagem	4 mL NFPA	3 mL MeOH	3 mL MeOH	3 mL MeOH	3 mL ACN
		(10mM)/MeOH				
		5%				
	Eluição	4 mL MeOH/	4 mL MeOH/	4 mL MeOH/	4 mL MeOH/	3 mL
		NFPA (10mM)	amônia 5%	amônia 5%	amônia 5%	ACN/amônia
		10%				5% + 3mL
						MeOH/
						amônia 5%

  aquosa. As cadeias hidrocarbonadas tanto no analito como no sorvente são atraídas umas às outras por forças de dispersão de van der Waals de baixa energia. Os sorbentes de fase inversa comuns contêm cadeias de hidrocarbonetos saturados pico em tr = 7.5 min, em primeiro lugar apresentou uma parte o íon molecular [M+H] + 269,1470 (formula bruta C 13 H 21 N 2 O 4 ), correspondendo ao éster metílico de Pyr, com um aduto de sódio [M+Na] + m/z 291,1279, e a outra parte, todos os fragmentos

	que seja formado sais entre ele e os AGEs e aumentar a afinidade ao solvente de A matriz complexa do leite pode ter influenciado na taxa de recuperação da Figura 25. SPE com o cartucho 30HCX de acordo com as recomendações do Tabela 7. Diferentes condições testadas com o cartucho 30HCX
	eluição. CML, pois quando se realizou a concentração e purificação por SPE do padrão de fabricante Etapas Cartucho polyclean 30HCX
	tais como C18 e C8, ou anéis aromáticos tais como fenil. Como as extrações em fase reversa são relativamente inespecíficas, uma gama de compostos é tipicamente A etapa de lavagem deve ser realizada, a fim de remover sujeiras presentes nas amostras, que possam prejudicar o funcionamento do sistema UPLC/ESI/Q-TOF, sendo imprescindível para remoção de sais e açúcares de amostras CML, observou que a taxa de recuperação foi superior a 65%, enquanto que a CML das amostras contaminadas antes da SPE, apresentou uma taxa de recuperação inferior a 13%. Método 1 Método 2 Método 3 Condicionamento: 4 mL de MeOH Acondicionamento da amostra: 1 mL Condicionamento 3 mL de MeOH 3 mL de MeOH idênticos ao do padrão da Pyr, m/z 237,12 [M-H 2 O+H] + ; m/z 219,11 [M-2H 2 O+H] + ; 3 mL de MeOH m/z 175,12 [M-2H 2 O-CO2+H] + e m/z 148,11 [M-2H 2 O+H] + . Em efeito, o éster metílico
	retida. Como resultado, é importante optimizar as condições de extração, complexas, como o leite, por exemplo. Nessa etapa os analitos alvos devem 1ª Lavagem: 2 mL de água/ácido fórmico 0,1% Equilíbrio 3 mL H 2 O 3 mL H 2 O/ácido fórmico 2% 3 mL H 2 O/ ácido fórmico 0,1% de Pyr é formado por uma reação entre a Pyr e o metanol, utilizado como solvente
	particularmente a composição do solvente de lavagem. Os analitos são tipicamente permanecer no cartucho, não podendo ser eluídos juntamente com o solvente de 5.3.2. Cartucho 30HCX 2ª Lavagem: 2 mL MeOH 1ª -Lavagem 3 mL H 2 O 3 mL H 2 O/ácido 3 mL H 2 O/ ácido de eluição da SPE. A fim de resolver esse problema de transformação, o metanol foi
	eluídos com solventes orgânicos tais como metanol ou acetonitrilo, em combinação com água, ácidos, bases ou outros solventes e modificadores orgânicos. lavagem. Os AGEs são compostos altamente polares e não são bem retidos nas fases C18. Foi observado entre os AGEs analisados, que a CML apresentou maior Os cartuchos 30HCX utilizam mecanismos de troca iônica para extrair analitos carregados a partir de amostras aquosas ou orgânicas de baixa resistência iônica. fórmico 2% fórmico 0,1% substituído pelo ACN, sendo as demais condições mantidas. Os resultados obtidos Eluição: 4 mL Acido acético/pirrolidina (pH 12) -Fração 1 1 mL Acido acético/pirrolidina (pH 12) -Fração 2 2ª -Lavagem 3 mL MeOH 3 mL MeOH 3 mL MeOH depois dessa substituição confirmam o desaparecimento do éster metílico no tr =7.5
	No caso do uso de cartuchos C18 para extração de AGEs, o eluente e o problema de retenção no cartucho C18. A CML começava a ser eluida durante o Nos cartuchos de troca iônica, os sorbentes carregados são usados para reter 1 mL Acido acético/pirrolidina (pH 12) -Fração 3 Eluição 4 mL MeOH/amônia5% 4 mL MeOH/ amônia 5% 4 mL MeOH/ amônia 5% min permanecendo apenas o pico da Pyr, no tr = 5.7 min.
	solvente de lavagem foram suplementados com NFPA. Neste trabalho, foi utilizado o processo de lavagem do cartucho (Tab. 5), especificamente durante a 2ª lavagem. analitos de carga iônica oposta. Por exemplo, os analitos carregados positivamente 1 mL Acido acético/pirrolidina (pH 12) -Fração 4 O uso de ácido fórmico 0,1% nas etapas de equilíbrio e 1ª lavagem, também
	método de concentração e purificação por SPE descrito por Hegele et al., (2008), Essa eluição precoce, afetou bruscamente na taxa recuperação desse AGE, de contendo aminas são retidos em "permutadores de catiônicos" carregados ajudaram na retenção dos AGEs no cartucho. Quando o ácido fórmico 0,1% foi
	com algumas modificações (Fig. 24). modo que o desempenho da CML na etapa SPE com os cartuchos C18, não foi Figura 26. Condição SPE com o cartucho 30HCX, substituindo MeOH por ACN substituído por água e/ou ácido fórmico 2% como soluções de equilíbrio e lavagem,
	Figura 24. Método SPE com cartucho C18 satisfatória, atingindo baixa taxa de recuperação, como observado na tabela 6. Paralelamente, foram desenvolvidos outros métodos com o cartucho 30HCX, a Condicionamento: 3 mL de MeOH
	fim de se aumentar a taxa de recuperação, utilizando diferentes eluentes, soluções
	Condicionamento: 4 mL de MeOH Tabela 5. Eluição de CML na SPE com C18 de lavagem e de equilíbrio (Tab. 7). Os resultados preliminares com o cartucho de Equilíbrio: 3 mL H 2 O/ ácido fórmico 0,1%
	Equilíbrio: 4 mL de NFPA (10 mM) CML concentração 3,3 µg/mL troca iônica, demonstrava que o pico de pirralina sempre se deslocava, partindo do Frações Acondicionamento da amostra: 1 mL
	Acondicionamento da amostra: 1 mL Teste 1 Rt (min) Área Rt (min) maioria dos contaminantes da matriz são simplesmente enxaguados para o lixo Teste 2 formação de algum tipo de aduto, que provocava o deslocamento da pirralina. Área Apenas as espécies da carga adequada são retidas pela coluna, de modo que a tempo de retenção de 5.7 min para 7.5 min. De alguma forma estava ocorrendo 1ª Lavagem: 3 mL de água/ácido fórmico 0,1%
	1ª Lavagem: 4 mL de NFPA (10 mM) --durante o carregamento e os passos de lavagem. Por esta razão, a SPE de troca 1ª Lavagem --Testou-se a influência do MeOH na formação desse aduto, reconstituindo os 2ª Lavagem: 3 mL ACN
	2ª Lavagem: 4 mL NFPA (10 mM)/MeOH (v/v; 95%:5%) 1.3 67.138 1.3 catiônica é comumente utilizada para a extração de compostos básicos (fármacos e 2ª Lavagem 83.523 padrões de AGEs com solução de MeOH/amônia 5%. Mesmo após esse Eluição: 3 mL ACN/amônia 5% (pH 10,5) + 3 mL MeOH/amônia 5% (pH 10,5)
	Eluição Fração 1 outras aminas) a partir de amostras biológicas complexas. Os analitos são 1.3 66.858 1.3 158.347 procedimento, o deslocamento do pico de pirralina para o tr = 7.5 min, continuou Eluição: 4 mL MeOH/NFPA 10 mM (v/v; 90%:10%) -Fração 1 1 mL MeOH/NFPA 10 mM (v/v; 90%:10%) -Fração 2 Eluição Fração 2 1.3 9.379 1.3 -tipicamente eluídos com sais e tampões de elevada resistência iônica, ácidos ou sendo observado. Ao substituir o MeOH por ACN, observou-se que o ACN não Apesar do problema de transformação da pirralina, observou-se que o uso do
	1 mL MeOH/NFPA 10 mM (v/v; 90%:10%) -Fração 3 ---provocava o deslocamento do pico de Pyr, permanecendo com o tr = 5.7 min. Logo, Eluição Fração 3 -bases fortes. metanol é necessário para a completa eluição dos AGEs, sendo adotada uma
	1 mL MeOH/NFPA 10 mM (v/v; 90%:10%) -Fração 4 ---O fabricante dos cartuchos 30HCX recomendou a utilização de pirrolidina Eluição Fração 4 -concluiu-se que havia alguma transformação da Pyr na presença de MeOH/amônia estratégia diferenciada para eluição dos AGEs. Inicialmente as amostras foram
	1 mL MeOH -Fração 5 --para a eluição dos analitos. Seguindo essas recomendações, os cartuchos 30HCX, Eluição Fração 5 --5%. eluídas com 3 mL de ACN/amônia 5%, seguida por 3 mL de MeOH/amônia 5%.
	foram testados com o protocolo (Fig. 25): A fim de resolver o problema de transformação da Pyr na presença de metanol, Verificou-se que a transformação da Pyr, ocorria apenas se o contato com o MeOH
	o método SPE, foi otimizado pela substituição do metanol por ACN, nas etapas da 2ª fosse antes do ACN. O uso de 6 mL de solvente de eluição (3 mL ACN/amônia + 3 Após a eluição inicial com 4 mL (fração 1), foi realizado mais 3 eluições Tabela 6. Taxa de recuperação de CML após SPE com C18 lavagem e de eluição (Fig. 26). Estratégia similar foi utilizada por Zhang et al. (2011), mL de MeOH/amônia 5%), foram suficientes para eluir todos os AGEs retidos no fracionadas, com 1 mL de MeOH/NFPA 10Mm 10%, com o objetivo de verificar se algum resíduo do analito alvo restou no cartucho. Ao final das eluições, mais 1 mL Amostra Rt (min) Conc. Recuperação (%) de CML após SPE quando eles utilizaram para eluição a solução ACN/amônia 50% (v/v), embora eles cartucho.
	de MeOH 100%, foi colocado no cartucho a fim de garantir total remoção dos (µg/mL) com cartucho C18 não tenham relatado problemas de transformação da pirralina.
	Padrão de CML analitos alvos. Devido à alta polaridade de CML, Pen e Pyr, o ácido 1.3 6 µg/mL 65,1 Leite contaminado com CML 1.3 12 µg/mL 12.34
	nonafluoropentanoico (NFPA) é frequentemente adicionados à fase de eluição para

negativos, tais como ácidos sulfônicos ou carboxílicos. Em contraste, os analitos carregados negativamente contendo ácido sulfônico ou grupo ácido carboxílico são retidos em "permutadores aniônicos" carregados positivamente contendo qualquer um de uma variedade de diferentes grupos amino. Os mecanismos de troca iônica dependem de interações específicas de alta energia entre o sorbente e o analito.

A análise do espectro de massa do novo pico e a sua comparação com o espectro de massa do padrão da Pyr (Fig.

27

), levou a entender que este novo pico na realidade corresponde a um éster metílico da Pyr. O espectro de massa do novo c) a taxa de recuperação foi bem menor que aquelas observadas com ácido fórmico 0,1%.

Tempo de Retenção -(tr /min)

  

	Intens.								+MS, 5.7min #342	Intens.								+MS, 7.5min #451
	[%]										[%]								
	100			175.1222							100			175.1209					
	80										80								
																	237.1211		
	60						237.1224				60								
	40										40								
												148.1107						
	20	148.1112				219.1118		255.1326			20					219.1103			
																		269.1470
									277.1116											291.1279
	0										0								
		140	160	180	200	220	240	260	280	m/z	120	140	160	180	200	220	240	260	280	m/z

  Taxa de recuperação de CML, pentosidina e pirralina, em amostras de leite contaminadas.

	Comparando a taxa de recuperação nas amostras de leite integral
	contaminadas com AGEs (Tab. 8), observou-se que a melhor taxa recuperaçã, foi
	obtida com o método ACN/amônia 5%, apresentando recuperação de quase 90%
	para CML, 95,7% e 117% para pentosidina e pirralina, respectivamente. Esses
	valores apresentam-se em conformidade com a faixa de recuperação média
	recomendada pela Comunidade Europeia (Commission Decision, 2002/657/EC) que
	recomenda faixas de recuperações entre 50 e 120%. Uma baixa taxa de
	recuperação foi observada mesmo com o cartucho 30HCX, quando a pirrolidina foi
	utilizado como solvente de eluição, conforme recomendação pelo fabricante. Em
	relação às taxas de recuperação com o cartucho C18, observou-se que a maior taxa
	foi obtida para pentosidina (17,91%), enquanto que a pirralina não foi recuperada.
	Tabela 8. AGEs	Rt	Conc.		Recuperação (%)	
		(min)	(µg/mL)	Cartucho C18 com	Cartucho 30HCX	Cartucho 30HCX
				NFPA 10 mM	com pirrolidina	com ACN/NH 4 OH 5%
	CML	1.3	12 µg/mL	12.34	1,68 ± 1,68	89,8 ± 0,8
	Pentosidina	3.8	2 µg/mL	17.91	64.63 ± 0,92	95,7 ± 2,3
	Pirralina	5.7	2 µg/mL	0	29.35 ± 4,58	117,0 ± 2,9
	Sun et al. (2015), ao analisares AGEs de carnes, também observaram que os
	cartuchos de troca iônica, apresentavam melhores taxas de recuperação, quando
	comparado com os cartuchos C18, comumente utilizados para determinação de
	AGEs. Zhang et al. (2011), ao determinarem AGEs de amêndoas, também
	observaram alta taxa de recuperação com cartuchos de troca iônica, embora eles
	não tenham comparado essas taxas utilizando cartuchos C18.	
	Cabe ressaltar que o leite já pode conter AGEs em sua constituição, portanto,
	resultados de recuperação acima de 100% pode sugerir a presença desse composto

no leite contaminado. Como observado na tabela 8, a taxa de recuperação da pirralina foi de 117%, supondo que no leite utilizado já havia a presença de Pyr mesmo antes da contaminação dessas amostras. Corroborando com esse resultado,