info.info-bi
Fausto Soares 
  
Ivanilde Dispato 
  
Presidente José Ruy Porto De Carvalho 
  
Luciana Alvim 
  
Santos Rom 
  
Izabel Fugisaw 
  
Souza Suzilei 
  
Alm Eida 
  
Carneiro Suplentes 
  
Adriana Delfino 
  
Santos Fábio 
  
Cesar Da 
  
Silva João 
  
Francisco Gonçalves 
  
Antunes M Aria 
  
Angélica De 
  
Andrade Leite 
  
M Oacir 
  
Pedroso Júnior 
  
M Arcia 
  
Souza 
  
Ph.D Paula Kuser Falcão 
  
Em 
  
Jair Lage 
  
Siqueira Neto 
  
Ph.D Jorge Hernandez Fernandez 
email: jorgeh@cnptia.embrapa.br
  
M Em Biologia 
  
Colaborador Olecular 
  
Roberto Hiroshi 
email: roberto@cnptia.embrapa.br
  
Christian Baudet 
email: christian@cnptia.embrapa.br
  
Ph.D Goran Neshich 
email: neshich@cnptia.embrapa.br
  
Em Biofísica 
  
Paula Kuser 
  
Falcão Jair 
email: jair@cnptia.embrapa.br
  
Lage De 
  
Roberto Hiroshi Higa 
  
O " Prim 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

Apresentação

Tanto o conhecim ento do funcionam ento das ferram entas de bioinform ática, quanto os problem as de biologia que podem ser estudados ou resolvidos por m eio de " softw ares" utilizados em com putadores, são um a nova fonte de pesquisa e trabalho para biólogos interessados em identificar novos genes ou novos padrões e para m atem áticos e cientistas da área de com putação que desejam desenvolver e aplicar novos algoritm os com putacionais a problem as da biologia.

O softw are Sting M illennium Suite (SM S) é um a ferram enta im portante para o pesquisador que trabalha com estruturas de proteínas. As análises obtidas com a utilização do program a podem dar subsídios para entender questões relativas ao funcionam ento dessas m oléculas, levando em conta a relação estrutura/função. Para contribuir com a form ação de recursos hum anos nesta nova área prom issora e m oderna da bioinform ática, o Núcleo de Bioinform ática Estrutural da Em brapa Inform ática Agropecuária ofereceu o " Prim eiro Curso STING M illennium Suite Chem ogenom ics: ferram entas para analisar estruturas m acrom oleculares e aplicações em chem ogenom ics" . O curso perm itiu o dom ínio das ferram entas e técnicas de bioinform ática oferecidas pelo SM S, assim com o adquirir um conhecim ento m ultidisciplinar em Biologia M olecular Com putacional. O curso forneceu diplom a e conteve em sua organização, seções teóricas e práticas.

José Gilberto Jardine

Chefe-Geral O objetivo do curso foi fam iliarizar pesquisadores de áreas de biotecnologia, com o genética, bioquím ica, biologia m olecular e bioinform ática, com as novas ferram entas disponíveis para a análise de estruturas m acrom oleculares, juntam ente com a explicação de novas abordagens e m etodologias para o estudo das m acrom oléculas.

Com o grande aum ento de projetos genom a, que tem com o objetivo identificar todos os gens de um organism o, identificar as sequências de DNA e as proteínas que são codificados por estes, há um a grande procura por program as que consigam extrair inform ações im portantes de

Introdução

estruturas de proteínas aum entando o conhecim ento das m esm as. Existem atualm ente centenas de projetos genom a em andam ento em laboratórios de todo o m undo. Estes projetos trouxeram a público m ilhares de seqüências de proteínas com função ainda desconhecida. O estudo e análise de m acrom oléculas com estrutura já desvendada pode ajudar na determ inação de proteínas hom ólogas.

O público-alvo do curso foi constituído por grupos de pesquisadores participantes do projeto " Aplicações de BioInform ática com alta dem anda por CPUs na era pós-genom a (BIpósG)" , financiado pela agência Financiadora de Estudos e Projetos ligada ao M inistério da Ciência e Tecnologia (FINEP/M CT).

Os aspectos gerais abordados no curso foram : busca por sim ilaridade de seqüências, dinâm ica e estrutura de m acrom oléculas, características de superfície determ inando interações m oleculares e chem ogenom ics.

A busca por sim ilaridade de seqüências de am inoácidos é realizada com o objetivo de identificar relações de evolução, estruturais e funcionais entre as seqüências que estão sendo estudadas. Esta busca é feita através de um alinham ento de seqüências, que é um processo com putacional com o objetivo de dispor seqüências alinhadas de form a a ressaltar as sim ilaridades entre elas e que perm ita dizer se as seqüências tem um a sim ilaridade suficiente que justifique inferir que elas são hom ólogas. Em bora os term os sim ilaridade e hom ologia são m uitas vezes confundidos, nesta situação eles possuem significados diferentes. Sim ilaridade é um a quantidade que pode ser expressa em por exem plo, porcentagem de identidade. Hom ologia, por outro lado, se refere a um a conclusão tirada desses dados que dois gens tem um a história evolucionária com um .

A relação estrutura-função é m uito significativa em proteínas (ou m acrom oléculas). Para entender o funcionam ento dos sistem as biológicos e os m ecanism os de ação da vida, é necessário entender com o as proteínas funcionam , e conseqüentem ente, precisa-se conhecer e ter ferram entas para analisar suas estruturas. Estudar a dinâm ica das proteínas significa estudar as energias envolvidas na estabilidade da estrutura tridim ensional da proteína ou em alterações da estrutura.

A im portância de estudar-se as superfícies das proteínas advém do fato de que a m aioria das interações entre proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-ligante, ocorrem nas superfícies.

Chem ogenom ics, além de ser um term o m uito recente, é um a nova área de estudo dentro da quím ica-genôm ica. Nesta ciência, pequenas m oléculas já bem conhecidas de um a determ inada fam ília são utilizadas para elucidar a função e o papel biológico de outro m em bro da m esm a fam ília cuja função ainda é desconhecida. Este m étodo genôm ico-quím ico pode representar um a nova m aneira de identificar m oléculas alvo e assim acelerar dram aticam ente o processo de desenvolvim ento de novos fárm acos.

O curso foi dividido em três etapas:

1) Estudo de propriedades da estrutura de proteínas: proteínas e ácidos nucléicos são os m aiores responsáveis por todas as reações que ocorrem nas vias bioquím icas dos seres vivos. Cada proteína têm sua própria função e o estudo das estruturas das proteínas é im portante em vários aspectos. As estruturas confirm am as m udanças de evolução que ocorrem em espécies relacionadas, através de m utações randôm icas. Um a vez que estas m utações podem levar a desordens genéticas e doenças no nível m olecular, um entendim ento claro da natureza dessas doenças depende da determ inação precisa de sua estrutura. Além disso, quando se conhece bem a estrutura de um a enzim a, um inibidor adequado pode ser desenhado, criando um novo fárm aco. Esta etapa foi constituída de apresentações orais, incluindo um a palestra introdutória. Em seguida, foi realizada um a atividade prática, onde os participantes puderam vivenciar toda a teoria apresentada nas palestras iniciais desta etapa, através do m ódulo JPD1 (Java Protein Dossier) do SM S (Sting M illennium Suite). Todas as atividades desenvolvidas estão descritas detalhadam ente em item posterior.

2) M odelagem e análise de estruturas protéicas: quando a seqüência de um a determ inada proteína tem alto grau de identidade (~50%) com outra, cuja estrutura já foi determ inada, é possível construir um m odelo tridim ensional da proteína genôm ica cuja estrutura é desconhecida. A m odelagem de proteínas utiliza ferram entas com putacionais para construção de m odelos da estrutura protéica.

A partir da busca de outras proteínas com estrutura conhecida e seqüência sim ilar de am inoácidos, faz-se um alinham ento m últiplo das seqüências, escolhe-se os m elhores hom ólogos potenciais cujas estruturas tridim ensionais serão usadas com o base para construção da proteína a ser m odelada. Pode-se fazer tam bém a construção de estruturas de m utantes da proteína através de alterações de sua seqüência. A m odelagem , quando possível, reduz o tem po necessário para determ inação de um a estrutura além de ter um custo econôm ico m ais baixo. Existem vários program as para m odelagem de estruturas protéicas, sendo que neste curso usou--se o program a M odeller [START_REF] Arti-Renom | Com parative protein structure m odeling of genes and genom es[END_REF].

3) Im pressão digital de proteínas: é o registro de contornos e propriedades eletrostáticas da superfície da proteína, útil para análise das possibilidades de ligação da proteína com outras m oléculas. É na interação que ocorre entre as superfícies proteína--proteína, proteína-ligante que acontecem as reações m ais im portantes das m acrom oléculas. A com plem entariedade destas superfícies é fundam ental para que essas interações aconteçam . Existe um m étodo que calcula um a im pressão digital bidim ensional das proteínas e ligantes, possibilitando encontrar quais im pressões digitais se com plem entam , reduzindo assim o tem po necessário para se encontrar um inibidor adequado para determ inada proteína. Este m étodo, desenvolvido pelo colaborador Bernard M aigret, foi apresentado no curso.

A m etodologia para a realização do curso foi separar os participantes em nove duplas, perm itindo que apenas dois participantes ocupassem um a m áquina, nas quais foram abertas contas específicas para uso durante o curso. Com a disponibilidade de um a m áquina para cada duas pessoas, foi possível praticar todos os exercícios. As etapas são descritas no decorrer do docum ento. O STING M illennium Suite (SM S) [START_REF] Neshich | STING M illennium : a Web based suite of program s for com prehensive and sim ultaneous analysis of protein structure and sequence[END_REF] é um a suite de program as para análise de estruturas de proteínas e a relação com a sua função. O Java Protein Dossier é um a apresentação das propriedades da proteína (um cartoon). Sua form a de apresentação tem a vantagem de perm itir que diversas propriedades sejam observadas sim ultaneam ente, facilitando a análise das propriedades da proteína.

Cronograma do Curso

Após a palestra inaugural, os participantes do curso tiveram a oportunidade de executar um a atividade prática utilizando o m ódulo descrito.

Foram apresentadas três serino proteases com plexadas a respectivos inibidores para que os participantes pudessem analisar três com plexos de proteína/inibidor no m ódulo JPD:

1SLU -enzim a tripsina com plexada com ecotina. Com o descrito no fluxogram a (Fig. 2), os participantes receberam um a de três possíveis seqüências de am inoácidos, sim ulando um a proteína de interesse sem estrutura resolvida. Os partipantes deveriam fazer busca por seqüências potencialm ente hom ólogas em diferentes bancos de dados, incluindo o Protein Data Bank (PDB) [START_REF] Berm | The Protein Data Bank[END_REF]. A busca por seqüências hom ólogas foram executadas com o auxílio do softw are Blast [START_REF] Altschul | Basic local alignm ent search tool[END_REF] O uso do program a M odeller exigiu um acom panham ento passo a passo, conform e descrito no parágrafo a seguir.

Roteiro para modelagem recebido e acompanhado pelos participantes do curso:

1) Logar na m áquina com o usuário tem pus e senha senhatem p;

2) Abrir a pasta SM Scg no canto superior direito da tela.

3) Abrir o Internet Explorer na página do curso. 7) Observar a quantidade de seqüências nucleotídicas que a busca por hom ologia retornou nessa base de dados.

8) Voltar ao brow ser com a página do curso e abrir novo program a Blast. Desta vez fazer um a busca por hom ologia da seqüência inicial contra um banco de proteínas -nr (protein) -usando o blastp. 9) Observar a quantidade de hits retornados nessa busca e com parar com a busca anterior. 12) Com parar o resultado da últim a busca com os resultados das buscas anteriores.

Alinhamento (Sequence Alignment):

13) Abrir na página do curso, no cam po " Data Bases" o " PDB" e conferir se a base de dados PDB está selecionada.

14) Selecionar e copiar (" Ctrl C" ) os 10 m elhores hits e colar (" Ctrl V" ) no cam po de " Identifiers" . Clicar em " Subm it" . [START_REF] Orris | Autom ated docking using a Lam arckian genetic algorithm and em pirical binding free energy function[END_REF][START_REF] Orris | Distributed autom ated docking of flexible ligands to proteins: parallel applications of AutoDock 2.4[END_REF][START_REF] Goodsell | Autom ated docking of substrates to proteins by sim ulated annealing[END_REF]. O program a desenvolvido por [START_REF] Cai | Protein-ligand recognition using spherical harm onic m olecular surfaces: tw ards a fast and efficient filter for a large virtual throughput screening[END_REF] O tutorial para este exercício está descrito a seguir:

• Abra SSH Secure Shell Client, e log in na m áquina " gaviao" com o user nam e" " guest0?" (passw ord sm scg).

• Digite $ cd FINGERPRINT para entrar no diretório.

• Digite $ pico Input para editar o arquivo FINGERPRINT.

• Selecione " LIG" (para calcular o superfície do ligante)) ou" " CAV" (para calcular a superfície da cavidade). Esta escolha deve ser feita na linha 27. Para ver o núm ero das linhas digite " Ctrl C" . Quando o arquivo estiver editado, digite" Ctrl X" para fechá-lo, " Y" para confirm ar e " Enter" e. • Um a janela gráfica será aberta na tela.

• Clicar no ícone " Proceed" .

• Clicar em " File" , " Open New Kin File" .

• Selecionar seu filenam e.kin e clicar " OK

Considerações Finais e Avaliação

O curso m ostrou-se bastante produtivo, tendo obtido excelente avaliação feita pelos próprios participantes. A seguir a Tabela 1 apresenta a opinião dos participantes. O curso deve ser oferecido novam ente no ano de 2003.

Tam bém foram feitos com entários aos organizadores do curso, transcritos a seguir: m ínim o, posso agora pensar e ter dúvidas sobre o assunto. Devido a dificuldade de alguns tem as, não entendi tudo m as acredito que foi m uito bem levado. Parabéns pelo curso! " " Sugiro a criação de cursos de 1 dia sobre um dos vários program as existentes (treinam ento). Colocam tutoriais na rede, caso ainda não existam , com exem plos sim ples e com plicados."

" Precisa-se de m ais tem po pela com plexidade do tem a."

" Na m inha opinião o curso poderia ter um a duração de 3 ou 4 dias."

" Achei o curso bastante am plo. Gostaria que outros cursos m ais específicos fossem oferecidos. Gostaria tam bém de parabenizar os organizadores. No geral foi excelente. Um a sugestão é fazer cursos m enores (m enos pessoas) e pessoas com conhecim entos anteriores parecidos."

" M ais tem po para exercícios práticos -curso on-line."

2

 2 1M TU -Inibidor do fator Xa em com plexo com tripsina bovina 1PPF -elastase com plexada com inibidor de ovom ucoide Estes três com plexos foram pré-selecionados pela equipe de organização, sendo considerados bons m odelos para finalidade didática, facilitando a com preensão dos participantes e contribuindo para um aprendizado efetivo. Os recursos do m ódulo JPD foram am plam ente dem onstrados aos participantes, explicando com o esta ferram enta pode facilitar o estudo de estruturas m acrom oleculares. A Fig. 1 m ostra o JPD em uso com o com plexo 1SLU, um m utante N143H, E151H de tripsina aniônica de rato com plexada com o inibidor ecotina A86H. Parte Na segunda etapa do curso, foram seguidos passos para se entender com o funciona a m odelagem m olecular. As aulas teórica e prática foram m inistradas pela Dr. Paula Kuser Falcão e pelo colaborador Dr. Jorge Hernandez Fernandez. O fluxogram a a seguir descreve as etapas que foram seguidas para explicar com o funciona a m odelagem de m acrom oléculas, desde a busca por seqüências hom ólogas até a obtenção de um m odelo da proteína em questão. O fluxogram a que se segue foi apresentado durante o curso. Os participantes acom panharam a atividade prática de m odelagem seguindo os passos do fluxogram a.

Fig. 1 .

 1 Fig. 1. Exem plo do tipo de figura que foi utilizada no curso para ser analisada e estudada pelos particpantes. Dossier de várias características estruturais do com plexo 1SLU criado pelo program a JPD.

Fig. 2 .

 2 Fig. 2. Fluxogram a da segunda etapa do curso: m odelagem e análise estrutural de proteínas.

4)

  Abrir em Program Details o II Practical Exercise e ler o fluxogram a. Busca por homologia nos bancos de dados (Sequence Databases Search): 5) Abrir o arquivo texto com a seqüência inicial em form ato fasta. 6) Abrir em Softw ares o program a Blast, e fazer um a busca por hom ologia da seqüência inicial contra o banco de nucleotídeosnr(nucleotide) -usando o tblastn.

10)

  Executar m ais um a vez o program a Blast, m as dessa vez contra um banco de estruturas -pdb -usando o blastp. 11) Abrir em Softw ares o program a PSI-Blast, e fazer a m esm a busca anterior.

Fig. 3 .

 3 Fig. 3. Cartoon explicativo descrevendo de form a visual com o será feito o casam ento (docking) de pares enzim a/inibidor através dos m apas de contorno (im presões digitais).

"

  O curso foi excelente. Sugiro som ente que vocês dêem um a noção de UNIX para todos no início. Acredito que assim vocês econom izariam tem po. Parabéns, foi ótim o! " " Apesar de ser um assunto" 'não-habitual' no m eu trabalho, foi um a introdução m uito bem feita ao assunto, despertando m ais m inha atenção para o assunto. Com o agora possuo um conhecim ento 0 -péssim o 1-ruim 2 -razoável 3 -bom 4 -m uito bom 5 Avaliação dos participantes do curso.

  

  Para dar início ao curso, o Dr. Goran Neshich, líder do Núcleo de Bioinform ática Estrutural da Em brapa, apresentou os objetivos e a form a com o seriam m inistradas as palestras e atividades práticas. Em seguida m inistrou um a palestra explorando de form a abrangente o softw are STING M illennium Suite (SM S) e seu com ponente Java Protein Dossier (JPD), dando início à prim eira etapa do curso.

		Parte 1
	29/10/2002	
	M anhã Atividade
	08:30 -09:40	1. Palestra descrevendo os objetivos do curso. (Goran
		Neshich)
		2. Apresentação introdutória descrevendo a dinâm ica do
		curso. (Goran Neshich)
	09:40 -10:00	Intervalo
	10:00 -12:00	3. Exploração com pleta do SM S e seu com ponente Java
		Protein Dossier (JPD)4. Exercício Prático I: estudando
		propriedades estruturais de proteínas. Uso de
		ferram entas do SM S e JPD para estudar estruturas
		protéicas.
	Tarde	Atividade
	13:30 -15:00	5. Exercício Prático II: M odelando e Analisando Estruturas
		de Proteínas
	15:00 -15:20	Intervalo
	15:20 -17:00	Exercício Prático II: M odelando e Analisando Estruturas
		de Proteínas (continuação)
	30/10/2002	
	M anhã Atividade
	08:30 -09:40	6. Sem inário do prof. Dr. Bernard M aigret: " Criando
		im pressões digitais"
	09:40 -10:00	Intervalo
	10:00 -12:00	7. Exercício Prático III: Im pressões digitais de proteínas
	Tarde	Atividade
	13:30 -15:00	8. Entendendo as harm ônicas esféricas.
	15:00 -15:20	Intervalo
	15:20 -17:00	Entendendo as harm ônicas esféricas

  do laboratório de um dos colaboradores do grupo, Dr. M aigret, foi instalado nas m áquinas do NIB especialm ente para o curso. A Dra. Paula Kuser desenvolveu um tutorial para operar este program a. Os participantes do curso, seguiram o tutorial e utilizaram o script que já havia sido desenvolvido para criar " fingerprints" de três enzim as e de três ligantes que haviam sido previam ente selecionados, e m isturados. Com um program a desenvolvido pelo Dr. M ichel Yam agishi, foi possível encontrar qual enzim a seria com plem entar a qual ligante, fazendo então os paream entos enzim a/ ligante. Esta etapa é de grande im portância para os pesquisadores que estão interessados em encontrar inibidores para os sítio-ativos de suas proteínas de estudo, um a vez que reduz m uito o processo de busca.

JPD -Java Protein Dossier ferram enta com putacional interativa do program a SM S que apresenta em form a gráfica as principais características físico-quím icas de estruturas m acrom oleculares descritas em arquivos PDB.