sdv.mhep.mi
Avaliação Estrutural 
  
Funcional De 
  
Novos Peptídeos 
  
Antimicrobianos Obtidos 
  
A Partir 
  
D E Desenho 
  
Racional Tese 
  
Apresentada Ao 
  
Professor Octávio Luiz Franco 
  
Dr Ali Ladram 
  
Da Dalton 
  
Nanosegundos Ncbi 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
LUZ NOEMI IRAZAZABAL

agradecimento, profunda admiração e grande carinho! Je tiens à remercier vivement le professeur Ali Ladram d'avoir bien voulu accepter d'être mon co-directeur de thèse, malgré mon "cas compliqué". Merci pour la confiance accordée dès le début et sans laquelle je n'aurais jamais réussi à apprendre autant durant le peu de temps dont je disposais pour le stage. Merci pour le soutien, les enseignements de qualité sur le domaine et les corrections, qui m'ont permis de mener à bien ce projet. Merci beaucoup Ali de m'avoir encadrée, c'est grâce à l'opportunité que tu m'as offerte que j'ai pu reprendre mon "chemin scientifique"! J'exprime ma gratitude au directeur du laboratoire, le professeur Thierry Foulon, pour sa gentillesse et pour m'avoir permis de réaliser ce stage au sein de son équipe Biogenèse des Signaux Peptidiques (BioSiPe

por me fazer esquecer a saudade de casa. Em especial, obrigada William pelo seu trabalho anterior que serviu de base para começar minha pesquisa e pela paciência para responder minhas perguntas a respeito.

Aos meus amigos Edemir e Thomas, agradeço ao destino (ou será que devo agradecer ao Nonato?!) ter nos colocado no mesmo apartamento da Colina. Estou muito feliz de ter compartilhado esses anos cheios de conversas apaixonantes, de saídas incrivelmente divertidas, de filmes e livros e peças de teatro e passeios na natureza que espero possamos continuar compartilhando por sempre. Obrigada pelas nossas rodas de chimarrão e mate, pelo suporte nos momentos difíceis que tive que passar, pelo apoio, pelos conselhos e por me permitir conhecer vocês cada dia mais. Los quiero muchísimo!! A mis amigas, Les Filles, que siempre me acompañaron (y me aguantaron) en las buenas y en las malas. Porque la distancia que nos separa nunca fue un obstáculo en nuestra amistad incondicional. Son mi cable a tierra, mis "media-naranja". Las amo!! A Carlos, por insistirme a no bajar los brazos. Sin tu ayuda no hubiera llegado hasta acá.

A mi familia que banca mis locuras, me apoya siempre y me da libertad para salir a cumplir mis sueños. Gracias por el aguante. Los adoro!! Agradeço ao CNPq e à CAPES pelas bolsas de estudo concedidas.

Finalmente, agradeço a todos aqueles que colocaram obstáculos durante este caminho. Graças a esses impedimentos, aprendi e cresci ainda mais, tanto profissionalmente, quanto pessoalmente. Eles me permitiram ganhar mais confiança, me oportunizaram lutar pelo certo e pelo justo. Hoje, não apenas finalizo meu trabalho como doutoranda, como me considero uma mulher mais forte. Gracias! Para mamá, minha "desenhadora" ABSTRACT Antimicrobial peptides (AMPs) have been considered as a potential novel class of antimicrobial compounds. In order to generate new potent and non-toxic antimicrobial agents, rational design strategies may be employed. In this view, we used a computational method to design three synthetic AMPs ([I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 and PaDBS1R1). By determining the minimum inhibitory concentration, we found that all the peptides were active against Gram-negative and -positive bacteria. Only [I 5 , R 8 ] MP was found to display antifungal activity. The determination of the peptide concentration producing 50% of cell lysis revealed low or no hemolytic activity, with no cytotoxicity towards human embryonic kidney cells HEK-293. During time-kill assays more rapid bactericidal effects were observed for PaDBS1R1 and [I 5 , R 8 ] MP against E. coli compared to S. aureus. For the peptide EcDBS1R6, identical killing curves were obtained for both bacterial strains. Membrane permeabilization and depolarization studies combined with field emission gun scanning electron microscopy (SEM-FEG) revealed that a membranolytic mechanism occurs for these peptides. When analyzed by circular dichroism and nuclear magnetic resonance microscopy or by molecular dynamics simulations during interaction with a membrane model, peptides were shown to adopt an amphipathic alpha-helical conformation. In conclusion, our results indicate that the structural and functional evaluation of rationally designed synthetic AMPs represents a promising strategy for the development of potent novel antimicrobial agents.

Keywords: infectious diseases, antimicrobial resistance, antimicrobial peptides, rational design, structure, therapeutic potential.

RESUMO

As infecçõesrelacionadas à assistência à saúde e o surgimento de cepas bacterianas resistentes aos antibióticos de uso convencional, representam um dos principais problemas de saúde pública. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm sido considerados como uma potencial nova classe de compostos antimicrobianos.

Objetivando a geração de novos agentes antimicrobianos potentes e não tóxicos, com potencial terapêutico, estratégias de desenho racional podem ser utilizadas para otimizar AMPs existentes ou para produzir novos AMPs com caraterísticas desejáveis. Nesta perspectiva, foi utilizada uma abordagem racional para gerar três peptídeos sintéticos ([I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1) e avaliar suas propriedades estruturais e funcionais.

Mediante a determinação da concentração mínima inibitória (CMI), observou-se que todos os peptídeos mostraram atividade contra bactérias Gram-negativas (CMI = 1,5 -12,5 µM) e Gram-positivas (CMI = 3,. Apenas [I 5 , R 8 ] MP apresentou atividade antifúngica contra Candida albicans com um valor de CMI baixo (12,5 µM). A determinação da concentração de peptídeo capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular, revelou baixa ou nula atividade hemolítica (LC 50 > 200 µM para os peptídeos [I 5 , R 8 ] MP e EcDBS1R1; LC 50 = 50 µM para PaDBS1R1), e ausência de citotoxicidade frente a células renais embrionárias humanas HEK-293 (LC 50 ~ 111 -143 µM). A cinética da atividade bactericida revelou uma rápida ação bactericida de PaDBS1R1 e [I 5 , R 8 ] MP frente a E. coli (< 5 e 15 min, respectivamente) e moderada frente a S. aureus (30 e 45 min, respectivamente). No caso de EcDBS1R1, observou-se rápido efeito bactericida para ambas espécies bacterianas (15 min). Os ensaios de permeabilização e despolarização combinados às imagens de microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV-FEG), indicaram que os peptídeos podem ser capazes de alterar a integridade da membrana bacteriana por meio de um mecanismo membranolítico. A análise da estrutura dos peptídeos por espectroscopia de dicroísmo circular e ressonância magnética nuclear, bem como a simulação por dinâmica molecular in silico em ambiente de membrana, revelou uma conformação α-hélice anfipática. Em conclusão, os resultados indicam que a avaliação estrutural e funcional dos AMPs sintéticos racionalmente desenhados, representa uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos como uma nova classe de fármacos com vista a abordar a problemática da resistência aos antibióticos.

Palavras chave: doenças infecciosas, resistência antimicrobiana, peptídeos antimicrobianos, desenho racional, estrutura, potencial terapêutico.

RESUMÉ

Les peptides antimicrobiens sont considérés comme une nouvelle classe prometteuse d'agents anti-infectieux. Afin de développer de nouveaux agents efficaces et non toxiques, des stratégies de conception rationnelle peuvent être utilisées. Dans cette perspective, nous avons utilisé une approche computationnelle pour concevoir trois peptides synthétiques ([I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 et PaDBS1R1). En déterminant la concentration minimale inhibitrice, nous avons montré que tous les peptides sont actifs contre les bactéries Gram-négatif et -positif. Seul [I 5 , R 8 ] MP a montré une activité antifongique. La mesure de la concentration de peptide provoquant 50 % de mortalité cellulaire a permis de montrer que les peptides étaient faiblement ou non hémolytiques, sans toxicité vis-à-vis des cellules embryonnaires rénales humaines HEK-293. La cinétique bactéricide a révélé que PaDBS1R1 et [I 5 , R 8 ] MP tuent rapidement E. coli en comparaison à S. aureus et que EcDBS1R6 élimine rapidement les deux souches. Des études de perméabilisation et de dépolarisation combinées à de la microscopie électronique à haute résolution (FEG-SEM) ont montré un mécanisme membranolytique des peptides. L'analyse de la structure des peptides par spectroscopie de dichroïsme circulaire et résonance magnétique nucléaire, ainsi que par modélisation moléculaire lors de leur interaction avec une membrane modèle, révèle une conformation en hélice alpha amphipatique. En conclusion, notre étude indique que l'évaluation structurale et fonctionnelle de peptides antimicrobiens synthétiques conçus de manière rationnelle représente une stratégie prometteuse pour le développement de nouveaux agents antimicrobiens.

Mots clés : maladies infectieuses, résistance aux antibiotiques, peptides antimicrobiens, conception rationnelle, structure, potentiel thérapeutique.

INTRODUÇÃO

Doenças infecciosas nosocomiais

Uma das maiores preocupações na área de saúde consiste na alta incidência de infecções microbianas que representam uma das principais causas de morte e incapacidade nos países em desenvolvimento. As doenças infecciosas podem ser causadas por microrganismos patogênicos, tais como bactérias, vírus, parasitas ou fungos, e podem ser transmitidas de forma direta ou indiretamente (por meio de veículos animados ou inanimados) de uma pessoa para outra. No caso particular das Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS), o principal agente causador de infecção são as bactérias, sendo estas associadas a 87% das infecções [START_REF] Anvisa | Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção em serviços de saúde Ministério da Saúde[END_REF]. A Organização Mundial de Saúde (OMS) define as IRAS como infecções adquiridas durante o atendimento no hospital, infecções que, no ato da admissão do paciente, não estavam presentes ou em incubação (Who, 2011). As IRAS constituem uma importante causa de mortalidade e aumento dos custos hospitalares em países desenvolvidos. Além de causar graves infecções nosocomiais afetando pacientes hospitalizados, recentemente os microrganismos patogênicos vêm se espalhando na comunidade provocando doenças severas em pacientes previamente saudáveis.

Tanto as bactérias Gram-positivas (Gram+) quanto as Gram-negativas (Gram-) podem estar associadas em grande medida ao desenvolvimento das doenças infecciosas nosocomiais e comunitárias. As infecções causadas por fungos também têm seu papel nos quadros de infecção hospitalar, onde resultam ser responsáveis por aproximadamente 8% das IRAS, sendo Candida albicans e Aspergillus os patógenos mais frequentes [START_REF] Anvisa | Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção em serviços de saúde Ministério da Saúde[END_REF]. Muitos desses microrganismos constituem a microbiota humana normal. Devido a sua baixa virulência, as bactérias da microbiota possuem um papel protetor significativo, impedindo a colonização por microrganismos patogênicos. Entretanto, elas podem causar infecção em indivíduos imunocomprometidos ou debilitados, denominadas assim de bactérias oportunistas [START_REF] Anvisa | Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção em serviços de saúde Ministério da Saúde[END_REF]. Desta forma, as IRAS podem ser causadas por um microrganismo adquirido de outra pessoa no hospital (infecção cruzada) ou podem ser causadas pela flora do próprio paciente (infecção endógena). Geralmente, os sítios de infecção hospitalar mais frequentemente atingidos podem ser o trato urinário, as feridas cirúrgicas, o trato respiratório e o sangue. Os patógenos que lideram o ranking das IRAS estão descritos na Tabela 1.

Tabela 1.

Agentes antimicrobianos e sítios de infecçõesmais frequentes nas doenças infecciosas nosocomiais [START_REF] Anvisa | Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção em serviços de saúde Ministério da Saúde[END_REF].

Patógeno

Sítios comuns de infecção 

Bactérias Gram negativas

Composição das membranas biológicas

As membranas biológicas funcionam como uma barreira celular de permeabilidade seletiva no transporte de moléculas para o interior e exterior da célula. A integridade das membranas celulares pode ser crucial na sobrevivência dos microrganismos, portanto, a ruptura da membrana resulta na morte celular. Praticamente todas as biomembranas são compostas de proteínas e fosfolipídeos, dispostos em bicamadas de característica anfipática tendo ambos os domínios, hidrofílico e hidrofóbico. As membranas dos organismos eucariontes e procariontes apresentam diferenças significativas em termos de composição, estrutura e carga. A superfície da membrana eucariótica pode ser rica em colesterol e fosfolipídios eletricamente neutros (zwitteriônicos), enquanto a superfície das células bacterianas apresenta densidade de carga negativa devido à presença de fosfolipídios eletricamente negativos na face externa da bicamada lipídica [START_REF] Pasupuleti | Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system[END_REF].

Parede celular bacteriana

As membranas bacterianas podem ser altamente complexas, apresentando diferenças estruturais que permitem a sua divisão em duas classes distintas de acordo com a sua resposta a coloração de Gram. As bactérias Gram-positivas apresentam composição singular na sua parede celular, baseada em mureína e peptidoglicanos, formando um arcabouço composto por uma alternância de N-acetil-glicosamina e ácido Nacetilmurâmico, no qual se encontra ligado o ácido teicóico (Figura1A) [START_REF] Kayser | Medical microbiology[END_REF]. Já as bactérias Gram-negativas são formadas por uma dupla camada membranácea, a qual consiste em uma membrana interna (MI) rica em fosfolipídios e uma externa (ME) rica em fosfolipídios e lipopolissacarídeos (LPS). O espaço periplasmático que separa essas membranas contém peptidoglicanos (Figura1B). Vários grupos de proteínas podem estar associados a essas membranas e envolvidas em diferentes atividades como ligação a ATP, transporte de íons e de pequenas moléculas. Dentre essas proteínas observam-se as porinas e lipoproteínas, associadas a ME; as proteínas integrais, que atravessam a ME em várias regiões; as periplasmáticas e as associadas à MI [START_REF] Cordwell | Technologies for bacterial surface proteomics[END_REF]. As bactérias Gram-negativas produzem uma variedade de polissacarídeos, como o LPS e os polissacarídeos capsulares, que podem ser particularmente importantes para a sua interação com o sistema imunitário do hospedeiro. O LPS atua como uma molécula padrão associada ao patógeno, estimulando a resposta do hospedeiro, e os polissacarídeos capsulares podem formar barreiras físicas (biofilmes e estruturas capsulares), as quais favorecem a evasão da resposta imune do hospedeiro [START_REF] Pasupuleti | Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system[END_REF]. As proteínas e os lipídeos estão presentes em menor proporção e os polímeros estruturais, β-glucano e quitina, conferem rigidez à parede celular. Os polímeros de manose constituem uma matriz amorfa na qual podem ser inseridos os polímeros estruturais [START_REF] Gow | Candida albicans morphogenesis and host defence: discriminating invasion from colonization[END_REF]. Em virtude da importância vital da superfície celular dos microrganismos, muitos antibióticos comumente utilizados atuam interferindo com a estabilidade dessa estrutura.

Figura 2. Estrutura de parede celular do fungo Candida albicans [START_REF] Gow | Candida albicans morphogenesis and host defence: discriminating invasion from colonization[END_REF].

À semelhança das bactérias, uma característica importante para a sobrevivência dos fungos (especialmente C. albicans), consiste no desenvolvimento de biofilmes quando expostos às superfícies sólidas. Isto constitui um grande problema na prática médica, pois os biofilmes podem estabelecer-se na superfície de diversos implantes médicos invasivos como é o caso dos cateteres intravenosos, os quais podem promover o acesso direto do patógeno na corrente sanguínea do paciente.

Antimicrobianos utilizados no tratamento das infecções e mecanismos de resistência

Para o tratamento de doenças infecciosas existe a necessidade do uso de agentes capazes de eliminar o patógeno (microbicidas) ou de interromper a sua proliferação.

Desde a década de 1940, quando a penicilina se tornou disponível para uso, se deu início a uma nova fase da medicina conhecida como a fase dos antimicrobianos. Desde então, muitas moléculas de origem natural têm sido identificadas e outras sintetizadas, reduzindo muito a doença e a morte por infeção. De forma geral, os antimicrobianos podem ser divididos em diferentes classes e apresentam diversos mecanismos de ação capazes de modificar o metabolismo microbiano e processos fisiológicos como a tradução, replicação

de DNA e biossíntese da parede celular. Frequentemente, os agentes antimicrobianos podem ser classificados de acordo com o seu principal mecanismo de ação. Entre esses mecanismos encontram-se a interferência com a síntese da parede celular (β-lactâmicos e agentes glicopeptídicos), a inibição da síntese proteica (macrólidos e tetraciclinas), a interferência com a síntese de ácidos nucleicos (fluoroquinolonas e rifampicina), a inibição de uma via metabólica (trimetoprim-sulfametoxazol), e a perturbação da estrutura da membrana bacteriana (polimixinas e daptomicina) (Tabela 2) [START_REF] Tenover | Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria[END_REF].

Tabela 2. Mecanismos de ação dos agentes antimicrobianos [START_REF] Tenover | Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria[END_REF]. 

Mecanismo de ação Antibiótico

Polimixinas e daptomicina

A utilização indiscriminada de antibióticos e drogas afins para terapia ou profilaxia, pode aumentar a pressão de seleção que favorece o surgimento, multiplicação e disseminação de cepas resistentes. A resistência antimicrobiana pode ser parte de um processo natural de evolução, no qual os microrganismos desenvolvem mecanismos de adaptação e sobrevivência ao ambiente em que vivem. Os microrganismos resistentes podem sobreviver à exposição as drogas e continuam a sua multiplicação no corpo, causando mais danos e aumentando a capacidade de transmissão [START_REF] Rice | The clinical consequences of antimicrobial resistance[END_REF]. A propagação da resistência antimicrobiana pode ser ainda mais exacerbada pelo aumento do comércio e das viagens internacionais, tornando mais fácil para formas resistentes de uma doença, se espalhar entre países e continentes. As infecções por microrganismos resistentes são difíceis de tratar, exigindo alternativas terapêuticas de custo elevado e às vezes tóxicas.

As bactérias podem ser intrinsecamente resistentes a uma classe de agentes antimicrobianos, ou podem adquirir resistência por mutação ou através da aquisição de genes de resistência de outros organismos. Esses genes de resistência podem permitir o bloqueio da entrada da droga na célula, a produção de enzimas proteolíticas que destroem a droga antibacteriana, a expressão de sistemas de efluxo que impedem a droga de "^! penetrar na célula e atingir o seu alvo intracelular, a alteração nos sítios alvo do medicamento, ou a produção de vias metabólicas alternativas que evitem a ação da droga [START_REF] Tenover | Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria[END_REF]Alekshun e Levy, 2007;[START_REF] Allen | Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments[END_REF] (Figura 3).

!

Figura 3. Mecanismos de resistência bacteriana aos agentes antimicrobianos. Adaptado de [START_REF] Allen | Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments[END_REF].

Em populações bacterianas, constantemente ocorrem mutações devido a erros durante a replicação. Se houver alguma vantagem seletiva de alguma mutação, como por exemplo a resistência a antibiótico, o mutante se torna rapidamente o principal componente da população devido à elevada taxa de crescimento da bactéria, o que pode constituir um problema no tratamento das infecções bacterianas. Não apenas as mutações podem ser um problema, como também os mecanismos pelos quais as bactérias transferem seus genes para outras células. Genes bacterianos são normalmente transferidos a membros da mesma espécie, mas ocasionalmente a transferência para outras espécies pode também ocorrer [START_REF] Kayser | Medical microbiology[END_REF].

A transferência de novo material genético entre as cepas resistentes e as cepas bacterianas suscetíveis aos antimicrobianos, pode ocorrer por meio de mecanismos como a transformação (o material genético liberado ao meio pela célula doadora, pode ser tomado pela célula receptora), a conjugação (transferência gênica unidirecional por contato físico entre as células), ou a transdução (transferência gênica pela via de um bacteriófago). Frequentemente os elementos de transposição (segmentos de DNA que possuem a capacidade de se movimentar de uma região para outra do genoma), podem facilitar a incorporação de genes de resistência múltipla diretamente no genoma do receptor ou nos plasmídeos (Alekshun e Levy, 2007).

O cenário atual da resistência bacteriana

Nas últimas décadas, uma grande variedade de bactérias patogênicas resistentes à drogas tem se multiplicado e disseminado a taxas alarmantes [START_REF] Brown | Antibacterial drug discovery in the resistance era[END_REF]. As bactérias mostram uma excelente habilidade em resistir e se adaptar ao ambiente através da seleção e troca de elementos genéticos de resistência. Assim como nos estabelecimentos de cuidados em saúde como na comunidade, a resistência antimicrobiana pode ser um problema, porém nos hospitais a transmissão pode ser amplificada por causa da população altamente suscetível e do grande reservatório de patógenos virulentos e oportunistas que representa o ambiente hospitalar. O impacto clínico da resistência antimicrobiana pode ser insignificante ou grave, dependendo do nível de resistência, do local da infecção, e da disponibilidade de alternativas terapêuticas eficazes [START_REF] Rice | The clinical consequences of antimicrobial resistance[END_REF]. O aumento da prevalência da resistência antimicrobiana pode representar uma preocupação global. O Brasil e outros países da América Latina, em geral, podem ter níveis mais elevados de resistência bacteriana entre os principais patógenos, comparados com a Europa e os Estados Unidos [START_REF] Reinert | Antimicrobial susceptibility among organisms from the Asia/Pacific Rim, Europe and Latin and North America collected as part of TEST and the in vitro activity of tigecycline[END_REF]. [START_REF] Ventola | The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats[END_REF].

Especificamente no Brasil, as cepas que apresentam uma maior prevalência são S. aureus MRSA, K. pneumoniae e E. coli ESBLs, com prevalências de 60, 50 e 18%, respectivamente [START_REF] Rossi | The challenges of antimicrobial resistance in Brazil[END_REF].

Ao longo dos anos, a pressão seletiva do uso de diferentes drogas resultou em microrganismos portadores de mecanismos de resistência a múltiplas drogas. Embora o surgimento de microrganismos MDR seja um fenômeno natural, o uso inadequado e descontrolado de agentes antimicrobianos, incluindo a prescrição desnecessária, a administração de doses inadequadas, o tempo insuficiente de tratamento e os erros de diagnóstico que levam à escolha inadequada de medicamentos, amplificam o fenômeno [START_REF] Ventola | The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats[END_REF]. Como consequência, um aumento de ganho de resistência pela vasta maioria de agentes patogênicos humanos foi relatado em todo o mundo [START_REF] Huttner | Antimicrobial resistance: a global view from the 2013 World Healthcare-Associated Infections Forum[END_REF]. Atualmente a resistência antimicrobiana compreende uma ameaça global que expõe sérios desafios clínicos onde as drogas comumente utilizadas se tornaram um recurso não renovável que pode ser extinto [START_REF] Brown | Antibacterial drug discovery in the resistance era[END_REF].

Peptídeos antimicrobianos (AMPs): uma nova fronteira no controle da infecção microbiana

Apesar do esforço realizado desde o tempo da penicilina pelas indústrias farmacêuticas na elaboração de metodologias para a busca e desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos, a prospecção de novos compostos continua sendo limitada. As empresas farmacêuticas parecem ter retirado os esforços na produção de novos agentes antimicrobianos, uma vez que apenas duas novas classes de antibióticos chegaram ao mercado desde 1962: a oxazolidinona (linezolida por Pfizer) e um lipopéptido cíclico (daptomicina por Cubist) [START_REF] Coates | Novel classes of antibiotics or more of the same?[END_REF], ativas contra bactérias Gram-positivas, incluindo MRSA.

Progressivamente, mais patógenos desenvolvem resistência contra os antibióticos convencionais, tornando assim indispensável à busca por novas substâncias potencialmente bioativas [START_REF] Harbarth | Antibiotic research and development: business as usual?[END_REF]. Dentre essas novas moléculas, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) se destacam como uma nova ferramenta biotecnológica na busca de antimicrobianos de caráter inovador [START_REF] Silva | Exploring the pharmacological potential of promiscuous host-defense peptides: from natural screenings to biotechnological applications[END_REF][START_REF] Da Costa | Antimicrobial peptides: an alternative for innovative medicines?[END_REF]Fosgerau e Hoffmann, 2015).

Comumente encontrados na natureza, os AMPs podem ser efetores do sistema imune inato de qualquer organismo. Este grupo de moléculas representa um mecanismo primitivo de defesa imunitária presente em diferentes organismos multicelulares tais como plantas, insetos, peixes, mamíferos e anfíbios [START_REF] Zasloff | Antimicrobial peptides of multicellular organisms[END_REF][START_REF] Pasupuleti | Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system[END_REF]. A ampla distribuição dos AMPs nos reinos animal e vegetal, sugere um papel fundamental na evolução bem-sucedida de organismos multicelulares complexos. Devido ao efeito bactericida, fungicida, antiviral e antitumoral dos AMPs, aliado ao fato de atuarem a baixas concentrações, eles podem ser considerados candidatos promissores a agentes terapêuticos no tratamento de infecções, em especial em situações de resistência à antibioterapia clássica [START_REF] Afacan | Therapeutic potential of host defense peptides in antibiotic-resistant infections[END_REF].

As vantagens potenciais dos AMPs como medicamentos antimicrobianos e imunomoduladores são significativas (Yount e Yeaman, 2005;[START_REF] Hancock | Antimicrobial and host-defense peptides as new antiinfective therapeutic strategies[END_REF][START_REF] Upton | Antimicrobial peptides as therapeutic agents[END_REF]. Os AMPs possuem a habilidade de eliminar um grande espectro de microrganismos de forma rápida, incluindo bactérias multirresistentes. Muitos AMPs têm demonstrado a capacidade de ativar a resposta imune inata sem exibir imunogenicidade.

Estes peptídeos, ainda, têm uma ampla gama de propriedades imunomoduladoras, incluindo a regulação da expressão de centenas de genes em variedade de células imunitárias e a indução de produção de citocinas [START_REF] Finlay | Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections?[END_REF][START_REF] Bowdish | A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity[END_REF]Oppenheim e Yang, 2005). Alguns AMPs mostraram um efeito sinérgico com antibióticos convencionais, aumentando a sua potência in vivo, provavelmente facilitando seu acesso na célula bacteriana [START_REF] Park | The role of antimicrobial peptides in preventing multidrug-resistant bacterial infections and biofilm formation[END_REF]. Outros AMPs podem ser utilizados também no controle de infecções sistêmicas, já que demonstraram reduzir o dano no tecido provocado pela resposta inflamatória à infecção, enquanto estimularam, simultaneamente, a atividade antimicrobiana do sistema imune [START_REF] Upton | Antimicrobial peptides as therapeutic agents[END_REF].

Outras aplicações incluem a utilização destas moléculas para impedir a colonização e o crescimento de microrganismos em materiais poliméricos sintéticos, tais como cateteres intravenosos de uso médico [START_REF] Melvin | Clinical potential of engineered cationic antimicrobial peptides against drug resistant biofilms[END_REF].

Os AMPs são pequenos polipeptídeos de baixa massa molecular (menor do que 5 kDa) em sua maioria catiônicos, de sequências e estruturas variáveis [START_REF] Reddy | Antimicrobial peptides: premises and promises[END_REF].

Apesar da sua grande diversidade, os AMPs são conhecidos por terem uma estrutura secundária anfipática com conjuntos de regiões hidrofóbicas e carregadas positivamente, com resíduos de aminoácidos arranjados de forma linear ou cíclica. Essa propriedade estrutural aparece como estando intimamente relacionada à sua atividade antimicrobiana [START_REF] Hancock | Antimicrobial and host-defense peptides as new antiinfective therapeutic strategies[END_REF]. [START_REF] Powers | The relationship between peptide structure and antibacterial activity[END_REF]. A estrutura de folha-β encontra-se estabilizada pela presença de 2 ou 3

ligações dissulfeto e, ocasionalmente, apresenta pequenas porções de estrutura α-hélice.

As estruturas helicoidais e estendidas, ocorrem apenas quando o peptídeo entra em contato com a membrana, apresentando uma conformação randômica em soluções aquosas (Yeaman e Yount, 2003). [START_REF] Nizet | Antimicrobial peptide resistance mechanisms of human bacterial pathogens[END_REF]Peschel e Sahl, 2006).

Embora a resistência aos AMPs parece ser menos comum do que a resistência aos antibióticos convencionais, a co-evolução dos agentes patogênicos e seus hospedeiros possibilitou a seleção desta característica em várias bactérias. Uma melhor compreensão dos mecanismos de resistência revela-se fundamental para a concepção de AMPs otimizados que permitam ser eficientemente utilizados como drogas terapêuticas [START_REF] Guilhelmelli | Antibiotic development challenges: the various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance[END_REF].

Mecanismo de ação dos AMPs

A ação microbicida associada aos AMPs pode ocorrer de maneira muito rápida, desafiando a caracterização passo a passo. Porém, de acordo com Brogden, o mecanismo antibacteriano dos AMPs depende de 3 passos específicos para a indução da lise bacteriana, descritos a seguir [START_REF] Brogden | Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?[END_REF].

A primeira etapa compreende a atração dos AMPs pela superfície bacteriana.

Acredita [START_REF] Nguyen | The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action[END_REF]. Segundo diversos estudos, a formação de poros transmembrana parece não ser o único mecanismo de ação antimicrobiana. Alguns AMPs têm como principal alvo a bicamada das membranas das células atacadas, enquanto outros atravessam a membrana e podem causar lise celular por meio da ativação de estruturas intracelulares. Várias observações sugerem que os peptídeos inibem a síntese de DNA, RNA e proteínas, inibem a atividade enzimática, ativam autolisinas e interferem na formação da parede celular [START_REF] Brogden | Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria?[END_REF][START_REF] Mookherjee | Cationic host defence peptides: innate immune regulatory peptides as a novel approach for treating infections[END_REF][START_REF] Nicolas | Multifunctional host defense peptides: intracellular-targeting antimicrobial peptides[END_REF].

Recentemente, tem sido proposto por Lee e colaboradores, um mecanismo de ação detalhado no qual foram exploradas as mudanças na estrutura da membrana alvo durante a ligação dos AMPs. Este trabalho propõe um modelo de plasticidade de membrana onde a partir da interação inicial do peptídeo com seu alvo de membrana, ocorrem mudanças de conformação e diferentes estados intermédios da membrana que surgem na presença de quantidades crescentes do peptídeo ligado, sendo a prevalência de cada estado dependente do peptídeo e da composição da membrana [START_REF] Lee | Antimicrobial Peptide Structure and Mechanism of Action: A Focus on the Role of Membrane Structure[END_REF].

Os mecanismos de ação dos AMPs parecem estar relacionados aos efeitos hidrofóbicos e eletrostáticos combinados [START_REF] Dathe | General aspects of peptide selectivity towards lipid bilayers and cell membranes studied by variation of the structural parameters of amphipathic helical model peptides[END_REF]. Porém, ao definir a atividade antimicrobiana, além das características físico-químicas dos AMPs, pode ser fundamental ter em consideração as condições fisiológicas in vivo. Isto inclui as concentrações de AMPs no local da infecção, o papel de substâncias sinérgicas e inibidoras que podem estar presentes em tecidos e fluidos, assim como determinadas características únicas de replicação bacteriana, particularmente a formação de biofilmes [START_REF] Fox | Antimicrobial peptides stage a comeback[END_REF][START_REF] Melvin | Clinical potential of engineered cationic antimicrobial peptides against drug resistant biofilms[END_REF].

Determinantes estruturais dos AMPs para a atividade antimicrobiana

Como apresentado anteriormente, a ação antimicrobiana dos AMPs pode ocorrer pela combinação de efeitos hidrofóbicos e eletrostáticos que levam a perturbações na membrana das células alvo. Apesar de quase duas décadas de esforços, a falta de conhecimento detalhado dos complexos métodos de ação dos AMPs, continua limitando a compreensão das relações estrutura-atividade, e como consequência, geram restrições no aproveitamento de dados e no desenvolvimento de terapias antimicrobianas sobre a base de peptídeos (Fosgerau e Hoffmann, 2015).

Além de exibirem uma grande variedade estrutural e de sequência, as propriedades físico-químicas dos AMPs podem ou não estar associadas a seu mecanismo de ação, a sua efetividade e especificidade de interação com membranas fosfolipídicas [START_REF] Powers | The relationship between peptide structure and antibacterial activity[END_REF]. As diferenças eletrostáticas na composição das membranas plasmáticas de mamíferos e bactérias, parecem ser as responsáveis pela toxicidade seletiva dos AMPs.

No entanto, além de atrair os AMPs catiônicos, as superfícies aniônicas das membranas bacterianas podem influenciar outros processos que afetam a seletividade (Khandelia e Kaznessis, 2006). Sabe-se que a maioria dos AMPs carecem de estrutura definida em solução, adotando uma forma geralmente helicoidal, após ligação à membrana. Portanto, o grau de formação de hélice induzida na presença da membrana, pode influenciar a atividade hemolítica e as propriedades antibacterianas dos AMPs [START_REF] Dathe | Peptide helicity and membrane surface charge modulate the balance of electrostatic and hydrophobic interactions with lipid bilayers and biological membranes[END_REF]. A atividade antimicrobiana pode ser induzida, então, pela interação com a membrana da célula alvo.

Compreender as relações entre as principais características estruturais dos AMPs e seus efeitos sobre a atividade bactericida e hemolítica, pode auxiliar o desenho racional de análogos melhorados para uso clínico [START_REF] Nguyen | The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action[END_REF]. Vários estudos têm sido realizados sobre a relação estrutura-função dos AMPs através da modulação de parâmetros estruturais tais como carga, conformação, hidrofobicidade, momento hidrofóbico, anfipaticidade, e ângulo polar [START_REF] Wimley | Describing the mechanism of antimicrobial peptide action with the interfacial activity model[END_REF]. Por meio desses estudos, constatou-se que tais propriedades determinam a potência e o espectro de atividade antimicrobiana, porém atuando de maneira interdependente. A modificação em um parâmetro induz alterações simultâneas em outros, o que torna difícil avaliar a influência específica de uma única variável (Yeaman e Yount, 2003).

Os AMPs podem ser caracterizados por apresentarem carga líquida positiva, variando entre +2 e +9. Esta cationicidade ocorre devido à ausência de resíduos ácidos (ácidos glutâmico e aspártico) e a presença em excesso de resíduos de aminoácidos básicos tais como arginina, lisina e histidina [START_REF] Brown | Cationic host defense (antimicrobial) peptides[END_REF]. O caráter catiônico, de grande importância para a interação eletrostática dos AMPs com as membranas biológicas, pode garantir uma certa seletividade na atividade antimicrobiana.

Os AMPs manifestam uma baixa atração pelas membranas citoplasmáticas de células de mamíferos de caráter eletricamente neutro, e uma alta afinidade pela superfície eletricamente negativa da superfície das células microbianas. Vários estudos mostraram que a atividade dos AMPs pode depender do seu caráter catiônico, relacionando mudanças na carga líquida com um aumento ou diminuição da efetividade antimicrobiana. No caso do peptídeo dermaseptina S4, por exemplo, um aumento da carga positiva, pode reduzir sua atividade hemolítica sem modificar sua ação antiviral [START_REF] Lorin | The antimicrobial peptide dermaseptin S4 inhibits HIV-1 infectivity in vitro[END_REF]. No entanto, a adição de carga positiva apresenta um limite, como demonstrado para a magainina II, no qual, um excesso de cationicidade pode levar ao incremento da capacidade hemolítica e perda de atividade antimicrobiana [START_REF] Dathe | Optimization of the antimicrobial activity of magainin peptides by modification of charge[END_REF].

A detalhada informação da estrutura e a orientação dos AMPs pode ser um elemento importante para a compreensão do papel dos aminoácidos individuais na formação de oligómeros em solução ou em ambientes que mimetizam as condições de membranas biológicas, assim como para uma melhor compreensão do mecanismo da lise celular. Portanto, a caracterização da estrutura tridimensional dos AMPs e suas interações dinâmicas com os lipídeos da membrana são elementos chave na compreensão das atividades biológicas. Para atingir esse objetivo, duas técnicas de espectroscopia são comumente utilizadas. O dicroísmo circular (DC), que fornece informações sobre as condições experimentais em que ocorre uma mudança estrutural, e a ressonância magnética nuclear (RMN), de maior resolução, que permite obter informações sobre as interações peptídeo-membrana em nível atômico. Ambas técnicas de espectroscopia permitiram determinar que os AMPs sofrem uma transição na conformação em presença de solventes orgânicos que mimetizam o ambiente de membrana celular tais como o TFE (trifluoretanol), o SDS (dodecil sulfato de sódio) ou em contato com modelos de membrana mais complexos, tais como vesículas de fosfolipídeos e lipossomas. Em um ambiente aquoso, os peptídeos lineares apresentam conformação randômica, ou seja, não evidenciam elementos de estrutura secundária. Logo, durante a interação do peptídeo com a superfície externa de diferentes tipos de membrana (aniônicas, zwitteriônicas) pode ocorrer uma mudança de conformação. Geralmente, os modelos de membranas microbianas induzem a formação de estruturas helicoidais (α-hélice ou folha-β). É preciso ressaltar que as modificações estruturais dos AMPs dependem tanto da composição lipídica da membrana, como também da temperatura, pH e força iónica [START_REF] Blondelle | Lipid-induced conformation and lipidbinding properties of cytolytic and antimicrobial peptides: determination and biological specificity[END_REF].

Acredita-se que a estrutura secundária adotada pelos AMPs em presença da membrana alvo tem influência significativa na sua atividade e seletividade. De fato, a indução de uma conformação em particular demonstrou ser um requerimento para a atividade lítica dos AMPs (Dathe e Wieprecht, 1999). Além disso, o modo de inserção na membrana provavelmente depende da conformação adotada.

De forma geral, os AMPs apresentam uma estrutura anfipática na interação com membranas biológicas. A anfipaticidade, caracterizada pela separação de uma face hidrofóbica e de uma hidrofílica, ocorre em uma grande variedade de estruturas sendo a estrutura helicoidal a mais comum entre os AMPs lineares. O caráter anfipático nos peptídeos de conformação α-hélice, pode ser formado com uma sequência periódica de resíduos polares e apolares em um intervalo entre três a quatro resíduos de aminoácidos.

Dessa forma, as cadeias laterais polares e apolares dos resíduos de aminoácidos posicionam-se adequadamente para uma separação em faces opostas [START_REF] Huang | Alpha-helical cationic antimicrobial peptides: relationships of structure and function[END_REF].

A anfipaticidade reflete a abundância relativa e a polarização dos domínios hidrofóbicos e hidrofílicos de uma proteína. O caráter anfipático pode ser quantificado mediante o momento hidrofóbico, calculado como sendo a soma vetorial da hidrofobicidade de cada aminoácido, normalizado para uma hélice ideal [START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF]. É possível alterar o valor do momento hidrofóbico fazendo mudanças na sequência de aminoácidos. Em 2010, nosso grupo desenvolveu um modelo de desenho racional (máquinas de vetores de suporte, SVM) que utiliza o momento hidrofóbico, em vez de usar a carga líquida, para a previsão da atividade antimicrobiana de peptídeos com motivos de nó de cisteína [START_REF] Porto | An SVM Model Based on Physicochemical Properties to Predict Antimicrobial Activity from Protein Sequences with Cysteine Knot Motifs[END_REF]. Desta forma, demonstrou-se que o método SVM de alta confiabilidade permite prever a atividade antimicrobiana independentemente do tamanho do peptídeo. Inclusive, observou-se que um elevado momento hidrofóbico gera um aumento significativo nas atividades hemolítica e de permeabilização dos AMPs frente as membranas alvo (Drin e Antonny, 2010). No entanto, um elevado grau de helicidade e/ou anfipaticidade está correlacionado com o aumento da toxicidade para as células compostas de fosfolipídeos neutros [START_REF] Dathe | Hydrophobicity, hydrophobic moment and angle subtended by charged residues modulate antibacterial and haemolytic activity of amphipathic helical peptides[END_REF]Yeaman e Yount, 2003).

A porcentagem de resíduos hidrofóbicos presentes no peptídeo define a hidrofobicidade. De aproximadamente 50% para a maioria dos AMPs, a hidrofobicidade aparentemente seria uma característica essencial para as interações peptídeo-membrana, assim como necessária para uma efetiva permeabilização da membrana. No entanto, níveis elevados de hidrofobicidade podem estar correlacionados com uma maior toxicidade em células de mamífero e com a perda da especificidade antimicrobiana [START_REF] Khandelia | The impact of peptides on lipid membranes[END_REF][START_REF] Schmidtchen | Boosting antimicrobial peptides by hydrophobic oligopeptide end tags[END_REF]. Portanto, muitos AMPs podem ser moderadamente hidrofóbicos, de tal modo que obtenham a optimização da sua atividade contra membranas de células microbianas.

Ângulo polar consiste em uma medida da proporção relativa das faces polares e não polares de um peptídeo de conformação de hélice anfipática. No caso de um peptídeo helicoidal hipotético, onde uma face pode ser composta exclusivamente de resíduos hidrofóbicos e a outra de resíduos carregados, o ângulo polar seria 180° [START_REF] Tossi | Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides[END_REF]. Uma segregação reduzida entre estes domínios ou um aumento da proporção hidrofóbica da hélice reduziria proporcionalmente o ângulo polar. Em numerosos estudos de peptídeos naturais e sintéticos, um menor ângulo polar (e, por conseguinte, uma maior superfície hidrofóbica) está associado com o aumento da capacidade para permeabilizar as membranas (Yeaman e Yount, 2003). Também, tem sido demonstrado que o ângulo polar influencia a estabilidade global e a meia-vida dos poros da membrana induzidos por peptídeos (Uematsu e Matsuzaki, 2000).

Abordagens computacionais para o desenvolvimento de novos AMPs

O uso terapêutico dos AMPs manifesta um possível impedimento que reside na toxicidade frente a células humanas e susceptibilidade à degradação proteolítica que gera uma farmacocinética potencialmente desfavorável (meia-vida curta no sangue). No entanto, este problema foi abordado e várias soluções têm sido propostas, incluindo a incorporação de fragmentos não proteicos; a amidação e acetilação da porção terminal da cadeia peptídica; a síntese de peptídeos contendo D-aminoácidos (em vez de os Laminoácidos de origem natural) que torna os peptídeos resistentes às enzimas plasmáticas, mantendo a atividade antimicrobiana e, muitas vezes, reduzindo a atividade hemolítica [START_REF] Mangoni | Effect of natural L-to D-amino acid conversion on the organization, membrane binding, and biological function of the antimicrobial peptides bombinins H[END_REF][START_REF] Knappe | Easy strategy to protect antimicrobial peptides from fast degradation in serum[END_REF]. Ademais, o uso terapêutico limitado dos AMPs tem a ver em grande medida com o alto custo de fabricação de peptídeos [START_REF] Marr | Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook[END_REF]. O presente cenário tem limitado tanto os testes como o desenvolvimento de um grande número de análogos. Porém, foram propostas muitas estratégias para produzir peptídeos na escala e pureza necessários para a aplicação terapêutica, utilizando uma variedade de métodos de DNA recombinante por meio de bactérias e fungos, bem como plantas e sistemas de produção animal.

A bioinformática tem contribuído de forma decisiva no que se refere à identificação e concepção de AMPs, assim como, aos estudos sobre os mecanismos de ação. Desde a década de 1990, vários métodos têm sido aplicados para a concepção racional de AMPs com o objetivo de gerar análogos de tamanho reduzido com atividade antimicrobiana melhorada e baixa toxicidade para as células humanas. Além disso, devido a quantidade limitada de compostos antimicrobianos naturais que pode ser extraída in vivo, a biotecnologia representa um papel central no desenvolvimento de fármacos a partir de

AMPs identificados e caracterizados [START_REF] Afacan | Therapeutic potential of host defense peptides in antibiotic-resistant infections[END_REF].

As estratégias computacionais para o desenho racional, podem ser utilizadas para a descoberta de moléculas candidatas a fármacos, mas também para a otimização de substâncias bioativas já existentes obtidas pelo próprio desenho. A triagem computacional constitui um método altamente automatizado para a identificação de potenciais medicamentos a partir de coleções de compostos reais ou virtuais. Esta técnica permite explorar de forma rápida grandes quantidades de sequências tornando mais simples o trabalho de identificação e seleção de moléculas capazes de interagir com alta afinidade e seletividade com o alvo molecular selecionado [START_REF] Fjell | Optimization of antibacterial peptides by genetic algorithms and cheminformatics[END_REF].

Portanto, podemos fazer uso de técnicas de rastreio de alto rendimento (HTS; High-Throughput Screening) que podem ser feitas in silico (virtual screening), in vivo ou in vitro. Um exemplo disso, a técnica spot array em suporte de celulose, permite sintetizar até 1000 peptídeos de maneira rápida e eficiente em termos de custo (Hilpert et al., 2007;[START_REF] Winkler | Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method[END_REF]. Os peptídeos sintetizados em celulose podem ser facilmente clivados e a sua atividade antimicrobiana testada com alta sensibilidade, por meio da cepa Pseudomonas aeruginosa H1001, na qual tem sido introduzido o gene que codifica a enzima luciferase bacteriana. Deste modo, detecta-se a presença de células vivas pela oxidação de D-luciferina em presença de ATP, pela análise da intensidade da fluorescência ao longo do tempo [START_REF] Hilpert | High-throughput generation of small antibacterial peptides with improved activity[END_REF]Hilpert e Hancock, 2007).

Por outro lado, a simulação molecular permite a visualização tridimensional e predição teórica das interações entre os AMPs e uma variedade de membranas miméticas (zwitteriônicas, aniônicas). Assim, a partir de mínimas informações experimentais e da sequência primaria, pode ser possível determinar a estrutura tridimensional dos peptídeos e suas interações. Isso nos ajuda a predizer e compreender os mecanismos moleculares da atividade antimicrobiana assim como os efeitos citotóxicos (Langham e Kaznessis, 2010).

Contudo, os modelos in silico devem ser integrados aos ensaios in vivo e in vitro com o propósito de diminuir a quantidade de moléculas a serem avaliadas e maximizar as chances de sucesso na identificação de novos AMPs com potencial de desenvolvimento clínico.

Métodos de desenho racional

A metodologia tradicional responsável pela descoberta da maioria dos fármacos utilizados hoje, consiste no teste direto de compostos naturais ou sintéticos em ensaios biológicos (testes em células ou modelos animais). O processo de purificação, caracterização e síntese de compostos naturais, além de precisar uma grande diversidade de material biológico para testes, tornam o processo trabalhoso, ineficiente e de alto custo.

Muitos AMPs de origem natural precisam ser melhorados antes que eles possam ser utilizados como agentes terapêuticos. Nos últimos anos, vem surgindo também uma grande variedade de AMPs produzidos sinteticamente com o objetivo de criar AMPs com características físico-químicas desejáveis. Neste contexto, surgem métodos de desenho in silico de moléculas com alta especificidade para patógenos, maior resistência à degradação por proteinases, baixa toxicidade para células eucariotas ou, ainda, técnicas de produção de partes menores a partir de peptídeos complexos que sejam mais facilmente sintetizados para elaboração em larga escala [START_REF] Fjell | Designing antimicrobial peptides: form follows function[END_REF].

Atualmente, uma abordagem racional para o desenho de novos fármacos tornou-se uma área de grande destaque na química medicinal. Os métodos de desenho racional de

AMPs visam criar um produto farmacêutico com maior especificidade para os microrganismos, evitando efeitos secundários. A descoberta do papel das propriedades físico-químicas dos AMPs permitiu o desenvolvimento de métodos para predizer a atividade antimicrobiana, o que, por sua vez, pode conduzir à identificação prévia de AMPs, antes de sua síntese.

Parâmetros estruturais e físico-químicos tais como a cationicidade, a propensão para estruturação helicoidal, a anfipaticidade, a hidrofobicidade, podem estar intimamente relacionados, de modo que as modificações destinadas a alterar um parâmetro, podem resultar em mudanças significativas para um ou mais dos outros. Compreender e controlar essas inter-relações pode ser a chave para a concepção de novos peptídeos com maior potência e especificidade. Vários métodos de predição de atividade antimicrobiana surgiram a partir de estudos de desenho racional [START_REF] Lata | AntiBP2: improved version of antibacterial peptide prediction[END_REF][START_REF] Thomas | CAMP: a useful resource for research on antimicrobial peptides[END_REF][START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF].

De acordo com [START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF], existem quatro tipos de metodologias de desenho racional, que incluem os métodos físico-químicos, os métodos baseados em uma sequência modelo, os métodos evolutivos e os métodos de novo. Embora também existam métodos híbridos, essencialmente, estas quatro classes conseguem definir os métodos de desenho racional.

• Métodos físico-químicos

Os primeiros métodos de desenho racional foram baseados no mecanismo de ação mais proposto para os AMPs, a ruptura de membrana. Assim, a maioria dos métodos físico-químicos usam peptídeos com conformação em α-hélice como base para o estudo [START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF]. Peptídeos com conformação em α-hélice apresentam uma ampla distribuição e um grande espectro de atividades, e as suas propriedades físico-químicas (carga total, hidrofobicidade, momento hidrofóbico) podem ser facilmente mensuradas. O trabalho de Giangaspero et al. (2001) demonstrou que modificações na propensão de formação de α-hélice modificam a potência antimicrobiana.

• Métodos baseados em uma sequência modelo

Enquanto as abordagens baseadas em uma sequência conhecida, a geração de AMPs não depende da atividade antimicrobiana do peptídeo escolhido como modelo.

Com o objetivo de reduzir o tamanho, aumentar a seletividade e/ou reduzir o efeito citotóxico de sequências conhecidas, tais abordagens podem utilizar as informações geradas pelos métodos físico-químicos [START_REF] Ahn | Design and synthesis of novel antimicrobial peptides on the basis of alpha helical domain of Tenecin 1, an insect defensin protein, and structure-activity relationship study[END_REF]. Pode ser possível desenvolver análogos através da substituição de alguns resíduos de aminoácidos para outros com propriedades diferentes. Em 2005, Zelezetsky e colaboradores desenvolveram 6 análogos com base no peptídeo P1(Aib 7 ) não proteinogênico de estrutura α-hélice efetuando uma substituição de aminoácido nas posições estratégicas 7 e/ou 14, demonstrando que pode ser possível modular a natureza lítica do peptídeo e torná-lo mais específico para células microbianas, através de substituições de aminoácidos mínimas [START_REF] Zelezetsky | Tuning the biological properties of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides: rational use of minimal amino acid substitutions[END_REF].

Seguindo a mesma estratégia de substituição de aminoácidos, foi possível fazer substituições de forma conservativa (a estrutura terá poucas alterações). Desse modo, Ueno e colaboradores no ano 2011, criaram com sucesso novos CAMPs (peptídeos antimicrobianos catiônicos) a partir de sequências de origem natural não antimicrobianas [START_REF] Ueno | Generation of novel cationic antimicrobial peptides from natural nonantimicrobial sequences by acid-amide substitution[END_REF]. Recentemente, foi desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, um peptídeo palíndromo rico em alanina, nomeado Pa-MAP2, a partir de um peptídeo sintético obtido do peixe P. americanus. O peptídeo Pa-MAP2, desenhado por substituição de aminoácidos, demonstrou baixa toxicidade para células de mamíferos e grande especificidade para membranas aniônicas [START_REF] Migliolo | Structural and functional evaluation of the palindromic alanine-rich antimicrobial peptide Pa-MAP2[END_REF].

• Métodos evolutivos

Os métodos evolutivos requerem um maior poder computacional que os dois citados anteriormente. Os métodos evolutivos utilizam algoritmos genéticos que tratam um conjunto de peptídeos como uma população onde cada indivíduo pode ser uma resposta em potencial. O algoritmo força a população de peptídeos a evoluir baseado em uma função de fitness (por exemplo, um score de atividade antimicrobiana) que pode ser maximizada ou minimizada. Este tipo de método tem sido pouco aplicado, existem apenas dois trabalhos que relatam o desenvolvimento de AMPs através de algoritmos genéticos [START_REF] Patel | Patenting computer-designed peptides[END_REF][START_REF] Fjell | Optimization of antibacterial peptides by genetic algorithms and cheminformatics[END_REF], e que utilizam a mesma função de fitness.

• Métodos de novo

Contrariamente aos métodos evolutivos que utilizam uma sequência central para desenvolver análogos, os métodos de novo, podem gerar uma grande variedade de sequências usando padrões ou frequências de aminoácidos e as preferências de posicionamento [START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF]. A semelhança do método anterior, os métodos de novo precisam de um alto poder computacional.

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Desenho racional de sequências para o trabalho

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A família de peptídeos mastoparanos consistem em AMPs componentes do veneno de vespa, ricos em resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e básicos que adotam uma conformação de "-hélice anfipática em ambientes lipídicos. Pertencente a essa família de tetradecapéptidos, o mastoparano L (MP) exibe uma grande variedade de atividades biológicas, entre elas, a capacidade de ativar a liberação dos grânulos de mastócitos que contém histamina, substância envolvida nos processos de reações alérgicas [START_REF] Hori | Interaction of mastoparan with membranes studied by 1H-NMR spectroscopy in detergent micelles and by solid-state 2H-NMR and 15N-NMR spectroscopy in oriented lipid bilayers[END_REF]. Experimentos com membranas modelo tem demonstrado a capacidade do MP de induzir a permeabilização de membranas e a formação de canais iônicos (Mellor e Sansom, 1990;[START_REF] Li | Antimicrobial activity of synthetic all-D mastoparan M[END_REF]. Apesar da sua atividade antimicrobiana, o potencial terapêutico do MP parece ser limitado devido aos efeitos tóxicos frente às células de original [START_REF] Porto | Duas Novas Ferramentas para Desenho Racional de Peptídeos Antimicrobianos[END_REF].

Síntese de peptídeos -técnica spot array em suporte de celulose

Os peptídeos desenhados in silico foram sintetizados sobre membrana de celulose utilizando a técnica spot array, produzida pela Kinexus Bioinformatics Corporation (Vancouver, BC). A metodologia desenvolvida por Ronald Frank e colaboradores [START_REF] Frank | The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications[END_REF], permite a construção rápida e eficiente de um grande número de sequências peptídicas (até 100 para síntese manual) em pontos, ou spots. Os aminoácidos são depositados em volume mínimo (0,6 µL) com auxílio de um micropipetador automático, permitindo obter aproximadamente 50 nmols de peptídeo por spot. Segundo Hilpert et al.

(2007), a confiabilidade da metodologia limita-se ao tamanho da sequência entre 6-18 aminoácidos. Após a síntese, os spots de membrana com os diversos peptídeos foram dissolvidos em água destilada overnight e, subsequentemente, avaliada a sua atividade antimicrobiana tal como descrito a seguir.

Determinação da atividade antimicrobiana frente a P. aeruginosa bioluminiscente

A atividade antimicrobiana dos peptídeos sintetizados foi avaliada contra a cepa bioluminescente Pseudomonas aeruginosa H1001 em placa de 96 poços tal como descrito anteriormente, com algumas modificações [START_REF] Hilpert | High-throughput generation of small antibacterial peptides with improved activity[END_REF]Hilpert e Hancock, 2007).

As soluções aquosas de peptídeos liberados a partir do suporte de celulose, foram diluídas duas vezes em meio BM2 (62 mM de tampão fosfato de potássio pH = 7, 7mM (NH 4 ) 2 corresponde à suspensão bacteriana em presença de formaldeído 0,7% (v:v) e o controle negativo em ausência de peptídeo [START_REF] Andre | Structure-activity relationship-based optimization of small temporin-SHf analogs with potent antibacterial activity[END_REF].

Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) antifúngica

A atividade antifúngica dos peptídeos foi avaliada também pelo ensaio de et al., 2015).

Ensaio hemolítico

O ensaio utilizado para determinar a atividade hemolítica dos peptídeos, foi modificado do protocolo descrito por [START_REF] Bignami | A rapid and sensitive hemolysis neutralization assay for palytoxin[END_REF] foi usada uma suspensão de eritrócitos incubados com uma solução de Triton X-100 1% (v:v). Os resultados foram expressos pela concentração de peptídeo capaz de produzir 50% de hemólise (concentração lítica 50, LC 50 ).

Avaliação citotóxica dos peptídeos in vitro

A avaliação da citotoxicidade dos peptídeos foi realizada frente a macrófagos humanos derivados de monócitos THP- 

Avaliação da permeabilização de membranas bacterianas induzida por peptídeos

O efeito dos peptídeos sobre a permeabilidade da membrana plasmática das bactérias Gram-negativa E. coli ATCC 25922 e Gram-positiva S. aureus ATCC 25923, foi avaliado mediante o uso da sonda fluorescente SYTOX green (SG) [START_REF] Thevissen | Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth[END_REF]. As células sadias não permitem a entrada da sonda SG, entretanto quando a membrana das células sofre alterações, a sonda penetra na célula e se associa aos ácidos nucleicos, que conduz a um aumento de fluorescência. Células bacterianas em crescimento exponencial foram centrifugadas (1000 x g, 10 min, 4 °C), lavadas e ressuspendidas em PBS (NaCl 1M, Na 2 HPO 4 0,1M, pH 7,3) até A 630 de 0,01. Um volume de 792 µL da suspensão bacteriana contendo 6 x 10 5 UFC.mL -1 , foi incubado com 8 µL de SG 100 µM durante 30 min a 37 °C no escuro. Após a adição do peptídeo (200 µL, concentração final, 2 vezes superior ao valor da CMI), a fluorescência foi monitorada durante 20 min a 37 °C no espectrofotómetro de fluorescência Varian Cary Eclipse, com excitação e emissão em 485 e 520 nm, respectivamente. Dois controles experimentais foram utilizados: o controle negativo, correspondente à células em presença de PBS e o controle positivo, correspondente à células em presença do peptídeo formador de poros na membrana, melitina [START_REF] Rex | Pore formation induced by the peptide melittin in different lipid vesicle membranes[END_REF]. Foram realizadas três experiências independentes e os resultados correspondem a uma experiência representativa.

Avaliação da despolarização de membranas bacterianas induzida por peptídeos

O efeito dos peptídeos sobre a polarização da membrana plasmática de bactérias Gram-negativa E. coli ATCC 25922 e Gram-positiva S. aureus ATCC 25923, foi avaliado mediante o uso da sonda fluorescente DiSC3(5) (3,3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide) [START_REF] Sims | Studies on the mechanism by which cyanine dyes measure membrane potential in red blood cells and phosphatidylcholine vesicles[END_REF]. A sonda sensível ao potencial de membrana DiSC3( 5 em 622 e 670 nm, respectivamente [START_REF] Andre | Structure-activity relationship-based optimization of small temporin-SHf analogs with potent antibacterial activity[END_REF]. Dois controles experimentais foram utilizados: o controle negativo, correspondente à células em presença de PBS e o controle positivo, correspondente à células em presença do peptídeo formador de poros na membrana, melitina [START_REF] Rex | Pore formation induced by the peptide melittin in different lipid vesicle membranes[END_REF]. Foram realizadas três experiências independentes e os resultados correspondem a uma experiência representativa.

Ensaios time-kill

A cinética de ação bactericida (time-kill) dos peptídeos desenhados foi investigada frente as bactérias Gram-negativa E. coli ATCC 25922 e Gram-positiva S. aureus ATCC 25923, com uma concentração de peptídeo duas vezes superior ao valor da CMI. Cultivos bacterianos em fase de crescimento exponencial, foram centrifugados (1000 g, 10 min, 4˚C), lavados três vezes com PBS (10 mM fosfato, 100 mM NaCl, pH 7,3), e em seguida, suspensos em PBS para obter uma concentração de 10 6 UFC.mL -1 . Foram incubados 100 µL desta suspensão bacteriana a 37˚C com 100 µL de PBS contendo os peptídeos.

Alíquotas de 10 µL foram retiradas a diferentes tempos, diluídas em meio LB, e espalhadas em placas de LB-agar. Após incubação durante a noite a 37 °C, os valores de UFC foram obtidos. Se realizaram controles em ausência de peptídeo. Duas replicas do experimento foram realizadas em triplicata para determinar a cinética do time-kill (Abbassi et al., 2013).

Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV-FEG)

A fim de observar possíveis alterações morfológicas na superfície das células em presença dos peptídeos desenhados, foram obtidas imagens de alta resolução utilizando microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV-FEG, do 

Modelagem molecular

A busca pelos moldes estruturais foi feita por meio do servidor HHPred [START_REF] Soding | The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction[END_REF]. Para a construção de modelos tridimensionais de peptídeos, foi realizada uma pesquisa usando os códigos PDB. Utilizou-se o código 1D7N para o peptídeo [I [START_REF] Laskowski | PROCHECK-a program to check the stereochemical quality of protein structures[END_REF]. PROCHECK verifica a qualidade estereoquímica da estrutura da proteína através do gráfico de Ramachandran, para o qual os modelos de boa qualidade apresentam > 90% dos resíduos de aminoácidos nas regiões mais favoráveis e permitidas, enquanto PROSA II indica a qualidade de dobramento. A visualização da estrutura foi realizada em PyMOL (http://www.pymol.org).

Dinâmica molecular em água

Utilizando o modelo de água Single Point Charge [START_REF] Berendsen | Interaction models for water in relation to protein hydratation[END_REF]; foram realizadas as simulações dos peptídeos em um ambiente aquoso. As análises foram realizadas utilizando o campo de força GROMOS96 43A1 e o pacote computacional GROMACS 4 [START_REF] Hess | GROMACS 4: algorithms for highly efficient, load-balanced, and scalable molecular simulation[END_REF]. A dinâmica utiliza os modelos moleculares dos peptídeos como as estruturas iniciais, imersas em moléculas de água em uma caixa cúbica com distância mínima de 10 Å entre o peptídeo e os limites do caixa. A fim de neutralizar a carga do sistema, foram adicionados íons cloro. A geometria das moléculas de água foi condicionada utilizando o algoritmo SETTLE (Miyamoto e Kollman, 1992). Todos os comprimentos das ligações entre átomos foram vinculados usando o algoritmo LINCS [START_REF] Hess | LINCS: a linear constraint solver for molecular simulations[END_REF]. As correções eletrostáticas foram feitas de acordo com o algoritmo Particle Mesh Ewald [START_REF] Darden | Particle mesh Ewald: an N⋅log(N) method for Ewald sums in large systems[END_REF], com um limite de raio de 1,4 nm, a fim de minimizar o tempo de cálculo. O mesmo limite de raio também foi utilizado para as interações de van der Waals. A lista dos vizinhos de cada átomo foi atualizada a cada 10 passos de simulação de 2 fs. O sistema foi submetido a uma minimização de energia usando 50.000 passos do algoritmo Steep Descent. Após isso, a temperatura do sistema foi normalizada a 310 K para 100 ps, utilizando o termostato velocity rescaling (conjunto NVT). Em seguida, a pressão do sistema foi normalizada a 1 bar para 100 ps, usando o baróstato Parrinello-Rahman (conjunto NPT). Os sistemas com energia minimizada, temperatura equilibrada e pressão foram simulados para 100 ns, utilizando o algoritmo leap-frog (Van Gunsteren e [START_REF] Van Gunsteren | A leap-frog algorithm for stochastic dynamics[END_REF]. As estruturas foram salvas a cada 2 ps de simulação.

Dinâmica molecular em membrana DOPC

O modelo molecular ou estrutura por RMN dos peptídeos foi colocado na membrana utilizando o servidor CHARMM-GUI [START_REF] Wu | CHARMM-GUI membrane builder toward realistic biological membrane simulations[END_REF]. A simulação foi realizada para o modelo de membranas miméticas dioleolylphosphatidylcholine (DOPC).

O eixo principal do peptídeo foi alinhado com o eixo Z e, em seguida, inserido na bicamada retangular DOPC de 50 Å 2 (eixos X e Y) utilizando o método de inserção para a construção do sistema. A simulação foi realizada de forma semelhante à simulação em água, com pequenas modificações. O sistema foi simulado utilizando o campo de força GROMOS96 53a6 ampliado para os lipídios Berger [START_REF] Berger | Molecular dynamics simulations of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidylcholine at full hydration, constant pressure, and constant temperature[END_REF]. O arquivo de topologia e os parâmetros lipídicos foram obtidos a partir do sítio web de Dr. Tieleman 

Atividade hemolítica e citotóxica sobre linhagens celulares humanas

Conforme os dados da Tabela 6, não foi detectada atividade hemolítica do peptídeo 

Cinética da atividade antibacteriana in vitro

A velocidade de ação de EcDBS1R6 foi investigada para E. coli e S. aureus na concentração de peptídeo duas vezes acima da CMI (6,25µM), concentração idêntica à utilizada nos ensaios de permeabilização e despolarização. Os resultados obtidos, representados pelas curvas de morte da Figura 14, indicaram que o tempo necessário para EcDBS1R6 produzir a morte de ambas cepas bacterianas sensíveis foi de 15 min.

Figura 14. Cinética da morte celular de E. coli ATCC 25922 (triângulos brancos) e S. aureus ATCC 25923 (círculos brancos) após incubação com 6,25 µM de EcDBS1R6 (dobro da CMI). O controle foi realizado em ausência de peptídeo. Os resultados são expressos como a média dos valores representativos de um experimento realizado em triplicata.

Visualização da atividade antimicrobiana por MEV-FEG

Na Figura 15, visualizam-se as imagens feitas mediante MEV-FEG para investigar o efeito de EcDBS1R6 sobre a morfologia da superfície das bactérias sensíveis P.

aeruginosa ATCC 27853 e L. ivanovii Li 4pVS2. De acordo com as análises microscópicas das amostras, observou-se que as células bacterianas P. aeruginosa e L.

ivanovii, crescendo na presença de EcDBS1R6, apresentaram danos na membrana, quando comparadas com as células controle.

No caso de P. aeruginosa, confirmou-se a potente atividade do peptídeo ao observar uma deformação da membrana das células bacterianas na presença de 6,25 µM EcDBS1R6 (CMI) (Figura 15B), quando comparadas com a célula controle (Figura 15A).

Além disso, ao aumentar a concentração de peptídeo utilizada na incubação, foi possível notar células de P. aeruginosa com alterações significativas na presença de 12,5 µM EcDBS1R6 (dobro da CMI) (Figura 15C) e, ainda de forma mais evidente, na presença de 50 µM EcDBS1R6 (8 vezes acima da CIM) observou-se o colapso da membrana e a formação de poros nas células (Figura 15D).

No caso de L. ivanovii, a Figura 15F revela que as células crescidas na presença de 25 µM EcDBS1R6 (dobro da CMI) sofreram deformações na membrana plasmática, observando-se a formação de poros, quando comparada com a membrana plasmática intata das células controle (Figura 15E). simultânea TOCSY e NOESY [START_REF] Wuthrich | Sequential individual resonance assignments in the 1H-nmr spectra of polypeptides and proteins[END_REF].

O diagrama de conectividades NOE (Figura 2C, Apêndice I), que indica a região provável de estruturação do peptídeo, não apresentou correlações i, i+3 referente as correlações 19HN-16H α , 17HN-14H α , 16NH-13H α e 15HN-12H α , devido aos sinais de H α se localizarem na mesma linha de ressonância da sua correlação (i+3) HN.

A predição da estrutura secundária de PaDBS1R1 realizou-se utilizando o método proposto por Wishart para peptídeos [START_REF] Wishart | The chemical shift index: a fast and simple method for the assignment of protein secondary structure through NMR spectroscopy[END_REF] A partir dos experimentos de HSQC de 13 C e HMQC de 15 N, foram preditos os ângulos de torção PHI (ϕ) e PSY (ψ), utilizando o programa TALOS+ [START_REF] Shen | TALOS+: a hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts[END_REF]. A predição foi classificada como apresentado uma boa predição para os resíduos de aminoácidos (dados não mostrados), exceto para o resíduo Lys-2 classificado como ambíguo, além de indicar uma estruturação em α-hélice do resíduo Leu-4 ao Phe-18.

Os elementos de estrutura secundária preditos pelo CSI, concordaram com o previsto pelo programa TALOS+, sendo assim prosseguiu-se os estudo, pela análise das restrições que seriam utilizadas nos cálculos, utilizando o programa QUEEN (Quantitative Evaluation of Experimental NMR Restraints), esse programa faz uma avaliação quantitativa das restrições experimentais [START_REF] Nabuurs | Quantitative evaluation of experimental NMR restraints[END_REF]. Assim, o programa QUEEN permitiu verificar e corrigir possíveis erros de atribuições pelas análises das restrições que apresentavam alta unicidade. As restrições utilizadas nos cálculos das estruturas apresentam baixa unicidade (I uni ) (Figura 3C em Apêndice I), confirmando a confiabilidade das restrições utilizadas, pela ausência de restrições não suportadas pelo conjunto. As informações de média distância (I med ) (Figura 3D em Apêndice I), ou seja, as restrição que contêm a maior parte da informação estrutural, indicaram uma maior importância para as restrições de média distância. Esta informação confirma que a restrição intra-residual, como esperado, contém apenas poucas informações estruturais, embora componham uma parte importante do conjunto de dados úteis para confirmar as atribuições e indicar a integralidade dos conjuntos de dados.

Após a análise da lista de restrições, foram realizados os cálculos estruturais. Foram utilizadas 278 restrições de distâncias, totalizando uma média de 16,4 restrições por resíduo.

Um total de 200 estruturas foram calculadas, sendo selecionadas as 20 estruturas de menor energia para o processo de refinamento em água [START_REF] Linge | Refinement of protein structures in explicit solvent[END_REF]. As 10 estruturas de menor energia das 20 foram selecionadas para representar a família de estruturas. A precisão das estruturas resolvidas por RMN, foi expressa em função de RMSD, como uma medida da qualidade da estrutura [START_REF] Nabuurs | Concepts and tools for NMR restraint analysis and validation[END_REF]. Através do programa MOLMOL [START_REF] Koradi | MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures[END_REF], as 10 estruturas de menor energia foram sobrepostas e obtidos os valores de RMSD (Figura 3B em Apêndice I). Os valores de RMSD, evidenciaram que as estruturas exibem uma boa geometria indicando uma boa flexibilidade conformacional, refletindo a dinâmica interna da molécula e as incertezas que derivam da conversão experimental dos dados e processos computacionais [START_REF] Spronk | The precision of NMR structure ensembles revisited[END_REF]. A existência de conformações convergentes mostra a consistência e compatibilidade das restrições utilizadas no cálculos estruturais.

As 

DISCUSSÃO

Nos dias de hoje, os peptídeos têm sido considerados como potentes candidatos para a geração de uma nova classe de drogas, oferecendo uma alternativa interessante para abordar o crescente problema da resistência aos antibióticos. Novos AMPs caracterizados recentemente, inspiram modelos moleculares para o desenvolvimento de agentes terapêuticos inovadores e, à medida que serão descobertos, continuarão a possibilitar estratégias antimicrobianas, porque foram baseados em estratégias de defesa que provaram ser eficazes ao longo dos milênios [START_REF] Zasloff | Antimicrobial peptides of multicellular organisms[END_REF]. Embora as bactérias tenham mecanismos de resistência contra esses peptídeos, a multifuncionalidade dos AMPs poderia fugir à resistência bacteriana [START_REF] Franco | Peptide promiscuity: an evolutionary concept for plant defense[END_REF].

Apesar do grande potencial terapêutico, a aplicação dos AMPs de origem natural na clínica, tem sido um sucesso limitado (Zhang e Falla, 2006). Existem certos obstáculos para o uso dos AMPs como agentes antiinfecciosos. Dentre eles, destaca-se o seu potencial de toxicidade. Todos os ensaios clínicos com peptídeos até à data, têm usados aplicações tópicas para tratar infecções de superfície, em vez da administração com efeito sistêmico (de tipo parenteral e/ou oral) que corresponde ao mercado mais lucrativo (Kosikowska e Lesner, 2016).

Além disso, durante a última década, apenas duas novas classes de antibióticos chegaram ao mercado, a oxazolidinona (linezolida por Pfizer) e um lipopeptídeo cíclico (daptomicina por Cubist), ativas contra bactérias Gram-positivas tais como MRSA, porém não tem se registrado novas classes em ensaios clínicos de fase II ou III [START_REF] Coates | Novel classes of antibiotics or more of the same?[END_REF]. Frente aos obstáculos da aplicação terapêutica dos AMPs, o desenho racional de sequências peptídicas proporciona uma alternativa eficiente para o desenvolvimento de novos fármacos. Pesquisas recentes do nosso grupo mostram que esta abordagem pode ser utilizada na predição, geração e/ou otimização de AMPs [START_REF] Porto | An SVM Model Based on Physicochemical Properties to Predict Antimicrobial Activity from Protein Sequences with Cysteine Knot Motifs[END_REF][START_REF] Porto | an updated SVM model for antimicrobial activity prediction in cysteine-stabilized peptides[END_REF][START_REF] Mandal | Controlling resistant bacteria with a novel class of beta-lactamase inhibitor peptides: from rational design to in vivo analyses[END_REF].

Com a perspectiva de utilizar uma abordagem racional para a geração de novas sequências peptídicas antimicrobianas, os métodos de desenho in silico ofereceram a base para o presente estudo. A partir de métodos baseados em sequência modelo, construiu-se uma grande variedade de sequências com potencial aplicação terapêutica. A síntese realizou-se por meio da estratégia spot array na qual os múltiplos peptídeos são fixos em suporte sólido, neste caso uma superfície de celulose. Posteriormente, a membrana de celulose foi usada para determinação da atividade antibacteriana dos peptídeos frente a bactéria bioluminiscente P. aeruginosa H1001. Esta cepa mutante foi escolhida porque ela expressa luminescência de uma forma abundante e constitutiva, e porque Pseudomonas sp. representa um dos principais agentes patogénicos resistentes aos antibióticos, sendo assim um alvo importante para o desenvolvimento de antibióticos (Hilpert e Hancock, 2007). Esta técnica possibilitou a análise de uma grande quantidade de sequencias para a escolha de peptídeos com potencial Por outro lado, a maior concentração de peptídeo necessária para atingir o efeito letal sobre a espécie E. faecalis não é de surpreender, uma vez que esta bactéria tem demonstrado ser um agente patogênico resistente aos antibióticos, difícil de matar [START_REF] Tong | An in vitro study on the effects of nisin on the antibacterial activities of 18 antibiotics against Enterococcus faecalis[END_REF]. Além disso, existe evidência de marcadas diferenças na composição lipídica da membrana de E. faecalis em comparação com as outras bactérias Grampositivas testadas neste trabalho [START_REF] Mishra | Daptomycin resistance in enterococci is associated with distinct alterations of cell membrane phospholipid content[END_REF][START_REF] Kumariya | Increased membrane surface positive charge and altered membrane fluidity leads to cationic antimicrobial peptide resistance in Enterococcus faecalis[END_REF].

A partir do banco de dados APD (Antimicrobial Peptide Database), verifica-se um maior número de AMPs registrados com atividade exclusivamente para o combate a bactérias Grampositivas (16,2% com atividade exclusiva contra Gram-positivas versus 8,1% contra Gramnegativas) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Além disso, muitas IRAS são causadas por bactérias Gram-negativas resistentes aos antibióticos de uso convencional [START_REF] Fox | Antimicrobial peptides stage a comeback[END_REF] [START_REF] Shibata | Existence of branched side chains in the cell wall mannan of pathogenic yeast, Candida albicans. Structure-antigenicity relationship between the cell wall mannans of Candida albicans and Candida parapsilosis[END_REF]. Essas diferenças encontram-se relacionadas também à interação com células do sistema imune, participando na adesão às células epiteliais, no reconhecimento pelos receptores imunes e no desenvolvimento de patogenicidade [START_REF] Shibata | Immunochemistry of pathogenic yeast, Candida species, focusing on mannan[END_REF]. Tendo isso em consideração, a falta de atividade antifúngica do peptídeo EcDBS1R6 sugere alguma deficiência na interação molecular com os componentes da parede fúngica que impediria ao peptídeo atingir a membrana plasmática do fungo.

Sabe-se que vários AMPs sofrem modificações pós traducionais que podem alterar a sua atividade biológica, particularmente aqueles peptídeos carboxamidados são muitas vezes mais eficazes em termos antimicrobianos, do que as formas não-amidadas [START_REF] Ali | Antimicrobial peptides isolated from skin secretions of the diploid frog, Xenopus tropicalis (Pipidae)[END_REF][START_REF] Katayama | Significance of a carboxyl-terminal amide moiety in the folding and biological activity of crustacean hyperglycemic hormone[END_REF]. Isto pode ser devido à neutralização da carga negativa do extremo Cterminal, aumentando assim a carga positiva líquida do peptídeo e/ou devido à proteção de degradação do peptídeo por parte de enzimas carboxipeptidases. Particularmente, estudos prévios revelaram uma intensificada ação antimicrobiana do peptídeo mastoparano e seus análogos na forma C-terminal amidada [START_REF] Sforca | How C-terminal carboxyamidation alters the biological activity of peptides from the venom of the eumenine solitary wasp[END_REF][START_REF] Da Silva | The effects of the C-terminal amidation of mastoparans on their biological actions and interactions with membrane-mimetic systems[END_REF] Afim de avaliar a atividade hemolítica dos peptídeos, bem como a toxicidade frente a células humanas, procedemos a determinar a concentração do peptídeo capaz de produzir a lise de 50% das células (LC 50 ). Desta maneira, os dados da capacidade hemolítica dos peptídeos revelaram a ausência de atividade hemolítica com valores superiores à 200 µM, para todos os peptídeos com a exceção de PaDBS1R1 que apresentou um valor menor de 50 µM, porém superior aos dados CMI (1,5 -3,125 [START_REF] Leite | The effect of acidic residues and amphipathicity on the lytic activities of mastoparan peptides studied by fluorescence and CD spectroscopy[END_REF][START_REF] Lin | Structural and biological characterization of mastoparans in the venom of Vespa species in Taiwan[END_REF][START_REF] Konno | Peptide toxins in solitary wasp Venoms[END_REF].

Após a determinação da capacidade antimicrobiana dos peptídeos, o passo seguinte consistiu em estudar a permeabilização e despolarização de membranas bacterianas induzida por peptídeos assim como a cinética da sua atividade bactericida. Portanto, utilizou-se para esses estudos, uma concentração correspondente ao dobro da CMI a fim de garantir a correta observação do efeito dos peptídeos nas bactérias susceptíveis. Conforme os fins do estudo, as sondas SG e DiSC3(5) permitiram avaliar o efeito dos peptídeos sobre a integridade de membranas citoplasmáticas das bactérias Gram-negativa E. coli e Gram-positiva S. aureus, utilizando como referência a atividade do peptídeo melitina, de conhecida ação formadora de poros. Dessa maneira, a análise quantitativa da intensidade de fluorescência das sondas ao longo do tempo, permitiu determinar a habilidade de todos os peptídeos desenhados para permeabilizar e despolarizar ambas cepas bacterianas testadas. De forma detalhada, a cinética de permeabilização da membrana de E. coli induzida por PaDBS1R1 evidenciou-se mais rápida comparada aos outros peptídeos, no entanto a cinética de despolarização, mostrou-se similar para todos os peptídeos. No caso da membrana de S. aureus, todos os peptídeos induziram rapidamente a sua permeabilização e despolarização, porém a intensidade do efeito sobre a membrana (intensidade de fluorescência das sondas) revelou-se muito menor para o peptídeo EcDBS1R6. Contudo, nossos resultados nos levam a sugerir que todos os peptídeos apresentariam um mecanismo de ação bactericida dependente do comprometimento da integridade da membrana.

A velocidade de ação bactericida dos peptídeos, foi monitorada pela contagem de UFC após incubação com o peptídeo (na concentração 2x CMI). Em função dos resultados da cinética de morte, percebemos que o peptídeo EcDBS1R6 atua com a mesma velocidade frente a ambas bactérias Gram-negativa e Gram-positiva (15 min). A rápida ação bactericida de EcDBS1R6, comparada a baixa intensidade do efeito de permeabilização e despolarização da membrana bacteriana (Figura 13), nos leva a pensar que o mecanismo de ação poderia envolver a interferência em processos intracelulares, provocando eventualmente um bloqueio de divisão celular. No caso de [I 5 , R 8 ] MP e PaDBS1R1, o ensaio de time-kill revelou que estes peptídeos atuam de forma mais rápida frente a bactéria E. coli que a bactéria S. aureus (diferença de 30 min entre as cepas). A rápida permeabilização e despolarização de S. aureus induzidas por [I 5 , R 8 ] MP (Figura 9) e PaDBS1R1 (Figura 17), sugere que o efeito sobre a integridade da membrana pode ser um fator importante no mecanismo de morte, no entanto, a capacidade de alterar a membrana bacteriana não representaria o passo letal. Desta forma, esses peptídeos poderiam estar envolvidos em eventos adicionais, tais como a translocação da membrana ou processos de sinalização intracelular. Além disso, o maior tempo necessário para matar a bactéria Gram-negativa em estudo, poderia estar indicando que a espessa camada de peptideoglicano e moléculas de ácido lipoteicoico, seriam responsáveis de retardar o passo dos peptídeos.

Com o intuito de obter maiores detalhes sobre o mecanismo bactericida, foram analisadas as possíveis alterações induzidas por peptídeos sobre a morfologia dos microrganismos susceptíveis, por meio de imagens de alta resolução obtidas pela técnica MEV-FEG. Com base nessas imagens podemos inferir que todos os peptídeos, em menor ou maior grau, provocaram danos na membrana dos microrganismos em estudo, ao compararmos com as imagens controle (células crescendo em ausência de peptídeo) (Figura 11, Figura 15 e Figura 19). Afim de investigar em detalhe a interação dos peptídeos com as membranas biológicas, a predição da estrutura tridimensional dos peptídeos em estudo torna-se fundamental. Assim, a determinação estrutural teórica para o análogo MP e para o peptídeo EcDBS1R6 por meio da estratégia de simulação de dinâmica molecular e os estudos de DC e RMN para PaDBS1R1, permitiram determinar que todos os peptídeos, em ambiente de membrana, apresentam-se em conformação helicoidal anfipática. Essa preferência conformacional dos peptídeos constitui uma características fundamental para a análise da dinâmica de interação com as membranas fosfolipídicas. O estudo de interação com membranas DOPC permitiu observar que os peptídeos mantém a conformação durante a simulação, com poucas variações espaciais, permitindo uma interação da face hidrofóbica da hélice com a região de caudas hidrofóbicas da bicamada lipídica. Podemos inferir que tais interações seriam cruciais para a inserção e estabilização dos peptídeos no centro da membrana bacteriana.

Peptídeos com conformação em hélice estão entre os mais abundantes e amplamente distribuídos na natureza [START_REF] Huang | Alpha-helical cationic antimicrobial peptides: relationships of structure and function[END_REF]. Com base no demonstrado sucesso dos peptídeos em hélice para a defesa inata, numerosos estudos têm sido realizados para otimizar o seu potencial para aplicações clínicas. Através da abordagem de desenho de novo, [START_REF] Mai | Effects and mechanisms of the secondary structure on the antimicrobial activity and specificity of antimicrobial peptides[END_REF] demonstraram a importância de manter uma estrutura α-hélice anfipática para uma atividade biológica desejável. Além disso, a capacidade de assumir estrutura anfipática mostrou ser um requisito funcional importante na interação e posterior translocação dos AMPs nas membranas bacterianas [START_REF] Giangaspero | Amphipathic alpha helical antimicrobial peptides[END_REF][START_REF] Mai | Effects and mechanisms of the secondary structure on the antimicrobial activity and specificity of antimicrobial peptides[END_REF]. Consistente com esta hipótese, no caso 

CONCLUSÕES

No presente estudo, 3 sequências peptídicas obtidas a partir do desenho racional foram propostas como potenciais peptídeos antimicrobianos. Tais sequências, denominadas [I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1, foram avaliadas quanto a seu potencial antimicrobiano frente a bactérias e fungos, assim como seu potencial tóxico frente a células humanas. Além, realizouse um estudo da sua estrutura tridimensional, mecanismo de ação e interação com membranas.

Os resultados obtidos permitem inferir que:

• A aplicação do nosso método de desenho racional possibilitou o desenvolvimento de 3 sequências peptídicas com alto potencial antimicrobiano in vitro contra bactérias Gram-positivas e -negativas, inclusive contra cepas resistentes à drogas e fungos do gênero Candida.

• O peptídeo PaDBS1R1 destacou-se por apresentar potente atividade antimicrobiana de amplo espectro em concentrações micromolares, incluindo bactérias resistentes, assim como uma rápida ação bactericida frente a bactéria E. coli (< 5 min).

• O cálculo do índice terapêutico sugeriu baixa toxicidade dos peptídeos desenhados frente às células humanas eritrócitos, macrófagos derivados de monócitos THP-1 e células renais embrionárias HEK-293.

• Otimizou-se a atividade antimicrobiana e citotóxica do peptídeo [I 5 , R 8 ] MP respeito da sequência original, o peptídeo de origem natural mastoparano L.

• Todos os peptídeos em estudo demonstraram a habilidade de induzir a permeabilização e despolarização de membranas citoplasmáticas bacterianas Gram-negativas e -positivas.

• A velocidade de ação bactericida dos peptídeos desenhados revelou-se rápida frente a E. coli e moderada frente a S. aureus.

• A visualização dos efeitos dos peptídeos desenhados sobre a morfologia dos microrganismos sensíveis sugeriu a capacidade de provocar danos na membrana citoplasmática.

• A avaliação estrutural determinou que os peptídeos desenhados apresentam conformação α-hélice anfipática em ambientes lipídicos

• A avaliação funcional e estrutural dos peptídeos indicaria um mecanismo de ação de tipo membranolítico

• Os dados apresentados sugerem o uso da estratégia de desenho racional na identificação, seleção e otimização de peptídeos de aplicabilidade farmacológica e medicinal de grande interesse

PERSPECTIVAS

• Continuar a avaliação citotóxica dos peptídeos desenhados frente a células humanas imunológicas, em diferentes tempos de exposição.

• Avaliar a biocompatibilidade dos peptídeos desenhados afim de definir o desempenho eficiente e não prejudicial ao hospedeiro, induzindo uma resposta vantajosa e apropriada durante o seu uso clínico.

• Realizar ensaios toxicológicos em modelos animais in vivo para avaliar o uso potencial na terapêutica.

• Realizar testes de sinergismo com antibióticos de uso convencional frente à bactérias resistentes.

• Aprofundar o estudo da interação peptídeo-membrana por meio do uso de vesículas miméticas de membranas biológicas, afim de obter informações detalhadas do mecanismo de ação e validar o modelo proposto. 

Apêndice I-Figuras complementárias

Figura 1 .

 1 Figura 1. Parede celular de bactérias (A) Gram-positivas e (B) Gram-negativas[START_REF] Kayser | Medical microbiology[END_REF].

Figura 4 .

 4 Figura 4. Representação das classes estruturais de AMPs. (A) folha-β, taquiplesina I; (B) αhélice, magainina II; (C) estendida, indolicidina; (D) mista, thanatina. As ligações dissulfeto estão indicadas em amarelo (Powers e Hancock, 2003).

Figura 5 .

 5 Figura 5. Modelos de interação entre os AMPs e a membrana bacteriana. Adaptado de[START_REF] Nguyen | The expanding scope of antimicrobial peptide structures and their modes of action[END_REF] 

  Figura 6. (A) Alinhamento das sequências (acima) e projeções de hélice (abaixo) do peptídeo mastoparano L (MP) e seu análogo [I 5 , R 8 ] mastoparano ([I 5 , R 8 ] MP). O ângulo da face polar é indicado por $. Resíduos de aminoácidos positivamente carregados estão representados como círculos brancos, os polares em cinza e os não-polares em preto. (B) Parâmetros físico-químicos do MP e seu análogo [I 5 , R 8 ] MP[START_REF] Irazazabal | Selective amino acid substitution reduces cytotoxicity of the antimicrobial peptide mastoparan[END_REF].

Figura 7 .

 7 Figura 7. (A) Projeção de hélice e (B) parâmetros físico-químicos dos peptídeos PaDBS1R1 e EcDBS1R6. O ângulo da face polar é indicado por $. Resíduos de aminoácidos positivamente carregados estão representados como círculos brancos, os polares em cinza e os não-polares em preto.

SO 4 ,

 4 2 mM MgSO 4 , 10 µM FeSO 4 , 0,4% glucose [m:v]), atingindo um volume final de 25 uL em cada poço. Subsequentemente, 50 µL de cultura overnight de P. aeruginosa H1001 (fliC :: luxCDABE) foram subcultivados em 5 mL de meio LB e crescidos até Abs 600 de 0,4. Esta cultura foi então diluída 4:100 (v:v) em meio BM2 e 25 µL e transferida para os poços da microplaca contendo 25 µL de solução de peptídeo (200 -3 µg.mL -1 , concentrações finais). As microplacas foram incubadas durante 4 h a 37 °C sob agitação constante de 50 rpm. A luminescência foi medida em leitor de microplacas Tecan SPECTRAfluor Plus (Tecan EUA, Morrisville, NC). A atividade antimicrobiana foi avaliada pela capacidade dos peptídeos para reduzir a luminescência de P. aeruginosa H1001, em comparação com as bactérias não tratadas. Os peptídeos magainina2 e meropenem carbapenem foram usados como controles positivos e, o controle negativo corresponde as bactérias em presença de água destilada.Síntese dos peptídeos escolhidos e confirmação da identidade por espectrometria de massasApós a escolha das sequências peptídicas pela estratégia de síntese spot array acoplada a análise de atividade antimicrobiana frente a P. aeruginosa bioluminescente; os 4 peptídeos selecionados foram sintetizados através de um protocolo de síntese química, purificados (> 95%), liofilizados e armazenados pela Peptide 2.0 Inc., EUA. A síntese foi realizada de acordo com a metodologia em fase sólida F-moc (envolve o uso de 9fluorenilmetoxicarbonila protetor do grupo amino). A verificação de massas moleculares e o grau de pureza dos peptídeos sintetizados foi realizada utilizando a análise de MALDI-ToF ToF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry) em UltraFlex III, Bruker Daltonics®, Billerica, MA. Os peptídeos foram dissolvidos em um volume mínimo de água, misturados com uma solução saturada de ácido matriz α-ciano-4-hidroxicinâmico(1:3; v:v). As amostras foram secas à temperatura ambiente sobre uma placa de MALDI. A solução de ácido matriz foi preparada em H 2 O:ACN:TFA nas proporções 50:50:0,3; v:v:v. A massa monoisotópica dos peptídeos foi obtida em modo refletor com a calibração externa utilizando o peptídeo de calibração padrão II por espectrometria de massa (até 4000 Da gama de massas, Bruker Daltonics, Billerica, MA).Determinação da concentração mínima inibitória (CMI) antibacterianaA atividade antibacteriana in vitro dos peptídeos foi avaliada pelo ensaio modificado de inibição do crescimento por microdiluição em caldo, de acordo com o NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Nccls, 2003). Foram utilizadas as cepas de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii ATCC 19606, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 e os isolados clínicos S. aureus resistente a meticilina (7133623) (MRSA) e K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos (3259271) (KPC), cultivadas em ágar LB (Lysogeny Broth). As duas cepas Gram-positivas Streptococcus pyogenes ATCC 19615 e Listeria ivanovii Li 4pVS2 foram cultivadas em ágar BHI (Brain Heart Infusion).A partir de colônias frescas, preparou-se um cultivo mãe que foi diluído em meio MH (Muller Hinton) de maneira seriada para determinar a carga bacteriana e obter uma suspensão com absorbância no cumprimento de onda de 630 nm (A 630 ) desejada, com a exceção de S. pyogenes, L. ivanovii e E. faecalis que foram diluídos em seus respectivos meios de cultura. Foram utilizados inóculos na fase de crescimento exponencial, na concentração aproximada de 10 6 UFC.mL -1 (A 630 = 0,01). A concentração mínima inibitória (CMI) foi determinada em placa de 96 poços, contendo 50µL da suspensão bacteriana e 50 µL do peptídeo em diluições seriadas (200 até 1 µM, concentração final). Após incubação durante a noite a 37 °C sob agitação a 150 rpm, a inibição do crescimento bacteriano foi avaliada pela leitura de absorbância pontual a A 630 utilizando um leitor de microplaca (UVM 340, Asys Hitech). A menor concentração que inibir o 100% crescimento bacteriano é considerada a CMI, correspondente à media dos resultados obtidos a partir de 3 experiências independentes realizadas em triplicata. O controle positivo (considerado como 100% de inibição de crescimento bacteriano)

  microdiluição em caldo utilizando as cepas Candida albicans ATCC 90028 e C. parapsilosis ATCC 22019, cultivadas a partir de colônias frescas em ágar contendo levedura, peptona e dextrose (Yeast Peptone Dextrose -YPD) por 48h à 30 °C(Nccls, 2003). O valor de CMI foi determinado pela medição da A 630 em placa de 96 poços contendo 50 µL da suspensão de fungos na fase do crescimento exponencial à 10 6 UFC.mL -1 em meio líquido YPD junto a 50 µL do peptídeo em diluições seriadas (200 até 1 µM, concentração final), após incubação durante a noite a 30 °C e 150 rpm. A concentração mínima inibitória (CMI) foi assumida como sendo a menor concentração onde não houve crescimento dos fungos detectável espectrofotometricamente, correspondente a média dos resultados obtidos a partir de 3 experiências independentes realizadas em triplicata. O controle positivo corresponde á suspensão bacteriana em presença de formaldeído 0,7% (v:v) e o controle negativo em ausência de peptídeo (Andre

  ) permite monitorar a despolarização da membrana plasmática induzida por peptídeos pela mudança da intensidade de emissão de fluorescência. Esta sonda catiônica e lipofílica, acumula-se dentro da bicamada lipídica das membranas celulares e, em seguida, agrega-se causando uma diminuição da sua fluorescência. Os agentes despolarizadores que geram a perda do potencial de membrana provocam a liberação da sonda e, desta forma, ocorre o aumento de fluorescência que pode ser monitorado ao longo do tempo. Para o experimento, células bacterianas em crescimento exponencial foram centrifugadas (1000 x g, 10 min, 4 °C), lavadas e ressupendidas em PBS (NaCl 1M, Na 2 HPO 4 0,1M, pH 7,3) até A 630 de 0,1 (1 x 10 7 UFC.mL -1 ). Um volume de 700 µL da suspensão bacteriana contendo DiSC3(5) 1 µM foi pre-incubado no escuro durante 10 min a 37 °C para permitir a máxima absorção da sonda (maximal dye uptake and fluorescence quenching). Para equilibrar as concentrações citoplasmáticas e externas de K + , 100 µL de KCl 1 mM foram adicionados. Após a adição do peptídeo (200 µL, concentração final, 2 vezes superior ao valor da CMI), mudanças na fluorescência foram monitoradas a 37 °C durante um período de 20 minutos empregandose o espectrofotómetro de fluorescência Varian Cary Eclipse, com excitação e emissão

(Tabela 4 .Figura 8 . 1 .

 481 Figura 8. Espectros de massas gerados no equipamento MALDI-ToF, para os peptídeos sintéticos (A) [I 5 , R 8 ] mastoparano; (B) [I 5 , R 8 ] mastoparano-amida; (C) EcDBS1R6; (D) PaDBS1R1 e (E) PaDBS1R1-amida.

1. 2 . 1 . 3 .

 213 Atividade hemolítica e citotóxica sobre linhagens celulares humanas Conforme indicado na Tabela 5, a atividade hemolítica de [I 5 , R 8 ] MP, investigada utilizando eritrócitos humanos, indicou que o peptídeo não apresentou efeito hemolítico significativo (LC 50 > 200 µM). Afim de avaliar a viabilidade de células humanas após incubação com [I 5 , R 8 ] MP, o ensaio colorimétrico MTT foi realizado com macrófagos derivados de monócitos THP-1 e células embrionárias do rim HEK-293. Os resultados foram expressos por LC 50 (concentração de peptídeo que causa 50% de morte celular) e indicaram que não há efeito citotóxico de [I 5 , R 8 ] MP contra as células HEK-293 (LC 50 > 200 µM). Por outro lado, o peptídeo exibiu citotoxicidade frente às células THP-1, apresentando um valor menor de LC 50 (24,5 ±12,9 µM). Os resultados contidos na Tabela 5, sugerem que [I 5 , R 8 ] MP não apresenta citotoxicidade em concentrações correspondentes à CMI para bactérias Gram-negativas, bactérias resistentes, S. pyogenes e C. albicans. Permeabilização e despolarização da membrana bacteriana O efeito de [I 5 , R 8 ] MP sobre a integridade das membranas citoplasmáticas bacterianas foi investigado para a bactéria Gram-negativa E. coli ATCC 25922 e a bactéria Gram-positiva S. aureus ATCC 25923, como cepas de referência, utilizando concentrações de peptídeo correspondentes a 2 vezes o valor da CMI (25 e 50 µM, respectivamente). A capacidade de [I 5 , R 8 ] MP de alterar a permeabilidade da membrana, foi avaliada através do estudo de fluorescência SYTOX Green (SG), uma sonda de alta afinidade pelos ácidos nucleicos, impermeável às membranas citoplasmáticas intactas. Quando a membrana citoplasmática consegue ser alterada, a sonda SG penetra à célula e permite detectar um aumento da fluorescência quando a ligada aos ácidos nucleicos. A Figura 9 permite observar a habilidade de [I 5 , R 8 ] MP para permeabilizar a membrana citoplasmática de ambas cepas bacterianas testadas, E. coli e S. aureus, como indicado pelo aumento da fluorescência de SG comparado com o controle negativo (PBS) e o controle positivo (melitina). Observa-se que a permeabilização da membrana de S. aureus (Figura 9B) induzida por [I 5 , R 8 ] MP foi mais rápida e potente comparada com aquela de E. coli (Figura 9A) apresentando um maior valor máximo de permeabilização (máxima fluorescência). A atividade de despolarização da membrana citoplasmática bacteriana induzida por [I 5 , R 8 ] MP, também foi avaliada para E. coli e S. aureus. Para isto, foi utilizada a sonda fluorescente DiSC3(5), que permite detectar mudanças na emissão de fluorescência quando o potencial de membrana sofre alterações. A Figura 9 ilustra o valor mínimo de fluorescência que indica a acumulação da sonda DiSC3(5) na bicamada lipídica. Após a incubação com o controle positivo melitina, que induz a perda do potencial de membrana, observa-se o aumento da fluorescência devido à liberação da sonda ao meio. Quando as células bacterianas foram incubadas com [I 5 , R 8 ] MP, observou-se uma rápida (< 5 min) despolarização em ambas as cepas E. coli (Figura 9C) e S. aureus (Figura 9D), com eficiências maiores que o peptídeo controle melitina.

Figura 9 . 1 . 5 .

 915 Figura 9. Efeito de [I 5 , R 8 ] MP sobre a integridade da membrana plasmática de E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC 25923. Cinética da emissão de fluorescência da sonda (A, B) SYTOX Green e (C, D) DiSC3(5) em função do tempo, após adição de peptídeo (linha pontilhada vertical). Permeabilização da membrana citoplasmática de E. coli (A) e S. aureus (B) induzida por [I 5 , R 8 ] MP na concentração correspondente à 2 vezes o valor da CMI (25 e 50 µM, respectivamente). Despolarização induzida por [I 5 , R 8 ] MP (mesma concentração) sobre a membrana citoplasmática de E. coli (C) e S. aureus (D). O controle negativo corresponde as células bacterianas incubadas em PBS na ausência do peptídeo, enquanto o controle positivo corresponde à incubação com 5 µM de melitina.

Figura 11 .Figura 12 . 1 .

 11121 Figura 11. Imagens obtidas por MEV-FEG do efeito de [I 5 , R 8 ] MP sobre as células de (A-C) P. aeruginosa ATCC 27853, (D-F) L. ivanovii Li 4pVS2 e (G-I) C. albicans ATCC 90028. (A, D, G) Células controle, na ausência de [I 5 , R 8 ] MP. (B, C) P. aeruginosa incubadas com 6,25 µM [I 5 , R 8 ] MP (CMI) e 12,5 µM, respectivamente. (E, F) L. ivanovii incubadas com 50 µM [I 5 , R 8 ] MP (CMI) e 100 µM, respectivamente. (H, I) C. albicans incubadas com 12,5 µM [I 5 , R 8 ] MP (CMI) e 25 µM, respectivamente. Barra = 1 µm.

  EcDBS1R6 contra eritrócitos humanos (LC 50 > 200 µM). A atividade citotóxica de EcDBS1R6 foi avaliada pelo ensaio colorimétrico MTT frente as células humanas: macrófagos derivados de monócitos THP-1 e células embrionárias do rim HEK-293. Os resultados, expostos na Tabela 6 e expressos em valores LC 50 indicaram que EcDBS1R6 não possui citotoxicidade frente as células HEK-293 (LC 50 = 111,1 ± 27,2 µM), apresentado efeito citotóxico frente as células THP-1 para as quais a concentração LC 50 foi inferior aos valores de CMIs determinados para as bactérias testadas (LC 50 = 5,1 ± 1,1 µM).

2. 3 .

 3 Permeabilização e despolarização da membrana bacteriana Utilizando as cepas de referência E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC 25923, a capacidade de EcDBS1R6 de afetar a integridade das membranas citoplasmáticas bacterianas foi investigada para concentrações equivalentes ao dobro da CMI (6,25 µM). Para isto, a permeabilidade e a despolarização das membranas após incubação com o peptídeo, foram avaliadas pela cinética da intensidade de fluorescência em função do tempo das sondas SG e DiSC3(5), respectivamente. Na Figura 13, observa-se que EcDBS1R6 foi capaz de permeabilizar a membrana citoplasmática de ambas bactérias Gram-negativa E. coli (Figura 13A) e Grampositiva S. aureus (Figura 13B), quando comparada com o controle (bactérias em PBS, na ausência de peptídeo). No caso de E. coli, a permeabilização induzida por EcDBS1R6 atingiu o máximo valor de fluorescência SG após um curto intervalo de tempo (5 min), e foi tão eficaz quanto à induzida por melitina (controle positivo). Para S. aureus, observou-se uma permeabilização instantânea da membrana, com um sinal de fluorescência SG máximo, menor do que o controle positivo. A Figura 13 mostra também o efeito de EcDBS1R6 sobre o potencial da membrana, indicando uma despolarização induzida pelo peptídeo para ambas bactérias E. coli (Figura 13C) e S. aureus (Figura 13D), como pode ser observado pelo aumento da fluorescência da sonda DiSC3(5) em comparação com o controle negativo (PBS). Para ambas as células bacterianas, a despolarização induzida aconteceu de forma rápida e atingiu intensidades máximas de fluorescência DiSC3(5) semelhantes às do controle positivo melitina.

Figura 13 .

 13 Figura 13. Efeito de EcDBS1R6 sobre a integridade da membrana plasmática de E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC 25923. Cinética da emissão de fluorescência da sonda (A, B) SYTOX Green e (C, D) DiSC3(5) em função do tempo, após adição de peptídeo (linha pontilhada vertical). Permeabilização da membrana citoplasmática de E. coli (A) e S. aureus (B) induzida por EcDBS1R6 na concentração correspondente à 2 vezes o valor da CMI (6,25 µM). Despolarização induzida por EcDBS1R6 (mesma concentração) sobre a membrana citoplasmática de E. coli (C) e S. aureus (D). O controle negativo corresponde as células bacterianas incubadas em PBS na ausência do peptídeo, enquanto o controle positivo corresponde à incubação com 5 µM de melitina.

Figura 15 .Figura 16 .Parte 3 : 3 . 1 .

 1516331 Figura 15. Imagens obtidas por MEV-FEG do efeito de EcDBS1R6 sobre as células de (A-D) P. aeruginosa ATCC 27853 e (E, F) L. ivanovii Li 4pVS2. (A, E) Células controle, na ausência de EcDBS1R6. (B, C e D) P. aeruginosa, incubadas com EcDBS1R6 nas concentrações 6,25 µM (CMI), 12,5 µM (dobro da CMI) e 50 µM, respectivamente. (F) L. ivanovii incubadas com 25 µM EcDBS1R6 (dobro da CMI). Barras = 1 µm.

3. 2 . 3 . 3 .

 233 Atividade hemolítica e citotóxica sobre linhagens celulares humanas O resultado do ensaio hemolítico expresso pelo valor LC 50 , determinou que PaDBS1R1 não apresenta atividade hemolítica frente a eritrócitos humanos (LC 50 = 50 µM), com valor LC 50 superior aos valores de CMIs da maioria das bactérias Gramnegativas e positivas testadas, conforme indicado na Tabela 7. O ensaio colorimétrico MTT foi utilizado para avaliar a toxicidade do peptídeo PaDBS1R1 frente as linhagens de células humanas: macrófagos derivados de monócitos THP-1 e células embrionárias do rim HEK-293. Os resultados, expressos em valores LC 50 , indicaram que PaDBS1R1 não apresentou efeito citotóxico frente as células HEK-293 (LC 50 = 143,2 ± 30,9 µM), sendo o valor de LC 50 superior aos valores CMIs determinados para as bactérias testadas (1,5 -12,5 µM) (Tabela 7). No caso dos macrófagos THP-1, o peptídeo PaDBS1R1 mostrou atividade citotóxica, com um valor baixo de LC 50 (7,3 ± 3,0 µM). Permeabilização e despolarização da membrana bacteriana A capacidade de PaDBS1R1 de produzir alterações na membrana plasmática de bactérias, foi avaliada nas cepas de referência E. coli ATCC 25922 e S. aureus ATCC 25923, na presença do peptídeo na concentração correspondente à 2 vezes o valor da CMI (6,25 µM). A permeabilidade e a despolarização da membrana citoplasmática bacteriana foram monitoradas com SYTOX Green (SG) e DiSC3(5), respectivamente, utilizando o peptídeo melitina (5 µM) como controle positivo. A Figura 17 revela que PaDBS1R1 possui a habilidade de permear as membranas de E. coli (Figura 17A) e S. aureus (Figura 17B), como indicado pelo aumento da intensidade da fluorescência da sonda SG, comparado ao controle negativo (PBS). No caso de E. coli, observou-se um padrão de permeabilização induzida por PaDBS1R1, similar ao obtido para a melitina. Para S. aureus, o sinal de SG foi maior com PaDBS1R1 que com o peptídeo melitina. Também, observa-se na Figura 17 que, na presença de PaDBS1R1, uma despolarização completa de ambas as membranas de E. coli (Figura 17C) e S. aureus (Figura 17D) foi rapidamente atingida (< 5 min). bacterianas sofreram alterações na membrana após interação com PaDBS1R1. Observou-se uma deformação na membrana das células de P. aeruginosa quando foram incubadas com 3,125 µM (duas vezes acima da CMI) e 50 µM de PaDBS1R1 (Figura 19B-C), quando comparado com as células controle (Figura 19A). No caso de L. ivanovii, a potente atividade de PaDBS1R1, confirmou-se pela presença de numerosas células lisadas e restos celulares quando foram incubadas com 3,125 µM (CMI) (Figura 19F), e 6,25 µM (duas vezes acima da CMI) (Figura 19F) em comparação com as células controle (Figura 19D).

Figura 19 .

 19 Figura 19. Imagens obtidas por MEV-FEG do efeito de PaDBS1R1 sobre as células de (A-C) P. aeruginosa ATCC 27853 e (D-F) L. ivanovii Li 4pVS2. (A, D) Células controle, na ausência de PaDBS1R1. (B, C) P. aeruginosa, incubadas com 3,125 µM PaDBS1R1 (dobro da CMI) e 50 µM, respectivamente. (E, F) L. ivanovii incubadas com 3,125 µM PaDBS1R1 (CMI) e 6,25 µM (dobro da CMI), respectivamente. Barras = 1 µm.

  , e a sua análise foi gerada na interface do programa nmrVIEW. O índice de deslocamento químico (chemical shift index, CSI) dos núcleos de H α , C α e N, foram utilizados como um indicativo de estrutura secundária e indicaram a presença de uma estrutura secundária em α-hélice entre os resíduos de Lys-2 e Lys-19 (Figura 3A em Apêndice I).

Figura 20 .

 20 Figura 20. Análise da estrutura tridimensional de PaDBS1R1. (A) Espectros de dicroísmo circular (DC) do peptídeo PaDBS1R1 (50 !M) em água; em 20 mM de DPC e 20 mM de SDS, a 25 °C e pH 4, 7 e 10, sendo [%] molar em função do comprimento de onda & (nm). (B) Estrutura de PaDBS1R1 resolvida por RMN, confirmando a estrutura "-hélice observada por DC. Os resíduos de aminoácidos catiônicos estão representados em azul, os aniônicos em verde, e os hidrofóbicos em amarelo. (C) Análise estrutural in silico da interação peptídeo-membrana para PaDBS1R1 em membrana DOPC, posição inicial a 0 ns (esquerda) e posição final após 100 ns de simulação (direita).! !

4. 2 1 )

 21 Índice terapêutico (TI) Com o intuito de avaliar o potencial terapêutico dos 3 peptídeos racionalmente desenhados, foi calculado o índice terapêutico (IT). O IT considera-se um parâmetro importante no estudo do equilíbrio entre os efeitos tóxicos e desejados para um fármaco. Foi utilizada a equação (1) adaptada do estudo de Chen e colaboradores no ano 2005 (Chen et al., 2005). (Sendo n o número de valores LC 50 e m o número de valores CMI. Para valores superiores à concentração máxima testada, assumiu-se 2 vezes o valor máximo testado (por exemplo, se o valor resultou > 100, considerou-se como 200)[START_REF] Chen | Rational design of alpha-helical antimicrobial peptides with enhanced activities and specificity/therapeutic index[END_REF].Por meio da equação(1), os valores calculados para [I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1 foram 10.29, 12.11 e 11.14, respectivamente. Consequentemente, pode-se sugerir que os 3 peptídeos desenhados apresentaram baixa toxicidade, sendo que doses superiores à 10 seriam necessárias para causar efeitos tóxicos nas células de mamífero testadas in vitro.

  antimicrobiano de forma rápida e eficiente. Os peptídeos selecionados [I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R1, constituíram o objeto de estudo do presente trabalho. Utilizando-se a técnica Fmoc síntese, os 5 peptídeos foram sintetizados, subsequentemente purificados e cada um analisado por espectrometria de massas, análise que permitiu verificar a sua identidade e pureza. Os peptídeos desenhados foram submetidos a diversos ensaios para determinar seu potencial terapêutico e investigar seu mecanismo de ação antimicrobiano. Iniciou-se o estudo avaliando o efeito bactericida contra variadas linhagens Gram-positivas e -negativas. Conforme ilustrado na Tabela 8, o espectro de ação dos peptídeos varia consideravelmente. De forma generalizada, todos mostraram maior atividade frente ás bactérias Gram-negativas (CMI = 1,5 -12,5 µM) em comparação com as Gram-positivas (CMI = 3,125 -50 µM), com exceção da bactéria E. faecalis, para a qual unicamente o peptídeo PaDBS1R1, apresentou moderada atividade (CMI = 50 µM). Cabe destacar que os melhores resultados foram obtidos para o peptídeo PaDBS1R1, de atividade bactericida de amplo espectro em concentrações micromolares (CMI = 1,5 -3,125 µM).

  . Baseado nesses dados, os nossos resultados podem ser alentadores no sentido de enfrentar as deficiências de novos compostos peptídicos específicos para o tratamento de infecções originadas por bactérias Gram-negativas. Porém, cabe ressaltar que o método de screening utilizado para a seleção das sequências desenhadas a partir do algoritmo Joker, poderia estar relacionado com o resultado obtido. Dessa maneira, a tendência dos peptídeos à maior atividade frente as bactérias Gram-negativas é esperado, uma vez que eles demonstraram potente atividade contra P. aeruginosa bioluminiscente. Adicionalmente, o efeito antifúngico dos peptídeos foi avaliado para duas cepas de Candida sp. Apenas [I 5 , R 8 ] MP mostrou atividade contra C. albicans (CMI = 12,5 µM) (Tabela 5). No caso de C. parapsilosis, obteve-se moderada ação antifúngica para [I 5 , R 8 ] MP e PaDBS1R1 na concentração de 25 µM. Estes resultados podem ser explicados pelas diferenças químicas e estruturais da parede externa destas espécies de Candida, já relatadas. As cadeias laterais dos polímeros de manose, o principal componente da parede externa, variam entre as espécies C. albicans e C. parapsilosis desencadeando heterogeneidade nos componentes oligossacarídeos da parede interna

  . Assim, decidimos investigar possíveis mudanças na atividade antibacteriana dos peptídeos [I 5 , R 8 ] MP e PaDBS1R1 carboxiamidados. Por um lado, em concordância com os dados da literatura, os resultados obtidos para [I 5 , R 8 ] MP indicam que a amidação do C-terminal conduziu a um aumento da atividade, com valores de CMI duas vezes menor contra K. pneumoniae, e três vezes menor contra S. aureus (ver Tabela 5). Pelo contrário, ao comparar os resultados de CMI para PaDBS1R1 nas formas amidada e não amidada, observam-se idênticos valores contra as bactérias testadas (E. coli, P. aeruginosa e S. aureus; ver Tabela 7), sugerindo que um aumento de carga e/ou proteção contra carboxipeptidases não seriam necessários para aumentar a potência de PaDBS1R1.

  µM) (Tabela 7). Além, os dados de LC 50 indicaram que os 3 peptídeos desenhados não apresentam toxicidade sobre as células HEK-293 (células renais embrionárias humanas) (LC 50 ≅ 111 -143 µM). Enquanto ao efeito lítico frente as células THP-1 (macrófagos derivados de monócitos humanos), observou-se atividade citotóxica para os peptídeos PaDBS1R1 e EcDBS1R6, com valores de LC 50 no intervalo 5 -7 µM sendo menores que os valores de CMI obtidos para os microrganismos testados. No caso do análogo [I 5 , R 8 ] MP, os nossos resultados indicaram atividade citotóxica frente as células THP-1, porém é de destacar que os dados contidos na Tabela 5 mostram a ausência de citotoxicidade para a maioria das bactérias testadas (bactérias Gram-negativas, bactérias resistentes aos antibióticos e S. pyogenes). Ainda, ao comparar com dados na literatura para o MP L, constatamos uma otimização referente à atividade antimicrobiana e citotóxica do análogo [I 5 , R 8 ] MP

  de PaDBS1R1, os nossos dados indicaram que a conformação α-hélice anfipática promove tanto a interação eletrostática quanto hidrofóbica com a membrana, onde a face positiva tem como alvo a superfície aniônica da membrana bacteriana (cabeças polares dos fosfolipídeos) e os resíduos hidrofóbicos interagem com o núcleo da membrana (cadeias hidrocarbonadas dos fosfolipídeos). Consequentemente, o peptídeo PaDBS1R1 insere-se na bicamada lipídica, induzindo perturbações e produzindo a permeabilização da membrana, que posteriormente conduz à lise celular. Considerando as informações aqui apresentadas, sobressai a possibilidade de utilização das novas sequências peptídicas [I 5 , R 8 ] MP, EcDBS1R6 e PaDBS1R6 como protótipos para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos.

Figura 1 .Tabela 1 .Figura 2 .

 112 Figura 1. Representação esquemática do funcionamento do algoritmo Joker e equação do número máximo de análogos para o peptídeo original. O número de análogos está representado por R, o número de aminoácidos da sequência por S e o número de componentes do padrão por P. Adaptado de Porto, 2013.

Figura 3 .

 3 Figura 3. (A) CSI dos núcleos de H α , C α e N do peptídeo PaDBS1R1. A região estrutural em hélice está indicada. (B) Resumo dos dados de cálculos estruturais das 20 melhores estruturas RMN para PaDBS1R1. (C, D) Análise das restrições de distancia e ângulos diedros obtidas por RMN. (C) Gráfico de unicidade (I uni ) pelo índice de cada restrição e (D) gráfico de informação única (I uni ) por informação média (I med ), respectivamente. IR, restrições intra-residuais; SR, restrições sequenciais; MR, restrições de média distancia.

  

  

  

  

  

  

  

  

Atividade e seletividade dos AMPs

  

	por lipídeos neutros que dificultam a interação eletrostática com os AMPs, protegendo-a
	assim da sua ação (Yeaman e Yount, 2003). Porém, as interações eletrostáticas entre os
	AMPs e as superfícies das células bacterianas, podem ser facilitadas pela presença de
	fosfolipídios carregados negativamente na face externa da bicamada lipídica.
	Contrário aos antibióticos de uso convencional, o efeito letal dos AMPs pode ser
	independente do reconhecimento de receptores. Como consequência, por muito tempo
	acreditou-se que os AMPs eram menos propensos a induzir mecanismos de resistência do
	que os antibióticos convencionais. Atualmente, é suposto que o desenvolvimento de
	resistência aos AMPs surge a partir de mutações espontâneas assim como também há
	exemplos de bactérias com resistência intrínseca a determinados AMPs (Maria-Neto et
	al., 2012). Os mecanismos de resistência aos AMPs podem ser extremamente complexos
	e, pelo menos até agora, não parecem seguir um padrão único. Dentre os principais
	mecanismos de resistência destacam-se o sequestro de peptídeos; a destruição por
	O mecanismo de ação dos AMPs vem sendo estudado ativamente e ainda hoje as proteólise através da expressão de proteases extracelulares; a remoção por meio de
	informações disponíveis nas publicações científicas, continuam crescendo. De forma transporte ativo; a modificação no metabolismo energético; e a alteração estrutural e/ou de
	geral, o potencial terapêutico dos AMPs pode ser associado com sua interação às carga da superfície bacteriana para evitar a interação com os AMPs
	membranas biológicas promovendo a sua desestabilização e, como consequência,
	vazamento de conteúdo intracelular destruindo rapidamente um amplo espectro de
	microrganismos (Huang et al., 2010). Acredita-se que a natureza anfipática (separação
	espacial entre uma porção hidrofóbica e outra hidrofílica) e o caráter catiônico (alta
	frequência de aminoácidos básicos como a arginina e/ou lisina) dos AMPs contribuem no
	desempenho da interação com a superfície da célula-alvo e a sua inserção na membrana.
	Portanto, a seletividade dos AMPs tem base nas diferentes composições lipídicas e as
	cargas presentes nas membranas de células eucarióticas e procarióticas. A camada externa
	da membrana celular de mamíferos e organismos eucariontes em geral, pode ser composta

Tabela 5 .

 5 Espectro de atividades antimicrobiana e citotóxica de [I 5 , R 8 ] mastoparano e [I 5 , R 8 ] mastoparano-amida.

	Microrganismo	Concentração Mínima Inibitória
			(µM)
		[I 5 , R 8 ] MP	[I 5 , R 8 ] MP-amida
	Bactérias Gram-negativas		
	Escherichia coli ATCC 25922	12,5	NT a
	Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	6,25	NT
	Klebsiella pneumoniae ATCC 13883	6,25	3,125
	Acinetobacter baumannii ATCC 19606	3,125	NT
	K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos	NT	3,125
	(3259271)-KPC		
	Bactéria Gram-positivas		
	Staphylococcus aureus ATCC 25923	25	6,25
	Streptococcus pyogenes ATCC 19615	6,25	NT
	Listeria ivanovii Li 4pVS2	50	NT
	Enterococcus faecalis ATCC 29212	> 100	NT
	S. aureus resistente a meticilina (7133623) -MRSA	NT	3,125
	Fungos		
	Candida albicans ATCC 90028	12,5	NT
	Candida parapsilosis ATCC 22019	25	NT
	Células humanas	Concentração Lítica 50 (µM)
	Macrófagos derivados de monócitos THP-1	24,5 ± 12,9	NT
	HEK-293	> 200	NT
	Eritrócitos	> 200	NT

a : Não testado. Concentração mínima inibitória (CMI) e concentração lítica 50 (LC 50 ), expressas como valores médios de 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

  Não testado. Concentração mínima inibitória (CMI) e concentração lítica 50 (LC 50 ), expressas como valores médios de 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

	Microrganismo	Concentração Mínima Inibitória
			(µM)
		PaDBS1R1	PaDBS1R1-amida
	Bactérias Gram-negativas		
	Escherichia coli ATCC 25922	3,125/1,5	1,5
	Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	1,5	1,5
	Klebsiella pneumoniae ATCC 13883	1,5	NT a
	Acinetobacter baumannii ATCC 19606	1,5	NT
	K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos	NT	6,25
	(3259271)-KPC		
	Bactéria Gram-positivas		
	Staphylococcus aureus ATCC 25923	3,125	3,125
	Streptococcus pyogenes ATCC 19615	3,125	NT
	Listeria ivanovii Li 4pVS2	3,125	NT
	Enterococcus faecalis ATCC 29212	50	NT
	S. aureus resistente a meticilina (7133623) -MRSA	NT	12,5
	Fungos		
	Candida albicans ATCC 90028	≥ 50	NT
	Candida parapsilosis ATCC 22019	25	NT
	Células humanas	Concentração Lítica 50 (µM)
	Macrófagos derivados de monócitos THP-1	7,3 ± 3,0	NT
	HEK-293	143,2 ± 30,9	NT
	Eritrócitos	50	NT

a :

  Tabela 8. Espectro de atividades antimicrobiana e citotóxica dos 5 peptídeos racionalmente desenhados. Não testado. Concentração mínima inibitória (CMI) e concentração lítica 50 (LC 50 ), expressas como valores médios de 3 experimentos independentes realizados em triplicata.

	Macrófagos THP-1	24,5 ± 12,9	NT	5,1 ± 1,1	7,3 ± 3,0	NT
	HEK-293	> 200	NT	111,0 ± 27,2	143,2 ± 30,9	NT
	Eritrócitos	> 200	NT	> 200	50	NT
	Microrganismo		Concentração Mínima Inibitória (µM)	
		[I 5 , R 8 ] MP	[I 5 , R 8 ] MP	EcDBS1R6	PaDBS1R1	PaDBS1R1
			amida			amida
	Escherichia coli ATCC 25922	12,5	NT a	3,125	3,125/1,5	1,5
	Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	6,25	NT	6,25	1,5	1,5
	Klebsiella pneumoniae ATCC 13883	6,25	3,125	3,125	1,5	NT
	Acinetobacter baumannii ATCC 19606	3,125	NT	3,125	1,5	NT
	K. pneumoniae resistente a	NT	3,125	NT	NT	6,25
	carbapenêmicos (3259271)					
	Staphylococcus aureus ATCC 25923	25	6,25	3,125	3,125	3,125
	Streptococcus pyogenes ATCC 19615	6,25	NT	25	3,125	3,125
	Listeria ivanovii Li 4pVS2	50	NT	12,5	3,125	3,125
	Enterococcus faecalis ATCC 29212	> 100	NT	> 100	50	50
	S. aureus resistente a meticilina	NT	3,125	NT	NT	NT
	(7133623)					
	Candida albicans ATCC 90028	12,5	NT	100	≥ 50	NT
	C. parapsilosis ATCC 22019	25	NT	100	25	NT
	Células humanas		Concentração Lítica 50 (µM)	

a :

). mínima inibitória min Minutos mL Mililitros MTT Tampão fosfato salino PBP Proteínas de ligação a penicilinas

Z após 100 ns de simulação. Tal variação parece estar relacionada com a porção N-terminal ( 1 PKILNKILGK 10 ) altamente carregada, e a porção altamente hidrofóbica C-terminal ( 11 ILRLAAAFK 19 ). Consequentemente, a porção N-terminal estaria interagindo com os grupos fosfatos polares, enquanto a porção C-terminal interage com as caudas lipídicas hidrofóbicas (Figura 20C). 

Apêndice II-Produção científica