UVOD

Iako pokrivaju manje od 1% Planete Zemlje (Coleman i Jove, 1992), serpentinizirane podloge predstavljaju unikatne habitate za razvoj specijalizirane flore, obično veoma bogate endemičnim vrstama i vrstama koje č esto pokazuju specifičnu adaptivnu morfologiju. Područje Balkana, kao najveća serpentinska zona u Europi, se po tome ne razlikuje od drugih velikih svjetskih serpentinskih zona, i predstavlja jedan od centara florističke diferencijacije i specijacije. Zbog toga ova područja predstavljaju stalni interes za istraživače iz različitih oblasti, ali i izazov kako ih pravilno zaštititi i konzervirati [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF][START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF]Chiarucci i Baker, 2007).

Serpentinske zone Balkana ekstenzivno su istraživane tokom 19 og vijeka te su otkrivene brojne vrste. Međutim, u Bosni i Hercegovini su prva veća, višegodišnja i sistemska istraživanja serpentinske flore i habitata izvršena od strane Hilde Riter Studnička. Ova autorica je svoje rezultate objavila u više načnih radova u drugoj polovini 20. vijeka. Nažalost, iako je bilo iskazano određeno interesovanje [START_REF] Beus | Zajednica bukovo jelove šume na peridotitu i serpentinitu Bosne. Radovi Šumarskog fakulteta i Instituta za šumarstvo u Sarajevu[END_REF](Beus, i 1986;;[START_REF] Redžić | Šumske fitocenoze i njihova staništa u uvjetima totalnih sječa[END_REF][START_REF] Vojniković | Sindinamske karakteristike fitocenoza kitnjaka i jele na zemljištima ofiolitske zone i perm karbonskih formacija u Bosni[END_REF], ovaj prirodni fenomen i bogatstvo flore na serpentinima u BiH tokom proteklih 40 godina nisu značajnije istraživani. Kao doprinos poznavanju ovih specifičnih habitata i biljnih vrsta koje tu obitavaju, odlučili smo se za citogenetički pristup, koji omogućava brzi screening vrsta na serpentinskim podlogama, količinu nuklearne DNK, identifikaciju broja hromosoma te prisustvo hibrida, različitih nivoa ploidije i prekobrojnih hromosoma (B hromosoma). Ovaj pristup, kao dio dinamike u uspostavljanju DNK baze na Balkanu (Siljak [START_REF] Yakovlev | Towards a genome size and chromosome number database of Balkan flora: C values in 343 taxa with novel values for 242[END_REF], može mnogo pomoći u evaluaciji i konzervaciji biodiverziteta biljnog svijeta u Bosni i Hercegovini.

Ultramafitne stijene

Ultramafitne (ultrabazične, serpentinske, peridotitske) stijene su magmatske stijene koje su karakterizirane vrlo malim sadržajem silicijuma (manje od 45%), više od 18% magnezij oksida, visokim nivoom željeznih oksida, niskim sadržajem kalija, i najčešće sa više od 90% mafičnih minerala (tamno obojenih, sa visokim koncentracijama magnezija i željeza). Serpentinizirane stijene su distribuirane na cijeloj Planeti, u svim klimatskim zonama i predstavljaju oko 13% globalnih geoloških supstrata (Sequeira i Pinto da Silva, 1991; Coleman i Jove, 1992). Ultramafitne stijene grade specijalizirane habitate s ekstremnim edafskim uvjetima i često imaju jedinstvene biljne zajednice i "ostrva" biodiverziteta sa brojnim ugroženim i endemičnim vrstama. Zbog svih ovih karakteristika, serpentini su interesantni za biljne ekologe, evolucioniste i ekofiziologe te istraživače u domenu genetike i evolucije [START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF]Chiarucci i Baker, 2007). Na Balkanu serpentinska zona pokriva velika područja, površine od 1300 km 2 , tako da pored Urala predstavlja najveći masiv ultrabazičnih stijena u Evropi, i to bilo u obliku velikih blokova ili malih stijena (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF][START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF].

Istočnomediteranski serpentinski region se može podijeliti na "Zapadni region", koji uključuje Balkan (Bosna i Hercegovina, Srbija, Albanija, FYR Makedonija, Grčka, Bugarska) i na "Istočni region" (Turska, Sirija, Kipar), gdje su ofioliti uglavnom iz razdoblja Krede. Metamorfni slojevi balkanskih ofiolita su uglavnom formirani u vrijeme srednje jure, te postoji više subparalelnih ofiolitskih pojaseva, koji sistematski pokazuju različit kemijski sastav. Jedna od grana Alpsko Himalajskog orogenskog pojasa se pruža jugoistočno od Alpa preko Dinarida u Hrvatskoj, Bosni i Srbiji, i potom južno kroz Albanide i Helenide, i dalje. Unutar Dinarida su uočeni subparalelni ofiolitski pojasi: jugozapadni Dinarski ofiolitski pojas sensu stricto (DB); centralni Vardarski zapadni pojas (VZWB), te sjevernoistočni, kao glavna Vardarska zona (Fig. 1). Svi ovi pojasi su uglavnom sastavljeni od ofiolitskog melanža, koji uključuje terigenske sedimentarne stijene (nastale erozijom stijena i zemljišta), male količine silikata i krečnjaka, zajedno sa bazaltom, dijabazom, različitim gabrovima i ultramafitnim stijenama. Ofiolitske stijene su različite veličine: od malih blokova do velikih masiva sa melanžom [START_REF] Pamić | Magmatske i tektonske strukture u ultramafitima bosanske serpentinske zone. Geološki glasnik, knjiga II, posebna izdanja[END_REF][START_REF] Pamić | Geodynamic and petrogenetic evolution of Alpine ophiolites from the central and NW Dinarides: an overview[END_REF][START_REF] Robertson | Development of concepts concerning the genesis and emplacement of Tethyan ophiolites in the Eastern Mediterranean and Oman regions[END_REF][START_REF] Bazylev | Mantle peridotites from the Dinaridic ophiolite belt and the Vardar zone western belt, central Balkan: A petrological comparison[END_REF]. Pored ovog, prisutni su i sporedni lanci: planina Ozren, područje oko Prnjavora (Kalesija), Zvornika i na obodima Majevice [START_REF] Kišpatić | Kristalinsko kamenje serpentinske zone u Bosni. Rad Jugoslovenske akademije znanosti i umjetnosti, Matematičko prirodoslovni razred[END_REF][START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF].

Na osnovu morfoloških osobina pojedinih kompleksa (prvenstveno reljefa i debljine zemljišnog sloja), serpentinska nalazišta se u Bosni mogu podijeliti u četiri skupine:

1. Nalazišta u zapadnom predjelu serpentinske zone, oko Prijedora i Banja Luke, karakterišu se malom nadmorskom visinom (do 400 m), blagim nagibom, dubljim tlima, te osobitost serpentinske flore ne dolazi do izražaja. 2. Skupini prelaznog tipa pripadaju nalazišta na Borje planini i Ozrenu te područje koje ih povezuje (jugoistočno od Teslića preko Maglaja do Ozrena). Brda su ovdje nešto viša (i preko 1000 m), sa mješavinom dubokih i plitkih tala te golog supstrata. Karakteristična serpentinska flora je mjestimično dobro razvijena.

3.

Treću skupinu čine nalazišta koja se protežu sjeverozapadno od Žepča prema Borje planini te područje oko srednjeg toka Gostović potoka i Krivaje. Ova skupina se odlikuje surovim reljefom i prisustvom tipične serpentinske flore.

Karakterišu se planinskim lancima visokim preko 1000 m nadmorske visine, duboko usječenim riječnim dolinama, strmim i skeletnim padinama.

4.

Serpentinska nalazišta oko Višegrada i Rudog se uglavnom karakterišu grubim i skeletnim goletima, gdje vladaju izrazito kserotermni uvjeti.

Karakteristike serpentinskih habitata

Klima

Prema Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF], serpentinska zona Bosne se karakteriše prisustvom umjereno kontinentalne klime sa dosta oštrim zimama i toplim ljetima, uz najveće količine padavina u vrijeme razvoja vegetacije. Klima je prilično ujednačena, jer se serpentinska zona prostire paralelno sa visokim planinama vododjelnice. Međutim, primjećuje se postepeno povećavanje zimskih i ljetnih temperatura te smanjenje oborina idući od zapada prema istoku. Ipak, ova klimatska pojava se ispoljava samo u serpentinskoj zoni u Istočnoj Bosni, dok se u prve tri zone ne ispoljava značajnije zbog prisustva visokih planina, koje ih odvajaju, prema istoku. Prema Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF], na bosanskim serpentinskim zonama je najhladniji mjesec januar (srednje minimalne temperature), a najtopliji juli (srednje maksimalne temperature). Prisustvo kasnih mrazeva (do aprila) štetno djeluje na vegetaciju na serpentinima. Prve tri skupine bosanskih serpentina se karakterišu godišnjim oborinama od preko 1000 mm, dok je na istoku prisutan nešto niži godišnji prosjek.

Uočavaju se dva temperaturna maksimuma: glavni u mjesecu junu i sporedni u oktobru. U suštini, maksimum oborina je tokom ljeta. Najmanji broj dana sa snijegom i kišom je prisutan u istočnoj serpentinskoj zoni. Važan klimatski parametar je i prisustvo magle, koja povećava vlažnost u zraku i time veoma utiče na biljni pokrov. Broj dana sa maglom nije velik i uglavnom se odnosi na jesenski i zimski period, s izuzetkom okoline Kladnja, gdje je najviše maglovitih dana tokom juna.

Iz navedenog se može zaključiti da je klima na većini serpentinskih nalazišta u Bosni srednjoeuropskog karaktera. Prve tri serpentinske zone se karakterišu i dodatnim uticajem klime Posavine, naročito u pogledu količine oborina. Kompleksi u istočnoj Bosni se karakterišu izraženijom kontinentalnom klimom.

Geološko petrografske karakteristike

Ultramafitne stijene se karakterišu malim procentom SiO2 i sa minimalnih 70% minerala feromagnezij silikata, te su uglavnom građene od piroksena i olivina, koji je slabije ili jače serpentiniziran. Zbog toga se ove stijene u petrografiji nazivaju peridotitima. Pod uticajem hidrotermalnih procesa peridotiti su slabije ili jače serpentinizirani, a čisti serpentiniti su rijetki. Trošenjem se peridotiti raspadaju u grubi, skeletni detritus, a serpentiniti u lističave pločice. Kao krajnji produkt erozije ovih stijena nastaju žuta ili crvena tla. Uglavnom su vrlo ujednačenog kemijskog sastava i sastoje se iz Si, Mg i Fe, dok su ostali elementi (Cr, Mn, Co i Ni) prisutni u neznatnim količinama. U mineralogiji je poznato do 20 varijeteta tala koji pripadaju serpentinskoj grupi (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF]Proctor i Woodel, 1975;[START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Brady | Evolutionary ecology of plant adaptation to serpentine soils[END_REF].

Specifičnost i tipovi serpentinskih tala u Bosni

Klima je osnovni faktor od kojeg zavisi tip tla koji će se razviti na serpentinskoj podlozi. Ultramafitna (serpentinska) tla, s obzirom na njihove ekstremne fizičko kemijske karakteristike, predstavljaju negostoljubive habitate i često su nepovoljni za normalan rast biljke. Ova tla su plitka i kamenita sa siromašnom strukturom zemljišta, visokom poroznošću i visokom hidrauličnom provodljivošću. Svi ovi faktori mogu voditi slobodnoj drenaži ovih tala rezultirajući smanjenjem sadržaja (nizak kapacitet zadržavanja) vode (Proctor i Woodell, 1975). Sa kemijskog aspekta, ultramafitna tla obično sadrže male količine esencijalnih nutrijenata (N, P, K, S, Ca) i visoke koncentracije Mg, Fe, Mn i drugih (teških) metalnih elemenata (Ni, Co, Mn i Cr), koji su potencijalno fitotoksični (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF][START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF][START_REF] Proctor | Toxins, nutrient shortages and droughts: The serpentine challenge[END_REF][START_REF] Bhatia | A role for nickel in osmotic adjustment in drought stressed plants of the nickel hyperaccumulator Stackhousia tryonii Bailey[END_REF][START_REF] Brady | Evolutionary ecology of plant adaptation to serpentine soils[END_REF]. Međutim, postepenim razvojem tla i stvaranjem humusa fizikalni uvjeti na serpentinima postaju znatno blaži. Naime, podloga se manje zagrijava i ne podliježe visokim (skoro ekstremnim) temperaturnim kolebanjima, kao što je to slučaj na golim stijenama. Ipak, tokom procesa trošenja stijene i obogaćivanja podloge sitnom zemljom dolazi i do ispiranja baza te tlo postaje sve kiselije. To je zapravo i razlog da se na serpentinima često zajedno pojavljuju na istom staništu acidofilni i bazofilni florni elementi. Drugi razlog tome je i to da značajan suvišak iona Mg uvjetuje visok stepen zasićenosti bazama i blago kiselu do neutralnu reakciju, osim u A horizontu koji može biti nešto kiseliji (pH 5.5) (Ćirić, 1984 Serpentinska tla se razlikuju od istih tipova tala razvijenih na drugim podlogama po: 1) manjoj debljini profila i slabije izraženim morfološkim osobinama, 2) znatno većem sadržaju čestica stijena u cijelom profilu i 3) većem sadržaju humusa. U suštini, koji tipovi tla će dominirati u pojedinim serpentinskim kompleksima zavisi u prvom redu od funkcije reljefa.

Na području Bosne (humidni krajevi umjerene zone) kemijski sastav tla ne razlikuje bitno od matične stijene. Ispitivanja bosanskih serpentinskih kompeksa su pokazala da su na njima prisutna skeletna, smeđa šumska i podzolasta tla te crnice (serpentinske rendzine). Ova tla su u dubljim slojevima bogatija bazama, imaju manju kiselost, a prisutnost čestica matične stijene je veća.

Na osnovu orografskih prilika u Bosni je prisutan različit raspored tala. Tako u prvom kompleksu serpentina (sjeverna Bosna) prisutna su uglavnom podzolasta tla; a kompleks prelaznog tipa se karakterizira prisustvom pretežno smeđih tala koja su više zakiseljena. U trećoj skupini se rjeđe nalaze parapodzolasta tla, a više su zastupljena plitka smeđa tla, koja su intezivnije obojena, plića i grubljeg mehaničkog sastava. Ipak, velika prostranstva zauzimaju i ogoljele površine, uz prisustvo humusnih silikatnih tala. U istočnoj Bosni su uglavnom prisutne ogoljele površine, koje se sastoje od krupnih blokova kamenja i pokazuju mali stepen erozije.

Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF] je u Bosni determinirala sljedeće tipove serpentinskih tala:

1. Najveće površine na serpentinima u Bosni zauzimaju plitka skeletna i nerazvijena tla. To su površine: a) otvorenih sipara sa nevezanim, krupnijim i sitnijim detritusom stijena, podložnim eroziji; b) skeletne padine građene od velikih blokova stijena; i c) kamenjari. Tokom ljeta na površini stijena temperature dosežu i 60°C, a ujedno je prisutno i intezivno dnevno noćno kolebanje temperatura. Ovo je manje rastrošena podloga, sa prisutnim većim stepenom zasićenosti bazama adsorpcijskog kompleksa tala. Ipak, može se primjetiti početak ispiranja baza, jer se odvija kemijsko trošenje serpentina (hidratacija i oksidacija).

2. Smeđa šumska tla bosanske serpentinske zone su plitka do srednje duboka, i u cijelom profilu sadrže čestice matične stijene. Kod plitkih tala je pH reakcija neutralna ili slabo kisela, uz visok stepen zasićenosti bazama.

3. Podzolasta tla, nastala nagomilavanjem erozijom, su prisutna na dubljim profilima, na blago nagnutim padinama ili ravnijim terenima. Na ovim staništima nema karakteristične serpentinske flore, jer je došlo do zakiseljavanja i opadanja stepena zasićenosti bazama adsorpcijskog kompleksa. Ipak, već na dubinama od 30 40 cm se smanjuje kiselost i povećava sadržaj baza i detritusa matične stijene. [START_REF] Asemaneh | Responses to Mg/Ca balance in an Iranian serpentine endemic plant, Cleome heratensis (Capparaceae) and a related non serpentine species, C. foliolosa[END_REF]. Crnice (serpentinske rendzine) su plitka tla prisutna u nižim predjelima Bosne, kao primarni razvojni stadij na serpentinima. Njihov postanak je vezan za kserofilne sastojine trava koje se razvijaju pri suhim i toplim uvjetima, kada se nagomilava humus zbog niske mikrobiološke aktivnosti. Karakteristika ovih tala je da je odnos Ca/Mg mnogo povoljniji, jer je usljed biološke akumulacije došlo do obogaćivanja adsorpcijskog kompleksa ionima Ca.

"Serpentinski sindrom"

Serpentinska staništa je lako prepoznati zbog njihovih karakterističih zeleno sivih i sjajnih stijena, koje su često prošarane sa crnim i bijelim žilama i rijetkom vegetacijom.

Tla nastala od serpentinskih stijena predstavljaju negostoljubiva staništa za život biljaka, tako da je [START_REF] Jenny | The soil resource: Origin and behaviour[END_REF] osmislio termin "serpentinski sindrom" kako bi kolektivno označio brojne strukturalne i funkcionalne adaptacije biljaka sa serpentina.

Zapravo, Jenny je na ovaj način pokušao objasniti preživljavanje biljaka na serpentinima kao njihov ukupan odogovor na niz faktora: kemijskih, bioloških, fizikalnih i klimatskih. "Sindrom" općenito utiče na biomasu (količinu živog materijala) na serpentinima, koja je niska u poređenju sa drugim biljnim zajednicama.

Dugo godina se pokušava razriješiti pitanje "serpentinskog sindroma" ali do danas nema općenite saglasnosti. Proctor i Nagy (1992) smatraju da su ključni faktori za kontroliranje vegetacije na serpentinskoj podlozi upravo različita serpentinska tla.

Međutim, fizikalni i drugi faktori mogu veoma kontrolirati sastav serpentinske flore. U suštini, zbog toga što su serpentinska tla bogata sa Mg, Fe, teškim metalima i azbestom, ona predstavljaju toksična područja za većinu biljaka. S druge strane, mnogi naučnici vjeruju da su kako odnos Ca/Mg tako i nedostatak važnih nutrijenata ključni faktori u determinaciji preživljavanja biljaka na ovim staništima. Treći važan faktor za život biljaka na serpentinima je plitkoća serpentinskih tala, tj. prisutnost manje količine supstrata koji može zadržati nutrijente i vodu, čineći ih pristupačnijim za biljke. Duboka serpentinska tla se nalaze samo u dolinama, u aluvijalnim tlima, gdje kiše sapiru male partikule. Vegetacija u ovim dolinama je gušća, ali su tla i dalje ultramafitna [START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF][START_REF] Robinson | Plant available elements in soils and their influence on the vegetation over ultramafic ("serpentine") rocks in New Zeland[END_REF].

Suša uzrokuje unutrašnje (fiziološke, metaboličke) i spoljašnje (morfološke) promjene u biljkama, što rezultira u konzervaciji/djelotvornoj upotrebi pristupačne vode. Endemične biljke na ultramafitnim tlima tipično demonstriraju karakteristike za preživljavanje kao što su tolerancija na visoku koncentraciju Ni i Mg i nisku koncentraciju Ca, i tolerancija na niske vodne potencijale tala. Oni pokazuju bolju stomatalnu kontrolu prekomjernog gubitka vode u poređenju sa biljkama koje obitavaju na normalnim tlima i odlikuju se kratkim i uskim listovima i kompaktnim rastom [START_REF] Proctor | Toxins, nutrient shortages and droughts: The serpentine challenge[END_REF]. Također, serpentinofite se č esto karakterišu nanizmom, plagiotropizmom, stenofilijom i atipičnim indumentumom, te ponekad glauscencijom, glabrescencijom, purpurescencijom i dekoloracijom lisnih površina te snažno razvijenim korjenovim sistemom (Pichi [START_REF] Sermolli | Flora e vegetazione delle serpentine e delle alter ofioliti del'alta valle del Trevere (Toscana)[END_REF][START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF]Proctor i Woodel, 1975;[START_REF] Brady | Evolutionary ecology of plant adaptation to serpentine soils[END_REF].

Serpentini i biljke

Specifičnost flore na serpentinskoj podlozi na području Toskane, Italija, su prvi zapazili Andrea Cesalpino, 1583, i Gaspare Amidei di Volterra, 1841, nakon čega su slijedila brojna proučavanja tih staništa [START_REF] Chiarucci | Vegetation ecology and conservation on Tuscan ultramafic soils[END_REF]. Dugogodišnja istraživanja su pokazala da biljni pokrov na različitim serpentinskim kompleksima ima mnogo zajedničkih karakteristika bez obzira na to u kojim klimatskim pojasevima se ti kompleksi nalaze.

Karakteristične vegetacijske zajednice svakog serpentinskog regiona su rezultat međuodnosa svakog tog pojedinačnog područja sa jedinstvenim okolišnim, geokemijskim i fizičkim karakteristikama, jer su upravo te jedinstvene karakteristike serpentinskih tala dovele do razvoja karakteristične flore. Ta područja se karakterišu u oskudnosti flore kako po brojnosti tako i po raznolikosti vrsta, u postojanju paleo i neoendema, prisutnosti specifičnih morfoloških osobina, acidofilnih i bazofilnih vrsta te flornih elemenata različitog porijekla (npr. visokoplaninske vrste, pontski elementi) na istim staništima, itd. (Proctor i Woodell, 1975;[START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF]; Sequeira i Pinto da Silva, 1991; Proctor i Nagy, 1992; Baker et al., 1993;[START_REF] Reeves | Nickel accumulating plants from the ancient serpentine soils of Cuba[END_REF][START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF][START_REF] Vojniković | Sindinamske karakteristike fitocenoza kitnjaka i jele na zemljištima ofiolitske zone i perm karbonskih formacija u Bosni[END_REF].

Nepovoljan mineralni sastav plitkog, alkalnog tla i drugi negativni okolišni uvjeti (nedostatak vode, visoke temperature, intenzivna insolacija) rezultiraju rijetkom zakržljalom vegetacijom, zbog č ega se serpentinski predjeli uglavnom smatraju neplodnim. Serpentinske vrste su općenito manjeg rasta nego neserpentinske, te su usljed specifičnih strukturalnih i funkcionalnih adaptivnih karakteristika klasificirane u ekološku grupu serpentinofita. Adaptivne karakteristike koje su se razvile tokom evolutivnog puta su učinile da su serpentinofite ne samo sposobne da podnose stresne uvjete, već i da uspješno ulaze u kompeticiju sa drugim biljkama na ovim staništima [START_REF] Harrison | Local and regional diversity in a patchy landscape: native, alien, and endemic herbs on serpentine[END_REF][START_REF] Freitas | Analysis of serpentinophytes from north-east of Portugal for trace metal accumulation--relevance to the management of mine environment[END_REF][START_REF] Brady | Evolutionary ecology of plant adaptation to serpentine soils[END_REF].

Serpentinofite se mogu klasificirati u dvije grupe [START_REF] Reeves | Nickel accumulating plants from the ancient serpentine soils of Cuba[END_REF][START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF]:

1) serpentin endemične ili serpentin obligatne biljke, koje rastu samo na serpentinskim tlima i nisu pronađene na drugim supstratima;

2) serpentin tolerantne ili serpentin fakultativne biljke, koje su sposobne da prežive i da se razvijaju na serpentinima. U okviru ove grupe se mogu razlikovati:

• fakultativne serpentinske vrste -biljke koje uglavnom rastu na serpentinima, ali se mogu pronaći na drugim supstratima (npr. krečnjacima ili silikatima), i

• slučajne serpentinske vrste -vrste koje najčešće rastu na neserpentinskim supstratima, ali ponekad (rijetko) i na serpentinima.

Između serpentin fakultivnih i serpentin obligatnih biljaka postoje određene razlike u strukturalnim i funkcionalnim karakteristikama koje im omogućavaju da podnose nutritivni i druge okolišne stresove. Tolerantne vrste su dominantne u ovom tipu vegetacije, i uglavnom su to niskorastuće grmlje i puzajuće biljke s užim lišćem i manjom dlakavošću (mada ima i suprotnih primjera) te obično tamnozelene boje. U ovu grupu spadaju i slučajni primjerci velikog drveća sa dlakavim listovima. Vrste koje izbjegavaju serpentine najčešće klijaju iz sjemenki ili rastu iz podzemnih skladištnih struktura i kompletiraju životni ciklus u periodu kada je pristupačna voda (Riter Studnička, 1964;O'Dell et al., 2006;[START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Dudić | Differences of metal concentrations and morpho anatomical adaptations between obligate and facultative serpentinophytes from Western Serbia[END_REF].

Biljne zajednice na serpentinskim tlima su adaptirane na toksične koncentracije teških metala, i to bilo korištenjem mehanizama isključivanja kojima je unos i/ili korijen izdanak transport teških metala ograničen, ili tolerancijom na teške metale putem "hiperakumulacije", i.e. sposobnosti biljaka da akumuliraju veoma velike koncentracije nekih teških metala u njihovim nadzemnim dijelovima [START_REF] Baker | Accumulators and excluders strategies in the response of plants to heavy metals[END_REF][START_REF] Brooks | Geobotany and hyperaccumulators[END_REF]. Ipak, novija istraživanja su pokazala da metali u tlu ne predstavljaju najvažniji limitirajući faktor za serpentinsku vegetaciju u Toskani, Italija [START_REF] Chiarucci | Community dynamics of serpentine vegetation in relation to nutrient addition and climatic variability[END_REF], već da je nutricionalni stres najodgovorniji za opstanak mnogih vrsta i za biljnu produktivnost (Chiarucci et al., 1998a;[START_REF] Chiarucci | Community dynamics of serpentine vegetation in relation to nutrient addition and climatic variability[END_REF]. Međutim, kombinacija različitih faktora koji kontroliraju serpentinsku floru se razlikuje od mjesta do mjesta (Proctor i Nagy, 1992). Općenito, flora na serpentinskim tlima je jedinstvena i dobro diferencirana u odnosu na okolna područja, te je normalno prisustvo velikog procenta endemičnih vrsta i nekih, danas prisutnih, specijalnih fizioloških adaptacija na nepovoljne uvjete [START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF][START_REF] Chiarucci | Community dynamics of serpentine vegetation in relation to nutrient addition and climatic variability[END_REF].

Pregled istraživanja serpentinske flore i vegetacije u Bosni

U odnosu na istovjetne grupacije na krečnjacima, na serpentinima se uočava velika jednoličnost u oblicima vegetacije kao i siromaštvo u brojnosti vrsta. Specifičnost flore na serpentinima dolazi do izražaja naročito na golom supstratu, na stijenama ili na grubo rastrošenom, skeletnom detritusu. Razvojem vegetacije i akumulacijom humusa dolazi do slabljenja veze sa matičnim supstratom te životni uvjeti postaju povoljniji, što omogućava mezofilnim vrstama da potisnu pionirsku vegetaciju. Osobena serpentinska vegetacija je prisutna i u kserofilnim šumama na kamenitom tlu (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF].

Prema [START_REF] Chiarucci | A test of vegetation environment relationship in serpentine soils of Tuscany, Italy[END_REF] i [START_REF] Chiarucci | Vegetation ecology and conservation on Tuscan ultramafic soils[END_REF] efekat nekih fizičkih osobenosti (nagib i taloženje supstrata) te pokrovnost drveća su odlučujući faktori u distribuciji vrsta na ultramafitnim tlima.

Biodiverzitet na Balkanskom poluotoku je visok, sa velikim brojem interesantnih lokalnih i regionalnih endema. Tako je više od 300 endemičnih svojti identificirano na cijelom Balkanu, što indicira važnost serpentinskih staništa kao centara florističke diferencijacije i specijacije [START_REF] Stevanović | Distribution of the endemic Balkan flora on serpentine I. -obligate serpenitne endemics[END_REF]Chiarucci i Baker, 2007).

Na ultramafitnim tlima Bosne se veoma č esto susreću acidofilni i bazifilni (neutrofilni) florni elementi (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF], a kao posljedica ispiranja baza iz tla i suviška iona magnezija. Pojava subalpinskih flornih elemenata na ultramafitima je posljedica povećane zračne vlage i inverzije temperatura usljed specifičnosti orografije.

Ukratko, ova staništa se karakterišu smjenom mezofilnih sa kserofilnim i acidofilnih sa bazofilnim flornim elementima, kao i prisustvom subalpinskih i pontskih flornih elemenata. Nepristupačnost ovih terena te dugogodišnje nepostojanje komunikacija su značajno onemogućili antropogeni uticaj na serpentinskim područjima Bosne. Najčešće negativne posljedice na ovim područjima izazivaju požari, koji se lako šire i, dugoročno gledano, dovode do brze degradacije staništa. Ograničavajući faktori sukcesija na ultramafitnim stijenama su: stres izazvan deficitom vode i hranjiva, specifična kombinacija orografskih faktora, te donekle i toksičnost teških metala, naročito nikla [START_REF] Robinson | Plant available elements in soils and their influence on the vegetation over ultramafic ("serpentine") rocks in New Zeland[END_REF]Chiarucci et al. 1998aChiarucci et al. , 1998b[START_REF] Chiarucci | A test of vegetation environment relationship in serpentine soils of Tuscany, Italy[END_REF][START_REF] Chiarucci | Vegetation ecology and conservation on Tuscan ultramafic soils[END_REF].

Može se reći da usljed specifičnih mikroklimatskih prilika najveće površine biljnog pokrova na serpentinima zauzimaju kserofilni oblici vegetacije (stijene, kamenjari i sipari, te šume crnog bora i hrasta kitnjaka). Najkserotermnija je vegetacija sipara, gdje je i najzastupljenija endemična serpentinska flora (Riter [START_REF] Studnička | Biljni pokrov na serpentinama u Bosni[END_REF][START_REF] Redžić | Šumske fitocenoze i njihova staništa u uvjetima totalnih sječa[END_REF][START_REF] Vojniković | Sindinamske karakteristike fitocenoza kitnjaka i jele na zemljištima ofiolitske zone i perm karbonskih formacija u Bosni[END_REF] 

Veličine genoma biljaka na serpentinima

Pomoću metoda citometrije je moguće izvršiti brzo i precizno skeniranje veličine genoma i nivoa ploidije, identifikaciju hibrida, te detekciju kako B hromosoma tako i malih razlika u količini DNK (Siljak Yakovlev et al., 2010, i refrence u radu). Proteklih godina je iskazano povećano interesovanje za mehanizme evolucije veličine genoma i odnosa između veličine genoma i ekoloških faktora, s obzirom na adaptivnu ulogu nukleotipa [START_REF] Gruner | Genome size is a strong predictor of rootmeristem growth rate[END_REF][START_REF] Hoffmann | Comparative analysis of growth, genome size, chromosome numbers and phylogeny of Arabidopsis thaliana and three cooccurring species of the Brassicaceae from Uzbekistan[END_REF]. Osim toga, veličina genoma važan je karakter u evaluaciji biodiverziteta, sistematici i evoluciji [START_REF] Godelle | Heterochromatin study demonstrating the non linearity of fluorometry useful for calculating genomic base composition[END_REF][START_REF] Martel | Genome size variation and basic chromosome number in pearl millet and fourteen related Pennisetum species[END_REF][START_REF] Cerbah | Evolutionary DNA variation in the genus Hypochaeris[END_REF]Le Thierry d'Ennequin et al., 1998;[START_REF] Ohri | Genome size variation and plant systematic[END_REF][START_REF] Cerbah | Genome size variation and species relationships in the genus Hydrangea[END_REF][START_REF] Slovak | Complex pattern of genome size variation in a polymorphic member of the Asteraceae[END_REF][START_REF] Vidic | Selective significance of genome size in a plant community with heavy metal pollution[END_REF][START_REF] Yakovlev | Towards a genome size and chromosome number database of Balkan flora: C values in 343 taxa with novel values for 242[END_REF]. Kod eukariota je prisutna veoma velika varijabilnost veličine nuklearnog genoma, što se nije moglo dovesti u vezu sa kompleksnošću organizama niti njihovim porijeklom. Ipak je uočeno da su vrste sa malim genomima prisutne u svim habitatima, da su vrlo invazivne i da opstaju i pri izraženijim ekstremnim uvjetima okoliša [START_REF] Leitch | Phylogenetic analysis of DNA C values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants[END_REF]Knight i Ackerly, 2002). Suprotno njima, vrste sa velikim genomima su veoma osjetljive na stresne okolišne uvjete i ograničene su na manje stresne uvjete sa dužim sezonama rasta [START_REF] Bennett | DNA amounts of angiosperms from the Antarctic and Soth Georgia[END_REF]Grime i Mowforth, 1982;[START_REF] Bennett | Variation in genomic form in plants and its ecological implications[END_REF]Knight i Ackerly, 2002;[START_REF] Knight | Variation in nuclear DNA content across environmental gradients: a quantile regression analysis[END_REF][START_REF] Vidic | Selective significance of genome size in a plant community with heavy metal pollution[END_REF]. Veliki broj studija je ukazalo na postojanje brojnih kako pozitivnih, tako negativnih ili odnosa bez signifikantnosti (čak i za isti karakter) između veličine genoma i nekih ćelijskih i fizioloških karaktera.

Veličina genoma varira i korelira sa veličinom hromosoma, nukleusa i ćelije; dužinom mitotičkog i mejotičkog ciklusa; veličinom i masom sjemena; nekim karakterima lista; stopom fotosinteze i rastom (Knight et al., 2005, i 

Biljke i teški metali

"Teški metali", nije potpuno definirani termin, no vrlo često ćemo ga naći u literaturi.

Koristi se kao termin za grupu metala koji su povezani sa polucijom i toksičnošću, mada uključuje i nekoliko kemijskih elemenata koji su značajni za živa bića, ali u malim koncentracijama. "Toksični metali" su alternativni termin za "teške metale", pod kojim se podrazumjeva i prisustvo određenih elemenata (Pb, Cd, Hg, As, Tl i U), mada ovaj termin nije podesan za biološki važne elemente kao što su Co, Cu, Mn, Se i Zn. Termin "elementi u tragovima" postaje sve popularniji kao zamjena za termin "teški metali", ali još uvijek nije u širokoj upotrebi (Stavreva Veselinovska et al., 2008).

Teški metali su članovi grupe elemenata sa metalnim karakteristikama, a koji uglavnom uključuje prelazne metale, neke metaloide, lantanide i aktinide. Oni su široko rasprostranjeni u Zemljinoj kori, i mogu se osloboditi iz eruptivnih stijena (vulkanskog porijekla), sedimenata (formiranih u slojevima sedimentacijom) ili metamorfnih stijena (transformirane intenzivnom vrućinom i pritiskom) koje sadrže specifične teške metale.

Teški metali isprani iz formacija prirodnih stijena su široko prisutni u okolišu, u obliku čestica ili rastvorenih formi u tlima, rijekama, jezerima, morskoj vodi i sedimentima mora. Vulkani također oslobađaju teške metale u atmosferu. Koncentracije teških metala se uočavaju i u područjima povećane agrikulturalne i industrijske aktivnosti.

Naročito su tla u blizini rudnika teških metala izložena ne samo stresu uzrokovanim teškim metalima (Zn, Pb, Cr, Mn, Fe ili In), već i metaloidima (Tl i As). Teški metali su veoma interesantni, s antropogenog stanovišta, zbog njihove mobilnosti, biopristupačnosti i toksičnosti u okolišu, gdje predstavljaju potencijalni rizik za žive organizme [START_REF] Babula | Uncommon heavy metals, metalloids and their plant toxicity: a review[END_REF].

Biljke iz tla apsorbiraju brojne elemente u odnosu na koncentracijske gradijente indukovane selektivnim unosom iona putem korjenja ili difuzijom elemenata u tlu.

Nivo akumulacije elemenata je različit kako među vrstama tako i unutar vrste. Neki od apsorbiranih elemenata se označavaju kao esencijalni, zbog toga što ih biljke trebaju kako bi kompletirale životni ciklus. S druge strane, neki prelazni elementi (npr. Fe, Mn, Mo, Cu, Zn i Ni) su poznati kao mikroelementi, pošto su biljkama za život neophodni u veoma malim količinama. Stimulativan efekat na rast biljaka, ali ne i esencijalan, imaju drugi prelazni elementi (Ag, Au i Co) ali i neki neprelazni elementi (npr. Al). Biljke, također, apsorbiraju elemente za koje se ne zna njihova biološka funkcija, iako čak mogu biti i toksični u malim koncentracijama (As, Cd, Cr, Hg i Pb). U suštini, čak i mikroelementi postaju toksični za biljke kada se apsorbiraju u količinama većim od graničnih (Peralta [START_REF] Videa | The biochemistry of environmental heavy metal uptake by plants: Implications for the food chain[END_REF]Taiz i Zeiger, 1998). [START_REF] Baker | Accumulators and excluders strategies in the response of plants to heavy metals[END_REF] predlaže podjelu biljaka u tri kategorije: 1) izbjegavači (ekskluderi; Thlaspi arvense, Armeria maritima, Silene vulgaris, etc.): su biljke koje a) nakon unosa u korjenov sistem, sprečavaju transport metala u izdanke i održavaju relativno niske koncentracije metala u izdanku u odnosu na njihove vrijednosti u tlu, ili b) su u nemogućnosti da unesu metal u korjenov sistem, jer ne posjeduju odgovarajuće metaboličke puteve.

2) akumulatori (Arabidopsis halleri, Thlaspi caerulescens, Alyssum murale, etc.): biljke koje, bez vidljivih simptoma toksičnosti, pokazuju tendenciju ili sposobnost da translociraju i akumuliraju veće koncentracije metala u nadzemnim dijelovima bez obzira na to kolike su koncentracije metala u tlima. U okviru ove grupe biljaka se mogu izdvojiti i hiperakumulatori, koji imaju sposobnost da akumuliraju metale u izdancima u koncentracijama preko 100 puta većim od uobičajenih.

3) indikatori (Taraxacum officinale, Populus nigra, Forsythia europaea, etc.): biljke koje pokazuju intermedijarni odgovor na visoke koncentracije metala u tlima. Naime, koncentracija teških metala u biljkama indikatorima je odraz koncentracija istih metala u okolnom tlu, dok ne dođe do trovanja organizma.

Važan faktor biopristupačnosti metala/metaloida je njihovo prisustvo u tlu i vodi pošto nema puno biljaka koje ih mogu usvojiti iz zraka. Sljedeći važan faktor je trenutna forma teškog metala (valencija) u tlu ili vodi koja se poklapa s aktualnim uvjetima, kao što su pH, sadržaj oksigena, prisustvo ili odsustvo drugih anorganskih kao i organskih spojeva. Nije uočena korelacija između sadržaja metala u tlu i u biljnim tkivima. Neki teški metali, npr. olovo [START_REF] Babula | Uncommon heavy metals, metalloids and their plant toxicity: a review[END_REF], su skoro apsolutno nepristupačni za biljke zbog njihove netopivosti i interakcija sa česticama tla.

Različiti mehanizmi tolerancije odgovorni za biljnu adaptaciju na visoke koncentracije teških metala u tlu se mogu sumirati kao kapacitet biljke ili da ograniči unos i translokaciju metala ili da akumulira metale u netoksičnim oblicima. Većina serpentinskih vrsta teži da ograniči unos metala, tako da je njihova koncentracija u listovima mala. Samo nekoliko vrsta, visoko adaptiranih i endemičnih za ove supstrate, su sposobne da akumuliraju metale u svojim izdancima, te se mogu smatrati hiperakumulatorima. Također, široko rasprostranjenje odstranjivača sugerira da njihova strategija dozvoljava visoku adaptibilnost na različite uvjete na serpentinima [START_REF] Baker | Accumulators and excluders strategies in the response of plants to heavy metals[END_REF][START_REF] Baker | Metal tolerance[END_REF][START_REF] Gabbrielli | Comparision of two serpentine species with different nickel tolerance strategies[END_REF].

Biljne vrste koje su tolerantne na višestruki nutritivni stres na serpentinskim tlima očekivano imaju nisku stopu rasta, izraženu toleranciju na nisku pristupačnost N, P, K i Ca, kao i toleranciju na toksičnost Mg i teških metala. Vrstama koje rastu u blizini, ali ne na serpentinima, nedostaje barem jedna od ovih karakteristika, zbog čega ne obitavaju na ovakvim staništima [START_REF] Kondo | Banding for the chromosomes of Cryptomeria japonica D. Don[END_REF][START_REF] Proctor | Toxins, nutrient shortages and droughts: The serpentine challenge[END_REF]O Dell et al., 2006).

Odgovor biljke na stres

Biljke posjeduju jedinstvene i sofisticirane mehanizme za toleranciju abiotičkih stresova, koji su najčešće uzrokovani sušom, slanošću, visokim ili niskim temperaturama, svjetlošću, nedostatku ili suvišku nutrijenata, teškim metalima, bilo pojedinačno ili njihovim kombinacijama. Stres nastao kao posljedica djelovanja abiotičkih faktora utiče na metabolizam i dovodi do negativnih efekata na rast, razviće i produktivnost biljaka. Ako stres postane veoma izražen i/ili traje duže vrijeme, on može veoma opteretiti metabolizam ć elija i uzrokovati smanjen rast, a u ekstremnim slučajevima i smrt individue.

Povećani sadržaj kako esencijalnih tako i neesencijalnih metala u tlu dovodi do izražaja simptoma trovanja i inhibicije rasta biljaka. Tolerancija na teške metale kod biljaka se može definirati kao sposobnost biljke da preživi u tlu, koje je toksično za ostale biljke, i manifestira se interakcijom između genotipa i njegovog okoliša. U brojnim genetičkim studijama, adaptivna tolerancija na metale uključuje mali broj gena i možda sudjelovanje nekih neynatno promjenjenih gena. Kako bi se zaštitile od trovanja metalima, biljke moraju razviti mehanizam kojim se metal nakon ulaska u citosol ćelije ili odmah izbacuje ili kompleksira i inaktivira. Na taj način se sprječava da metal inaktivira katalitički aktivne ili strukturne proteine, prvenstveno pomoću adaptivnog mehanizma koji može biti uključen u općenitu homeostazu esencijalnih iona i njihovu toleranciju [START_REF] Baniwal | Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[END_REF]Shah i Nongkynrih, 2007).

Bijeli narcis (Narcissus poeticus L.)

Rod monokotiledonih biljaka narcisa (Narcissus), iz porodice amarilisa (Amaryllidaceae), čine trajnice sa lukovicom i nadzemnom stabljikom. Rod je nativan u centralnoj Europi i cijelom Mediteranskom regionu, s izuzetkom jedne vrste koja obitava u Aziji. Centar diverziteta roda se nalazi na Iberijskom poluostrvu [START_REF] Hanks | Narcissus and daffodil, 1st edn[END_REF].

Postoje dvije verzije porijekla imena roda. Poznati rimski historičari Pliny i Virgil su bili mišljenja da ime narcissus dolazi od riječi narke, koja označava narkotičko djelovanje jakog mirisa cvjetova. Ipak, švedski botaničar Linnaeus je inspiraciju za ime roda pronašao u ličnosti lijepog mladića Narcissusa iz grčke mitologije (http://en.wikipedia.org/wiki/Narcissus_%28flower%29; http://pss.uvm.edu/ppp/articles/sprbulbs.html).

Taksonomija roda je vrlo kompleksna i predstavljena je sa različitim klasifikacijama i brojem vrsta (Webb, 1980;[START_REF] Fernandes | Keys to the identification of native and naturalized taxa of the genus Narcissus L[END_REF]. Nedavno su Graham i Barret (2004) i Zonneveld (2008) sa različitim pristupima prihvatili samo 36 vrsta. U rodu je opisano više od 27 000 kultiviranih varijeteta [START_REF] Kington | The international daffodil checklist[END_REF]; The International Daffodil Register and Classified List /updated 2008/), s obično veoma složenim porijeklom.

Varijeteti su uglavnom proizvedeni ukrštanjem vrsta N. poeticus L., N. pseudonarcissus L.

i N. tazetta L. (Wylie, 1952;Brandham, 1992;Brandham i West, 1993).

Uprkos veoma važnoj ulozi koju Narcissus poeticus igra u kultivaciji narcisa, do danas je rađeno relativno malo istraživanja na njegovim prirodnim populacijama. U Bosni i Hercegovini, bijeli narcis ima vrlo velike i brojne populacije na kraškim poljima, ali je zastupljen i sa manje brojnim populacijama na planinskim i subalpinskim travnjacima i kamenjarima na krečnjacima te na serpentinskim supstratima. Populacije bijelog narcisa su pronađene na nadmorskim visinama od 700 do 1750 m. Ova biljka zahtjeva bazična do slabo kisela, vlažna i dobro drenirana tla. Što se tiče osunčanosti, veoma dobro podnosi jaku sunčevu insolaciju, ali i polusjenu. Cvjeta od kraja aprila do sredine juna, i karakterizira se sa jakim i specifičnim mirisom.

Citogenetičke karakteristike roda Narcissus

Prisustvo različitih evolutivnih procesa, kao što su hibridizacija, poliploidizacija, adaptivna radijacija i prisustvo prekobrojnih hromosoma su uočeni kod različitih predstavnika roda Narccissus [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF]Wylie, 1952;Fernandes, 1975;Brandham, 1986;Brandham i Kirton, 1987;Zonneveld, 2008).

Poliploidija je značajan proces u evolutivnoj historiji biljnog svijeta, gdje novonastale promjene u strukturi genoma direktno utiču na fenotip i fitnes individua u različitim okolišnim uvjetima. Na uspostavljanje i održavanje poliploida veliki uticaj imaju perenijalna životna forma, visok fekonditet, samooplodnja ili aseksualni način razmnožavanja, slabo rasijavanje i prisustvo različitih niša (Otto, 2007; Rieseberg i Willie, 2007). Optimalni nivo poliploidije za kultivare roda Narcissus je tetraploidija, gdje su individue sa većim nivoom ploidije vrlo rijetke. Poliploidija je rijetka u prirodnim populacijama, osim kod vrste N. bulbocodium, koji može biti 2x, 4x i 6x (Wylie, 1952). Prema pristupačnoj literaturi, individue N. poeticus iz prirode su uglavnom diploidi 2n=14 [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF]Wylie, 1952;[START_REF] Cesca | Numeri cromosomici per la Flora Italiana: 98 107[END_REF]Brandham i Kirton, 1987;[START_REF] Takhtajan | Numeri chromosomatum magnoliophytorum florae URSS, Aceraceae-Menyanthaceae, 1st edition[END_REF]Zonneveld, 2008). Triploidi (2n=3x=21) su registrirani u samo po jednoj populaciji u Grčkoj i Švicarskoj (Zonneveld, 2008). Iako su i kultivirane individue uglavnom diploidi, ipak postoji evidecija o postojanju nekoliko triploidnih varijeteta (N. poeticus var. poetarum, N. poeticus "Recurvus", N. poeticus "Hellenicus", N.

poeticus "Pheasant Eye") i jednog tetraploida N. poeticus "Actaea" [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF]Wylie, 1952;[START_REF] Cesca | Numeri cromosomici per la Flora Italiana: 98 107[END_REF]Brandham i Kirton, 1987;[START_REF] Takhtajan | Numeri chromosomatum magnoliophytorum florae URSS, Aceraceae-Menyanthaceae, 1st edition[END_REF]Zonneveld, 2008).

Prisustvo B hromosoma je primjećeno kod nekoliko vrsta roda Narcissus [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF]Wylie, 1952;Brandham i Kirton, 1987;Zonneveld, 2008) Svi pronađeni B hromosomi u rodu Narcissus dugi su oko 2/3 hromosoma iz garniture A, a koji nosi satelit (najčešće najkraćeg hromosomskog para u komplementu), sa subterminalnom centromerom, mogu biti vrlo slični ili morfološki varijabilni, te mogu ali i ne moraju biti heterohromatični [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF]Wylie, 1952;Brandham i Kirton, 1987;Zonneveld, 2008). U relevantnoj literaturi postoji samo nekoliko referenci o postojanju B hromosoma kod vrste N. poeticus [START_REF] Takhtajan | Numeri chromosomatum magnoliophytorum florae URSS, Aceraceae-Menyanthaceae, 1st edition[END_REF] 

Ciljevi

Ciljevi ove studije su sljedeći: 1) da se odrede veličina genoma i nivoi ploidije za brojne vrste koje obitavaju na serpentinskim supstratima u zapadnom dijelu Balkanskog poluostrva;

2) da se provjeri postojanje favoriziranih odnosa između veličine biljnih genoma i stresnih okolišnih uvjeta u prirodnim habitatima na serpentinskim supstratima;

3) da se nastavi sa širenjem baze podataka o veličini genoma biljnih vrsta Balkanske flore; 4) da se ukaže na problematiku konzervacije ovih unikatnih biljnih resursa na specifičnim habitatima u Bosni; 5) da se izvrši mjerenje koncentracije određenih teških metala (Ni, Co, Mn i Fe) te makronutrijenata Mg i Ca u različitim biljnim dijelovima i pripadajućoj rizosferi datih individua bijelog narcisa koje uspijevaju na različitim supstratima; 6) da se identificiraju moguće promjene na bijelom narcisu kao rezultat uticaja nekih teških metala; 7) da se izvrše citogenetička istraživanja hromosomalne strukture (prisustvo heterohromatina i ribosomalnih gena) u različitim populacijama vrste Narcissus poeticus u zapadnom dijelu Balkanskog poluostrva; 8) da se identificiraju tipovi odgovora genoma bijelog narcisa na različite okolišne uvjete; 9) da se valoriziraju varijabilnosti veličine genoma među populacijama bijelog narcisa u različitim habitatima, uključujući tla bogata teškim metalima (serpentini); 10) da se istraže odnosi između ukupne nuklearne količine DNK bijelog narcisa i broja B hromosoma.

MATERIJALI I METODE

Veličina nuklearnog genoma serpentinofita

U cilju mjerenja količine nuklearnog genoma biljni materijal (listovi) je prikupljen tokom cijele vegetacijske sezone na prirodnim serpentinskim kompleksima centralne i istočne Bosne, na zapadnim padinama planine Zlatibor u Srbiji, te u FYR Makedoniji.

Taksonomska pripadnost, geografsko porijeklo, sklonost ka supstratu, tip životnog ciklusa, životna forma, broj hromosoma iz literature i determiniran u ovoj studiji, nivo ploidije, 2C DNK i 1C DNK vrijednosti, monoploidna veličina genoma, broj analiziranih individua, i vrste koje su služile kao standardi prezentirani su u Prilogu 1. Vaučeri sakupljenih biljaka su pohranjeni u Laboratoriji za istraživanje i zaštitu endemičnih resursa, Odjel za Biologiju, Prirodno -matematički fakultet, Univerzitet u Sarajevu. Sistematski status, životni ciklus i životna forma su determinirani za svaku svojtu iz relevantne bibliografije [START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Novopazarskog Sandžaka. 1. Gymnospermae i Monocotyledones[END_REF][START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Novopazarskog Sandžaka, II (7). Glasnik Zemaljskog Muzeja u BiH[END_REF][START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Oblasti Novog Pazara, III choripetalae[END_REF]Beck i Malý, 1950;[START_REF] Beck | Flora Bosnae et Hercegovinae, IV sympetalae, pars 2 4, Zem[END_REF][START_REF] Beck | Flora Bosnae et Hercegovinae, IV sympetalae, pars 2 4, Zem[END_REF][START_REF] Hayek | Prodromus Florae Peninsulae Balkanicae 1 3[END_REF]Josifović, 1970Josifović, 1977;;Sarić, 1986;Tutin et al., 1992Tutin et al., 1996;;[START_REF] Oberdorfer | Congeneric serpentine and nonserpentine shrubs differ more in leaf Ca:Mg than in tolerance of low N, low P, or heavy metals[END_REF][START_REF] Šugar | [END_REF][START_REF] Šilić | Narcissus poeticus pripada prealpsko submediteranskoj flori (Mišić i Lakušić[END_REF]Tutin et al., 1996;[START_REF] Šilić | Narcissus poeticus pripada prealpsko submediteranskoj flori (Mišić i Lakušić[END_REF]Nikolić, 1994Nikolić, 2000;;Nikolić i Topić, 2005).

Svježi listovi prikupljeni su sa jedne do pet individua, u zavisnosti od brojnosti individua u populaicjama na serpentinskim staništima, za određivanje ukupne veličine genoma. Pojedinačni listovi su odvojeno umotavani u vlažni klineks papir, potom u prozirnu foliju i pohranjeni na temperaturi od +4°C do mjerenja. Svježi listovi analiziranih vrsta, zajedno sa listovima odgovarajućeg standarda, usitne se žiletom u sterilnim Petrijevim posudama (Fig. 3), uz dodatak 600 μl Galbraithovog pufera [START_REF] Galbraith | Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues[END_REF]) koji sadrži 1% PVP (polivinilpirolidin) 10.000; 10 mM natrij metabisulfit i 0.1% Triton X 100. Navedene kemikalije se dodaju radi pojačavanja permeabilnosti nuklearne membrane, što omogućava lakši prodor fluorohroma u svježi materijal (Heslop Harrison i Schwarzacher, 1996). Da bi se dobili intaktni izolirani nukleusi, vršeno je filtriranje suspenzija maceriranog materijala kroz ultra filter, sa promjerom pora od 48 μm. Dobivene otopine se u plastičnim flakonima konstantno drže na ledu. Nakon toga slijedi tretman sa RNA zom 2.5 jedinica ml 1 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka). Za estimaciju veličine genoma se dodaje 50 g ml 1 interkalarne fluorescentne boje propidium iodida (Sigma), koji markira totalnu DNK i proizvodi nizak koeficijent varijacije (cv).

Određivanje ukupne nuklearne količine DNK

Ovako izolirani nukleusi obojeni fluorohromom se propuštaju kroz laserski protočni citometar (Fig 4). Mjerenja su izvršena na pet individua iz svake ispitivane populacije, uz ponavljanje mjerenja (konačna vrijednost je rezultat dobijen na osnovu mjerenja najmanje 2.500 bojenih nukleusa za svaku individuu).

Kroz "protočnu ć eliju" citometra propuštaju se pojedinačno izolovani i fluorohromom obojeni nukleusi u vidu uskog toka. Pri prolasku kroz protočnu ćeliju, nukleusi se obasjavaju snažnim laserskim snopom svjetlosti određene talasne dužine koja odgovara upotrebljenom fluorohromu. Standardne otopine određivanih elemenata u koncentraciji od 1.0 g L 1 su pripremljeni otapanjem spektrografski č istih ( 99,99%) određivanih elemenata u kloridnoj ili nitratnoj kiselini, ili su pripremljeni otapanjem karbonata u kloridnoj kiselini (za Ca i Mg). Kalibracione otopine su pripremane na isti način kao i za biljni materijal, s obzirom da je Si isplinjen, a ostali elementi su odmjeravani.

Mjerenja koncentracija elemenata u biljnom materijalu i tlu su vršena u serijama po pet otopina uzoraka. Kako su rađene po dvije otopineistog uzorka istovremeno, mjerenje apsorbance je izvođeno prvo na pet otopina prve paralelke, a zatim druge.

Linearnost kalibracione krivulje je kod svakog elementa provjeravana nakon mjerenja apsorbancije seta od pet otopina prve paralelke.

Preračunavanje očitanih vrijednosti na AAS

Iako su koncentracije otopina za kalibracionu krivulju iskazivane u g ml 1 , koncentracije pojednih elemenata u uzorcima su iskazivane u mg kg 1 . Preračunavanje se vršilo prema sljedećoj formuli:

m V A kg mg elem Konc ⋅ = -) ( 1

Gdje su:

A -očitana koncentracija otopine na AAS ( g ml 1 )

V -volumen tikvice (10 ili 25 ml) m -početna masa suhe materije (0.2 ili 0.5 g)

Citogenetičke metode

Biljni materijal (svježi listovi za određivanje veličine genoma i lukovice za citogenetička istraživanja) iz svih 13 istraživanih populacija je prikupljen u periodu 2007 2010 godine.

Lokaliteti, supstrati i geografske koordinate, te broj analiziranih individua su predstavljeni u Tabeli 1 i Fig. 5. Živi materijal je uzgajan u stakleniku Univerziteta Pariz Jug (Université Paris Sud, Francuska) kako bi se dobili meristemi korjenčića za hromosomske analize.

Priprema hromosoma

Za citogenetičku analizu su korišteni korjenčići dužine 1. [START_REF] Babula | Uncommon heavy metals, metalloids and their plant toxicity: a review[END_REF] 

Bojenje srebro nitratom (AgNO3)

U svrhu određivanja aktivnosti ribosomalnih gena 18S 5.8S 26S vršilo se bojenje nukleusa srebro nitratom (AgNO3). Mladi korjenčići su tokom noći držani u 2% otopini srebro nitrata, na temperaturi od 60°C (Hall i Parker, 1995). Naime, otopina srebro nitrata se vezuje za proteine prisutne u regiji nukleolarnog organizatora (i nukleolusima), što se na citogenetičkom nivou očituje tamno obojenjem u ovim hromosomskim/nuklearnim regijama. Za svaku populaciju je prebrojavano stotinu nukleusa, u kojima su se jasno mogli uočiti i prebrojati tamnije obojeni nukleolusi.

Molekularno citogenetičke metode -Fluorohrom bojenje hromosoma

Na osnovu različitih tipova fluorohrom bojenja (Chromomycin A3 bojenje, Hoechst 33258 bojenje) omogućena je vizualizacija repetitivnih ili visokorepetitivnih regija DNK, bogatih GC ili AT bazama. Nakon predtretmana i fiksacije korjenčića vršena je enzimatska hidroliza biljnih ćelija (Fig. 6), modifikacijom protokola Geber i Schweizer (1988). Poslije ispiranja u citratnom puferu 4 , korjenčići su hidrolizirani u enzimatskom rastvoru 5 , napravljenom u istom puferu, u vlažnoj komori na temperaturi od 37°C u trajanju od 10 30 minuta. Na ovaj način, ćelije oslobođene od pekto celuloznog zida (protoplasti) se prebacuju u kap 45% sirćetne kiseline na predmetnom stakalcetu.

Ovako dobivena suspenzija protoplasta se promatra pod Wild fazno kontrastnim mikroskopom (Wild M20).

Odabrani preparati su se oslobađali pokrovnice metodom brzog zamrzavanja (Conger i Fairchild, 1953) pomoću CO2 (ili na 80°C) i nakon ispiranja apsolutnim alkoholom ostavljeni da se suše na sobnoj temperaturi do konačne upotrebe.

4 0.01M citratna kiselina-natrij citrat, ph 4.69 5 4% celulaza Onozuka R10/Onozuka, Japan/, 1% pektoliaza Y23 /Seishin Pharmaceutical, Japan/ i 4% hemicelulaza /Sigma Chemical Co., Francuska/ Fig. 6. Shematski prikaz enzimatske digestije korjenčića za dobivanje protoplasta (prema Abdeddaim Boughanmi, 2010).

Chromomycin A3 bojenje

Pomoću fluorohroma chromoycin A3 (antibiotik iz grupe hromomicina, CMA; Sigma Aldrich Chemie Gmbh, Steinheim, Njemačka) se mogu identificirati regioni DNK bogati guanin i citozin bazama. Ti regioni emitiraju fluorescenciju (eksitacija na max=435nm)

nakon izlaganja svjetlosti talasne dužine max=560nm [START_REF] Sumner | Spisak biljnih vrsta (Pterydophyta i Spermatophyta) za Crvenu knjigu Bosne i Hercegovine[END_REF] Region od minimalno četiri do pet uzastopnih baznih AT parova [START_REF] Godelle | Heterochromatin study demonstrating the non linearity of fluorometry useful for calculating genomic base composition[END_REF] će se vezati za ovu boju, a jačina fluorescencije ć e zavisiti od koncentracije Hoechsta i same veličine regiona DNK (eksitacija max=356nm, a emisija na max=465nm) [START_REF] Sumner | Spisak biljnih vrsta (Pterydophyta i Spermatophyta) za Crvenu knjigu Bosne i Hercegovine[END_REF].

U predtretmanu bojenja fluorohromom Hoechst potrebno je izvršiti rehidrataciju preparata sukcesivnim dodavanjem različitih koncentracija alkohola etanola (70%, 50% , 30%, i to u svakom po pet minuta), potom ih ispirati u destiliranoj vodi, pa onda Po potrebi, nakon fluorohrom bojenja, preparati se obezbojavaju potapanjem u fiksativ (etanol sirćetna kiselina, 3:1) ili u 2xSSC. Nakon uklanjanja pokrovnice i otapanja citifluora, preparati se provlače kroz seriju otopina 70%, 90% i 100% etanola.

Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)

Ribosomalna RNA je kod eukariota kvantitativno najzastupljeniji tip ribonukleinske Prethodno obezbojeni preparati, nakon fluorohrom bojenja, su podvrgnuti predtretmanu, tj. oslobođeni od RNA i proteina, koji mogu biti smetnja uspješnoj hibridizaciji, jer neciljana vezivanja mogu pojačati neželjene signale u pozadini (Fig. 7).

Inkubacijom na temperaturi od 37°C u trajanju od jednog sata, preparati se podvrgavaju RNaznom tretmanu (100 g ml 1 ), gdje se željena koncentracija RNaze dobiva pomoću pufera 2xSSC 9 (pH 7). Nakon trostrukog (po pet minuta) ispiranja u 2SSC preparati se tretiraju 10 15 minuta, na temperaturi od 37°C pepsinom (0.1 mg ml 1 pepsina u 0.01 N HCl), koji digestira ostatak citoplazme. Ponovo slijedi ispiranje preparata, ali ovog puta ultračistom vodom (dvije minute), te dvostruko ispiranje (po pet minuta) u 2xSSC puferu.

Potapanjem preparata u seriju otopina 70%, 90% i 100% etanola (po tri minute) vrši se njihova dehidratacija. Nakon toga se preparati suše na sobnoj temperaturi najviše dva sata, i pomoću fazno kontrastnog mikroskopa se provjerava prisustvo prethodno markiranih figura.

8 Digoxigenin je steroid izolovan iz vrste Digitalis purpurea L. 9 2xSSC=0.03 M natrij citrat + 0.3M natrij hlorid u omjeru 1:1.

Uspješnost hibridizacije zavisi od:

1. baznog sastava probe i ciljanih sekvenci, kao i dužine njihovih fragmenata i Sljedeći dan se vršilo posthibridizacijsko ispiranje preparata u 2xSSC na sobnoj temperaturi, a radi uklanjanja nevezanih i slabo hibridiziranih signala. Potom je slijedila serija ispiranja preparata u trajanju od pet minuta na temperaturi od 42°C:

tri ispiranja u 2xSSC,

-dva ispiranja u 20% formamidu, -jedno ispiranje u 0.1xSSC, -tri ispiranja u 2xSSC,
jedno ispiranje u 4xSSCT 10 i jedno ispiranje u 4xSSCT na sobnoj temperaturi.

Detekcija hibridiziranih regiona, markiranih digoxigeninom, je izvršena pomoću anti digoxigenina (anti hapten antitijela). Preparati su tretirani u trajanju od pet minuta sa 5% (w/v) BSA (bovin serum albumin) rastopljenim u 4xSSCT, tj. tamponom za detekciju. Nakon toga se na preparate nanosio anti dioxigenin (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka) u istom tamponu (koncentracije 20 g ml 1 ). Narednih sat vremena, na temperaturi od 37°C, je trajala inkubacija te serija ispiranja preparata u 4xSSCT, tri puta po pet minuta na sobnoj temperaturi.

Na kraju FISH eksperimenta, preparati su uklapani u medij za uklapanje (Vectashield mounting medium, Vector Laboratories, Peterborough, UK) koji u sebi sadrži fluorohrom DAPI. Na taj način su hromosomi obojeni plavo (pozadinsko bojenje), kako bi se istakli zeleni i crveni hibridizacijski signali koji odgovaraju 18S 26S i 5S rDNK lokusima.

Analiza preparata i priprema fotodokumentacije

Preparati su nakon bojenja fluorohromima te nakon FISH a posmatrani i fotografirani pomoću epifluorescentnog Zeiss Axiophot mikroskopa, uz korištenje seta filtera (01, 07, 15 i trostruki 25) i visoko osjetljive CCD kamere (Retiga 2000R, Princeton Instruments, Evry, Francuska). Dobivene fotografije su obrađivane odgovarajućim programom za akviziciju i analizu slike (MetaVue Image analyzer, Metavue, vers.7.0r4 Evry, Francuska) te u programu Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems, Švicarska).

10 Dodavanjem 0.2% deterdženta Tween 20 u SSC nastaje SSCT.

Statistička obrada podataka

Deskriptivna statistika je obuhvatila sljedeće parametre: 2C DNK, sklonosti biljaka ka supstratu, životne forme i tipa ciklusa, koncentracije analiziranih elemenata i pH vrijednosti tala. U cilju predstavljanja varijabilnosti pojedinačnih varijabli izračunate su aritmetička sredina, standardna devijacija, koeficijent varijacije, minimum i maksimum.

Pomoću univarijantnih metoda ANOVA (analiza varijance) izvršena su testiranja srednjih vrijednosti za grupe, te je korišten Tukey test u cilju detekcije eventualnih razlika. Također, korišten je i Spearman test korelacije u cilju analize odnosa između vrijednosti veličine genoma očitanih u ovoj studiji i rezultata drugih autora. Logaritamski prikaz 1C veličine genoma (Fig. 8) ima pravilnu sigmoidnu krivu i pokazuje da je uzorak slučajan. Međutim, interesantno je primjetiti da distribucija 1C vrijednosti nije kontinuirana, jer se mogu uočiti četiri prekida u logaritamskoj krivoj:

jedan odgovara vrlo malim 1C vrijednostima, dok preostala tri odgovaraju srednjim, velikim i vrlo velikim veličinama genoma (Fig. 8). Prema 

Odnos veličine genoma i nekih karakteristika serpentinofita

U analiziranom biljnom setu, najprisutnije porodice sa vrlo malim genomima su Rosaceae (19 svojti), Fabaceae [START_REF] Baniwal | Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[END_REF], Brassicaceae [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF] i Scrophulariaceae [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF]. Porodica

Asteraceae je jedina prisutna sa 10 i više svojti u kategorijama malih [START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Novopazarskog Sandžaka. 1. Gymnospermae i Monocotyledones[END_REF] i srednjih [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF] genoma.

S obzirom na sklonost sakupljenih individua prema tipu geološke podloge, može se uočiti da je prisutno samo 24 vrsta vezanih za serpentin (Fig. 10). Najzastupljenije porodice u kategoriji vrsta vezanih za serpentin su Brassicaceae i Caryophylaceae (s tri svojte). S druge strane, najveći broj svojti su indiferentne vrste (171) i fakultativne vrste koje se mogu naći i na krečnjaku (103). U stvari, indiferentne svojte su najprisutnije u svakoj kategoriji veličine genoma.

Prema tipu životnog ciklusa, u analiziranom uzorku, čak 272 svojte (88.31%) su višegodišnje biljke. Više od polovine višegodišnjih biljaka imaju vrlo male genome (57%), a po 20% male i srednje genome (Fig. 10). Interesantno je napomenuti da je prisutno relativno malo jednogodišnjih biljaka (∼4%).

U analiziranom uzorku, hemikriptofite (149, 48.38%) su dominantna životna forma. Slijede fanerofite (17%), hamefite (15%) te terofite i geofite sa po 9% (Fig. 10). 

Narcissus poeticus i neki biogeni elementi

Vrijednosti prezentirane u Tabeli 3 predstavljaju raspon pH tala, raspone srednjih vrijednosti minimalna-maksimalna koncentracija analiziranih elemenata nakon tri ponavljanja, i odnose Ca/Mg u nadzemnim i podzemnim dijelovima biljaka i pripadajućim tlima.

Interesantno je uočiti da su srednje najmanje i najveće vrijednosti pH tla izmjerene na kraškim poljima: najmanja u populaciji 3 (pH 4.64), a najveća u populaciji 5 (pH 7.85; Tabela 3). Vrijednosti pH serpentinskih tala su u rasponu od pH 5.39 6.95. Nije uočeno postojanje korelacije između pH tla i sadržaja teških metala u analiziranim tlima.

Koncentracije mangana su bile višestruko veće u tlu nego u biljnim dijelovima (Tabela 3). Vrijednosti Mn u krečnjačkim tlima su znatno varijabilnije (44 4800 ppm), dok su ujednačenije u serpentinskim populacijama (600 2000 ppm). Nadzemni dijelovi biljaka su uvijek sadržavali veće količine Mn u odnosu na podzemne, osim u populaciji 13. U populacijama 2, 3, 7, 11 i 12 nadzemni i podzemni dijelovi analiziranih individua imali su približno slične i ujednačene vrijednosti koncentracija Mn (do 10 ppm).

Također, potrebno je napomenuti da je kod nekoliko analiziranih individua u populacijama 5 i 12 koncentracija Mn bila ispod praga osjetljivosti AAS, iako je pripadajuća rizosfera imala relativno veliku koncentraciju Mn. S druge strane, populacija 5 se, u odnosu na sve ostale, karakterisala nešto većim razlikama u koncentracijama Mn (20 40 ppm) između nadzemnih i podzemnih dijelova. 

Citogenetičke osobenosti Narcissus poeticus na zapadnom Balkanu

Na Fig. 11 dat je prikaz nekih karakteristika istraživanih populacija (veličina i gustina) i individua (morfologija, boja, veličina i broj cvjetova) bijelog narcisa. 

Osnovne karakteristike kariotipa

Organizacija heterohromatina

U osnovnom kariotipu N. poeticus pronađena su 22 24 CMA signala, u zavisnosti od njihove prisutnosti na satelitnom paru 7, distribuirana na svim hromosomima (Fig. 12 A1, B1 i D; Tabela 5). Hromosomski parovi 1 i 5 posjeduju samo jedan terminalni CMA signal na dugom kraku, dok je na paru 6 lociran samo jedan signal na kratkom kraku.

Hromosomski par 3 posjeduje samo centromerni CMA band, a hromosomski par 4 ima slabe terminalne CMA signale na oba kraka. Jak interkalarni band na dugom kraku i slab terminalni signal na kratkom kraku su uočeni na hromosomskom paru 2. Satelitni hromosomski par 7 se karakteriše sa jednim centromernim bandom i jednim slabim terminalnim signalom na dugom kraku koji nije uvijek bio vidljiv. Dodatno, ovaj hromosomski par posjeduje vrlo jake CMA signale na obje strane sekundarne konstrikcije (SC), uključujući satelit, ili samo na terminalnom dijelu kratkog kraka, bez bojenja satelita (Fig. 12 A1, B1 i D-uokvireno).

TABELA 5. Nivo ploidije; karakteristike hromosomskog para 7; broj, tip B hromosoma, broj nukleolusa, i ekološke karakteristike analiziranih populacija. Hoechst bojenje je pokazalo da je samo hromosomski par 2 posjeduje AT bogate regione: slabi centromerni i jaki interkalarni bandovi na dugom kraku, koji kolokalizira sa CMA bandom (Fig. 12 A2, B2 i D).

Interkalarni DAPI signali uočeni su nakon FISH eksperimenta na hromosomskim parovima 2 (dugi krak) i 4 (kratki krak), koji odgovaraju konstitutivnom heterohromatinu (Fig. 12 A2, B2 i D).

Sve triploidne individue imale su iste osnovne karakteristike kariotipa kao diploidi (Fig. 12 C1, C2 i D).

Fizikalno mapiranje rDNK

Ova studija po prvi put otkriva broj i položaj 18S 26S i 5S rDNK lokusa na kromosomima vrste N. poeticus. Osnovni kariotip (Fig. 12 Standardni rDNK obrazac za diploide je također prisutan i u kariotipu triploidnih individua.

Specifičan sistem B hromosoma kod N. poeticus

Jedan do tri B hromosoma je uočeno u većini istraživanih populacija (u 9/13 populacija). Sve uočene citogenetičke karakteristike analiziranih individua su bile stabilne tokom tri ili četiri godine uzgajanja u stakleniku Univerziteta Paris Sud, Francuska.

Odstupanja od standardnih karakteristika kariotipa

Neke individue sa različitim hromosomalnim translokacijama i inverzijama su uočene u tri populacije: dvije na serpentinskoj i jedna subalpinska na krečnjačkoj podlozi.

Jedan tip odstupanja kariotipa je uočen kod individue koja je imala B hromosom u populaciji 11 na serpentinskoj podlozi (Fig. 12 U odnosu na osnovni kariotip, individue sa translokacijama (populacije 12 i 2;

Fig. 12 G2, G3, H2, H3) pokazuju istovjetan obrazac DAPI bandova te 5S i 18S rDNK lokusa. Jedino se individua iz serpentinske populacije 2 karakterizirala prisustvom dodatnog terminalnog neuparenog 18S rDNK lokusa na dugom kraku hromosomskog para 3 (Fig. 12 G2, G3-uokvireno). 

Procjena veličine genoma

pH tala istraživanih populacija

Kiselost, odnosno bazičnost tla je glavni faktor u determiniranju pristupačnosti nutrijenata u tlu, jer utiče na oksidaciono stanje i rastvorljivost elementa ili biološke procese, a time i na koncentraciju nutrijenata u biljkama [START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF]. Na veoma izraženo variranje pH tla (kako unutar male površine, tako i u zavisnosti od dubine soluma) utiče niz faktora: geološka podloga, klima, živi organizmi, topografija i geološko vrijeme [START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF][START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF]. 

U

Organizacija rDNK i heterohromatina na B hromosomima

Iako nisu neophodni za preživljavanje, B hromosomi su prisutni kod 10 15%

angiospermi [START_REF] Jones | Tansley review no. 85: B chromosomes in plants[END_REF] 

Devijantni oblici kariotipa

Spontane hromosomske translokacije su već uočene kod nekih vrsta roda Narcissus [START_REF] Fernandes | Sur le rôle probable des heterochromatinosomes dans l'évolution des nombres chromosomiques[END_REF][START_REF] Karihaloo | Variation in the karyotype of three cultivars of Narcissus tazetta L. (Amaryllidaceae)[END_REF] Dans les Balkans les serpentines se présentent en grands blocs ou de petits affleurements allant de Centre Nord de la Bosnie, vers Ouest et Centre de la Serbie, Centre Nord et Sud Est de l Albanie, Nord de la Grèce. La péninsule balkanique, la plus grande zone européenne de serpentine, abrite 334 à 350 espèces (15 16% du total des taxons endémiques) qui sont endémiques de la serpentine. Le nombre de taxons endémiques sur serpentine dans les Balkans augmente progressivement du Nord de la Bosnie, à travers Ouest et Centre de la Serbie, puis vers la partie centrale de la péninsule (SW Serbie, l Albanie et N & NW Grèce).

Quoique la flore des Balkans soit bien étudiée du point de vue floristique, phytogéographique et taxinomique, divers aspects sont encore mal connus. Par exemple, la taille du génome (la quantité d'ADN nucléaire), caractère important dans l évaluation de la biodiversité, n'est pas, jusqu à présent, étudiée chez les espèces végétales qui poussant sur serpentine. Pour cette raison, dans cette étude, nous avons évalué la teneur en ADN chez les espèces végétales serpentinophytes en Bosnie Herzégovine centrale et orientale, en Serbie occidentale et en Ancienne République Yougoslave de Macédoine (ARY Macédoine). Ainsi, cette étude apporte pour la première fois des données sur la taille du génome des serpentinophytes, leur nombre chromosomique et le niveau de ploïdie en relation avec leur affinité avec le substrat, le type de cycle de vie et la forme de croissance.

Les objectifs principaux de la première partie de la thèse ont été de déterminer la taille du génome, le nombre chromosomique et le niveau de ploïdie d un grand nombre de serpentinophytes strictes et facultatives sur serpentine en Bosnie Herzégovine centrale et orientale avec un accent particulier sur l établissement de la relation entre la taille du génome et les conditions de stress subies par les plantes sur ce substrat. Dans ce contexte, une des principales questions posées est : Existe il une catégorie de taille du génome qui serait plus favorisée dans de tels habitats?

La deuxième partie de la thèse porte sur l'analyse des métaux lourds et des macronutriments dans les sols et sur la propriété de bioaccumulation de l espèce Narcissus poeticus dans les populations poussant sur différents types de substrats dont la serpentine et le calcaire. Ces analyses comportent la mesure des concentrations en métaux lourds (Ni, Co, Mn, Fe) et en macronutriments Mg et Ca dans les diverses parties de la plante et l observation d éventuelles modifications chez le N. poeticus causée par l influence des métaux lourds contenus dans les sols de serpentine.

La troisième partie concerne l'étude cytogénétique, à savoir la structure des chromosomes du N. poeticus dans différentes populations de la partie occidentale de la péninsule des Balkans. La question posée dans cette partie est la suivante : Quelle est la réponse du génome aux conditions de stress abiotique ? Ainsi tous les changements dans l'organisation du génome concernant l ADN total, le nombre chromosomique, la présence de chromosomes B et des translocations chromosomiques recensés ont été étudiés.

La taille du génome chez les serpentinophytes dans la partie extrême nord ouest de la zone de serpentine dans les Balkans

Le contenu de l'ADN (valeur 2C) a été estimé par cytométrie en flux et le nombre chromosomique par des méthodes standard. Le statut systématique, la préférence au substrat géologique, le type du cycle de vie et la forme de croissance de chaque taxon ont été déterminés selon les données bibliographiques disponibles.

Dans cette étude nous avons présenté des données sur la taille du génome de 308 taxons appartenant à 213 genres, récoltés sur substrat de serpentine. Selon les bases de données disponibles, nous avons obtenu les premiers résultats sur la taille du génome de 28 genres (2 appartenant aux Ptéridophytes, 3 aux monocotylédones et 23 aux eudicots), et 97 espèces et deux taxons au niveau intraspécifique. La taille du génome haploïde des espèces étudiées varient de 0,14 pg (Selaginella helvetica) à 41,59 pg (Lilium martagon), se qui fait un rapport de ∼300 fois.

Selon l échelle proposée pour la taille du génome par Leitch et coll. (1998), plus de la moitié des taxons estimée (55,63%) ont un très petit génome, 22,18% ont de petit génome et 18,75% un génome intermédiaire. Les taxons avec de grandes et très grandes tailles de génome sont principalement des gymnospermes et des monocotylédones, et représentent un faible pourcentage (respectivement 3,13% et 0,31%).

Plus des 2/3 de taxons analysés présentent un génome de petite ou très petite taille (1C <3,5 pg), ce qui est en accord avec les résultats précédemment rapportés et avec l'opinion selon laquelle les espèces dont les génomes sont petits sont répandues dans tous les environnements, tandis que les espèces à grands génomes sont plus sensibles aux conditions environnementales extrêmes. Environ 90% des espèces à courte duré de vie, au sein de notre échantillonnage, possèdent de petits et très petits génomes, ce qui correspond au fait que le temps minimum de génération et le type de cycle de vie sont des caractéristiques limitées par la taille du génome. Comme on pouvait s'y attendre, dans notre échantillon, les espèces dont les génomes sont grands ou très grands (1C> 14 pg), appartiennent aux géophytes monocotylédones et aux phanérophytes gymnospermes. Les taxons à grand génome sont représentés par 11 espèces (3,44%), toutes vivaces et serpentinophytes facultatives. Dans cette catégorie, toutes les espèces herbacées complètent leur cycle de vie au début du printemps, à l exception de l'octoploïd du Leucanthemum vulgare. Ces résultats appuient l hypothèse de Knight concernant la contrainte du grand génome [START_REF] Knight | Variation in nuclear DNA content across environmental gradients: a quantile regression analysis[END_REF], sur lequel le stress hydrique, la température élevée et la présence de métaux lourds exercent extrême pression sélective qui a plutôt favorisé les plantes avec de petits génomes.

Une forte corrélation positive (r = 0,96, p <0,05) a été observée entre nos résultats et les 331 données concernant les 209 taxons déjà publiées et dont certaines ont été mesurées plus qu'une fois. La comparaison par paire entre nos résultats et ceux précédemment publiés montre des différences dans presque la moitié des valeurs obtenues. Ces différences allant de 0 à 5% ont été enregistrées pour 140 valeurs, 5 10% pour 48 valeurs et supérieures à 10% pour 143 valeurs.

La variation de la taille du génome pour une espèce donnée est considérée comme acceptable jusqu'à 5%. Elle est la conséquence des différences méthodologiques et de l'utilisation des différents instruments de mesure. Dans les cas où cette différence était plus importante, elle a été due à la présence de différents niveaux de ploïdie, éventuellement à la présence d aneuploïdie et de B chromosomes. D autre part, les différences observées dans la fourchette de 5 à 10% ne peuvent pas être toutes expliquées par les phénomènes déjà mentionnés. Très probablement, la plupart de ces différences est le résultat de différentes approches et méthodes dans la détermination de la taille du génome. Plus précisément, ces différences peuvent provenir de l utilisation de différents standards, de la méthode de préparation des échantillons, de la composition du tampon et du type de matériel végétal (feuilles fraîches, lyophilisées, séchées dans silica gel, ou provenant d'herbier, etc.). Des facteurs incontournables sont aussi la possibilité d erreur humaine dans la détermination des espèces, dans la manipulation, ainsi que dans la lecture des pics.

Dans plusieurs taxons la présence de polyploïdie et des chromosomes B a conduit à des variations significatives de la taille du génome au niveau intraspécifique. Dans cette étude, 10 taxons avec au moins deux niveaux de ploïdie différents ont été détectés: Centaurea micranthos, Convolvolus arvensis, Coronilla varia, Daphne mezereum, Helianthemum nummularium, Leucanthemum vulgare, Narcissus poeticus, Solidago virgaurea, Tanacetum corymbosum, et Veronica urticifolia. La découverte des individus avec des niveaux de ploïdie différents dans la même population a confirmé la bonne pratique d estimation de la taille du génome sur au moins cinq ou plus d individus de la même localité. En fait, la cytométrie en flux facilite l'estimation rapide de la taille du génome et favorise la détection de tous les événements de polyploïdie au niveau intra et inter populations.

Grâce à la cytométrie en flux, il est également possible de détecter les individus avec un ou plusieurs chromosomes B, en particulier chez les espèces avec des grands et très grands chromosomes, comme dans le cas de Lilium bosniacum, L. martagon, et Narcissus poeticus. L identification des chromosomes B par cytométrie en flux chez les espèces dont les génomes sont très petits ou petits n a pas été convaincante, comme nous l avons montré pour le taxon Stachys recta var chrysophea.

Dans l ensemble des plantes analysées, le très petit génome a été la catégorie la plus fréquente dans les familles suivantes: Rosaceae (19 taxons), Fabaceae [START_REF] Beck | Flora Bosnae et Hercegovinae, IV sympetalae, pars 1[END_REF], des Lamiacées [START_REF] Baniwal | Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[END_REF], Brassicacées [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF], et Scrophulariaceae [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF]. Seule la famille des Asteraceae était représentée par 10 ou plus de taxons appartenant aux catégories de petits génomes et de génomes à taille intermédiaires. En ce qui concerne l affinité avec le substrat, un très petit nombre de serpentinophytes obligatoires (24 au total) a été enregistré. Leur taille du génome varie de 0,50 à 5,07 pg, mais la plupart ont de très petits génomes. L abondance des serpentinophytes obligatoires endémiques dans des habitats sur serpentine pourrait être expliquée par l isolement édaphique à long terme, sans interruption ou perturbation de la spéciation. Il est intéressant de noter que la majorité des serpentinophytes obligatoires possèdent une très petite taille du génome, ce qui est en accord avec l hypothèse de Knight.

Le plus grand nombre de taxons, distribué dans toutes les catégories de taille du génome, appartiennent aux groupes des espèces indifférentes (55%) et à des serpentinophytes facultatives (33%). Selon le type de cycle de vie, même 272 taxons (88,31%) sont vivaces. Plus de la moitié d entre eux, soit 57%, possèdent un très petit génome tandis que 20% ont de petit génome et de génomes intermédiaires. Les autres types de cycle de vie sont représentés par moins de 2,5% dans chaque catégorie de taille du génome. L'absence ou le faible nombre de plantes annuelles observées peut être expliquée par l'incompatibilité entre le court cycle de vie et la nature extrêmement xérophile des habitats sur serpentine, ce qui peut empêcher les plantes de terminer leur développement.

Indépendamment de la catégorie de taille du génome au sein de notre échantillonnage, les Hémicryptophytes sont dominants (48,38%), suivis par les phanérophytes (17%), les chaméphytes (15%), les thérophytes (9%) et les géophytes (9%). La dominance des Hémicryptophytes est probablement le reflet de l interaction entre des conditions de grande sécheresse et de haute température sur les habitats de serpentine. Par conséquent, il est probable que l eau, la température et les métaux lourds soient les acteurs principaux exerçant une haute pression sélective sur la flore de serpentine et favorisant les espèces pérennes dont les génomes sont de très petite taille.

Narcissus poeticus, serpentinophyte facultative, et certains éléments biogènes (Ni, Co, Mn, Fe, Ca et Mg)

Le Narcisse du poète (Narcissus poeticus L., Amaryllidaceae) est originaire d Europe centrale et de la région méditerranéenne de l Europe et de l Afrique du Nord, seulement une espèce est en Asie, avec un centre de diversité dans la péninsule ibérique. En Bosnie Herzégovine, le N. poeticus forme de très grandes populations avec de nombreux individus surtout dans les champs karstiques. Cette espèce se trouve aussi dans de petites populations à faible nombre d individus dispersés dans des crevasses rocheuses, dans des prairies de la zone montagnarde et subalpine sur calcaire, et sur substrat de serpentine (comme des serpentinophytes facultatives), à des altitudes de 700 à 1750m. Cette espèce a besoin de sols humides bien drainés, basiques ou légèrement acides, en plein soleil ou à mi ombre. Elle fleurit de la fin avril à juin et possède un parfum caractéristique et fort. Malgré son importance dans le développement de variétés cultivées, un nombre relativement restreint d études a été réalisé sur des populations naturelles.

Les espèces qui sont tolérantes au stress nutritif multiple sur les sols de serpentine ont une croissance faible, la tolérance manifeste à faible accessibilité de N, P, K, et Ca, ainsi que la tolérance à la toxicité de Mg et des métaux lourds.

C est la première fois, et sans doute l'unique étude de population naturelles concernant la relation du narcisse du poète avec le sol contenant certains métaux lourds. Cinq individus de narcisse avec leur rhizosphère associée (le sol autour des bulbes et des racines) ont été échantillonnés dans 11 populations de Bosnie Herzégovine, de Croatie et de Serbie. La quantité totale de Ni, Co, Mn, Fe, Mg et Ca dans des échantillons du sol et dans le matériel végétal a été analysée par spectrophotométrie d absorption atomique (AAS). Les valeurs du pH du sol ont été déterminées par le pH mètre dans une solution saturée de boue = sol / eau déminéralisée.

L acidité ou l alcalinité du sol est un facteur majeur dans la détermination de l accessibilité des nutriments du sol, car elle affecte l état d oxydation et la solubilité des éléments, les processus biologiques, et donc la concentration en nutriments dans les plantes. Sur la base des résultats obtenus par l analyse des populations naturelles de Narcissus poeticus dans les Balkans, il est possible de dire que cette espèce supporte des changements relativement importants de pH du sol, mais qu'elle évite le sol basique. Plus précisément, on a observé que le narcisse du poète montre une gamme relativement large des valeurs de pH de sa rhizosphère (pH 4,64 narcisse du poète à 7,85), ce qui est probablement l une des raisons de sa réussite en culture pendant plusieurs siècles. Les rhizosphères des individus sur serpentine ont une réaction légèrement acide ou à pH neutre, ceci probablement causé par un excédent de magnésium. D autre part, le pH de la rhizosphère dans les populations sur calcaire a une plus large gamme, sans toutefois une régularité dans la distribution, à la fois au sein et entre les populations. Il n'existe pas de corrélations entre le pH du sol et la teneur en métaux lourds dans les sols analysés.

Le manganèse est principalement stocké dans les parties aériennes, et non dans le système racinaire, qui dépendent principalement du pH du sol et de la concentration en matière organique dans le sol. Au cours de cette étude les concentrations en Mn mesurées ont été plusieurs fois plus élevées dans le sol que dans les parties de la plante. Les valeurs de Mn dans les sols calcaires ont été plus variables que dans les sols sur serpentine. Les parties aériennes des plantes avaient presque toujours de plus grandes quantités de Mn que les parties souterraines, sauf pour les individus d'une population sur serpentine (Mokra Gora, Serbie), ce qui est probablement la conséquence des rapports spécifiques des ions dans des sols plus profonds et plus humides dans cet habitat. Il est intéressant de noter que les individus dans une population sur serpentine (Zepce, B & H) contenaient une faible valeur de Mn, mais des symptômes de carence n ont pas pu être observés. On peut dire que tous les individus analysés avaient un régime relativement satisfaisant en Mn.

Le nickel s accumule dans les végétaux, en fonction de sa disponibilité dans le sol, de l'espèce, des différentes parties de la plante, et de la saison. Les concentrations de nickel dans les sols sur serpentine ont été beaucoup plus élevées que dans les sols calcaires. Dans la plupart des individus analysés, les concentrations de Ni dans les parties souterraines ont été inférieures à celles des parties aériennes, avec, comme attendu des valeurs plus élevées pour les individus issus des populations sur serpentine. Puisque le nickel est principalement accumulé dans les cellules de l épiderme, les résultats des concentrations plus élevées dans les parties aériennes ne sont pas surprenants. Toutefois, pour un certain nombre d individus analysés dans de deux populations sur serpentine (Zepce, B &H; Mokra Gora, Serbie) on a enregistré dans les pousses souterraines des concentrations élevées de nickel, ce qui ne pouvait pas être corrélé avec d autres facteurs testés dans cette étude. Bien que la quantité totale de nickel dans les tissus des individus étudiés dans les populations sur serpentine soit extrêmement élevé par rapport à la concentration de Ni généralement exprimée dans les autres populations, narcisse du poète ne peut pas être considéré comme son hyperaccumulateur.

Le cobalt est distribué dans l organisme végétal selon les espèces. Dans des concentrations très élevées il peut provoquer des anomalies chez les plantes. Dans cette étude, les concentrations de cobalt dans les sols sur serpentine ont été significativement plus élevées que dans les sols calcaires. La caractéristique des individus poussant sur le substrat de serpentine se traduit par une plus faible concentration en Co que celle de Ni, ce qui n est pas toujours le cas chez les individus provenant de substrat calcaire. Les plantes analysées ont montré une concentration en Co relativement faible et uniforme dans toutes les parties de plante. Très probablement, les différents organes du narcisse du poète ont des exigences similaires en Co, de sorte que sa concentration dans le sol n affecte pas significativement son entrée, sa translocation et son accumulation dans les plantes.

Le fer est accumulé principalement dans les organes actifs du point de vue photosynthétique, bien qu il soit noté que certaines serpentinophytes le déposent également dans les racines. Bien que le fer soit présent en grandes quantités dans le sol, sa disponibilité est généralement très faible, ce qui provoque souvent une carence. Les concentrations en fer dans les sols sur serpentine sont plus élevées que sur le calcaire, ce qui n est pas toujours le cas dans les tissus végétaux. Les concentrations en fer ont été en général plus élevées dans les bulbes que dans les parties aériennes (sauf dans les populations Peulje et Kladanj, B & H), mais toujours beaucoup moins élevées que les concentrations dans le sol. Si la plupart des plantes accumulent le fer dans les feuilles, le narcisse du poète le dépose essentiellement dans les organes souterrains. Un autre résultat intéressant est la concentration relativement élevée du Fe dans la plante complète, pour la majorité des individus étudiés. Ces résultats suggèrent que les rhizosphères analysées, en raison de valeurs inférieures de pH, ont été relativement riches en forme de fer accessible pour les plantes.

La translocation du magnésium est facile dans les plantes et sa concentration varie dans les différentes parties de la plante en fonction de l âge de l individu et des nutriments accessibles dans le sol. Les sols analysés sur serpentine sont caractérisés par une valeur de magnésium presque deux fois plus grande que sur sol calcaire. Les concentrations de Mg dans les feuilles des individus étudiés sont presque identiques, quel que soit le substrat géologique, ce qui indique la régularité du processus de la photosynthèse. Les individus sur sols calcaire avaient des concentrations de Mg dans les parties aériennes presque deux fois plus importantes que dans les organes souterrains. D autre part, des concentrations légèrement supérieures de Mg chez les individus sur serpentine, à celles des individus sur calcaire (en particulier dans les organes souterrains), indiquent leur capacité à s adapter et à survivre dans des conditions plus stressantes. C est justement cette capacité que possède le Narcissus poeticus à répondre aux conditions de déficit hydrique par l apport accru de magnésium et son accumulation dans les parties souterraines, afin de protéger l appareil photosynthétique, qui probablement lui donne la possibilité de survivre dans un habitat aussi hostile que celui sur serpentine.

Le calcium est toujours présent dans des concentrations plus élevées dans la tige et les feuilles des plantes que dans le sol, bien que les espèces endémiques serpentinophytes soient mieux adaptées à de faibles concentrations en Ca. La rhizosphère des individus provenant des populations sur serpentine avaient généralement des concentrations plus élevées de calcium que les individus des populations en calcaire. Cependant, presque tous les individus analysés, indépendamment du substrat géologique, ont accumulé plus de Ca dans les organes souterrains. Afin de déterminer les raisons qui ont conduit à une telle distribution du calcium il est nécessaire d effectuer des recherches supplémentaires, étant donné que cette propriété peut être une caractéristique du narcisse du poète, ou une conséquence des relations antagonistes du calcium avec d autres cations, et de sa faible mobilité. Comme prévu, les individus sur serpentine avaient bien moins du calcium accumulé que les individus provenant des populations sur calcaire. En outre, les concentrations de Ca dans les feuilles ont presque toujours été inférieures à celles des organes souterrains, ce qui est probablement dû à la présence de magnésium en concentrations très élevées, tant dans le sol que dans les tissus.

Le rapport molaire Ca / Mg dans les feuilles est considéré comme la plus grande spécificité de paires congénères de serpentine par rapport au nonserpentine. Fondamentalement, les espèces sur serpentine ont un rapport molaire de Ca / Mg de les feuilles inférieur à celui de leur paires congénères nonserpentine, mais supérieur à leur sol correspondant. On considère que la croissance normale de la plupart des plantes nécessite un rapport Ca/Mg>1. Cependant, les plantes sur serpentine se sont adaptées aux niveaux bas de Ca et au faible rapport de Ca / Mg dans leurs substrats. Dans tous les sols étudiés, le magnésium a été en excès par rapport au Ca, alors que dans les sols calcaires, l'intervalle de variation du rapport Ca / Mg a été plus élevée que dans les sols sur serpentine. Les plantes des populations sur serpentine ont, dans la plupart des cas, contenus des niveaux plus élevés de Mg que de Ca, et le rapport Ca / Mg dans les tissus végétaux a été <1, et beaucoup plus variable que dans le sol. Le narcisse du poète se caractérise par un rapport molaire Ca / Mg plus grand dans les parties souterraines qu'aériennes. Ceci peut être corrélé avec la forme de vie (géophyte) et le besoin de protéger davantage le tissu du bulbe dont les parois cellulaires sont plus épaisses et plus rigides. Plus précisément, cette espèce a une dormance en été caractéristique, au cours de laquelle se déroule le processus de la méiose, qui suit immédiatement une exposition de la plante à de très hautes températures et forte sécheresse pendant l été.

Sur la base des résultats obtenus, nous pouvons conclure que l espèce Narcissus poeticus, bien que généralement accumule de grandes quantités de métaux (Mn, Ni, Co, Fe), n'est pas leur hyperaccumulateur. En outre, cette espèce possède des mécanismes physiologiques qui lui permettent de s adapter et de survivre dans différentes conditions stressantes, en particulier à l exposition au déficit hydrique et aux températures élevées.

Caractères cytogénétiques et un système particulier des chromosomes B chez N. poeticus dans différents conditions environnementales dans les Dinarides

Cette partie de la thèse concerne la variabilité de la structure chromosomique, polyploïdie, présence de chromosomes B (Bs) et taille du génome dans des populations naturelles de Narcissus poeticus dans les Balkans occidentaux. Les individus de treize populations se trouvant dans des conditions environnementales et sur des sols différents ont été analysés à l aide de la cytométrie en flux pour l estimation de la taille du génome nucléaire, de l hybridation fluorescente in situ (FISH) pour la cartographie physique des gènes ribosomiques, de fluorochrome banding (chromomycine et Hoechst) pour l organisation de l hétérochromatine et de coloration au nitrate d argent pour l'activité des gènes ribosomiques.

Des études antérieures ont montré que N. poeticus et N. radiiflorus représentent une seule espèce avec quelques différences morphologiques. Nos résultats confirment également que N. poeticus représente une espèce polymorphe au niveau morphologique et cytogénétique.

Caryotype de Narcissus poeticus

Dans toutes les populations étudiées, N. poeticus présente un nombre chromosomique diploïde 2n = 2x = 14, sauf dans deux populations où il existe aussi quelques individus triploïdes, 2n = 3x = 21. Tous les individus triploïdes ont le même caryotype standard que les diploïdes. Des variations interindividuelles ont été observées dans les deux niveaux de ploïdie et concernent la présence de chromosomes B en nombre et en morphologie variable.

Le caryotype standard de N. poeticus décrite dans ce travail correspond aux données précédemment publiées. La formule chromosomique commune de N. poeticus est 2n = 8 sm + 2 m + 2 m sm + 2 sm st sat . Les chromosomes B sont principalement de type submétacentrique, mais ils peuvent être aussi métacentriques ou subtélocentriques.

Le caryotype standard de N. poeticus possède 22 24 bandes chromomycine positives, selon sa présence ou non d'une bande sur les satellites de la paire 7, réparties sur tous les chromosomes. La coloration de Hoechst a montré qu une seule paire de chromosomes (paire 2) possédait des régions AT riches. Après l'application de la technique de FISH, les signaux intercalaires DAPI + , correspondant à des régions d hétérochromatine constitutive, ont été observés seulement sur deux paires de chromosomes (2 et 4).

Les résultats concernant l'hybridation in situ des gènes ribosomiques chez N. poeticus sont présentés pour la première fois dans cette étude. Le caryotype standard montre un locus d ADNr 5S (colocalisé avec la bande DAPI + sur la paire 4), tandis que le locus d ADNr 18S 5.8S 26S a été visible comme un très fort signal sur la partie terminale du bras court ou sur les deux côtés de la constriction secondaire (CS) de la paire satellifère 7. Ces résultats montrent la constance du caryotype et de l'organisation de l'hétérochromatine et de l'ADNr au niveau spécifique, malgré l'éloignement géographique des populations et des différents types d habitats dans lesquels elles se développent.

La polyploïdie, comme un des mécanismes majeurs de l adaptation et de la spéciation chez les plantes, est présente dans 47 à 70% des angiospermes. Les polyploïdes nouvellement apparus possèdent souvent de nouvelles caractéristiques physiologiques, écologiques ou phénologiques, et peuvent représenter un moyen rapide d adaptation et de spéciation.

Le genre Narcissus est caractérisé par une polyploïdisation sporadique, avec une plus grande fréquence des tétraploïdes. La polyploïdie est fréquente dans la création de variétés de jardin, où les triploïdes sont formés en premier, puis les tétraploïdes. La présence de triploïdes avec une origine incertaine a été remarquée chez plusieurs espèces de Narcisses. Jusqu'à présent, des populations sauvages triploïdes ne sont pas connues, bien qu'elles aient été décrites en Grèce et en Suisse. Il a été supposé que ces triploïdes se seraient échappés d'une culture ou bien auraient été sélectionnés à partir d'une population naturelle pour leur vigueur.

Dans cette étude, l'apparition spontanée de triploïdes chez N. poeticus dans certaines populations des Balkans a été observée pour la première fois. Morphologiquement, il était impossible de distinguer ces individus triploïdes. Ils possèdent trois garnitures chromosomiques identiques, ce qui suggère leur origine autotriploïde. Il est intéressant de noter que ces triploïdes: 1) existent dans deux habitats écologiquement presque totalement contrastés (populations sur serpentine et sur calcaire), et 2) possèdent 0 3 chromosomes B, avec des types variables dans la population karstique. Des conditions environnementales défavorables affectent à la fois la présence et la dynamique évolutive des polyploïdes. Il est très difficile de déterminer quels sont les facteurs environnementaux qui ont une action stressante sur les plantes, bien que des nombreux et rapides changements de la température dans des environnements humides soient le plus souvent suggérés. Etant donné que la présence de plus grand nombre de triploïdes a été observée dans la population karstique, on peut supposer que dans cette population la production de diplo pollen (fréquemment observé, mais données non présentées) serait l une des conséquences particulières aux conditions écologiques extrêmes. D'autres recherches sont nécessaires dans ces populations afin d estimer la fréquence des individus triploïdes spontanés dans différentes conditions environnementales.

Chromosome B

Même s'ils ne sont pas nécessaires à la survie des individus, des chromosomes B sont présents dans 10 15% des angiospermes. Chromosome B est un système dynamique et sa fréquence dépend de deux forces opposées: l accumulation et leur effets sur le « fitness » des individus. Dans les populations naturelles les individus ne possèdent pas plus de trois à quatre chromosomes B, sauf pour Allium schoenoprasum ou il a été signalé 20 chromosomes B.

La présence de chromosomes B dans le genre Narcissus a été rapportée chez plusieurs espèces. Le nombre de chromosomes B, principalement dans les variétés de narcisses horticoles, varie généralement de un à cinq maximum. Toutes les descriptions des chromosomes B dans ce genre indiquent que sa taille correspond environ aux deux tiers de celle du chromosome satellifère, avec un centromère subterminale, morphologiquement très similaires ou variables, hétérochromatiques ou pas. La bibliographie mentionne seulement quelques remarques sur la présence de chromosomes B chez N. poeticus.

Un à trois chromosomes B ont été observés dans la majorité des populations étudiées (dans 9 sur 13 populations). La présence de polymorphisme structural de ces chromosomes (trois types) a été observée dans les populations avec plus grande fréquence des chromosomes B. Tous les types de chromosomes B sont similaires en taille, environ 2/3 de la taille de la plus petite paire de chromosomes. L origine du polymorphisme structural des Bs peut être expliquée par misdivision du centromère pendant la méiose. Les chromosomes B de types II et III peuvent être des produits éphémères des différents événements de macromutations du type I. En effet, le type standard de Bs est bien conservé et répandu dans toutes les populations étudiées. Le plus grand polymorphisme des chromosomes B a été observé dans la population karstique qui est caractérisée par les conditions environnementales les plus stressantes, notamment par la combinaison des régimes hydriques et thermiques extrêmes (un été très sec et l'inondation le reste de l année).

Le type le plus fréquent de Bs (submétacentrique), possède quatre patterns différents dans l'organisation de l'hétérochromatine et des gènes ribosomiques. La coloration au nitrate d'argent a montré que le nombre de nucléoles formés augmente en présence des chromosomes B portant des gènes ribosomiques, dont l'activité est ainsi prouvée.

Taille du génome chez Narcissus poeticus Jusqu à aujourd hui, le contenu en ADN nucléaire a été estimé pour 36 espèces du genre Narcissus. Selon les données disponibles, la taille du génome de N. poeticus varie de 24,33 à 27,50 pg pour les individus diploïdes, de 34,55 pg à 38,70 pg pour les triploïdes, et 52,70 pg pour le cultivar tétraploïde.

Dans les populations de N. poeticus des Balkans, on a constaté une variation intraspécifique de la quantité d ADN selon les individus avec ou sans chromosomes B, ce qui confirme l'opinion que ces chromosomes accessoires constituent une source majeure de variation intraspécifique dans la quantité d ADN nucléaire. Ainsi la taille du génome des diploïdes sans chromosomes B variait de 23,97 à 25,84 pg, pour les diploïdes avec des Bs de 24,31 à 26,86 pg, pour les triploïdes sans Bs de 34,51 à 35,32 pg, et pour l individu triploïde avec 3 chromosomes B, 38,80 pg. Chaque chromosome B porte environ 0,6 pg d ADN, et représente près de 5% de la valeur C du génome standard.

Les résultats obtenus dans ce travail démontrent que Narcissus poeticus possède un génome dynamique de taille variable en raison de la polyploïdie, de la présence de B chromosomes et des réarrangements chromosomiques. Il est fort probable que ces modifications du génome soient le reflet de la réponse du génome à différentes conditions environnementales, où les individus portant les chromosomes B pourraient avoir certains avantages sélectifs.

Pour toutes ces raisons, le N. poeticus pourrait être un modèle naturel approprié pour étudier l organisation du génome dans différentes conditions environnementales.

Conclusions

Cette étude est la première qui se rapporte à l étude de la taille du génome d espèces provenant de zones de serpentine et, aussi, un complément de la collecte de données pour la base sur la taille du génome des espèces de la flore des Balkans.

A partir des résultats obtenus dans ce travail les conclusions suivantes ont pu être formulées :

1. La taille du génome a été déterminée pour 308 espèces appartenant aux 213 genres en Bosnie Herzégovine, dans l ouest de la Serbie et de l ARY Macédoine. Les données sont nouvelles pour 28 genres (2 genres de Ptéridophytes, trois de monocotylédones et 23 eudicotiledones), soit 97 espèces et 2 sous espèces. Plus de la moitié des taxons étudiés (55,63%) possède un très petit génome, 22,19% un petit, 18,75% moyenne, 3,13% grand, et seulement 0,31% un très grand génome haploïde.

2. Dix taxons avec différents niveaux de ploïdie ont été détectés: Centaurea micranthos, Convolvolus arvensis, Coronilla varia, Daphne mezereum, Helianthemum nummularium, Leucanthemum vulgare, Narcissus poeticus, Solidago virgaurea, Tanacetum corymbosum, et Veronica urticifolia.

3. Chez certaines espèces dont les génomes sont grands et très grands, il a été observé une augmentation de 1C valeurs de l ADN dans des individus qui possédaient des chromosomes B (Lilium bosniacum, L. martagon et Narcissus poeticus). La présence des chromosomes B, observée par les méthodes de cytogénétique classique chez Stachys recta var. chrysophea qui possède un très petit génome, n était pas possible en utilisant la cytométrie en flux.

4. Un échantillonnage plus important dans l'estimation de la quantité d ADN (nombre de populations et d'individus par population) permet la détection de la variabilité au niveau interspécifique. Ainsi dans le cas de l'espèce Leucanthemum vulgare sur substrat de serpentine en Bosnie, il a été noté la présence de trois niveaux de ploïdie (2x, 4x et 6x) et une population où les diploïdes et les tétraploïdes sont en sympatrie.

5. Dans l ensemble des plantes analysées, les familles représentées par le plus grand nombre de taxons à très petits génomes sont : les Rosacées (avec 19 taxons), les Fabaceae [START_REF] Baniwal | Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors[END_REF], les Brassicacées [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF] et les Scrophulariaceae [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF]. La famille des Asteraceae est la seule à présenter plus de 10 taxons dans les catégories des petits [START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Novopazarskog Sandžaka. 1. Gymnospermae i Monocotyledones[END_REF] et des moyens [START_REF]The Vegetation of Ultramafic (Serpentine) Soils[END_REF] génomes.

6. Par rapport à la préférence au substrat géologique, la plupart des espèces sont indifférentes (171), ou facultatives (103) lesquelles, à part sur le serpentine peuvent, peuvent se rencontrer sur le calcaire, mais plus rarement. Dans le présent échantillon, seulement 11 serpentinophytes obligatoires strictes et 13 espèces obligatoires ont été, en plus de serpentine, très rarement trouvées sur substrat de calcaire. 7. Selon le type de cycle de vie, 272 taxons (88,31%) sont pérennes. Plus de la moitié des plantes vivaces (57%) ont de très petits génomes, 20% de petits et 20% de moyens génomes. Il a été noté relativement peu (∼ 4%) de plantes annuelles. Les Hémicryptophytes représentent une forme de vie dominante avec 48.38%, tandis que les Phanérophytes sont à 17%, les Chaméphytes 15%, les Thérophyte 9% et les Géophytes 9%.

8. Le stress hydrique, la température élevée et la présence de métaux lourds dans les habitats sur serpentine, exercent une forte pression sélective favorisant les espèces pérennes à petits génomes. 9. C est la première étude sur l interaction entre le narcisse du poète et les sols dans des populations naturelles, avec une référence spéciale à certains métaux lourds (Mn, Ni, Co, Fe). Narcissus poeticus tolère le changement du pH du sol dans la gamme de 4.64 à 7.85, ce qui est probablement l une des raisons de sa culture réussie pendant des siècles. 10. Par comparaison aux sols calcaires, les sols analysés sur la serpentine sont beaucoup plus riches en quantité totale de nickel, de cobalt et de magnésium, tandis que les concentrations de manganèse, de fer et de calcium sont assez uniformes. Les concentrations de manganèse, de nickel et de magnésium ont été généralement plus élevées dans les parties aériennes du narcisse du poète, contrairement au fer et au calcium. Des valeurs cohérentes et similaires concernant le cobalt ont été mesurées dans toutes les parties des plantes. Bien que généralement accumule de grandes quantités des métaux analysés (Mn, Ni, Co, Fe), le narcisse du poète n'est pas un hyperaccumulateur.

11. Le rapport molaire Ca / Mg dans les différentes parties des individus du narcisse du poète est conforme aux valeurs attendues: > 1 dans les populations calcaires et <1 dans les populations sur serpentine. La particularité du narcisse du poète se reflète dans le fait que son rapport molaire Ca / Mg dans sa partie souterraine est plus grand que dans la partie aérienne, ce qui peux être corrélé avec sa forme de vie (géophyte) et sa dormance pendant l'été.

12. La répartition naturelle du narcisse du poète est probablement surtout influencée par la combinaison spécifique des régimes thermique et hydrique, et de manière secondaire par la concentration des éléments nutritifs dans le sol.

13. Il n existe pas de corrélation entre les caractéristiques morphologiques et cytogénétiques des individus analysés du narcisse du poète. On observe les mêmes caractéristiques du caryotype standard et la même organisation de l'hétérochromatine chez Narcissus poeticus au niveau spécifique, indépendamment de la distance géographique entre les populations et les différents types d habitats dans lesquels il se trouve.

14. La variation de la quantité d ADN nucléaire chez le Narcissus poeticus est causée par la présence de la polyploïdie (des individus triploïdes ont été observés dans deux populations) et de chromosomes B (dans 9 sur 13 populations). C'est la première confirmation de la présence de triploïdes naturels du narcisse du poète dans la péninsule des Balkans. [START_REF] Beck | Flora Bosne, Hercegovine i Novopazarskog Sandžaka. 1. Gymnospermae i Monocotyledones[END_REF]. Dans les populations naturelles du narcisse du poète, un système unique de chromosomes B, avec trois morphotypes différents, a été observé. Le type submetacéntrique, le plus fréquent, montre quatre modèles différents selon l'organisation de l'hétérochromatine et des gènes ribosomiques, en général actifs. Les individus qui possèdent des chromosomes B avec des gènes ribosomiques (18S 5.8S 26S) actifs, montre également une augmentation du nombre total de nucléoles formés.

16. Il a été noté la présence de translocations et d'inversions chez certains individus qui poussent dans des habitats spécifiques (avec la présence de métaux lourds ou d humidité pendant l été). 17. Les modifications observées au niveau de la structure chromosomique et de la quantité d'ADN chez N. poeticus probablement reflètent la réponse du génome aux conditions de stress, où les individus possédant des chromosomes B pourraient avoir un avantage sélectif. On peut supposer que les populations du narcisse du poète dans les prés humides subalpins et submontagnards se développent dans des conditions optimales et montre l organisation du génome la plus stable.

ZAKLJUČCI

Habitati na serpentinskim substratima predstavljaju nepovoljne uvjete za razvoj biljaka. Karakteriziraju se sa malim brojem vrsta, ali prisustvom velikog broja endema. U ovoj studiji se po prvi put prezentira serija podataka o veličini genoma serpentinofita, njihovom hromosomskom broju, nivou ploidije, sklonosti ka supstratu, tipu životnog ciklusa i životne forme na krajnjem sjeverozapadnom dijelu serpentinskog područja Balkanskog poluostrva. Uzorak je obuhvatao 308 svojti iz 213 rodova, sa novim vrijednostima za 28 rodova i 99 vrsta. Prema Leitch-evim kriterijima, više od polovine analiziranih svojti (55.63%) pripadale su grupi vrlo malih genoma, 22.19% malim, 18.75% srednjim, 3.13% velikim i samo 0.31% vrlo velikim genomima. U odnosu na sklonost ka supstratu, glavnina vrsta (171) su bile indiferentne ili fakultativne serpentinofite (103). U zavisnosti od životnog ciklusa, ~ 4% vrsta su bile jednogodišnje, a 88.31% višegodišnje, od kojih je 57% imalo vrlo male genome. Hemikriptofite su predstavljale dominantnu životnu formu (48.38%), koju slijede fanerofite (17%), hamefite (15%), terofite (9%) i geofite (9%). Iz dobivenih rezultata proizilazi da vodni stres, visoke temperature i prisustvo teških metala u serpentinskim habitatima imaju visok selektivni pritisak i favoriziraju višegodišnje vrste sa vrlo malim genomom.

Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), fakultativna serpentinofita, je predak kultiviranih narcisa. Ovo je prva studija o N. poeticus i njegovoj rizosferi u prirodnim populacijama. Ova vrsta pokazuje toleranciju na promjene pH vrijednosti u dijapazonu od 4.64 do 7.85. Totalne koncentracije nikla, kobalta i magnezija u serpenitnskim tlima su bile veće nego u krečnjačkim. Narcissus poeticus se karakterizirao većom akumulacijom mangana, nikla i magnezija u nadzemnim dijelovima biljke. Suprotno, kobalt je imao skoro istu totalnu koncentraciju u svim dijelovima biljke. Druga neuobičajena karakteristika N. poeticus je najveći iskazani molarni odnos Ca/Mg u podzemnim dijelovima, vjerovatno zbog njegove životne forme (geofita) i ljetne dormancije. Očito je da iako N. poeticus akumulira određene količine istraživanih teških metala (Mn, Ni, Co, Fe) on se ne moze smatrati nije njihovim hiperakumulatorom.

Važan dio ove studije se odnosi na varijabilnost hromosomske strukture, veličine genoma, nivoa ploidije i prisustva B-hromosoma u 13 prirodnih populacija N. poeticus koje rastu na različitim geološkim supstratima i pod različitim okolišnim uslovima. Korištena je tehnika protočne citometrije za određivanje veličine genoma, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) za fizicko mapiranje rDNK, fluorohrom banding za organizaciju heterohromatina i bojenje srebrenim nitratom za utvrđivanje aktivnosti ribozomalnih gena. Organizacija ribosomalnih gena i prisustvo prirodnih triploida su u ovoj studiji saopćeni po prvi put. Uočeno je prisustvo individua koje nose B-hromosome (u 9 od 13 populacija) i hromosomske translokacije. Poseban sistem B-hromosoma je predstavljen sa tri različita morfotipa. Najčešći submetacentrični tip pokazuje četiri različita obrasca u organizaciji heterohromatina i rDNK. Bojenje s AgNO 3 je pokazalo da se formirani broj nukleolusa povećava u prisustvu B-hromosoma koji nose ribosomalne gene, što potvrđuje njihovu aktivnost. Dobiveni rezultati pokazuju da N. poeticus ima dinamičan genom sa različitom količinom DNK usljed prisustva poliploidije, B-hromosoma i hromosomskih rearanžmana. Uočene promjene najvjerovatnije odražavaju odgovor genoma na različite okolišne uslove u kojima individue koje posjeduju B-hromosome imaju izvjesnu selektivnu prednost.

RÉSUMÉ

Les habitats sur le substrat de serpentine représentent un environnement hostile pour le développement des plantes. Ils sont caractérisés par un faible nombre d'espèces mais un haut niveau d'endémisme. Cette étude présente pour la première fois une série des données sur la taille du génome, du nombre chromosomique, du niveau de ploïdie, de l'affinité pour le substrat, du cycle de vie, du type et de la forme de croissance des serpentinophytes dans l'extrême nord-ouest de la zone de serpentine dans les Balkans. Les 308 taxons des plantes étudiées comprennent appartenant à 213 genres, dont la taille du génome est donnée pour la première fois pour 28 genres et 99 espèces. En utilisant les critères de Leitch, plus de la moitié des taxons (55.63%) appartiennent au groupe des très petits génomes, 22.19% aux petits, 18.75% aux moyens, 3.13% aux grands, et seulement 0.31% aux très grands génomes. Concernant l'affinité au substrat, la majorité d'espèces (171) sont indifférentes ou des serpentinophytes facultatives (103). Selon le type de cycle de vie, ~ 4% des espèces sont annuelles, 88.31% pérennes, dont 57% possèdent de très petits génomes. Les hémicryptophytes représentent une forme de vie dominante (48.38%), tandis que les phanérophytes représentent 17%, les chaméphytes 15%, les thérophyte 9% et les géophytes 9%. Il est évident que le stress hydrique, les températures élevées et la présence de métaux lourds dans les habitats sur la serpentine jouent une haute pression sélective et favorisent des espèces pérennes à très petits génomes.

Le Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), serpentinophyte facultative, est l'ancêtre des narcisses cultivés. C'est la première étude de N. poeticus et de sa rhizosphère dans les populations naturelles. Il montre une tolérance au pH du sol qui varie du 4.64 à 7.85. Les concentrations totales de nickel, de cobalt et de magnésium sont plus élevées dans les sols sur serpentine que dans ceux sur calcaires. Narcissus poeticus est caractérisé par une plus grande accumulation de manganèse, de nickel et de magnésium dans ses parties aériennes. Le cobalt, par contre, a une concentration totale uniforme dans toutes les parties de la plante. Une autre caractéristique inhabituelle de N. poeticus est son plus grand rapport molaire Ca/Mg dans les parties souterraines, probablement dû à sa forme de vie (géophytes) et une dormance estivale. Il est évident que, même si N. poeticus accumule certaines quantités de métaux lourds estimés (Mn, Ni, Co, Fe), il n'est pas pour autant un hyperaccumulateur.

Une partie importante de ce travail concerne la variabilité de la structure chromosomique, la taille du génome, le niveau de ploïdie et la présence de chromosomes B dans 13 populations naturelles de N. poeticus poussant sur différents substrats géologiques et dans différentes conditions environnementales. La technique de la cytométrie en flux a été utilisée pour estimer la taille du génome, l'hybridation in situ fluorescente (FISH) pour la cartographie physique de l'ADNr, le fluorochrome banding pour l'organisation de l'hétérochromatine et la coloration au nitrate d'argent pour estimer l'activité des gènes ribosomiques. L'organisation des gènes ribosomiques et l'existence des triploïdes naturels ont été rapportés ici pour la première fois. Présence des individus portant de chromosomes B (dans 9 populations sur 13) et de translocations chromosomiques a été détectée. Un système particulier de chromosomes B présente trois différents morphotypes. Le submétacentrique type, le plus fréquent, possède quatre paternes différents dans l'organisation de l'hétérochromatine et de l'ADNr. La coloration à l'AgNO3 a montré que le nombre de nucléoles formés augmente en présence des chromosomes B portant des gènes ribosomiques, dont l'activité est ainsi prouvée. Les résultats obtenus démontrent que N. poeticus possède un génome dynamique avec la quantité d'ADN variable en raison de la présence de polyploïdie, de chromosomes B et de réarrangements chromosomiques. Il semble que les modifications observées reflètent la réponse du génome à différentes conditions environnementales où les individus portant les chromosomes B pourraient avoir des avantages sélectifs.

SUMMARY

Habitats on serpentine substrate present a hostile environment for the plants development. They are characterized by a small number of species, but high levels of endemism. This study shows for the first time a series of data on genome size, chromosome number, ploidy level, the affinity to the substrate, the life cycle, the type and form of growth in the extreme northwest region of serpentine area in the Balkans. The sample includes 308 taxa belonging to 213 genera, with new values recorded for 28 genera and 99 species. Using Leitch's criteria, more than half of estimated taxa (55.63%) belong to the group of very small genomes, 22.19% small, 18.75% intermediary, 3.13% large and only 0.31% to very large genomes. Regarding the affinity to the substrate, the majority of species (171) were indifferent or facultative serpentinophytes (103). Concerning the life cycle, ~ 4% of species are annuals and 88.31% perennials, and 57% had very small genomes. Hemicryptophytes represent a dominant life form (48.38%), phanerophytes 17%, 1chamaephytes5%, therophytes 9% and geophytes 9%. It is clear that the water stress, high temperatures and presence of heavy metals in serpentine habitats have the high selective pressure and favor perennial species with very small genome.

The Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), facultative serpentinophyte, is the ancestor of cultivated daffodils. This is the first study of N. poeticus and its rhizosphere in natural populations. It shows tolerance to soil pH ranging from 4.64 to 7.85. Serpentine soils have total concentrations of nickel, cobalt and magnesium highest, compared with calcareous soils. Narcissus poeticus is characterized by the greater accumulation of manganese, nickel and magnesium in the aerial parts of plant. Against the cobalt has a uniform total concentration in all parts of the plant. Another unusual feature of N. poeticus is the highest molar ratio Ca / Mg in the underground parts, probably du to his life form (geophytes) and summer dormancy. It is obvious that although N. poeticus accumulate certain amounts of estimated heavy metals (Mn, Ni, Co, Fe), it does not a hyperaccumulator.

An important part of this work concerns the variability of the chromosome structure, genome size, the ploidy level and the presence of B chromosomes in 13 natural populations growing on different soils and under different environmental conditions. The technique of flow cytometry was used to estimate the genome size, fluorescent in situ hybridization (FISH) for the physical mapping of rDNA, the fluorochrome banding for the organization of heterochromatin and silver staining to estimate the activity of ribosomal genes. Organization of ribosomal genes and natural triploids have been reported here for the first time. Presence of individuals carrying B chromosomes (in 9 / 13 populations) and chromosomal translocations were detected. A particular system of B chromosomes presents three different morphotypes. The most common submetacentric type shows four different patterns in the organization of heterochromatin and rDNA. The AgNO 3 staining showed that the number of nucleoli formed increases in the presence of B chromosomes carrying ribosomal genes, which proved their activity. The obtained results show that N. poeticus has a dynamic genome with the variable amount of DNA due to the presence of polyploidy, B chromosomes and chromosomal rearrangements. It seems that the observed changes reflect the response of the genome to different environmental conditions in which individuals carrying B chromosomes may have some selective advantages.

PRILOG 1. Alfabetska lista svojti analiziranih pomoću protočne citometrije: pripadnost porodici, lokalitet, sklonost ka supstratu (SA), tip životnog ciklusa (LCT), životna forma (LGF), broj hromosoma iz literature (2n lit), pridužen broj hromosoma (2n: *, brojevi su determinirani u ovoj studiji), nivo ploidije (x), 2C DNK vrijednosti u pg (standardna devijacija), 1C DNK vrijednosti u pg (u Mbp), monoploidna veličina genoma u pg (1Cx), broj analiziranih individua (N), i vrste standardi (S). 

Alyssum markgrafii Schulz

Alyssum murale

Waldst. et Kit.

Ambrosia artemisiifolia L.

Anagallis arvensis L.

Anchusa arvensis (L.) M. Bieb.

Anchusa officinalis L.

Andropogon ischaemum L.

Anemone nemorosa L.

Anthemis tinctoria L.

Anthericum liliago L.

Aquilegia vulgaris L. 

Aruncus dioicus (Walter) Fernald

Asarum europaeum L.

Asplenium adulterinum Milde

Asplenium cuneifolium

Viv.

Asplenium scolopendrium L.

Asplenium trichomanes L.

Aster bellidiastrum (L.) Scop. 

Astragalus onobrychis

Bromus pannonicus

Kumm. & Sendtn.

Bromus sterilis L.

Calamagrostis arundinacea (L.) Roth.

Calamintha alpina ssp. hungarica Hayek

Calamintha officinalis

Moench.

Campanula glomerata L.

Campanula patula L.

Campanula rapunculoides L.

Capsella bursa pastoris (L.) Medik.

Cardamine glauca

Spreng. 

Carpinus betulus L.

Centaurea micranthos Gmel. ex Hayek

Centaurea micranthos

Gmel. ex Hayek

Centaurea micranthos

Gmel. ex Hayek

Centaurea montana L.

Centaurium erythraea Rafn

Cephalanthera rubra (L.) Rich. 

Cerastium malyi (Georgiev

Euonymus europaeus L.

Euonymus verrucosus

Scop.

Euphorbia cyparissias L.

Euphorbia glabriflora Vis.

Euphorbia montenegrina (Bald.) K. Maly ex Rohlena

Euphrasia illyrica Wettst.

Fagus sylvatica L.

Fallopia dumetorum (L.) Holub.

Filipendula hexapetala

Gilib. ex Maxim. 

Fragaria vesca L.

Fraxinus ornus L.

Fumana bonapartei

Maire & Petitm.

Galinsoga parviflora

Cav.

Galium austriacum Jacq.

Galium mollugo L.

Genista januensis Viv.

Genista ovata Waldst. & Kit.

Genista pilosa L.

Genista tinctoria L.

Gentiana asclepiadea L. 

Geranium sanguineum L.

S

Iris rubromarginata Baker

Juglans regia L.

Juniperus communis L.

Juniperus excelsa Wild.

Knautia dinarica (Murb.) Borbas

Lactuca perennis L.

Lamium orvala L.

Laserpitium marginatum W.K.

Lasiagrostis calamagrostis (L.) Link

Lathyrus latifolius L. 

Lathyrus megalanthus

Melampyrum pratense L.

Melica ciliata L.

Melilotus albus Medik.

Melilotus officinalis (L.) Lam.

Melittis melissophyllum L.

Mentha arvensis L.

Mercurialis perennis L. 

Quercus robur L.

Ramonda nathaliae Pancic et Petrovic

Reseda lutea L.

Rhamnus cathartica L.

Rhinanthus rumelicus

Vel.

Robinia pseudoacacia L.

Rorippa sylvestris (L.) Bess. 

Rosa pendulina L.

Rubus hirtus

Thlaspi goesingense Halácsy

Thymus jankae Čelak

Tragopogon dubius

Scop.

Tragopogon porrifolius L.

Tragus racemosus (L.) All.

Trifolium alpestre L.

Trifolium dalmaticum

Vis. 

Trifolium incarnatum L.

Fig. 1 .

 1 Fig. 1. Pozicija peridotitskih masiva u geodinamičkom okviru regiona. Ofiolitski pojasi i okolni tereni: DB -Dinarski ofiolitski pojas; VZWB -Vardarski zapadni pojas; MVZBglavni Vardarski pojas; DIE -Drina Ivanjica element; KBR -Kopaonik blok i brazda; JBT -Jadranski blok; SMCT -Srpsko Makedonski blok; EBDT -istočno Bosansko Durmitorski teren; CBMT -Teren centralno bosanskih planina; SUBKT -Sana Una Banija Kordun teren. Ultramafitni masivi, kompleksi i tijela: 1 Maljen; 2 Troglav; 3 Stolovi; 4 Trnava; 5 Banjska; 6 Kozara; 7 Čavka; 8 Bosanski Ozren; 9 Borja; 10 Konjuh; 11 Zlatibor; 12 Bistrica; 13 Sjenički Ozren; 14 Tuzinje; 15 Brezovica. Dinarski pojas se proteže kroz Albaniju do zapadne Grčke i vjerovatno predstavlja ostatak Dinarsko Mirdita Pindos "Okeana" (Prema Bazylev et al., 2009).

Fig. 2 .

 2 Fig. 2. Prikaz Centralnog Dinarskog ofiolitskog pojasa (CDOB). Individualni masivi: 1 -Banija, 2 -Kozara, 3 -Vrbanja Čelinac Skatavica Šnjegotinja, 4 -Ljubić Čavka, 5 -Bosanski Ozren, 6 -Borja, 7 -Krivaja Konjuh, 8 -Varda Tara Zlatibor, 9 -Sjenički Ozren (Prema Lugović et al., 1991).

; Resulović i

 Resulović Čustović, 2002; Brady et al. 2005).

  reference u radu; Gregory, 2001); dužinom ćelija zatvaračica i ćelija epidermisa (Knight i Beaulieu, 2008); geografskom širinom i dužinom i otpornošću na mraz (Knight i Ackerly, 2002, i reference u radu), otpornošću na metale (Vidic et al., 2009). Sve ove studije su pokušavale dati odgovor na pitanje: da li veličina genoma može imati adaptivnu vrijednost u izvjesnim uslovima? Međutim, ogromna većina ovih studija nisu izučavale veličinu genoma i njegov eventualni selektivan značaj u prirodnim populacijama, a naročito u odnosu na uticaj teških metala. Ipak, nedavno su Vidic et al. (2009) upoređivali floristički sastav zajednica na napuštenom rudniku olova sa količinom nuklearnog genoma, brojem hromosoma i prisustvom ploidije. Oni su u uzorku od 70 višegodišnjih dikotiledonih biljaka uočili da postoji negativna korelacija između koncentracije kontaminirajućih metala u tlu i broja vaskularnih biljaka, i to naročito onih sa velikim genomima. S obzirom da je Druškovič (1984) uočio jako veliki broj hromosomalnih aberacija u biljkama s istog područja, može se zaključiti da su biljne zajednice izučavanih travnjaka na napuštenim područjima taljenja olova relativno mlade i najvjerovatnije, pod jakim selektivnim pritiskom.

Fig. 3 .

 3 Fig. 3. Priprema uzoraka za mjerenje veličine genoma pomoću protočne citometrije (Bourge i Brown, personalna komunikacija).

Fig. 4 .

 4 Fig. 4. Shematski prikaz rada protočnog citometra (Bourge i Brown, personalna komunikacija).

  inkubirati 10 minuta u McIlvain puferu pH 5.5. Nakon toga se na preparat nanosi fluorohrom Hoechst (2 g ml 1 ) u trajanju od dvije minute, u zatamnjenom prostoru i na sobnoj temperaturi. Ispiranje je vršeno 2 3 puta u okomitom položaju, te 15 min u zamračenom prostoru pomoću McIlvain pufera pH 5.5, i na kraju u destiliranoj vodi (15 minuta). Nepotpuno osušeni preparati se potom uklapaju u rastvoru glicerola "Citifluor AF2". Na ovaj način je omogućena precizna linearna diferencijacija dobivena različitim molekularno citogenetičkim metodama na istim metafaznim figurama.

  kiseline. Prema modificiranoj metodi Heslop Harrison et al. (1991) kao hibridizacijske sonde, u DNK:DNK dvostrukoj simultanoj in situ hibridizaciji, služe ribosomalni geni 5S i 18S 5.8S 26S (18S). Priprema sondi i njihovo markiranje je izvršeno prema Cerbah et al. (1999) protokolu. EcoRI fragment, veličine 4 kb, koji odgovara dijelu 18S 5.8S 26S rDNK, zajedno s internim transkribujućim razmaknicama (ITS), izolovan iz vrste Arabidopsis thaliana L., je korišten kao 18S rDNK sonda. 18S rDNK hibridizacijska sonda je markirana pomoću Cy3 fluorohroma (Amersham Co., Francuska) nik translacijom. Sonda 5S rDNK odgovara plazmidu pTa794 sa cijelim 410 bp BamHI fragmentom 5S rRNA gena izolovanim iz Triticum vulgare L. (Gerlach i Dyer, 1980). Sonda je markirana pomoću haptena digoxigenina11 dUTP 8 (Roche Diagnostics, Meylan, Francuska) PCR metodom.

Fig. 7 .

 7 Fig. 7. Shematski prikaz principa FISH eksperimenta za lokalizovanje gena u nukleusu http://fr.wikipedia.org/wiki/Fichier:FISH_(Fluorescent_In_Situ_Hybridization).jp

  [START_REF] Leitch | Phylogenetic analysis of DNA C values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants[END_REF] više od pola izmjerenih svojti (55.63%) imaju vrlo male, dok 22.19% svojti imaju male i 18.75% srednje 1C vrijednosti. Svojte sa velikim i vrlo velikim veličinama genoma su prisutne u malom broju (3.13% i 0.31%) i predstavljaju uglavnom čine četinjače i monokotiledone biljke.Prisutna je visoka pozitivna korelacija (r=0.94, p<0.05, Fig.9) između 208 prethodno publikovanih i naših mjerenja 1C vrijednosti. Signifikantne razlike se uočavaju kod nekih vrsta (Fig.9), što najčešće reflektira različite nivoe ploidije tih svojti.U okviru ove studije je detektovano 10 vrsta sa različitim nivoima ploidije (Centaurea micranthos, Convolvolus arvensis, Coronilla varia, Daphne mezereum, Helianthemum

Fig. 8 .

 8 Fig. 8. Kumulativna frekvencija 1C vrijednosti istraživanih svojti.

Fig. 9 .

 9 Fig. 9. Poređenje prethodno publikovanih i naših 1Cx podataka (siva linija je tačna korelaciona linija sa ± 5% odstupanja).

Fig. 10 .

 10 Fig. 10. Procentualna zastupljenost istraživanih vrsta, klasificiranih prema veličini genoma i njihovoj grupisanosti na osnovu: a) sklonosti prema supstratu; b) tipu životnog ciklusa; c) tipu životne forme. Veličina genoma: VS vrlo mali; S mali; IM srednji; L veliki; VL vrlo veliki. Sklonost ka supstratu: F(C) fakultativne serpentinofite koje se pretežno mogu naći na krečnjaku; F(S) fakultativne serpentinofite koje se pretežno mogu naći na silikatu; I indiferentne; O obligatne; O(C) obligatne serpentinofite koje se veoma rijetko mogu naći i na krečnjačkoj podlozi; X Nepoznato. Tip životnog ciklusa: A jednogodišnja; B dvogodišnja; AB jedno dvogodišnja; AP jedno višegodišnja; P višegodišnja; PB dvogodišnje višegodišnje. Tip životne forme: Ch-hamefite; G-geofite; H-hemikriptofite; NP-žbunovi ispod 2 m; P-fanerofite; S-penjačice i lijane; T-terofite; X-nepoznato.

  Izmjerene koncentracije Ni u serpentinskim tlima su bile višestruko veće u odnosu na vrijednosti krečnjačkih tala (Tabela 3). Koncentracije usvojenog Ni u podzemnim izdancima su bile manje u odnosu na nadzemne, s očekivano većim vrijednostima kod individua iz serpentinskih populacija. Nivo Ni u tkivu individua u populacijama 6 i 10 je bio manji od detekcionog limita. Iako su koncentracije kobalta u serpentinskim tlima bile značajno veće, biljke su, u svim populacijama, pokazivale relativno ujednačene koncentracije kako u nadzemnom tako i u podzemnom dijelu (Tabela 3). Izuzetak su bile tri individue iz serpentinske populacije 13, koje su imale akumuliranog Co u podzemnom izdanku čak i do četiri puta više u odnosu na nadzemni. U tkivima serpentinskih individua je koncentracija Co uvijek bila niža od Ni, što nije uvijek slučaj s individuama sa krečnjačke podloge. Koncentracije željeza su uglavnom veće u lukovicama u odnosu na nadzemne izdanke (osim u populacijama 5 i 11), ali uvijek znatno manje od koncentracija u tlima. Općenito, koncentracije Fe u serpentinskim tlima su veće u odnosu na krečnjačke (Tabela 3), što nije slučaj i sa koncentracijama u biljnim tkivima. Serpentinska tla su se karakterizirala skoro dvostruko većim vrijednostima magnezija u odnosu na krečnjačka tla (Tabela 3). Nadzemni biljni dijelovi su, uglavnom, imali veće koncentracije Mg u odnosu na podzemne dijelove. Međutim, individue iz serpentinskih populacija su uglavnom pokazivale suprotan trend. Iznenađujuća je konstatacija da je rizosfera analiziranih individua bijelog narcisa iz serpentinskih populacija uglavnom imala veće koncentracije kalcija u odnosu na krečnjačke (Tabela 3). Međutim, skoro sve individue, bez obzira na geološku podlogu, su akumulirale više Ca u podzemnim izdancima. Izmjenljivi Mg u svim istraživanim tlima je bio u suvišku u odnosu na Ca. Biljke serpentinskih populacija su u većini slučajeva sadržavale veće nivoe Mg od Ca, te je odnos Ca/Mg u biljnom tkivu bio <1 i mnogo više varirao nego u tlu. S druge strane, krečnjačka tla su imala relativno slične vrijednosti izmjenjivih iona Ca i Mg, te je raspon TABELA 3. Kemijske karakteristike (pH tala, minimalne i maksimalne koncentracije elemenata u ppm, i odnosi Ca/Mg) nadzemnog i podzemnog izdanka te rizosfere istraživanih individua vrste Narcissus poeticus u uzorkovanim populacijama.

  variranja odnosa Ca/Mg veoma mali. Međutim, iako su odnosi Ca/Mg očekivano u biljnim dijelovima bili >1, njihov raspon variranja je bio relativno velik, s uglavnom većim vrijednostima u lukovicama u odnosu na nadzemni izdanak (Tabela 3).

  Individue svih istraživanih populacija N. poeticus su se karakterisale diploidnim hromosomskim brojem 2n=2x=14, uz izuzetak dvije populacije (8 i 12), gdje su pronađene i triploidne individue, 2n=3x=21. Uočene su interindividualne varijabilnosti kariotipa (jedinki oba nivoa ploidije) s obzirom na prisustvo B hromosoma (varijabilan broj i morfologija kod različitih jedinki). Morfometrijski podaci o kariotipu su predstavljeni u Tabeli 4, s osnovnom hromosomskom formulom za vrstu N. poeticus 2n=8 sm + 2 m + 2 st + 2 sm m sat . Većina uočenih B hromosoma su bili submetacentričnog tipa, ali su također uočeni i metacentrični i akrocentrični tipovi. Srednja dužina hromosoma varira od 5.02 do 9.31 m, dok B hromosomi predstavljaju 2/3 dužine najkraćeg para A hromosomske garniture.

Fig. 11 .TABELA 4 .

 114 Fig.11. Neke karakteristike istraživanih populacija i individua N. poeticus. Različita brojnost populacija: A1 i A2, subalpinske i submontane livade; B1 i B2, serpentinski habitati; C, populacija na kraškom polju; D, različita 'skloništa' individua: D1, serpentinska i D2 3, subalpinska populacija; E1 i E2, različita veličina i boja cvjetova na lokalitetu Mokra Gora; F1 i F2, različita obojenost cvjetova na kraškim poljima; G1 4, različita morfologija cvjetova u kraškoj populaciji; H, rijetki dvocvjetni bijeli narcisi: H1, serpentinska i H2, subalpinska populacija.

Fig. 12 .

 12 Fig. 12. Rezultati hromomicin bandinga i FISH eksperimenta za različite populacije N. poeticus. A1 CMA i A2 FISH za diploide kraških populacija sa 1 B hromosomom (strelica); B1 CMA i B2 FISH za diploide serpentinske populacije sa 2 Bs (strelice); C1 CMA i C2 FISH za triploidnu populaciju sa 3 različita tipa Bs (strelice, kraška populacija); D idiogram standardnog diploidnog kariotipa /dva homologna hromosoma para 7 pokazuju razliku u obrascu bojenja satelita (uokvireno)/; E različiti tipovi B hromosoma: Ia submetacentrični B hromosom bez signala, Ib, Ic, Id submetacentrični B hromosomi sa različitim obrascom signala (kolokalizacija CMA i 18S u bloku Ib, disperzirano Ic, ili s oba obrasca Id); II metacentrični B hromosom sa dva signal na oba kraka, jedan u bloku a drugi disperziran, i tip III subtelocentrični B hromosom sa jednim disperziranim signalom na dugom kraku blizu centromere; F1 CMA, F2 FISH i F3 idiogram individue iz serpentinske populacije s inverzijom na paru 4 (strelice, uokvireno); G1 i H1 CMA, G2 i H2 FISH, i G3 i H3 idiogrami dvije individue sa translokacijama (populacije na serpentinu /G/ i subalpinskoj livadi /H/, neupareni hromosomi uokvireni). Bar na fotografijama = 10 m.

  A1, A2, B1, B2, D) posjeduje jedan 5S rDNK lokus na hromosomskom paru 4, dok je 18S rDNK lokus bio vidljiv kao veoma jak signal na terminalnom dijelu kratkog kraka ili na obje strane sekundarne konstrikcije hromosomskog para 7. Hromosomski par 4 nosi 5S signale na kratkom kraku koji su DAPI pozitivni (Fig. 12 A2, B2, D).

  F1, F2, F3). Ovaj kariotip se karakterisao s inverzijom velikog dijela hromosoma na jednom homologu para 4. Ovu inverziju je bilo moguće uočiti zahvaljujući prisustvu markera kao što su DAPI band i 5S rDNK lokus na invertnom dijelu hromosoma. Inače, ovaj kariotip je posjedovao iste CMA i Hoechst obrasce kao i individue sa standardnim kariotipom.Dva tipa hromosomalnih translokacija uočenih u populacijama 2 i 12 prouzrokovala su jasno različite kariotipove u odnosu na standardan kariotip. Za serpentinsku individuu (populacija 12; Fig.12 G1, G2, G3) je bilo moguće kompletirati samo šest homologih parova, a dva neuparena metacentrična hromosoma bila su karakterizirana važnim razlikama u njihovoj dužini. Tako je ova individua imala pet submetacentričnih parova, jedan subtelocentričan par i dva neuparena metacentrična hromosoma (Fig.12 G3). Kariotip individue sa planinskih livada na krečnjaku (populacija 2) bio je sastavljen od jednog metacentričnog i četiri submetacentrična para te četiri neuparena submetacentrična hromosoma (Fig.12H1, H2, H3). Najvjerovatnije je nekoliko hromosoma učestvovalo u ovim translokacijama. Individue sa translokacijama su imale skoro identičan CMA i Hoechst obrazac kao u osnovnom kariotipu. Razlika je uočena u odsustvu centromernog Hoechst signala na hromosomskom paru 2, koji već posjeduje Hoechst band na dugom kraku. Osim toga, telomerni i centromerni CMA signali se nisu uočili na hromosomima ovih dviju individua.

1C

  

  subsp. nigerscens (Willd.) Hayek Centaurea jacea L.

11

 11 

  Primula veris L. subsp. columnae (Ten.) Ludi Primula vulgaris Huds.Prunella vulgaris L.Prunus avium (L.) L.Prunus mahaleb L.Pteridium acquilinum (L.) KuhnPulmonaria officinalis L.Pyrus communis L.Pyrus piraster Burgsd.Quercus cerris L.Quercus frainetto Ten.

1C

  

1C

  

  Stachys officinalis (L.) TrevisianStachys recta L. var. chrysopheaStachys sylvatica L.Stellaria graminea L.Stellaria media (L.) Vill.Stenactis annua (L.) Cass. ex Less.

1C

  

  

  ). Prema istraživanjima Riter Studničke (1963), u Bosni se nalaze 583 vrste koje obitavaju na serpentinskim supstratima. Od toga su 284 vrste prisutne na skeletnim tlima, u okviru kojih je pronađeno samo 37 obligatnih serpentinofita (5 paleoendema, 14 neoendema i 17 tipičnih vrsta za serpentin). Na dobro razvijenim tlima u mezofilnim šumama je prisutno 104, a na vrištinama 22 vrste (ukupno 126). Preostale 173 vrste su okarakterizirane kao indifirentne. Pri određivanju biljnih vrsta na serpentinskim kompleksima, Riter Studnička nije uzela u obzir nekih 60 vrsta, koje uglavnom prate čovjeka i stoku, ili su dio vodene vegetacije. Nažalost, kompletan spisak vrsta pronađenih na serpentinskim supstratima Riter Studnička nije objavila.

  , no njihovo je postojanje indicirano i veličinom genoma (Siljak Yakovlev et al., 2010).

	Zonneveld (2008) je utvrdio količinu nuklearne DNK za sve vrste roda Narcissus,
	međutim njegove vrijednosti dobivene su mjerenjima samo jedne individue po taksonu.
	Međutim, prema navodima više autora (Olszewska i Osiecka, 1982; Zonneveld, 2008;
	Siljak Yakovlev et al., 2010), veličina nuklearnog genoma vrste N. poeticus je varijabilna,
	što upućuje na potrebu mjerenja količine DNK na više individua u populaciji, ali i u
	okviru više populacija.

2.2. Analiza ukupnih koncentracija Ni, Co, Mn, Fe, Ca i Mg u biljnom materijalu i tlu

  Geografsko rasprostranjenje istraživanih populacija Narcissus poeticus.

	uzorcima bio dovoljno visok, što omogućava dobijanje pouzdano tačnog i preciznog
	Biljni uzorci su očišćeni sa svježom vodom, a zatim saprani destilovanom rezultata.
	vodom, kako bi se odstranile sve površinske nečistoće. Nakon separiranja, biljni uzorci Ukupna količina Ni, Co, Mn, Fe, Mg i Ca u uzorcima tla i biljnog materijala je
	Po pet kompletnih individua bijelog narcisa sa pripadajućom rizosferom (tlo oko (nadzemni izdanci i lukovice) su sušeni na temperaturi od 60°C tokom 24 sata i analizirana pomoću atomske apsorpcione spektrofotometrije (AAS), korištenjem
	lukovice i korjenčića) je prikupljeno u 13 populacija u Bosni i Hercegovini, Hrvatskoj i pohranjeni u polietilenske posude do analiziranja. Uzorci tla su sušeni na sobnoj uređaja Perkin Elmer M 3110, na metalurškom institutu "Kemal Kapetanović Zenica",
	Srbiji (Tabela 1). temperaturi, prosijani kroz sito veličine otvora <2mm, u ahatnom tarioniku usitnjeni do Univerziteta u Zenici.
	veličine čestica 100 m i pohranjeni u polietilenske posude do analiziranja.	
		Pripadajuća rizosfera analiziranih bijelih narcisa je uzorkovana u č iste
	polietilenske vrećice. Uzorci tla su sušeni na sobnoj temperaturi, prosijani kroz sito TABELA 1. Br. Lokalitet Supstrat GŠ GD NV (m) N veličine otvora <2mm, u ahatnom tarioniku usitnjeni do veličine č estica 100 m i
	1. pohranjeni u papirne kese do analiziranja količine elemenata i pH tla. Mt. Čvrsnica, Mala Čvrsnica, B&H K 43° 34 38 17° 29	1384	5
	2.	Mt. Čvrsnica, Barice, B&H	K	43° 35 01	17° 30	1350	6
	3.	Glamočko Polje, Mliništa, B&H Izbor postupka određivanja sadržaja Ni, Co, Mn, Fe, Mg i Ca u biljnom materijalu K 44° 14 07 16° 49 1198 11
	4. je prvenstveno zavisio od njihovih kemijskih i termokemijskih osobina. Naime, oksidi Mt. Zelengora, Točila, B&H K 43° 19 51 18° 33 1470 1570 11
	5. ovih elemenata su lako rastvorljivi u kiselinama i praktički nisu isparljivi na Livanjsko Polje, Peulje, B&H K 44° 08 42 16° 27 806 859 13
	6. temperaturama od oko 1200 o C. Navedene karakteristike su bile odlučujuće za izbor Livanjsko Polje, Čelebići, B&H K 43° 56 01 16° 40 710 5
	7. termičkog načina mineralizacije biljnog materijala (spaljivanjem), a na osnovu Mt. Čvrsnica, Rakitno, B&H K 43° 32 79 17° 24 895 910 8
	8. instrukcija proizvođača uređaja atomskog apsorbcionog spektrometra (AAS) i iskustva Gatačko Polje, Avtovica, B&H K 43° 09 15 18° 31 940 54
	9. Laboratorija (Perkin Elmer Manual, 1996). Dodatna pogodnost načina mineralizacije i Mt. Biokovo, Lađena, Cro K 43° 17 27 17° 05 1265 7
	10. pripravljanja otopina uzoraka, u kojima se pomoću AAS vrši mjerenje sadržaja Mt. Biokovo, Vošac, Cro K 43° 18 46 17° 04 1340 9
	11. određivanog elementa, osim brzine određivanja, ogleda se i u činjenici da je neophodna Kladanj, Katranica, B&H S 44° 16 09 18° 33 800 940 26
	12. vrlo mala količina reagensa/kiseline, što umanjuje i mogućnost pojave greške u očitanju Žepče, Matinski Vis, B&H S 44° 28 03 17° 58 820 900 23
	13. rezultata, jer je manja mogućnost kontaminacije i/ili gubitaka. Preliminarna mjerenja Mt. Zlatibor, Mokra Gora, Srb S 43° 49 09 19° 30 810 11
	Napomena: GŠ, sjeverna geografska širina; GD, istočna geografska dužina; NV, nadmorska sadržaja elemenata u biljnom materijalu su potvrdila ispravnost izbora određivanja
	visina; N, broj analiziranih individua; K, krečnjak ; S, serpentin; B&H, Bosna i Hercegovina; Cro, Hrvatska; Srb, Srbija. koncentracije elemenata tehnikom plamene, a ne bezplamene AAS tehnike
	elektrotermičke atomizacije (HGA), s obzirom da je sadržaj analiziranih elemenata u

2.2.1. Određivanje pH rizosfere uzorkovanih bijelih narcisa

  

	Vrijednosti pH tala su determinirane pH metrom u zasićenom mulju = otopini
	tlo/deionizirana voda (v/v, 1:2.5; 20 g uzorka tla i 50 ml vode; Steubing, 1965).

2.2.2. Određivanje sadržaja Ni, Co, Mn, Fe, Mg i Ca u biljnom materijalu

  

	sadržaj je iz lončića kvantitativno prenesen u odmjernu tikvicu od 10 ml u koju je,
	nakon hlađenja do sobne temperature, pipetom dodano 2 ml 0.2% otopine lantan nitrata
	[La(NO3)3 H2O; BDH Aristar, UK] i dopunjeno redestiliranom vodom do marke.
	Otopina lantana (0.1 1%) se dodaje kako bi se suzbile eventualne kemijske interferencije
	u plamenu.
	Paralelno sa pripremom otopina uzoraka, pripremane su i referentne otopine za
	konstrukciju kalibracione krivulje. Na taj način se postiže kompenzacija eventualnih
	odstupanja sobne temperature pri kojoj su vršena očitanja, ali i to da se uvijek koristi isti
	set reagencija (i.e. veoma važno zbog "slijepe" probe). Kalibraciona krivulja je
	konstruisana sa tri tačke, u okviru č ijih raspona se nalaze i najniže i najviše
	koncentracije određivanih elemenata iz uzoraka i slijepe probe. U č etiri odmjerne
	tikvice je dodavana ista količina reagensa kao kod obrade uzoraka, s tim da su u tri od
	njih dodavani alikvoti standardnih otopina elemenata čiji je sadržaj određivan.
	Odvagano je 0.5 ±0.001 g uzorka biljnog materijala pomoću analitičke vage i
	kvantitativno preneseno u platinski lončić. Lončić s odvaganim uzorkom je prenesen u
	hladnu električnu žarnu peć (Gerhard), koja se u narednih 3 sata zagrijavala do
	temperature od 800 o C, čime se postiglo postepeno, a ne naglo, sagorijevanje organske
	komponente uzorka i izbjegao "mehanički" gubitak uzorka. Nakon potpunog
	spaljivanja organske komponente i hlađenja uzorka do sobne temperature, sadržaj
	pepela u lončiću je razblažen sa 2 3 ml redestilirane vode, a zatim je u lončić dodato 2
	ml nitratne kiseline (HNO3, BDH Aristar, UK). Nakon toga je lončić pokriven
	platinskim poklopčićem i prenesen na grijnu platu kako bi se sadržaj otopio na
	temperaturi nešto nižoj od temperature ključanja otopine (100 110 o C). Potpuno otopljeni

2.2.3. Određivanje sadržaja Ni, Co, Mn, Fe, Mg i Ca u tlu

  

	Izvagano je 0.2±0.001 g tla i kvantitativno preneseno u platinski lončić, koji je
	zatim stavljen u žarnu peć na temperaturu od 850 o C kako bi se odstranili tragovi
	organske materije. Nakon hlađenja u eksikatoru, u lončić je dodato 1 ml redestilirane
	vode uz lagano homogeniziranje sadržaja. U lončić je zatim dodat 1 ml koncentrirane
	nitratne kiseline, 2 ml koncentrirane perklorne kiseline (HClO4 p.a., Merck, Njemačka) i
	2 ml koncentrirane fluorovodonične kiseline (HF p.a., Merck, Njemačka). Lončić sa
	homogeniziranim rastvorom je prenesen na platu i sadržaj je zagrijan do temperature
	ključanja. Kada je sadržaj u lončiću uparen do naznake pojave perklornih isparenja,
	temperatura plate je povećana kako bi se pojavila perklorna isparenja. Nakon
	isparavanja perklorne kiseline, lončić se djelimično hladio i u njega se dodalo 10 ml 50%
	otopine klorovodonične kiseline (HCl, BDH Aristar, UK), koji se potom ponovo
	zagrijavao do temperature ključanja, kako bi se potpuno rastvorio sadržaj (soli). Ovako
	dobiven rastvor je iz lončića, sapiranjem zidova redestiliranom vodom, kvantitativno
	prenesen u odmjernu tikvicu, u koju je potom dodato 5 ml otopina lantana i dopunjeno
	do 25 ml redestiliranom vodom. Sadržaj u tikvici se potom homogenizirao, čime je
	obrada uzorka za mjerenje apsorbancije na AAS bila završena.
	S obzirom da je sadržaj određivanih elemenata u tlu, izuzimajući Ca a djelomično i Mg i
	Fe, nizak, za njihovo određivanje je korištena atomska apsorpciona spektrofotometrija
	tehnike plamena. Razblaživanjem otopine i snimanjem apsorbancije na talasnim
	duljinama koje daju nižu osjetljivost (gdje je to bilo neophodno), pomoću AAS je bilo
	moguće odrediti i sadržaje Ca, Mg i Fe.
	Prema uputstvu proizvođača (Perkin Elmer Manual, 1996), pripremljene su
	otopine uzoraka te postavljeni parametri, energija lampe (šuplja katoda), talasna duljina
	i tip plamena (C2H2 zrak ili C2H2 N2O), pri kojim je mjerena apsorbancija pojedinih
	elemenata na AAS.

2.3.2. Bojenje meristema korjenčića po Feulgen metodi i određivanje kariotipa klasičnom metodom

  

				A1	A2
	Determinacija pozicije centromera, tipa hromosoma i uparivanje homologih
	hromosoma se vršilo na osnovu nomenklature i metode po Levan et al. (1964). Totalna
	2.5 cm, koji su dužina hromosoma (TLC), centromerni index (Ci), odnos krakova (r), index asimetrije
	tretirani ili sa 0.05% rastvorom kolhicina (AsI%, prema Arano i Saito, 1980) te odnos najkraći/najduži hromosomski par (R) su
	(Sigma Aldrich korišteni za karakterizaciju kariotipa. Sateliti i dužine sekundarnih konstrikcija nisu Chemie Gmbh,
	Steinheim, Njemačka) u trajanju od 2 4 uključene u mjerenja. Konstruiranje idiograma kao i poredak hromosoma su vršeni na
	sata na temperaturi od 18 20°C, ili sa osnovu opadajuće totalne dužine hromosoma, odnosa krakova i srednje vrijednosti
	0.002 M 8 hidroksikinolinom u trajanju centromernog indexa. Statistička analiza dobivenih podataka je vršena pomoću
	od 3 4 sata na temperaturi od 16°C. standardnog T testa.	
	Nakon toga, korjenčići su fiksirani u	
	svježe napravljenom rastvoru Carnoy II	
	(etanol:sirćetna	kiselina,	3:1,	v/v)	Fig. 5. Lokacije istraživanih populacija bijelog
	narednih 24 48 sati u frižideru na +4°C, a	narcisa (v. Tabelu 1)
	potom prebačeni u 70% etanol i pohranjeni na temperaturu od 20°C.
	Bojenje hromosoma se vršilo prema metodi Feulgen i Rossenbeck (1924). Vršena je
	vruća hidroliza, pomoću 1M HCl na 60°C u vodenom kupatilu, u trajanju od 12 14
	minuta. Hidrolizirani korjenčići su, potom, potapani u Schiffov reagens na sobnoj
	temperaturi, u tamnoj komori. Nakon najmanje 30 minuta, obojeni vršak korjenčića
	(meristem) je disekovan skalpelom i prebačen na predmetno staklo u kapljicu 45%
	glacijalne sirćetne kiseline, kako bi se napravio preparat klasičnom "squash" metodom.
	Ovako pripremljeni preparati su korišteni za analizu morfologije hromosoma,
	određivanje kariotipa te za konstruiranje idiograma.

3.4.2. Hoechst 33258 bojenje Prema

  McIlvain pH 7=6.5 ml (0.21 g citratne kiseline + 10 ml destilovane H 2 O) + 43.6 ml (1.78 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O + 50 ml H 2 O) + 49.9 ml H 2 O 7 McIlvain pH 5.5=21.6 ml (1.05 g citratne kiseline + 50 ml destilovane H 2 O) + 28.4 ml (2.136 g Na 2 HPO 4 x 12H 2 O

. Bojenje je izvedeno po izmjenjenim protokolima Schweizer (1976), Kondo i Hizume (1982) i Siljak Yakovlev et al. (2002). Osušeni preparati su inkubirani 15 minuta, na sobnoj temperaturi, u citratno fosfornom puferu McIlvain pH7 6 uz dodatak 10 mM MgCl2. Nakon otklanjanja pufera nanosio se rastvor chromomycin A3 boje, koncentracije 0.2 mg ml 1 , otopljene u McIlvain puferu pH 7. Ova boja je djelovala 90 minuta, na sobnoj temperaturi i u zamračenom prostoru, prije nego je saprana McIlvain puferom pH 7. Narednih 7 minuta (u istim uvjetima) preparati su bojeni metil zelenom bojom (0.5% u McIlvain puferu, pH 5.5 7 ), a u cilju dobivanja kontrasta. Konačno, preparati su isprani McIlvain puferom pH 5.5;

djelimično osušeni i uklopljeni u rastvoru glicerola "Citifluor AF2".

2.neznatno izmjenjenoj metodologiji

Martin i Hesemann (1988), identificirani su regioni DNK bogati adenin timin bazama pomoću Hoechst 33258 {2,2 (4 hidroksifenil)-6-benzimidazolil-6 (1 metil4 piperazil)-benzimidazol trihidrohlorid; Sigma Aldrich Chemie Gmbh, Steinheim, Njemačka} bojenja. 6 + 60 ml H 2 O) + 50 ml H 2 O

  Napomena: L-list; K-podzemni izdanak sa korjenčićima; T-rizosfera; Populacije: 2 Mt. Čvrsnica, Barice; 3 Glamočko Polje, Mliništa; 5 Livanjsko Polje, Peulje; 6 Livanjsko Polje, Č elebići; 7 Mt. Č vrsnica, Rakitno; 8 Gatačko Polje, Avtovica; 9 Mt. Biokovo, Lađena; 10 Mt. Biokovo, Vošac; 11 Kladanj, Katranica; 12 Žepče, Matinski Vis; 13 Mt. Zlatibor, Mokra Gora.

	2	3	5	6	7	8	9	10	11	12	13
	4120	2800 5680	2954 3440	5720	928.00 1516	3920 6520	1880 6800	9400 10794	920.00 2089	346.00 2292	1552 2064
	5680	5600 10400	2880 5680	4380	816.00 1448	4020 4340	10440 14240	5740 10860	1376 3027	406.00 1635	2760 3680
	395	57.50 283.00	725.00 8000	18.5	645.00 1200	915.00 1800	705.00 1260	650.00 1600	6380 8210	1413 5625	2075 3375
	3.32	2.69 5.92	1.04 1.72	4.61	4.84 6.80	2.61 3.66	1.36 3.01	3.79 4.17	0.25 0.75	0.08 0.45	0.06 0.54
	6.17	4.24 8.88	2.02 3.52	3.27	2.99 6.32	3.06 4.57	9.25 15.82	6.24 7.99	0.31 0.91	0.11 0.62	0.21 0.53
		0.01 0.06	0.09 0.29	0.02	0.11 0.27	0.27 0.42	0.28 0.47	0.20 0.59	0.07 0.13	0.04 0.08	0.03 0.06

DISKUSIJA 4.1. Neke karakteristike biljnih vrsta na krajnjem sjeverozapadnom arealu ofiolitske zone Balkanskog poluostrva

  Prema Brady i suradnicima, serpentinska tla se, iako posjeduju bogat diverzitet endemičnih vrsta, smatraju nisko produktivnim staništima koje naseljava flora često okarakterisana tipičnom tolerancijom na različite stresne faktore[START_REF] Brady | Evolutionary ecology of plant adaptation to serpentine soils[END_REF].Sposobnost vrsta da koloniziraju i prežive na serpentinima se razvila od njihovih neserpentinskih predaka. U mnogim slučajevima nove vrste opstaju na serpentinima upravo usljed toga što su slabi kompetitori na drugim supstratima. Kao rezultat ovog ostrvskog efekta, serpentinski supstrati su domaćini relativno velikom broju vrsta koje se mogu naći samo na serpentinima i koje imaju veoma ograničeno rasprostranjenje.[START_REF] Bogunic | Genome size and base composition of five Pinus species from Balkan region[END_REF][START_REF] Yakovlev | Genome size and chromosome number in some Centaurea (Asteraceae: Cardueae) from Dalmatia region[END_REF] Bancheva i Greilhuber, 2006;[START_REF] Bogunic | Genome size stability among five subspecies of Pinus nigra Arnold s[END_REF][START_REF] Yakovlev | Towards a genome size and chromosome number database of Balkan flora: C values in 343 taxa with novel values for 242[END_REF]. Ovo je prva studija koja se odnosi isključivo na istraživanje veličine genoma vrsta sa serpentinskih područja.Postoje pretpostavke da su se veliki genomi razvili pod uvjetima u kojima je rast ograničen s efektima niske temperature u odnosu na stopu ćelijske diobe. Naime, ove biljke ostvaruju rast na niskim temperaturama brzim porastom velikih ć elija obrazovanih tokom prethodne tople suhe sezone. Zapravo, uočeno je da vremenska odvojenost mitoze i ćelijske ekspanzije nije favorizirana kada vlažnost potpomaže rast biljke tokom ljeta. Na taj način duži mitotički ciklus velikih genoma biva najvjerovatnije ograničen te efekat prirodne selekcije ide u pravcu redukovanja veličine ćelije i genoma(Grime i Mowforth, 1982). Suprotni stavovi su izneseni za nivo vrste, prema kojima individue pod stresom imaju veći genom od individua koje rastu u uobičajenim uvjetima. Razlog tome leži u č injenici da se gen povećava ekspanzijom mobilnih elemenata kao odgovor na stres. Na ovaj način se, povećanjem mase nukleusa (efekat nukleotipa), produžuje ćelijski ciklus, usporavaju ćelijske diobe i biljka usporava rast (prilagodba na vodni stres i stres na niske temperature;[START_REF] Kalendar | Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE 1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence[END_REF]. Autori zaključuju da je veličina genoma u vezi sa različitim stepenom preživljavanja vrsta u ovim ekstremnim uvjetima, gdje vrste sa velikim genomima nestaju. Sintezom rezultata istraživanja drugih autora[START_REF] Druškovič | Uticaj zagadjenja sredine na genetske promene u biljnim populacijama[END_REF] Vidic et al., 2001) na istoj oglednoj plohi sa vlastitim rezultatima, Temsch et al. (2010) zaključuju da usljed genotoksičnih nekih teških metala efekata dolazi do različitih oštećenja DNK, kako kod vrsta sa malim tako i kod vrsta sa velikim genomom. Ipak, efekat oštećenja DNK je puno vidljiviji kod vrsta sa velikim genomom, s obzirom da takve individue primaju više "udaraca" zbog veličine genoma (odnosno, veće su "mete"). Dosadašnje studije se zasnivaju na analizama distribucije veličine genoma ili ograničenih grupa biljaka ili fragmentiranih podataka iz pristupačne literature, osim studija Vidic et al. (2009) i Temsch et al. (2010). U odnosu na prethodne, u našoj studiji se po prvi put razmatra veličina genoma u prirodnim populacijama na serpentinskim supstratima. Čak više od 2/3 analiziranih biljaka ima vrlo male i male genome (1C<3.5

	interpopulacijske razlike u veličini genoma između populacija sa ili bez B hromosoma fizičkim karakteristikama (Proctor i Nagy, 1991; Coleman i Jove, 1991; Rajakaruna i Tokom naše trogodišnje studije, koja se odnosila na veličinu genoma, sakupljeno vezu sa karakteristikama serpentinskih tala (mala hranjivost, velike koncentracije sa posebnim osvrtom na veličinu nuklearnog genoma su rijetke (Dimitrova i velikim genomima preferiraju umjereno vlažna staništa, u ovoj studiji smo pronašli
	signifikantne (p<0.05). Intrapopulacijske razlike u 2C DNK vrijednostima između diploidnih individua sa i bez B hromosoma su također bile signifikantne (p<0.01). S obzirom da je detaljno i produbljeno istraživanje o veličini genoma N. poeticus u toku, ovdje su prezentirani samo preliminarni rezultati. Bohm, 1999). je 308 vrsta koje obitavaju na serpentinskim supstratima. Najveći broj su indiferentne (171. 55%) vrste i fakultativne vrste koje se mogu naći i na krečnjačkoj podlozi (112. 36%), dok su prisutne samo 24 vrste vezane za serpentin, što čini 8% istraživanog uzorka. Nažalost, nije bilo moguće izvršiti poređenje prisutnosti i zastupljenosti vrsta metala) i uspostavljanja kompeticije nativnih i invazivnih vrsta (Kazakou et al., 2008 i reference u radu). Međutim, kada se razmatra ukupno bogatstvo vrsta na serpentinskim (ali i na neserpentinskim) tlima može se reći da ono raste sa pojavom požara i ispaše (Kazakou dvije vrste sa velikim genomima (Leucanthemum vulgare i Narcissus poeticus) na izraženijim kserofilnim staništima. Greilhuber, 2000; Općenito, biljke iskazuju izuzetnu varijabilnost veličine genoma (razlika od oko između naše i studije Riter Studničke, s obzirom da originalna lista vrsta nije dostupna. prisutna brojna istraživanja značajnosti varijacije veličine genoma u odnosu na životnu narušavanja habitata. serpentinofita, kao vrijednih resursa flore BiH. omogućava testiranje značajnosti selektivnih razlika u veličini genoma. Tako su povećava, ali i uz pojavu povećanja brojnosti invazivnih vrsta, kao rezultata Očito, neophodno je proširiti naša istraživanja i kompletirati inventarizaciju et al., 2008). Naime, usljed požara i ispaše brojnost nativnih vrsta na serpentinima se 2000 puta između najmanjeg i najvećeg biljnog genoma; Greilhuber et al., 2006), što 4.1.1.
	historiju, taksonomske i evolutivne veze i geografsku distribuciju.	
				Diploidi			Triploidi
					Translokacije	
		Bez B hr.	Sa 1B hr.	S 2B hr.	Serpentin	Krečnjak	Bez B hr.	S 3B
								hr.
	2C DNK	25.25±0.39 25.81±0.36	26.52±0.15	25.77	24.91	34.55±0.59	38.80
	(pg±sd)						
	% za B hr. (±sd)		3.29±0.07	5.94±0.03				6.53
	Odsustvo i slabu zastupljenost jednogodišnjih biljaka je uočio i Selvi (2007) u
	Toskanskom serpentinskom regionu, što je objasnio njihovim kratkim životnim Iako je ova kategorija predstavljena sa samo 11 vrsta (3.44%), nijedna od njih nije vezana
	Zbog specifičnih kemijskih i fizioloških uvjeta serpentinska tla predstavljaju ekstremni Ista autorica (1963) je, nakon dugogodišnjih istraživanja, uočila da je bogatstvo ciklusom u odnosu na kserofilnu prirodu serpentinske flore. za serpentinsku podlogu (6 indiferentnih vrsta i 5 fakultativnih svojti sa krečnjaka), i Među istraživanim populacijama se veličina genoma za diploide bez B hromosoma kretala u rasponu od 23.97 do 25.84 pg, za diploid sa B hromosomima od 24.31 26.86 pg, za triploide bez B hromosoma od 34.51 do 35.32 pg, i za triploidnu individuu sa 3B hromosoma 38.80 pg (Tabela 6). Analiza varijanse (ANOVA) je pokazala da postoje signifikantne razlike među grupama. LSD test je pokazao da su selektivni pritisak za biljne organizme te se smatraju podstrekačima specijacijskih događaja (Kruckeberg, 1984). Rezultat ovih procesa je jedinstvena flora, visoka stopa endemizma i velik broj vrsta s ograničenim rasprostranjenjem (Brooks 1987; Whittaker 1954; Stevanović et al., 2003). Ipak, karakteristične flore određenog regiona su rezultat kombinacije svakog pojedinačnog područja sa jedinstvenim okolišnim, geokemijskim i vrsta na serpentinima Bosne daleko veće na skeletnom supstratu nego na razvijenom tlu, iako su tu uvjeti za život znatno povoljniji. Njihov odnos iznosi 70:30%. U suštini, približno 10% vrsta uzorka je vezano za serpentin, a oko 60% vrsta su indiferentne. Najveći broj vrsta vezanih za serpentin pripada porodicama Caryophyllaceae i Scrophulariaceae, i to su najčešće kserofilne vrste. Najveći broj autora se slaže da je nivo biljnog diverziteta pozitivna funkcija u sve su višegodišnje. U ovom uzorku pet vrsta su geofite, č etiri fanerofite i dvije Prema Riter Studnička (1963) serpentinska flora u Bosni predstavlja ostatke jedne većim prostornim okvirima, dok su neutralni ili negativni odnosi između produktivnosti i diverziteta često uočeni u manjim prostornim okvirima (Kazakou et al., hemikriptofite, što ne iznenađuje s obzirom da su to uglavnom monokotiledone biljke i stare autohtone flore, ograničene na Balkansko poluostrvo. Ova činjenica je doprinjela četinjače. Ovi rezultati idu u prilog Knightovoj hipotezi (2005), jer je očito da vodni tome da je flora Balkana veoma mnogo izučavana, i to na različitim nivoima: 2008 i reference u radu). Prema Davis i suradnicima (Davis et al., 2005) zajednice stres, visoke temperature i prisustvo teških metala vrše visok selekcioni pritisak i morfološkim, fitogeografskim i taksonomskim. Međutim, obimnije citogenetičke studije okarakterisane visokim diverzitetom su otpornije na invaziju, što se može dovesti u favoriziraju vrste sa malim genomima. Iako Knight i Ackerly (2002) navode da biljke sa

Srednja vrijednost veličine genoma koja se odnosi na 13 populacija predstavljena je u Tabeli 6. Mjerenja su izvršena kod diploidnih biljaka bez B hromosoma i sa 1 2 B hromosoma, triploidnih biljaka bez B hromosoma i sa 3 B hromosoma, kao i kod biljaka sa hromosomalnim translokacijama. TABELA 6. Veličina genoma različitih varijanti kariotipa vrste Narcissus poeticus. Napomena: Za diploide su srednje vrijednosti računate za 39 individua bez B hromosoma, 27 individua sa 1 B hromosomom, dvije individue sa 2 B hromosoma, po jedna individua sa translokacijama iz serpentinske i krečnjačke populacije. Srednja vrijednost je predstavljena za tri triploidne individue bez B hromosoma, i za jednu individuu sa 3 B hromosoma; B hr.-B hromosom; sd-standardna devijacija; % za B hr.-procenat veličine genoma koji se odnosi na B hromosome.

66 4. S obzirom da se Balkansko poluostrvo karakterizira izvanrednim biljnim diverzitetom, ono predstavlja jedno od glavnih hotspot regiona u Europi. Zapravo, ovo područje je jedno od najvažnijih europskih refugijuma, veoma bogato tercijarnim reliktima te elementima glacijalne i postglacijalne flore, što ga čini prirodnom laboratorijom za evolutivne studije (Krystufek i Reed, 2004; Thompson, 2005; Taberlet et al., 1998; Petit et al., 2002; Stevanović et al., 2003; Siljak Yakovev et al., 2010). Ultramafitne podloge su "domaćini" specifične flore razvijene tokom dugoročnoj interakciji s edafskim i fizikalnim karakteristikama pripadajućih tala (Brooks 1987; Baker et al. 1992; Roberts i Proctor 1992). Najvjerovatnije fizički faktori (kseričnost tla, nagib i insolacija) i sadržaj nutrijenata u tlu imaju veći utjecaj na sastav vrsta nego sadržaj teških metala u tlu (Chiarucci et al., 2001). U kombinaciji s općenito stjenovitim i izloženim ultramafitnim stijenama, sastav minerala i njihov odnos kreiraju negostoljubiv okoliš za mnoge biljke (Kruckeberg 1979; Rajakaruna i Whitton, 2004). Neke od ovih vrsta su ugrožene zbog antropogenog uticaja, ali mnoge su rijetke upravo zbog neuobičajenog ograničenja u njihovoj distribuciji. S druge strane nisu sve vrste koje rastu na serpentinima ograničene samo na ove supstrate, što im omogućava da imaju široko rasprostranjenje. Prema Riter Studnička (1963), u odnosu na istovjetne grupacije na krečnjacima, na serpentinima BiH se uočava velika jednoličnost u oblicima vegetacije kao i siromaštvo u brojnosti vrsta. Usljed specifičnih mikroklimatskih prilika, na serpentinima Bosne najveće površine biljnog pokrova zauzimaju kserofilni oblici vegetacije (Riter Studnička, 1963). Naša studija potvrđuje rezultate Stevanović i suradnika da se najmanji broj endemičnih vrsta nalazi na krajnjem sjeverozapadnom dijelu serpentinske zone Balkanskog poluostrva (Stevanović et al., 2003). Postoje kontradiktorna mišljenja o ulozi strukture habitata i drugih faktora na bogatstvo lokalne i regionalne serpentinske vegetacije (Kazakou et al., 2008 i reference u radu). Prisustvo lokalnih endema je, najvjerovatnije, determinirano veoma varijabilnim okolišnim faktorima (karakteristike tla i vegetacije), ali ne i veličinom serpentinske zone i njene izoliranosti. S druge strane, prema Kazakou i suradnicima postoje suprotna mišljenja o faktorima koji utiču na bogatstvo regionalnih endema Kazakou et al. (2008 i reference u radu). Naime, brojnost regionalnih endema raste ili sa povećanjem ukupne veličine serpentinskih habitata ili ovisi od količine padavina. Dodatno, kao i drugdje, geološka starost područja utiče na bogatstvo regionalnih endema. U uzorku od 583 vrste sa bosansko serpentinskih kompleksa, Riter Studnička (1963) je uočila da su hemikriptofite najzastupljenije u svim tipovima vegetacije, uz blagi porast prema mezofilnijim uvjetima života. Prisustvo hamefita se smanjuje u mezofilnim uvjetima, dok su geofite podjednako prisutne i na golom supstratu i na mezofilnim staništima. Terofite su nešto zastupljenije u otvorenim sastojinama. Ovom obrascu je veoma slična i zastupljenost životnih formi dobivena tokom ove studije.

Uopćeno, može se reći da su hemikriptofite najzastupljenija životna forma na serpentinima

[START_REF] Chiarucci | Vegetation ecology and conservation on Tuscan ultramafic soils[END_REF][START_REF] Selvi | Diversity, geographic variation and conservation of the serpentine flora of Tuscany (Italy)[END_REF][START_REF] Pavlova | A survey of the serpentine flora in the West Bulgarian Frontier Mts (Mt Vlahina and Mt Ograzhden)[END_REF]

. Neophodno je istaći i to da su jednogodišnje biljke zastupljene u vrlo malom procentu u okviru istraživane flore.

Neke studije o geografskoj distribuciji biljaka sugeriraju da vrste sa malim genomima preovladavaju u svim okolišima, jer su vrste sa velikim genomima osjetljivije na ekstremnije okolišne uvjete

[START_REF] Bennett | DNA amounts of angiosperms from the Antarctic and Soth Georgia[END_REF]

; Grime i Mowforth, 1982; Bennett, 1987; Knight i Ackerly, 2002; Knight et al., 2005; Vidic et al., 2009; Temsch et al., 2010; Kubešová et al., 2010). Ovo svojstvo je iskazano hipotezom o ograničenju velikog genoma ("Large Genome Constraint Hypothesis"; Knight et al., 2005), kojom se pretpostavlja da u stresnim okolišima vrste sa prevelikim genomima nestaju.

Zamijećeno je, također, da su veliki genomi naročito prisutni kod mediteranskih geofita i trava, kod kojih je rast ograničen usljed mrazeva tokom zime i ranog proljeća.

U prilog navedenom idu i dobiveni rezultati analiziranja odnosa veličine genoma i okolišnih uvjeta od strane Knight i Ackerly (2002). Autori navode da npr. i ekstremne temperature i niska precipitacija favoriziraju biljke sa malim genomima.

[START_REF] Vinogradov | Selfish DNA is maladaptive: evidence from the plant Red List[END_REF] 

je zamijetio da vrste sa crvenih lista mnogo češće posjeduju velike genome u odnosu na neugrožene svojte što, također, ukazuje na njihovu veću osjetljivost. S druge strane, postoje i hipoteze da vrste sa velikim genomima ne mogu obitavati u ekstremnim okolišnim uvjetima usljed polucije sa teškim metalima

[START_REF] Vidic | Selective significance of genome size in a plant community with heavy metal pollution[END_REF]

. Naime, autori su prilikom istraživanja biljnih zajednica koje su se razvile na napuštenom rudniku olova dokazali negativnu korelaciju između koncentracije teških metala u tlu i prisustva vrsta sa velikim genomima duž gradijenta polucije. Ovu pojavu objašnjavaju time da korelacija između okolišnih faktora i količine DNK može reflektovati funkcionalne odnose između nukleotipskih efekata DNK mase i zapremine sa fiziološkim procesima na nivou ćelije i organizma. pg,

[START_REF] Leitch | Phylogenetic analysis of DNA C values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants[END_REF]

, što je u saglasnosti sa nizom autora

[START_REF] Bennett | DNA amounts of angiosperms from the Antarctic and Soth Georgia[END_REF]

; Grime i Mowforth, 1982; Bennett, 1987; Knight i Ackerly, 2002; Knight et al., 2005; Vidic et al., 2009; Temsch et al., 2010; Kubešová et al., 2010). Više od 50% vrsta iz ovih kategorija su hemikriptofite te hamefite i fanerofite (sa po ∼17%). Važno je napomenuti da oko 90%

kratkoživućih vrsta, od ukupnog uzorka, ima male i vrlo male genome, što je u saglasnosti sa mišljenjima da su minimalno generacijsko vrijeme i životni ciklus ilustrativni primjeri biljnih karaktera koje ograničava veličina genoma

(Bennett, 1972; Kubešová et al., 2010)

.

Vrlo interesantna č injenica jeste prisustvo vrsta sa velikim i vrlo velikim genomima (1C>14 pg; prema

[START_REF] Leitch | Phylogenetic analysis of DNA C values provides evidence for a small ancestral genome size in flowering plants[END_REF] 

u analiziranom uzorku sa serpentina.

Prisutnost različitih nivoa ploidije i B hromosoma kod nekih rodova Povećavanje

  Pomoću protočne citometrije moguće je lako detektirati i individue koje imaju jedan ili više B hromosoma, naročito kod vrsta sa srednjim i velikim genomima. Na ovaj način se može značajno ubrzati i olakšati izvođenje, kao i smanjenje troškova, različitih eksperimenta. Identifikacija broja B hromosoma kod vrsta koje imaju vrlo male ili male genome pomoću protočne citometrije ipak nije najsigurniji, pa time i uobičajen, metod kao što je prethodno spomenuto za takson Stachys recta var. chrysophea.

veličine genoma kroz auto i alopoliploidiju predstavlja jedan od najvažnijih mehanizama specijacije i evolucije vrsta u biljnom svijetu

(Soltis i Soltis, 1999)

. Alopoliploidija je primarna snaga hibridizacije koja višestruko utiče na variranje veličine genoma kroz poliploidne serije (Siljak Yakovlev et al., 2010 i reference u radu ), što je dokumentirano i kod niza rodova u Balkanskoj flori. U ovom radu je uočeno prisustvo različitih nivoa ploidije kod 10 vrsta, gdje najinteresantnije slučajeve predstavljaju Leucanthemum vulgare i Narcissus poeticus. Naime, L. vulgare je na serpentinskim podlogama u Bosni prisutan sa tri nivoa ploidije (2x, 4x i 6x), gdje se diploidi i tetraploidi mogu naći u simpatriji. Bila bi interesantna detaljnija studija ovog poliploidnog kompleksa, naročito na području Istočne Bosne, gdje su zabilježene simpatrijske populacije.

Otkrivanje individua sa različitim nivoom ploidije u istoj populaciji potvrdilo je dobru praksu mjerenja veličine genoma za tri i više individue s istog lokaliteta. U suštini, citometrija olakšava brzi pregled veličine genoma kako na nivou jedinki tako i na populacionom nivou, č ime je moguće relativno lako i brzo otkriti prisustvo poliploidije.

4.2.

Interakcija bijelog narcisa sa pH pripadajuće rizosfere i nekim biogenim elementima

  

	daleko većim nego u tlu (Baker, 1981; Brooks, 1998; Asemaneh et al., 2006; Kazakou et
	al., 2008).
	S obzirom da ultramafitna tla obično sadrže visoke koncentracije teških metala,
	biljna otpornost na toksičnost metala je posljedica strategije "izbjegavanja", koja je
	bazirana na smanjenju unosa metala u korjenov sistem, pohranjivanju metala u vakuole
	ćelija korjena i ograničenju translokacije metala u izdanke (Kruckerberg, 1984; Brooks,
	1987; Lasat i Kochian, 2000; Kazakou et al., 2008). S druge strane, neke biljke aktivno
	usvajaju metale što vodi njihovoj akumulaciji u visokim koncentracijama, ponekad

Ovo je prva, i vjerovatno jedinstvena studija o odnosu bijelog narcisa prema tlu u prirodnim populacijama, sa posebnim osvrtom na neke teške metale. Količina mineralnih hranjiva u biljkama varira kod različitih vrsta ovisno o genotipu, starosti individue, lokalitetu i sezoni, kao i o tipu tkiva i organa iste jedinke

[START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF]

. Adekvatne intercelularne koncentracije esencijalnih metalnih iona su neophodne za optimalni rast i razvoj biljaka. Međutim, veoma izražen disbalans u ishrani ispoljavaju biljke koje obitavaju na serpentinskim tlima

[START_REF] Proctor | Toxins, nutrient shortages and droughts: The serpentine challenge[END_REF]

.

2.3. Magnezij, kalcij i njihov molarni odnos Magnezij

  Mangan je važan biljni mikronutrijent neophodan za niz metaboličkih procesa: od različitih uloga u procesu fotosinteze, preko kofaktora za č itav niz enzima do neophodnog prisustva za obrazovanje nekih lipida i vitamina[START_REF] Buchannan | Biochemistry and molecular biology of plants[END_REF] (2004), gdje navode da neserpentinske biljke sadrže Ni u listu oko 0.1 5 mg kg 1 suhe materije, a serpentinske 20 100 mg kg 1 suhe materije.

	Na osnovu rezultata dobivenih analiziranjem prirodnih populacija bijelog analiziranim lokalitetima (Tabela 3). Koncentracije Mn u nadzemnim izdancima su biljku je kontroliran različitim mehanizmima, gdje fizikalni uvjeti (npr. salinitet, rizosfere s organskim kiselinama koje su izlučene iz korijena (Vert et al., 2002; Dudić et Značajan efekat na unos iona magnezija ima njegova interakcija sa drugim Adekvatna koncentracija Ca u biljnim listovima je 5 g kg 1 (Epstein 1972; Tisdale izdanka (Asemaneh et al., 2007). Izgleda da su selektivni unos Ca i eliminiranje Mg u Na osnovu dobivenih rezultata, može se konstatirati da vrsta Narcissus poeticus,
	narcisa moguće je reći da ta vrsta podnosi relativno velike promjene pH tla, ali i to da najčešće bile veće u odnosu na podzemne izdanke, što Marschner (2002) smatra temperatura, pH tla i prisustvo drugih metala) veoma utiču na procese unosa i al., 2007). Prema Epstein (1972) i Larcher (1995), količina željeza u biljnim tkivima kationima u rizosferi (Kozlowski i Pallardy, 1997; Marschner, 2002). Tako deficit Mg et al., 1993; Taiz i Zeiger, 1998). Kalcij je uvijek prisutan u većim koncentracijama u korjenovom sistemu važniji od različitih načina translokacije Ca i Mg iz korjenova u iako općenito akumulira veće količine analiziranih metala (Mn, Ni, Co, Fe), nije
	izbjegava bazičnija tla. očekivanim rezultatom. Izuzetak su bile individue u populaciji 13, kod kojih je količina Koncentracije Ni kod individua bijelog narcisa iz krečnjačkih populacija u ovoj akumulaciju (Marschner, 2002). serpentinofita je znatno veća u odnosu na normalne vrijednosti za biljke najčešće nije uzrokovan njegovim nedostatkom u tlu, već inhibicijom unosa u biljku stabljici i listovima biljaka, u odnosu na substrat (serpentin ili krečnjak), iako su izdanke (Asemaneh et al., 2007; Kazakou et al., 2008). hiperakumulator istih. Također, ova vrsta posjeduje fiziološke mehanizme koji joj
	Mn bila veća u lukovicama i korjenčićima nego u nadzemnim izdancima, što je studiji su bile u okviru raspona vrijednosti predloženih za neserpentinska i Iako su Palit et al. (1994) prezentirali da različite biljke sa serpentina pokazuju 100 -700 mg kg 1 suhe materije. (Marschner, 2002). S druge strane, veoma rijetko se uočava suficit Mg, jer većina biljaka serpentinske endemične vrste bolje adaptirane na niske koncentracije Ca (Marschner, Nije neuobičajeno da serpentinske vrste imaju molarne odnose Ca/Mg u omogućavaju da se prilagodi i preživi u različitim stresnim uslovima, naročito
	vjerovatno posljedica specifičnih odnosa iona u nešto dubljim i vlažnijim serpentinskim nekontaminirana tla. S obzirom da se nikl prvenstveno akumulira u epidermalnim povećan sadržaj Co od korijena preko stabljike do listova, u ovoj studiji su neke Iako biljke većinom akumuliraju željezo u listovima, bijeli narcis ga je uglavnom višak magnezija deponuje u vakuole (Stelzer et al., 1990). Ali, ako je ova pojava praćena 2002; Chaney et al., 2008). listovima veće i do nekoliko puta u odnosu na tlo gdje rastu. Na osnovu nekoliko izloženosti vodnom deficitu i visokim temperaturama.
	4.2.2. Mangan, nikl, kobalt i željezo tlima na ovom lokalitetu. ćelijama, dobiveni rezultati o većim koncentracijama u nadzemnim dijelovima biljaka individue imale veće koncentracije Co u podzemnim izdancima. Prema Freitas et al. deponovao u podzemnim organima (osim u dvije populacije, Tabela 3). Drugi sa vodnim deficitom, tad se koncentracija Mg u biljkama drastično povećava. U suštini, Izmjerene koncentracije Ca u podzemnim izdancima krečnjačkih individua su studija, čak 79% istraživanih serpentinskih vrsta su općenito imale veći lisni molarni
	Nikl je neophodni mikronutrijent za biljne organizme, koji utiče na rast biljaka, nisu iznenađujući. Međutim, kod određenog broja analiziranih individua iz (2004), listovi serpentinskih biljaka sadrže 10 puta veće koncentracije Co u odnosu na interesantan rezultat jeste relativno visoka koncentracija Fe u kompletnoj biljci, kako u bilo koja vrsta poremećaja u ishrani sa Mg (bilo deficit ili suficit) dovodi do smanjenja bile zadovoljavajuće i u adekvatnim granicama (Tabela 3). Međutim, primjećena je odnos Ca/Mg nego njihovo odgovarajuće tlo (Kruckeberg, 1950; Lyon et al., 1971;
	njihov metabolizam i starenje, vijabilnost sjemenki, ali i povećava otpornost biljaka na serpentinskih populacija (12 i 13), u podzemnim izdancima su zabilježene veće neserpentinske biljke. Međutim, rezultati dobiveni ovom studijom nisu potvrdili populacijama na krečnjaku tako i u serpentinskim. Ovi rezultati upućuju na to da se stope fotosinteze (Marschner, 2002). 4.3.
	neke bolesti (Brown et al., 1987; Marschner, 2002). koncentracije nikla. Ova pojava se nije mogla dovesti u korelaciju niti s ijednim pristupačno željezo nalazi u relativno velikim količinama u rizosferi bijelog narcisa. Prisusutvo skoro identičnih raspona koncentracija Mg u listovima istraživanih
	ispitivanim faktorom tokom ove studije. individua, bez obzira na geološki supstrat, u ovoj studiji ukazuje na ujednačeno
	odvijanje fotosintetskih procesa.
	Učestvuje u nizu fizioloških procesa u biljkama: inhibicijom sinteze etilena potpomaže Upravo ta sposobnost bijelog narcisa da reagira na sušne uvjete povećanim unosom Mg
	Marschner (2002) navodi da je većini biljnih vrsta kritična granica za Mn između 200 i razvoj nadzemnog izdanka; sprječava senescenciju; povećava toleranciju na vodni stres; i njegovom akumulacijom u podzemnim dijelovima, a u cilju zaštite fotosintetičkog
	5300 ppm u izdancima. Međutim, divljerastuće vrste imaju tendenciju da budu Prosječne potrebe biljaka za niklom su manje od 0.05 mg kg 1 suhe mase, što je pokazuje biocidalnu i antifungalnu aktivnost; regulira akumulaciju nekih alkaloida i aparata, mu najvjerovatnije omogućava opstanak u specifičnim serpentinskim Ovo se može dovesti u vezu sa životnom formom vrste (geofita) i njene potrebe da se
	tolerantnije na toksične stresove i veće koncentracije Mn od kultiviranih svojti (El Jaoual inače najmanja vrijednost za neki od esencijalnih elemenata. Međutim, kod biljaka sa neophodan je za fiksaciju azota (Buchannan et al., 2000; Taiz i Zeiger, 1998). habitatima. tkivo lukovice dodatno zaštiti sa rigidnim i debljim ćelijskim zidovima. Naime, vrsta Chiarucci et al., 2001, 2004). S druge strane, kod krečnjačkih populacija je pH rizosfere dosta većeg raspona (ujedno i za analizirani uzorak): od 4.64 do 7.85, bez iskazane pravilnosti u distribuciji, kako unutar tako i među populacijama. i Cox, 1998; Marschner, 2002). Minimalne i maksimalne koncentracije Mn zabilježene u uzorcima tla tokom ove studije su bile u očekivanim vrijednostima, a u odnosu na geokemizam uzorkovanih tala. Može se reći da bijeli narcis ima relativno zadovoljavajuću ishranu sa Mn na prirodnih staništa nije zabilježena niža vrijednost Ni od 0.2 mg kg 1 suhe mase (Hovmand, 1984). Uobičajeno, biljke sadrže 1-5 mg Ni kg 1 (Brooks, 1987; Reeves, 1992; Uren, 1992) i trpe značajnu fitotoksičnost pri vrijednostima ispod 100 mg Ni kg 1 Općenito, količina željeza je najveća u fotosintetički aktivnim organima Koncentracija Mg varira u različitim biljnim dijelovima te zavisi od starosti Kalcij, esencijalni makroelement, je neophodan za izgradnju ć elijskog zida, Molarni odnos Ca/Mg u listu se smatra najvećom specifičnošću serpentinskih ima karakterističnu ljetnu dormanciju tokom koje se odvija mejoza, i to neposredno U neserpentinskim tlima koncentracija Co se kreće od 1 do 40 ppm, i jedino u u serpentinskim tlima sa visokim pH, tako da njegova apsorpcija zavisi od acidifikacije Merschner, 2002). kongeneričkih parova, što je primarna posljedica regulacije translokacije od korijena do Međutim, distribucija Co u biljkama zavisi prvenstveno od same biljne vrste. Unos Co u 2007). Ovaj neophodni biljni mikronutrijent ima tendenciju da bude manje pristupačan su ∼80 mol g 1 suhe mase (Marschner, 2002). mnogih enzima i djeluje kao sekundarni nosač (Vitosh et al., 1994; Taiz i Zeiger, 1998; vrste, uglavnom, imaju lisni molarni odnos Ca/Mg manji od njihovih neserpentinskih vrlo visokim koncentracijama može uzrokovati anomalije kod biljaka (Palit et al., 1994). (Marschner, 2002), dok je kod nekih serpentinofita dominantna u korijenu (Dudić et al., individue i od pristupačnih nutrijenata u tlu. Prosječne vrijednosti magnezija u biljkama obezbjeđuje normalan transport i održavanje drugih elemenata u biljci, kofaktor je kongeneričkih parova u odnosu na neserpentinske (Kazakou et al., 2008). Serpentinske nakon izloženosti lukovice veoma visokim temperaturama i suši tokom ljeta.

ovoj studiji je uočeno da bijeli narcis ima relativno široki raspon vrijednosti pH rizosfere (pH 4.

64 7.85)

, što je vjerovatno jedan od razloga njegovog viševjekovnog uspješnog kultiviranja. Rizosfere serpentinskih individua imaju blago kiselu do neutralnu pH reakciju (5.39 6.95), najvjerovatnije uzrokovanu specifičnim kemijskim sastavom, prvenstveno suficitom magnezija. Prema

Ćirić (1984) 

i Resulović i Čustović (2002), značajan suvišak iona magnezija uvjetuje visok stepen zasićenosti bazama i blago kiselu do neutralnu reakciju, osim u A horizontu koji može biti nešto kiseliji (pH 5.5). S druge strane

[START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF] 

serpentinska tla generalno karakterizira sa pH 6.5 8.

Međutim, različiti fizički faktori (nagib, taloženje supstrata, plitkoća tla, relativna blizina matične podloge) značajno utiču na njihovo zakišeljavanje

[START_REF] Robinson | Plant available elements in soils and their influence on the vegetation over ultramafic ("serpentine") rocks in New Zeland[END_REF][START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF][START_REF] Millaleo | Manganese as essential and toxic element for plants: transport, accumulation and resistance mechanisms[END_REF]

.

U tlima se koncentracija Mg, najčešće, kreće u vrijednostima od 0.02 do 1%

[START_REF] Buchannan | Biochemistry and molecular biology of plants[END_REF][START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF][START_REF] Millaleo | Manganese as essential and toxic element for plants: transport, accumulation and resistance mechanisms[END_REF]

. Međutim, velika količina mangana u tlu je nepristupačna za biljke, što uglavnom ovisi o pH tla i koncentracije organskih materija u tlu.

Općenito, mangan se predominantno akumulira u izdancima, a ne u korjenovom sistemu. Stepen translokacije Mn od korjenova do izdanka varira znatno među vrstama i čak može značajno varirati i između ekotipova iste vrste (El Jaoual i Cox, 1998;

[START_REF] Marschner | Mineral nutrition of higher plants[END_REF]

. Prema Vitosh et al.

(1994)

, biljke su izložene deficijenciji Mn kada ga ima manje od 20 ppm u tkivima i suficijenciji pri vrijednostima iznad 300 ppm, dok Srednje vrijednosti Ni u tlu iznose 50 mg kg 1 , ali uopćeno variraju od 5 do 500 mg kg 1

[START_REF] Barceloux | Nickel[END_REF]

. Međutim, ukupni sadržaj nikla nije dobar pokazatelj njegove pristupačnosti, pošto mu se mobilnost povećava u kiselijim tlima

[START_REF] Brown | Influence of redox potential and plant species on the uptake of nickel and cadmium from soils[END_REF]

. Sadržaj nikla u biljkama ovisi od njegove pristupačnosti u tlu, biljne vrste, dijela biljke i sezone. Biljke koje rastu na serpentinima ili kontaminiranim tlima sa niklom, mogu da ga akumuliraju u značajnijim dozama. Poznato je da se biljke koje rastu na istom lokalitetu, ali i njihovi organi, mogu međusobno značajno razlikovati u sadržaju nikla

(Guha i Mitchell, 1966;[START_REF] Baker | Accumulators and excluders strategies in the response of plants to heavy metals[END_REF][START_REF] Baker | Metal tolerance[END_REF][START_REF] Reeves | The hyperaccumulation of nickel by serpentine plants[END_REF]

. U suštini, povećanjem pH vrijednosti tla opada količina izmjenljivog nikla, koji se tada taloži (ukupna količina nikla raste) i postaje nepristupačan za biljke

[START_REF] Chiarucci | A test of vegetation environment relationship in serpentine soils of Tuscany, Italy[END_REF][START_REF] Chiarucci | Vegetation ecology and conservation on Tuscan ultramafic soils[END_REF]

. (Kukier i Chaney, 2004). Nešto drugačiju skalu koncentracije Ni u biljkama su dali Freitas et al. U suštini, može se reći da je ukupna količina nikla u tkivima individua istraživanih serpentinskih populacija bila ekstremno visoka (10 40 mg kg 1 suhe materije) u odnosu na koncentraciju Ni uopćeno iskazanu kod neserpentinskih populacija (0.1 5 mg kg 1 suhe materije). Ipak, vrijednosti karakteristične za serpentinske Ni hiperakumulatore (Reeves et al., 1999; Wenzel et al., 2003) nisu nađene kod analiziranih individua. Kobalt je za neke biljne vrste beneficijalan, a za neke esencijalan mikroelement. njihove nalaze jer su koncentracije Co u skoro svim analiziranim individuama bile međusobno veoma bliske i relativno malih vrijednosti (Tabela 3). Slični rezultati su dobiveni i pri poređenju vrijednosti Co između populacija, s izuzetkom nekih individua iz populacije 13. Najvjerovatnije, različiti organi bijelog narcisa imaju slične zahtjeve za Co, tako da njegova koncentracija u tlima značajnije ne utiče na njegov unos, translokaciju i akumulaciju. Željezo je mikroelement neophodan za sintezu hlorofila, fiksaciju azota i aktivaciju nekih respiratornih enzima (Vitosh et al., 1994; Kozlowski i Pallardy, 1997; Marschner, 2002). Deficijencija željeza je rijetka pojava kod biljaka koje rastu na tlima čiji je pH manji od 7.0 (Kozlowski i Pallardy, 1997; Marschner, 2002). Međutim, željezo postaje toksično za biljke koje rastu na kiselim tlima (pH<5.0). Važno je istaknuti da visoka koncentracija mangana može dovesti do deficijencije željeza, i obratno (Vitosh et al., 1994). Međutim, zahvaljujući specifičnostima mikrostaništa, ove veće vrijednosti Fe nisu dovele do deficijencije Mn u biljkama, iako su relativno niske vrijednosti Mn izmjerene u lukovicama individua u populacijama 5, 10 i 12. Rizosfere ovih individua su imale pH vrijednosti ∼7.00 ili veće, što je dodatno otežavalo unos managana u biljku i protok željeza kroz organizam. 4.je esencijalan makronutrijent koji nije pronađen u elementarnom obliku u prirodi. Sastavni je dio klorofila, aktivator mnogih enzima i učestvuje u očuvanju integriteta ribosoma. Relativno je mobilan element i lako se translocira u biljkama (Vitosh et al., 1994; Kozlowski i Pallardy, 1997; Marschner, 2002).

Najvjerovatnije je stopa fotosinteze kod analiziranih individua bijelog narcisa u krečnjačkim populacijama zadovoljavajuća. Na to ukazuje prisustvo skoro dvostruko veće koncentracije Mg u nadzemnim nego u podzemnim izdancima, uzevši u obzir vrijeme prikupljanja materijala (faza punog cvjetanja). S druge strane, povećane koncentracije Mg kod serpentinskih individua (naročito u podzemnim izdancima) ukazuju na njihovu sposobnost prilagođavanja i opstanka u stresnijim uvjetima. blaga deficijencija Ca u listovima krečnjačkih individua, osim u populacijama 5 i 10. Za utvrđivanje razloga koji su doveli do ovakve raspodjele usvojenog kalcija neophodno je izvršiti dodatna istraživanja, s obzirom da ovo svojstvo može biti karakteristika bijelog narcisa ili posljedica specifičnih antagonističkih odnosa kalcija sa nekim drugim kationima i njegove slabe pokretljivosti. Kao što se i očekivalo, serpentinske individue su imale znatno manje akumuliranog kalcija u odnosu na krečnjačke. Uz to, koncentracije Ca u listovima su skoro uvijek bile manje u odnosu na podzemne izdanke, što je vjerovatno posljedica prisustva magnezija u vrlo visokim koncentracijama, kako u tlu tako i u tkivima. Zapravo, jednosmjeran transport Ca iz zone elongacije korijena do izdanka, te slaba pokretljivost i translokacija Ca iz izdanaka u korijen dovodi do toga da meristemska zona korijena koristi sav raspoloživi Ca

[START_REF] Kazakou | Hypotheses, mechanisms and trade offs of tolerance and adaptation to serpentine soils: from species to ecosystem level[END_REF]

. Sve ovo govori o prisustvu specijaliziranih fizioloških mehanizama za zaštitu vrhova korjenova i sprječavanje pojava nekroza na njima kod biljaka koje rastu na serpentinskim podlogama. Proctor i Woodell, 1975; Koenigs et al., 1982; Angelone et al., 1993; Nagy i Proctor, 1997; Lombini et al., 1998). Široko rasprostranjena pojava povećanih lisnih molarnih odnosa Ca/Mg kod serpentinskih vrsta i ekotipova u odnosu na niske molarne odnose Ca/Mg u tlima podržavaju mišljenja da su selektivna translokacija Ca do listova i inhibicija translokacije Mg i sekvestracije putem korjenova važne evolutivne adaptacije kod serpentinskih vrsta (Asemaneh et al., 2007; Kazakou et al., 2008). Smatra se da je za normalan rast biljaka neophodan odnos Ca/Mg>1. Međutim, serpentinske biljke su prilagođene na niske nivoe Ca (Main, 1981) ili niske odnose Ca/Mg (0.04 0.2) u njihovim supstratima

[START_REF] Brooks | Serpentine and its vegetation: a multidisciplinary approach[END_REF]

. Dobiveni rezultati o molarnim odnosima Ca/Mg u ovoj studiji, kako u biljkama tako i u tlima, potvrđuju gore navedeno. Osobenost bijelog narcisa se ogleda u tome da je njegov molarni odnos Ca/Mg podzemnog dijela bio veći nego kod nadzemnog dijela.

Citogenetika vrste Narcissus poeticus 4.3.1. Karakteristike kariotipa i organizacija heterohromatina

  

	heterohromatina (DAPI bandovi) i 5S rDNK lokusa u istom regionu. Satelitni par,
	karakteriziran prisustvom trećeg C banda na nivou SC, odgovara CMA bandu i 18S
	rDNK lokusu u našoj studiji. Prema prethodnim izvještajima (De Dominicis et al., 2002;
	D'Amato, 2004; Tucci et al., 2004), bojenje srebro nitratom je potvrdilo prisustvo NOR a
	u nivou SC na ovom hromosomskom paru.
	Svi ovi rezultati upućuju na konstantnost karakteristika osnovnog kariotipa vrste
	i organizacije heterohromatina na specijskom nivou, neovisno od geografske udaljenosti
	među populacijama te različitih tipova habitata u kojima obitavaju.
	Prisustvo tri regiona konstitutivnog heterohromatina je dokazano Giemsa
	bojenjem od strane De Dominicis et al. (2002) i D'Amato (2004). Naši rezultati potvrđuju
	da interkalarni band na hromosomskom paru 2 odgovara kolokalizaciji GC i AT
	bogatih DNK regiona i konstitutivnog heterohromatina (DAPI poslije FISH). Isti autori
	su također prezentirali da interkalarni C band na hromosomskom paru 4 nije prisutan u
	svim metafaznim figurama te nije bio vidljiv ni pri fluorohrom bojenju. Ipak, dvostruki
	FISH eksperiment, u našoj studiji, je pokazao kolokalizaciju nespecifičnog

Prethodne studije su pokazale da N. poeticus i N. radiiflorus predstavljaju jednu vrstu s izvjesnim morfološkim razlikama

(Webb, 1980; D'Amato, 2004;[START_REF] Tucci | Genetic diversity in Narcissus poeticus L. and N. radiiflorus Salisb. (Amaryllidaceae) in two different populations: AFLP and karyological studies[END_REF]

. Naši rezultati također potvrđuju identičnost kariotipa bez obzira na varijabilnost u morfologiji. Citogenetički rezultati dobiveni u ovoj studiji jedino ukazuju na varijabilnost u prisustvu, broju i strukturi B hromosoma u različitim populacijama.

Standardni kariotip

Narcissus poeticus opisan u ovoj studiji odgovara onim već opisanim od strane Wylie (1952), Maugini (1962), Brandham i Kirton (1987), De Dominicis et al. (2002), D'Amato (2004) i Tucci et al. (2004).

5. Količina DNK se povećava usljed prisustva triploidije i B hromosoma

  

	U ovoj studiji, intraspecijska varijacija u količini DNK je uočena između
	individua sa i bez B hromosoma. Dobiveni rezultat je u saglasnosti sa zaključcima Jones
	. U ovoj studiji prisustvo rijetkih individua sa et al. (2008) da su B hromosomi glavni izvor intraspecijske varijacije količine nuklearne
	translokacijama ili inverzijama je primjećeno u populacijama na subalpinskim livadama DNK. Srednja vrijednost za diploidne individue bez B hromosoma (25.81 pg) je vrlo
	i na serpentinskoj podlozi. Individua iz serpentinske populacije je posjedovala dodatni slična srednjoj vrijednosti (26.0 pg; Zonneveld, 2008). Ove vrijednosti su signifikantno
	subterminalni 18S rDNK lokus na samo jednom homologu para 3. Porijeklo ovog manje od vrijednosti (27.5 pg) date od strane Olszewska i Osiecka (1982). U poređenju
	prekobrojnog rDNK lokusa se može objasniti spontanom A B translokacijom, već naših podataka sa Zonneveldovim (2008), može se pretpostaviti da njegova č etiri
	diploidna uzorka, sa veličinom genoma većom od 26.0 pg, najvjerovatnije posjeduju
	najmanje jedan B hromosom. Zonneveld (2008) je, uostalom, primjetio da B hromosomi
	vjerovatno učestvuju u određenom procentu u ukupnoj veličini genoma kod nekih vrsta
	Količina nuklearne DNK je kod vrsta općenito konstantna, mada su uočene i
	intraspecijske varijacije. Veličina genoma se uvijek povećava usljed ploidije i prisustva B
	hromosoma (Jones, 1995; Leitch i Bennett, 2004; Jones et al., 2008).

primjećenom kod nekih vrsta

[START_REF] Jones | Tansley review no. 85: B chromosomes in plants[END_REF][START_REF] Camacho | B-chromosome evolution[END_REF] Jones i Houben, 2003;[START_REF] Ribeiro | Evidence for 'cross-talk' between A and B chromosomes of rye[END_REF]

. Taj tip translokacije je vrlo rijedak, s obzirom da vrlo mali dio B specifičnog hromatina može probiti jaku barijeru između A i B hromosoma

(Ribiero et al., 2004)

. Ovaj specifični slučaj je najvjerovatnije prisutan kod individue sa serpentinskog supstrata, naročito zbog dva uočena fenomena u ovoj populaciji: B hromosomi su se karakterizirali prisustvom aktivnih rRNA gena, i ova individua je posjedovala veću količinu DNK od individua bez B hromosoma. U stvari, primjećeno povećanje količine DNK može reflektirati prisustvo B hromosoma u kariotipu.

Posmatrani mutacioni događaj na ovim specifičnim habitatima može biti frekventniji, ali teško ustanovljiv ako invertirani regioni ne posjeduju bilo koji od vidljivih markera.

4.3.

u okviru sekcija Narcissus i Pseudonarcissus.

Srednja vrijednost veličine genoma prirodnih Balkanskih triploidnih individua je iznosila 34.55 pg, što je za otprilike 4 pg manje u odnosu na kultivirane triploide

(Zonneveld, 2008)

. Ipak, veličina genoma triploidne individue sa 3 B hromosoma, u ovoj studiji, je vrlo bliska vrijednostima Zonneveldovih (2008) uzoraka. Bilo bi vrlo interesantno uporediti kariotipove i banding obrasce Zonneveldovih uzoraka sa kariotipovima i bandingom triploida istraživanim u ovoj studiji u cilju otkrivanja uzroka ove razlike u veličini genoma.

Također bi bilo korisno istražiti odnose između ukupne veličine nuklearne DNK i broja B hromosoma i/ili količine heterohromatina, što je jedan od ciljeva u tekućoj citogenetičkoj studiji roda Narcissus.

Synthèse de la thèse : Réponse du génome aux stress abiotiques: le cas des plantes serpentinophytes en Bosnie centrale

  Les habitats sur le substrat de serpentine présentent un environnement hostile pour le développement de plantes. Il s'agit des roches à lente érosion dont les sols sont principalement caractérisés par un faible rapport Ca/Mg, de faibles concentrations de macronutriments, de haute teneur en métaux lourds (Ni, Cr, Co, Fe, Al), et par des valeurs de pH allant de basique jusqu'à ultrabasique. La spécialisation édaphique des plantes subissant ces conditions résulte dans leur adaptation spécifique qui a été décrite comme le «syndrome de la serpentine . Les végétaux adaptés aux conditions des sols sur serpentine sont classés comme des serpentinophytes. Ces plantes sont souvent morphologiquement et physiologiquement adaptées à cet environnement extrême face à une forte concentration de métaux lourds, et des stress hydrique, thermique et nutritionnel. Les habitats sur serpentine sont caractérisés par un faible nombre d'espèces mais un haut niveau d'endémisme.

  Leontodon crispus Vill.

		LGF	2n lit	2n	x	2C	1C	1Cx	N	S
		H scap	12	12	2	1.74	0.87	0.87		B
						(0.01)	(851)		
		H scap	18,30,32			1.17	0.59			A
						(0.01)	(572)		
		H scap	16,18,36			5.21	2.61			B
						(0.09)	(2548)		
		H scap	28,30,56			1.52	0.76			B
						(0.05)	(743)		
	Leucanthemum vulgare Lam.	S lig dec	18	18	2	(0.01) 0.99	(484) 0.50	0.50		A
	Leucanthemum vulgare Lam.	H scap	12,24,36	24	4	(0.04) 2.37	(1159) 1.19	0.60		B
	Leucanthemum vulgare Lam.	H scap	28,30			(0.01) 0.73	(357) 0.37			A
	Ligustrum vulgare L.								
		H caesp	12,24			1.80	0.90			B
						(0.01)	(880)		
	Lilium bosniacum (G.								
	Beck) G. Beck ex Fritsch	H scap	24	24	2	5.46	2.73	2.73		B
						(0.03)	(2670)		
	Lilium martagon L.	Ch herb	30,32,36,43,			3.18	1.59			B
		rept	44,45			(0.02)	(1555)		
	Linaria concolor Gris.		34,51			1.55	0.78			A
	var. rubioides (Vis. et					(0.04)	(758)		
	Panč.) Maly								

  Waldst. & Kit.

	LGF	2n lit	2n	x	2C	1C	1Cx	N	S
	H scap	14,21,28,35,			1.60	0.80			A
		42			(0.04)	(782)			
	Ch frut	40	40	2	17.20	8.60	8.60		E
	semp				(0.17)	(8411)			
	P caesp	38,57,76	38	2	0.90	0.45	0.45		A
	dec/P scap				(0.03)	(440)			
	dec								
	P caesp dec	38	38	2	0.87	0.44	0.44		A
					(0.03)	(425)			
	P caesp dec	38	38	2	0.86	0.43	0.43		A
					(0.03)	(421)			
	H scap	16,18,32	32*	4*	2.24	1.12	0.56		B
	semiros				(0.03)	(1095)			
	G rhiz	36	36	2	21.67	10.84	10.84		E
						(10597)			
	P caesp dec	36,38	36	2	26.36	13.18	13.18		E
					(0.36)	(12890)			
	P caesp dec	36,38			23.02	11.51			F
					(0.46)	(11257)			
		28,54	28	4	1.12	0.56	0.28		B
					(0.03)	(548)			
	Rubus idaeus L.	16	16	2	2.44	1.22	1.22		B
						(1193)			
	147								

Porodica

Veronica spicata L.

Veronica urticifolia Jacq.

Veronica urticifolia Jacq.

Viburnum lantana L.

Viburnum opulus L.

Vicia cracca L.

Vicia villosa Roth

Viola beckiana Fiala

Viola tricolor L.

Viscaria vulgaris (Röhl.) Bernh.