Patricia Melnyk 
  
Hélène 
  
Dr Claudia Simões-Pires 
  
Dr Attilio Di 
  
Charlotte Gauthier 
  
Evelyn Winter 
  
Doriane Lorendeau 
  
Lauriane Dury 
  
Gustavo Jabor- Gozzi 
  
Rachad Nasr 
  
Amanda Andrade-Pires 
  
Dr Léa Payen 
  
Antoine Ben 
  
Cédric, Doudou, Elina Emma Ben 
  
Jeff Julien 
  
Laurent, Luma, Matt, Momo Kim 
  
Noémie 
  
Sam 
  
Vinicus Simon 
  
Alex Kim 
  
Nbd2 
  
SYNTHÈSE Activité Conception 
  
Étude Biologique 
  
Computationnelle 
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
TMD1 TMD2 Membrane cellulaire Cytoplasme

Keywords: ABC ATP-Binding Cassette ABCP ABC transporter in Placenta ADME Absorption, Distribution, Métabolisme et Excrétion ADN

REMERCI EMENTS

Je souhaite dédier ces quelques lignes aux personnes qui m'ont permis de mener à bien ce projet, qui m'ont suivi tout au long de ces trois années et m'ont tant apporté d'un point de vue scientifique, professionnel et humain. En premier lieu, je tiens à dire un grand merci au Pr. Ahcène Boumendjel, pour son soutien au quotidien, sa disponibilité, son oeil avisé et pour m'avoir donné la liberté de construire mon projet. Je remercie le Dr. Basile Pérès, pour tout ce qu'il m'a appris, ses « méthodes à la Saïd », ses blagues, son énergie infinie, sa motivation et sa bonne humeur éternelle. Je

LE CANCER

Le corps humain est constitué de cellules dont les formes, les tailles et les fonctions sont très diverses. Suite à différents évènements génétiques conduisant à la mutation de certains gènes, certaines cellules deviennent indisciplinées et résistantes aux systèmes de réparation de l'ADN et à l'apoptose, processus de mort programmée des cellules. Ces cellules, appelées cellules cancéreuses, sont donc des cellules altérées capables de se multiplier de manière anarchique, de s'adapter, de survivre et de se disséminer au sein de l'organisme. Les cellules cancéreuses commencent à proliférer conduisant à la formation de regroupement de cellules anormales appelées tumeurs. Une tumeur devient maligne lorsque les cellules cancéreuses débutent leur migration vers d'autres organes via le sang ou la lymphe : on parle alors de métastases. Il existe plus d'une centaine de cancers, définis en fonction de la cellule initiale dont ils sont issus. Une meilleure compréhension des différents mécanismes et des molécules impliquées dans leur développement a permis la mise au point de nouveaux traitements et médicaments.

I.2. LES TRAITEMENTS

La chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie constituent aujourd'hui les grandes catégories de traitement des cancers. Ces traitements dépendent du type de tumeur et de leur gravité. Ces stratégies peuvent être mises en oeuvre indépendamment, employées successivement ou associées les unes aux autres.

I.2.1. La chirurgie

La chirurgie est un traitement locorégional qui permet d'extraire les tumeurs les plus importantes. Ce traitement est en général préconisé pour le cas des tumeurs solides, non métastatiques. Néanmoins, elle ne peut éliminer toutes les cellules cancéreuses et doit être souvent assistée de traitements complémentaires tels que la radiothérapie ou la chimiothérapie.

I.2.2. La radiothérapie

La radiothérapie est également un traitement locorégional des cancers. Cette technique consiste à utiliser des rayonnements capables d'altérer la composition de l'information génétique des cellules cancéreuses afin de les rendre incapables de se reproduire, tout en préservant le mieux possible les tissus sains et les organes à proximité.

Les traitements par chirurgie et radiothérapie concentrent leur action au niveau de la tumeur et de sa région avoisinante. Cependant, en cas de cancer en phase de généralisation, les traitements les plus efficaces sont les traitements systémiques tels que la chimiothérapie.

I.2.3. La chimiothérapie

Les traitements par chimiothérapie consistent à injecter, le plus souvent par voie intraveineuse, des substances xénobiotiques dont le but est d'enrayer ou de ralentir l'évolution de la prolifération des cellules tumorales. Ils s'utilisent dans le cas de métastases ou de cancers non localisés, comme ceux qui atteignent les globules blancs. Les médicaments employés tuent les cellules en agissant sur l'ADN, sur l'ARN ou sur les protéines des cellules, bloquant certaines étapes de la division cellulaire.

La chimiothérapie peut présenter quatre objectifs distincts :

la chimiothérapie à visée curative, dont l'objectif est de détruire toutes les cellules cancéreuses métastatiques. C'est l'unique traitement capable de traiter les cancers non localisés comme les leucémies ou les cancers généralisés ; -la chimiothérapie néo-adjuvante qui permet de réduire la taille de la tumeur avant un traitement localisé (chirurgie ou radiothérapie) ; -la chimiothérapie adjuvante qui permet d'éliminer les cellules cancéreuses résiduelles éventuelles après un traitement localisé ; -la chimiothérapie palliative dont l'objectif n'est pas de guérir du cancer mais de ralentir l'évolution de la maladie. Elle permet de soulager et de prolonger l'espérance de vie des patients.

Les agents anticancéreux peuvent être classés selon leur mécanisme d'action thérapeutique :

les agents antimétabolites. Ils inhibent la synthèse des acides nucléiques, première étape nécessaire à toute multiplication cellulaire. On peut citer le méthotrexate (Figure 1) qui inhibe la dihydrofolate réductase, enzyme capitale dans le métabolisme de l'acide folique, indispensable à la synthèse de bases nucléiques ; 1 les agents alkylants. Ils créent un lien chimique covalent fort avec les nucléotides de la chaîne ADN empêchant la réplication et conduisant à la mort cellulaire. C'est le cas du cisplatine, 3 un complexe à base de platine (Figure 3) ; les poisons du fuseau cellulaire. 5 Ils agissent pendant la mitose, lorsque les chromosomes dédoublés migrent le long des tubules du fuseau cellulaire, vers un des deux pôles, avant la séparation des cellules. Ils entraînent une désorganisation des chromosomes au moment de la mitose. La vincristine, le paclitaxel (taxol) et son analogue, le docétaxel (taxotère), font partis de cette classe d'anticancéreux (Figure 5). 6,7 N les inhibiteurs de la tyrosine kinase. Ils bloquent les tyrosines kinases, protéines impliquées dans le processus de transduction du signal et intervenant dans l'initiation, la croissance et la genèse des tumeurs humaines. Parmi ces inhibiteurs, on peut citer l'imatinib, premier inhibiteur de la tyrosine kinase utilisé avec succès dans les tumeurs solides ou encore le sorafénib (Figure 6). D'autres thérapies ciblées, telles que l'hormonothérapie, l'immunothérapie ou encore les anticorps monoclonaux émergent afin de réduire les effets néfastes sur les cellules non cancéreuses.

Dans certains cas, les cellules tumorales sont ou deviennent résistantes aux agents anticancéreux, conduisant ainsi à l'échec du traitement : on appelle ce phénomène la chimiorésistance ou phénotype MDR (Multidrug resistance).

I.3. LE PHÉNOTYPE MDR

L'efficacité de la chimiothérapie peut être limitée par le développement d'une résistance des cellules cancéreuses envers l'agent anticancéreux employé. Cette résistance peut être naturelle. En effet, certains cancers, tels que les cancers du rein ou de la thyroïde, sont naturellement résistants à tous les agents anticancéreux. Dans d'autres cas, les cellules cancéreuses, dans un premier temps sensibles, acquièrent une résistance au cours du traitement. Plusieurs mécanismes peuvent conduire à une résistance (Figure 7). 9 Parmi ces mécanismes, on retrouve :

la diminution de la pénétration des agents anticancéreux au sein de la cellule : une mauvaise vascularisation ou la présence de barrières, telles que la barrière hématoencéphaliques, peuvent rendre difficile l'accessibilité des médicaments aux cellules ;

le métabolisme du médicament : Au sein de l'organisme, l'agent anticancéreux peut subir des processus de métabolisation qui comprennent trois phases : la phase I, ou métabolisme oxydant, au cours de laquelle les médicaments sont métabolisés par des enzymes tels que les cytochromes P450. [START_REF] Guengerich | Cytochrome P450s and other enzymes in drug metabolism and toxicity[END_REF] On peut citer l'enzyme CYP3A4 impliquée dans la métabolisation du docétaxel en son dérivé hydroxylé inactif. [START_REF] Marre | Hepatic biotransformation of docetaxel (Taxotere) in vitro: involvement of the CYP3A subfamily in humans[END_REF][START_REF] Engels | Effect of cytochrome P450 3A4 inhibition on the pharmacokinetics of docetaxel[END_REF] Le paclitaxel est également métabolisé par CYP3A4 mais aussi par l'enzyme CYP2C8. 13 Les xénobiotiques peuvent également être métabolisés par des enzymes de phase II par conjugaison, notamment au glutathion (GSH), via l'activité de la glutathion-S-transférase (GST). Les enzymes de phase II protègent généralement les cellules normales d'agents endogènes ou exogènes électrophiles induisant un stress oxydant. Ces agents sont alors conjugués au GSH afin de former des complexes GSH-agents moins toxiques et facilement transportables hors des cellules. Ce même mécanisme est observé chez les cellules cancéreuses conduisant ainsi à une résistance aux agents antinéoplasiques en réponse au stress oxydant induit. [START_REF] Backos | The role of glutathione in brain tumor drug resistance[END_REF][START_REF] Hao | Acquired resistance to cisplatin and doxorubicin in a small cell lung cancer cell line is correlated to elevated expression of glutathione-linked detoxification enzymes[END_REF] Ces métabolites conjugués sont ensuite transportés hors de la cellule via des transporteurs membranaires constituant la phase III ; Efflux des médicaments -l'altération de la cible du médicament : on peut observer des altérations quantitatives de la cible par augmentation de la concentration de la cible (la concentration de médicament devient alors insuffisante) ou diminution de la concentration de la cible (comme, par exemple, la diminution du taux de topoisomérases qui réduit l'activité des inhibiteurs de ces enzymes). Des altérations qualitatives telles que des mutations génétiques ponctuelles peuvent également modifier la cible. Des modifications conformationnelles peuvent empêcher la reconnaissance du principe actif. Par exemple, des mutations dans le gène codant pour la topoisomérase II confèrent une résistance à l'étoposide ou à l'amsacrine ; [START_REF] Nitiss | Mutations in the gyrB domain of eukaryotic topoisomerase II can lead to partially dominant resistance to etoposide and amsacrine[END_REF] l'accroissement de la réparation des lésions de l'ADN : Il existe plusieurs mécanismes de réparation de l'ADN qui permettent aux cellules cancéreuses d'échapper à la cytotoxicité induite par les agents anticancéreux ;

la mutation de protéines impliquées dans le mécanisme d'apoptose : on observe l'inactivation de protéines pro-apoptotiques tels que la protéine p53, mutée dans 50% des cancers, induisant l'échec de l'apoptose et donc la chimiorésistance. [START_REF] Levine | p53, the cellular gatekeeper for growth and division[END_REF] La surexpression de protéines anti-apoptotiques telles que la protéine Bcl-2 [START_REF] Walton | Constitutive expression of human Bcl-2 modulates nitrogen mustard and camptothecin induced apoptosis[END_REF][START_REF] Allouche | Influence of Bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells[END_REF] ou la protéine TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) peuvent également être à l'origine du phénotype MDR ; [START_REF] Lucibello | TCTP is a critical survival factor that protects cancer cells from oxidative stress-induced cell-death[END_REF] la diminution de l'accumulation intracellulaire des médicaments : la surexpression de protéines membranaires, agissant comme pompes à efflux et capables de transporter les agents anticancéreux hors des cellules cancéreuses entraîne une réduction de leur concentration intracellulaire et donc de leur efficacité. Les cellules développent alors une résistance croisée à un grand nombre de xénobiotiques présentant une variété chimique et fonctionnelle étendue. Les protéines membranaires impliquées dans ce phénotype MDR appartiennent à la superfamille des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette).

II. Les transporteurs ABC

II.1. GÉNÉRALITÉS

Les transporteurs ABC constituent une large famille de protéines que l'on retrouve dans tout le règne vivant. En 1986, Higgins décrit pour la première fois une famille de protéines bactériennes se liant à l'ATP et impliquées dans le transport de composés (substrats). [START_REF] Higgins | A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria[END_REF] Ces protéines membranaires sont capables de transporter un grand nombre de substrats endogènes ou exogènes, des ions aux macromolécules, en utilisant l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP. Chez Escherichia coli, 5% de la totalité du génome code pour ces transporteurs ABC qui sont au nombre de 80. [START_REF] Blattner | The complete genome sequence of Escherichia coli K-12[END_REF] Le génome des plantes en comporte plus de 100. [START_REF] Kang | Plant ABC Transporters[END_REF] On dénombre 48 gènes distincts codant pour les transporteurs ABC dans le génome humain.

Ces gènes peuvent être divisés en sept sous familles distinctes, de ABCA à ABCG, et classés selon leur organisation structurale et l'homologie de leurs acides aminés (Tableau 1). 

II.2. TOPOLOGIE GÉNÉRALE DES TRANSPORTEURS ABC

Malgré leur diversité, les transporteurs ABC présentent des homologies de structure.

II.2.1. Les domaines transmembranaires (TMDs)

Pour la plupart des transporteurs ABC eucaryotes, chaque TMD est constitué de 6 hélices αtransmembranaires. Néanmoins dans certains cas, on peut dénombrer 5 à 11 hélices pour un même TMD. [START_REF] Biemans-Oldehinkel | ABC transporter architecture and regulatory roles of accessory domains[END_REF] Un transporteur contient ainsi entre 12 et 20 segments transmembranaires. [START_REF] Rees | ABC transporters: the power to change[END_REF][START_REF] Ter Beek | Structural diversity of ABC transporters[END_REF] Les hélices α-transmembranaires des deux TMDs sont disposées de sorte qu'elles puissent former un passage transmembranaire à travers lequel les substrats pourront être transportés.

Les TMDs sont reliés par des boucles extracellulaires et intracellulaires pouvant être importantes dans la reconnaissance des substrats, dans le mécanisme de transport ou dans l'interaction avec les NBDs. [START_REF] Dawson | Structure of a bacterial multidrug ABC transporter[END_REF] Tout en possédant une topologie similaire, les TMDs ne présentent généralement qu'une faible conservation de séquence entre les transporteurs. Ce manque de conservation de structure primaire est fortement lié à la diversité des substrats que sont capables de transporter les transporteurs ABC.

Des études cristallographiques et de mutagénèse indiquent le comportement différent des substrats sur les transporteurs ABC. Pour un grand nombre d'entre eux, tels que le transporteur maltose MalK issu d'Escherichia coli, [START_REF] Chen | Molecular mechanism of the Escherichia coli maltose transporter[END_REF][START_REF] Oldham | Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis[END_REF] le substrat interagit en un point distinct avec les résidus des hélices α-transmembranaires. Au contraire, pour d'autres transporteurs, tels que la protéine P-gp, différents sites d'interaction avec les substrats se chevauchant ont été décrits faisant de cette protéine un transporteur polyspécifique. [START_REF] Loo | Simultaneous binding of two different drugs in the binding pocket of the human multidrug resistance P-glycoprotein[END_REF][START_REF] Li | Refined structures of mouse P-glycoprotein[END_REF] II.2.2.

Les domaines nucléotidiques cytoplasmiques (NBDs)

Grâce à la forte conservation de leurs motifs, les NBDs représentent la marque de fabrique des transporteurs ABC. Les NBDs constituent le moteur énergétique des transporteurs ABC.

En effet, l'ATP se fixe au NBDs et s'hydrolyse afin de fournir l'énergie nécessaire au transport de substrats.

Un grand nombre de structures cristallographiques des NBDs, telles que les structures de l'histidine perméase, [START_REF] Hung | Crystal structure of the ATP-binding subunit of an ABC transporter[END_REF] de Rad50 34 et de MJ0796 [START_REF] Smith | ATP binding to the motor domain from an ABC transporter drives formation of a nucleotide sandwich dimer[END_REF] Chacun de ces motifs, détaillés ci-dessous, joue un rôle unique dans l'hydrolyse de l'ATP:

les motifs Walker A et Walker B, [START_REF] Walker | Distantly related sequences in the alpha-and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold[END_REF] communs aux protéines qui fixent et hydrolysent l'ATP. Le motif Walker A permet la liaison à l'ATP/ADP par la chaîne phosphate. [START_REF] Chen | A tweezers-like motion of the ATP-binding cassette dimer in an ABC transport cycle[END_REF] 

II.2.3. Organisation générale des transporteurs ABC

Comme nous l'avons vu précédemment, ces transporteurs ABC comportent quatre domaines distincts, deux NBDs, sièges de l'hydrolyse de l'ATP et deux TMDs, lieu de fixation et de passage des substrats. Ces quatre domaines peuvent s'organiser de différentes façons. Chez les bactéries, ces quatre domaines peuvent être sous la forme d'une combinaison de sous unités individuelles ou appariées ou une combinaison de NBDs et/ou TMDs fusionnés. [START_REF] Holland | ABC-ATPases, adaptable energy generators fuelling transmembrane movement of a variety of molecules in organisms from bacteria to humans[END_REF] Chez les eucaryotes, la majorité des transporteurs ABC sont constitués d'un seul polypeptide comportant ces quatre domaines fonctionnels. Certains sont constitués à partir de demitransporteurs assemblés sous la forme d'homodimères ou d'hétérodimères. L'organisation des quatre domaines la plus répandue est représentée dans la Figure 9. A l'heure actuelle, l'obtention de structures cristallines 3D haute résolution de protéines membranaires reste encore un challenge pour la biologie structurale. A ce jour, les structures de plus d'une dizaine de transporteurs seulement ont été résolues. Parmi eux, les transporteurs d'origine procaryote sont :

-BtuCD, importateur de la vitamine B12 ; [START_REF] Locher | coli BtuCD structure: a framework for ABC transporter architecture and mechanism[END_REF] le transporteur ABC codé par les gènes HI1470 et HI1471 ; [START_REF] Pinkett | An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter[END_REF] -Sav1866, un transporteur ABC bactérien (Figure 10A) ; [START_REF] Dawson | Structure of a bacterial multidrug ABC transporter[END_REF] -MsbA ; [START_REF] Ward | Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist[END_REF] le transporteur du maltose ; [START_REF] Chen | Molecular mechanism of the Escherichia coli maltose transporter[END_REF][START_REF] Oldham | Crystal structure of the maltose transporter in a pretranslocation intermediate state[END_REF][START_REF] Oldham | Crystal structure of a catalytic intermediate of the maltose transporter[END_REF] le transporteur de molybdate ModB2C2 [START_REF] Hollenstein | Structure of an ABC transporter in complex with its binding protein[END_REF] complexé avec sa protéine de liaison ModA ainsi que le transporteur molybdate/tungstate ModBC ; [START_REF] Gerber | Structural basis of transinhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter[END_REF] le transporteur de méthionine MetNi ; [START_REF] Kadaba | The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation[END_REF] l'hétérodimère TM287/288 ; [START_REF] Hohl | Crystal structure of a heterodimeric ABC transporter in its inward-facing conformation[END_REF] le transporteur antibactérien McjD. [START_REF] Choudhury | Structure of an antibacterial peptide ATP-binding cassette transporter in a novel outward occluded state[END_REF] La P-gp de Caenorhabditis elegans chez le nématode a également été résolue [START_REF] Jin | Crystal structure of the multidrug transporter P-glycoprotein from Caenorhabditis elegans[END_REF] ainsi que les transporteurs ABC mitochondriaux Atm1 51 et NaAtm1. [START_REF] Lee | Structural basis for heavy metal detoxification by an Atm1-type ABC exporter[END_REF] Pour finir trois structures ont été résolues chez les mammifères :

-ABCB10, un demi-transporteur de la mitochondrie chez l'homme (Figure 10B) ; [START_REF] Shintre | Structures of ABCB10, a human ATP-binding cassette transporter in apo-and nucleotide-bound states[END_REF] la glycoprotéine P murine (Figure 10C) ; [START_REF] Aller | Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding[END_REF] un homologue de la P-gp, CmABCB1. [START_REF] Kodan | Structural basis for gating mechanisms of a eukaryotic P-glycoprotein homolog[END_REF] A) B) C)

Figure 10 : Structures cristallographiques de Sav1866 (A), [START_REF] Dawson | Structure of a bacterial multidrug ABC transporter[END_REF] d'ABCB10 (B) [START_REF] Shintre | Structures of ABCB10, a human ATP-binding cassette transporter in apo-and nucleotide-bound states[END_REF] et de la P-gp murine (C). [START_REF] Aller | Structure of P-glycoprotein reveals a molecular basis for poly-specific drug binding[END_REF] Ces structures tridimensionnelles soulignent la large variabilité conformationnelle au sein des A partir des données biochimiques, biophysiques et structurales à disposition, plusieurs modèles du cycle de l'hydrolyse de l'ATP ont été mis au point. Trois modèles se démarquent des autres, le modèle « Switch » développé par Higgins et Linton, [START_REF] Walker | Distantly related sequences in the alpha-and beta-subunits of ATP synthase, myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold[END_REF][START_REF] Chen | A tweezers-like motion of the ATP-binding cassette dimer in an ABC transport cycle[END_REF] le modèle « Constant contact » développé par Jones et George [START_REF] Jones | Opening of the ADP-bound active site in the ABC transporter ATPase dimer: evidence for a constant contact, alternating sites model for the catalytic cycle[END_REF] et, dans sa continuité, le modèle « Reciprocating twin channel ». [START_REF] Jones | A reciprocating twin-channel model for ABC transporters[END_REF] Nous nous focaliserons sur les mécanismes des exportateurs ABC.

II.3.1. Le modèle « Switch »

Le modèle « Switch » [START_REF] Higgins | The ATP switch model for ABC transporters[END_REF][START_REF] Linton | Structure and function of ABC transporters: the ATP switch provides flexible control[END_REF] suppose que le transport de substrat résulte d'une alternance de changements conformationnels des NBDs et TMDs. Le moteur du transport consiste en un « switch » on/off entre deux formes des NBDs, l'une étant un dimère fermé de NBDs à l'interface duquel deux molécules d'ATP sont intercalées ou « prise en sandwich », la seconde étant une forme ouverte dissociée résultant de l'hydrolyse de l'ATP et de la libération d'ADP et de phosphate inorganique (Pi). Le passage de la forme fermée à la forme ouverte des NBDs induit un changement de conformation des TMDs qui facilite la translocation du substrat. A l'inverse, le passage de la forme ouverte à la forme fermée permet de réinitialiser le transporteur pour un prochain cycle de transport. Ces travaux se basent ainsi sur l'idée d'un fonctionnement en décalage à « 180° » des NBDs.

Cette idée fut par la suite exploitée par la même équipe et appliquée à l'ensemble du transporteur pour conduire à un nouveau modèle : le modèle « reciprocating twin channel ». 57

II.3.3. Le modèle « Reciprocating twin channel »

Dans ce nouveau modèle, deux voies de translocation des substrats séparées fonctionnent de manière décalée et alternative au sein des TMDs, et de manière couplée avec les cycles catalytiques de l'hydrolyse de l'ATP au sein des NBDs. La séquence de liaison à l'ATP, de son hydrolyse, et de la libération des produits de l'hydrolyse dans chaque site actif des NBDs est directement couplée à la séquence analogue de liaison de substrat, translocation et libération du substrat au sein de l'une des deux voies de translocation au niveau des TMDs. Les différentes étapes de ce mécanisme sont (Figure 14) :

étape 1 : le transporteur est sur le point de se lier à un substrat au niveau du site de haute affinité en conformation « inward-facing » de la voie 2. Le substrat transporté attend sa dissociation au niveau de la voie 1 ;

étape 2 : le substrat se lie au niveau de la voie 2, l'autre substrat est libéré de la voie 

Les pathologies génétiques

Les transporteurs ABC humains sont impliqués dans l'export cellulaire d'un grand nombre de molécules incluant le cholestérol et les stérols, des lipides et des dérivés de l'acide rétinoïque, de l'acide biliaire, du fer, des nucléosides ou de peptides. L'altération du transport de l'une de ces substances conduit à un grand nombre de maladies génétiques (Tableau 2).

De plus, certains transporteurs ABC humains, exprimés dans la région du cerveau, sont impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Les symptômes de cette maladie ont pour origine l'accumulation de peptides β-amyloïdes dans les cellules neuronales. Cette accumulation, issue d'un dérèglement de la formation ou de la dégradation de ces peptides, peut être due à certains transporteurs ABC impliqués de manière directe ou indirecte. Parmi ces transporteurs, on retrouve ABCA1/A2, ABCB1, ABCC1, ABCG1/G2/G4 61 et plus récemment ABCA7. 62

II.4.2. Les transporteurs ABC impliqués dans le phénotype MDR

Certains transporteurs ABC sont largement exprimés dans le foie, le placenta et au sein de la barrière hémato-encéphalique où ils sont impliqués dans la détoxification contre des molécules organiques hydrophobes. [START_REF] Gottesman | Multidrug resistance in cancer: role of ATPdependent transporters[END_REF] Cependant, lorsque ces transporteurs sont surexprimés au sein des membranes plasmiques des cellules cancéreuses, ils sont alors capables de transporter activement les agents anticancéreux, réduisant ainsi leur concentration intracellulaire et donc leur efficacité et conduisant à l'échec du traitement par chimiothérapie.

Ce mécanisme de résistance a été décrit pour la première fois en 1973 par l'équipe de Dano qui a observé un transport massif de daunomycine au sein de cellules cancéreuses résistantes de l'ascite du carcinome d'Ehrlich. [START_REF] Dano | Active outward transport of daunomycin in resistant Ehrlich ascites tumor cells[END_REF] Le premier transporteur impliqué dans le phénotype MDR identifié est la glycoprotéine P, appelée aussi P-gp, ABCB1 ou MDR, découvert par l'équipe de Juliano en 1976. [START_REF] Juliano | A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants[END_REF] La seconde protéine identifiée est la protéine codant pour le gène ABCC1 appelée Multidrug resistance associated protein 1 ou MRP1 et découverte par l'équipe de Code en 1992. [START_REF] Cole | Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line[END_REF] Par la suite, tous les transporteurs appartenant à la sous-famille C, à l'exception d'ABCC6 et ABCC12 se sont révélés être impliqués dans le phénotype MDR. [START_REF] Chen | Multidrug resistance proteins (MRPs/ABCCs) in cancer chemotherapy and genetic diseases[END_REF] Pour finir, la dernière protéine à être impliquée dans le phénomène de chimiorésistance est la protéine ABCG2 ou BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) découverte par plusieurs équipes vers la fin des années 90. [START_REF] Doyle | A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells[END_REF][START_REF] Allikmets | A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance[END_REF][START_REF] Miyake | Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes[END_REF] II.4.3.

Lutte contre la chimiorésistance due aux transporteurs ABC

Afin de contrecarrer la chimiorésistance induite par les transporteurs ABC, différentes stratégies thérapeutiques, ciblées, alternatives ou complémentaires aux traitements conventionnels ont vu le jour, avec plus ou moins de succès.

II.4.3.1 Le développement d'inhibiteurs des transporteurs ABC dans le but de resensibiliser les cellules cancéreuses résistantes

L'une des stratégies les plus directes et faciles à mettre en place afin de combattre le phénotype MDR est le développement de nouveaux modulateurs capables de bloquer l'efflux induit par les transporteurs ABC. Depuis 1980, de nombreux travaux se sont concentrés sur la recherche de modulateurs actifs, sélectifs et peu toxiques des protéines ABC et en particulier sur la protéine P-gp.

Le premier agent découvert, capable d'inverser le phénotype MDR induit par la protéine P-gp, est le vérapamil, identifié en 1981 par l'équipe de Tsuruo (Figure 15). [START_REF] Tsuruo | Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil[END_REF] Cet antagoniste calcique est en effet capable de sensibiliser à nouveau à la vincristine et à la vinblastine des cellules leucémiques P388 résistantes. L'année suivante, cette même équipe a démontré la capacité du vérapamil à restaurer la toxicité des vinca-alcaloïdes par augmentation de leur accumulation au sein des cellules résistantes. [START_REF] Tsuruo | Increased accumulation of vincristine and adriamycin in drug-resistant P388 tumor cells following incubation with calcium antagonists and calmodulin inhibitors[END_REF] Cependant, le vérapamil ne parvient pas à restaurer la sensibilité à la vinblastine lors des tests cliniques de phases I. [START_REF] Benson | Phase I study of vinblastine and verapamil given by concurrent iv infusion[END_REF] Quelques années plus tard, la capacité de la cyclosporine A, un agent immunosuppresseur, à resensibiliser à la vincristine et à la daunorubicine des cellules leucémiques lymphatiques humaines résistantes ainsi qu'à la doxorubicine des cellules du cancer des poumons résistantes est rapportée (Figure 15). [START_REF] Twentyman | Cyclosporin A and its analogues as modifiers of adriamycin and vincristine resistance in a multi-drug resistant human lung cancer cell line[END_REF] Cependant, tout comme le vérapamil, la cyclosporine A n'a pas donné de résultats probants lors des tests cliniques. [START_REF] Bartlett | Phase I trial of doxorubicin with cyclosporine as a modulator of multidrug resistance[END_REF]100 Il sera découvert, plusieurs années plus tard, que la cyclosporine A est également capable d'inhiber l'activité de transport d'ABCG2 et de resensibiliser les cellules chimiorésistantes surexprimant ce transporteur. 101 Au-delà des résultats cliniques décevants, un problème de taille s'oppose à l'utilisation du vérapamil et de la cyclosporine A comme modulateurs de la MDR : leur activité pharmacologique propre qui peut engendrer des effets secondaires sévères.

Afin de maintenir l'effet chimiosensibilisant et diminuer les effets secondaires du vérapamil et de la cyclosporine A, d'autres dérivés ont émergé tels que le SDZ PSC833 (Valspodar), dérivé de la cyclosporine A et le S9788 dont la structure se base sur celle du vérapamil (Figure 16). 102,103 Cependant, malgré des résultats in vitro prometteurs, ces composés n'ont pas fourni de réponse clinique favorable. 18). Ces caractéristiques propres à ABCG2 indiquent que le mécanisme de transport de cette protéine diffère des protéines P-gp et MRP1. 

Rôles physiologiques d'ABCG2

Du fait de sa large expression au sein de l'organisme et de sa capacité à transporter un grand nombre de substrats, ABCG2 est impliquée dans un grand nombre de processus biologiques détaillés au sein de différentes revues. 164,165,172,173 21). Nous avons poursuivi ce travail dans le cadre de cette thèse et avons choisi le MBL-II-141 comme composé chef de file à partir duquel différentes pharmacomodulations ont été réalisées (Figure 35). Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la partie indolique du MBL-II-141.

Des études précédentes de relations structure-activité démontrant l'importance de la présence du groupement méthoxy sur la partie aromatique reliée à l'amide pour une bonne activité La transformation de l'acétophénone 1 en chromone 2 passe par la formation d'un intermédiaire 2' (Figure 36). 2)

H 2 O, H + DMF 25°C HO X O X O O O X O O O O O X OH O R 2 R 3 O O O X N O R 3 N R 1 R 2 R 1
Schéma réactionnel 3 : Schéma général de synthèse de certains analogues du MBL-II-141.

II.3.2. Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 1

La position du groupement para-bromobenzyloxy porté initialement en position 5 de la chromone fut étudiée en position 6 et en position 7 (Figure 38). La synthèse de ces composés est identique à celle du MBL-II-141 (Schéma réactionnel 3).

Elle s'effectue à partir de la 2,5-dihydroxyacétophénone pour le composé 7a et de la 

II.3.3.1 Synthèse des analogues 11a à 11f

Dans le cadre de cette étude, deux groupements halogénés, le brome et le fluor, ont été étudiés en différentes positions sur le cycle benzyloxy porté par la chromone (Figure 39). Ces composés sont synthétisés de la même manière que le 

II.3.3.2 Synthèse du dérivé 16

Un groupement méthoxy a également été introduit en position 4' du cycle benzyloxy (Figure 41). Ainsi, une autre voie de synthèse a été mise en place (Schéma réactionnel 5).

Schéma réactionnel 5 : Nouvelle voie de synthèse du dérivé 16.

Une déprotection du groupement benzyloxy par action du dihydrogène en présence de charbon palladié activé sur l'ester 2 a permis l'obtention du phénol libre 13 avec un rendement de 58%. Ce phénol a ensuite été lui-même alkylé par action du chlorure de 4méthoxybenzyle avec un rendement de 55%. Le composé 14 issu de cette étape a été saponifié avec un rendement de 62% puis couplé avec le chlorhydrate de la 5méthoxytryptamine afin d'obtenir le dérivé final 16 avec un rendement de 20%. Le rendement global correspondant au composé final est ainsi de 4% sur 6 étapes.

II.3.4. Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 3

Dans le cadre de cette étude, nous avons fait varier la nature du groupement R1 porté en position 5 de l'indole ainsi que sa position lorsque celui-ci est un groupement méthoxy (Figure 42). 

O O O O H N Br NH HO O O O O H N Br NH R 1 RI K 2 CO 3, TBAB 17b Acetone Reflux 17c, R 1 = OEt (17%) 17d, R 1 = OPr (31%) 17e, R 1 = OiPr (30%)
Schéma réactionnel 6 : Synthèse des dérivés 17c, 17d et 17e.

Le composé 17f possédant un groupement méthoxy en position 6 de l'indole est issu du couplage peptidique entre l'acide 3 et le chlorhydrate de la 6-méthoxytryptamine commercial réalisé dans les conditions identiques au MBL-II-141 et a été obtenu avec un rendement de global de 5%.

II.3.5.

Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 4

II.3.5.1 Synthèse des analogues 25a à 25e

Les composés 25a à 25e sont issus d'un couplage peptidique entre l'acide 3 et différents dérivés de la tryptamine synthétisés au laboratoire. Les mêmes conditions de couplage que celles employées pour la synthèse du MBL-II-141 ont été utilisées (Schéma rétrosynthétique 1). 244

Schéma rétrosynthétique 1 de la méthylation de l'azote amidique et de l'azote indolique.

II.3.5.2 Synthèse des dérivés de la tryptamine

Afin de synthétiser les dérivés de la tryptamine et de la Le dérivé de la tryptamine diméthylé sur les azotes amidique et indolique (24) a été synthétisé à partir du carbamate 18a selon la voie présentée sur le Schéma réactionnel 9.

Schéma réactionnel 9 : Synthèse du dérivé diméthylé de la tryptamine 24.

La première étape est la méthylation du dérivé 18a par action du diméthylsulfate en présence 

II.3.5.3 Obtention des analogues par couplage peptidique

Une fois les dérivés de la tryptamine synthétisés, l'étape finale est le couplage peptidique entre l'acide 3 et les dérivés de la tryptamine dans les conditions classiques afin d'obtenir les produits finaux 25a à 25e (Figure 43). Les rendements de l'étape de couplage sont compris entre 19% et 37%. 

II.3.5.5 Synthèse des analogues 25g et 25h

Les composés 25g et 25h sont obtenus par couplage peptidique dans les conditions classiques à partir de l'acide 6a et respectivement des dérivés de la tryptamine 19a et 24 avec des rendements de 42% et 37% (Figure 44). 

Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 6

Dans le cadre de cette pharmacomodulation, deux analogues, l'un sous forme chlorhydrate (composé 32a), et l'autre sous forme de base libre méthoxylé en position 5 du cycle indolique (composé 31b) ont été synthétisés (Figure 46). 

II.3.8. Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 7

Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés à l'introduction de trois motifs acides aminés au sein de la chaîne centrale de nos composés (Figure 47). Ces dérivés ont été obtenus selon la voie de synthèse décrite sur le Schéma réactionnel 14. 

3 R = CH 3, R' = CH(CH 3 ) 2, 33a (83%) R = CH 3, R' = CH 2 CH(CH 3 ) 2, 33b (79%) R = CH 3, R' = CH(CH 3 )CH 2 CH 3, 33c (95%) R = C(CH 3 ) 3, R' = CH(CH 3 ) 2, 33d (93%) R' = CH(CH 3 ) 2, 34a (72%) R' = CH 2 CH(CH 3 ) 2, 34b (37%) R' = CH(CH 3 )CH 2 CH 3, 34c (32%) R' = CH(CH 3 ) 2, 35a (18%) R' = CH 2 CH(CH 3 ) 2, 35b ( 

II.4.1.1 Évaluation de l'inhibition de l'activité de transport d'ABCG2

On s'intéresse ici à l'étude de l'inhibition de l'efflux de la mitoxantrone, substrat d'ABCG2 Pour chacun des composés testés, des concentrations croissantes des dérivés testés, de 5 à 10 µM, ont été ajoutées et les EC50 ont été évaluées. Ces valeurs ont été déterminées à partir des courbes d'accumulation intracellulaire de la mitoxantrone en fonction de la concentration en inhibiteur.

II.4.1.2 Détermination de la cytotoxicité

La cytotoxicité des composés testés a été évaluée par le test de viabilité cellulaire, MTT.

Après incubation avec les composés testés, le MTT (sel de bromure de 3-( 

II.4.1.3 Évaluation de la sélectivité vis-à-vis de la P-gp et MRP1

La sélectivité des composés pour ABCG2, relativement à la P-gp et à MRP1, a été étudiée sur deux lignées cellulaires :

la lignée NIH-3T3, issue de cellules murines embryonnaires transfectées pour exprimer ABCB1 (P-gp) incubées en présence de rhodamine 123 (0,5 µM), substrat de la Pgp ;

la lignée HEK293 transfectée pour exprimer ABCC1 (MRP1), incubée en présence de calcéine-AM (0,2 µM), substrat de MRP1.

Ces lignées cellulaires ont ainsi été incubées 30 min à 37°C en présence de leur substrat respectif ainsi qu'en présence ou absence des composés testés, à 1 et 5 µM. et pour indiquer la nature de ces interactions (Figure 49). L'activité ATPasique se mesure à partir de préparations membranaires issues de cellules ovariennes de Spodoptera frugiperda (Sf9) infectées préalablement par un baculovirus permettant la surexpression d'ABCG2, préparées et conservées avec du cholestérol à 2 mM.

ATP + H2O

Transporteur ABC

ADP + Pi Mb Composé testé

Ces membranes (10 µg de protéine) ont ainsi été incubées en présence des composés testés (2 µM), avec et sans orthovanadate de sodium (0,33 mM), un inhibiteur de l'ATPase. Ainsi, la différence entre l'activité ATPasique avec l'orthovanadate de sodium et l'activité ATPasique obtenue sans orthovanadate de sodium constitue l'activité ATPasique spécifique du transporteur.

La réaction d'hydrolyse de l'ATP est initiée par l'ajout de MgATP (3,9 µM) 50). 

II.4.3.2 Influence de la nature et de la position de l'halogène

II.4.3.3 Introduction d'un groupement méthoxylé

La substitution du groupement brome par un groupement méthoxy a également été entreprise 

II.4.8. RSA issues de la pharmacomodulation 7 : introduction d'un motif acide aminé

Le composé Ko143, inhibiteur de référence d'ABCG2, contient un motif leucine au sein de sa structure (Figure 56). 

Inhibition de l'activité

ATPasique couplée lors de la substitution avec un indole.

Suppression de l'amide central

Défavorable pour l'inhibition de l'efflux de MXR.

Diminution de la cytotoxicité.

Inhibition de l'activité ATPasique basale.

Diminution de l'inhibition de l'activité ATPasique couplée.

Introduction d'un acide aminé

Légèrement défavorable à l'inhibition de l'efflux de MXR.

Augmentation de la cytotoxicité.

Mais nouvelle piste à explorer.

inhibitrice du MBL-II-141, malgré la diversité structurale des modulations apportées. Nous retiendrons tout de même le composé 11a d'activité équivalente au chef de file et dépourvu de toute cytotoxicité. Ceci apporte ainsi de nouveaux éléments quant à la polyspécificité de la protéine.

L'étude des activités ATPasiques basale et couplée nous apportent de nouvelles informations quant à l'interaction de nos composés avec la protéine ABCG2. En effet, ces activités 

II.6. PERPECTIVES

Dans la continuité de la pharmacomodulation 7, de nouveaux acides aminés seront introduits, nous permettant ainsi de moduler certaines propriétés physiques telles que la solubilité. Dans Ne connaissant pas la structure 3D de la protéine ABCG2 mais possédant une large base de données de composés appartenant à chacun des deux sites d'interaction, un travail de modélisation moléculaire a été entrepris afin de générer deux modèles pharmacophores permettant de comprendre les informations structurales et interactionnelles caractérisant chacun des deux sites. Ceci nous permettra également d'obtenir de nouvelles informations quant aux relations structure-activité et de nouvelles orientations pour les futures synthèses. Les structures de l'ensemble des composés sont regroupées en annexe I.

III

A) B) C) O O R R R R O O D) E) N O OH R 2 R 1 R 3

III.2.2. Les logiciels utilisés pour la détermination et l'analyse des pharmacophores

Afin de réaliser l'ensemble de ces travaux, deux logiciels de modélisation moléculaire, développés par Molecular Discovery, ont été utilisés : VolSurf+ (Version 1.1. 

III.2.2.2 VolSurf+

VolSurf+ est un logiciel qui permet de convertir les informations contenues dans les champs d'interaction moléculaire GRID 3D de composés en 128 descripteurs, décrivant leurs propriétés physico-chimiques et pharmacocinétiques (Figure 66). [258][259][260] Ces descripteurs réfèrent entre autre à :

- Ces outils statistiques permettent ainsi de convertir l'ensemble des informations obtenues à partir des descripteurs en cartes à 2 ou 3 dimensions, corrélant le comportement de chaque composé vis-à-vis de chaque descripteur avec leurs données expérimentales, telles que les activités biologiques (Figure 66). Lorsque l'on compare les différents modèles pharmacophores, on remarque que certains points pharmacophoriques semblent être conservés entre les différents modèles, tels qu'un site accepteur de liaison hydrogène (site A), ainsi que deux sites accepteur/donneur de liaison hydrogène (site A/D) situés l'un à côté de l'autre (Figure 72). 

III.3.2. Génération des modèles pharmacophores pour les sites 3 et 4

Modèles Contraintes

Résultats

III.3.3.3 Comparaison des modèles pharmacophores des sites 3 et 4

Suite aux criblages virtuels réalisés, des premières différences structurales apparaissent entre les deux sites 3 et 4. En effet, à la vue des paramètres obtenus, la cavité correspondante au site Une liste non exhaustive des substrats de MRP1 est regroupée dans le Tableau 30.

Classes de composés Exemples

Agents La conception de nouveaux inhibiteurs à partir de la structure du raloxifène, utilisé dans le cadre de traitements hormonaux de substitution, a conduit à la découverte de nouveaux analogues présentant des activités inhibitrices in vitro et in vivo (Figure 85). 367,368 Figure 85 : Le raloxifène et ses analogues.

Le probénécide, utilisé couramment pour sa capacité à abaisser la concentration de l'acide urique dans le sang, se révèle être un inhibiteur du transport du LTC4 mais également être capable de sensibiliser à nouveau des cellules chimiorésistances surexprimant MRP1 tout en n'étant pas actif sur la P-gp in vitro (Figure 86). 369 De plus, des analogues d'indolopyrimidines et de pyrrolopyrimidines 370,371 ont également présenté une activité inhibitrice de l'activité de transport de MRP1 (Figure 87). Des pipérazines N,N-disubstituées ainsi que des pipéridylfluorendione nitrogénées ont été mises au point comme inhibiteurs doubles agissant sur la P-gp et sur MRP1 (Figure 90). [374][375][376] Figure 90 : Dérivés de pipérazines et pipéridines, inhibiteurs doubles de la P-gp et de MRP1.

Par la suite, un analogue possédant un cycle isoxazole, le LY402913 377 ainsi qu'un dérivé quinoxilinone se sont révélés être des inhibiteurs actifs et sélectifs de MRP1 par rapport à la P-gp. 375,378 Il en est de même pour le dérivé quinoléinique issu des structures de MS-209 et de LY335979, inhibiteurs de référence de la P-gp (Figure 91). 379 Ainsi la surexpression de GST est associée à la résistance de certains agents thérapeutiques.

Des inhibiteurs de l'enzyme GST ont été conçus et deux types de modulateurs de MRP1 ont été étudiés : les composés capables d'imiter le GSH et des composés glutathioconjugués.

Parmi ces composés on retrouve le TER199, un compétiteur des substrats et analogue du GSH. 380 Parmi les analogues glutathioconjugués, un inhibiteur de la GST conjugué au GSH et à l'acide éthacrynique s'est révélé être un inhibiteur compétitif de MRP1 (Figure 92). 381 La P-gp ne nécessitant pas de GSH pour assurer sa fonction de transport, les composés glutathioconjugués ou analogues du GSH tendent ainsi à être sélectifs à MRP1.

Malheureusement leur interférence avec le rôle physiologique du GSH peut poser quelques problèmes en termes de toxicité. Des études plus récentes portent sur la structure de dérivés galloyls comme inhibiteurs de MRP1 et de la P-gp (Figure 94). De faibles modifications structurales permettent de moduler la sélectivité pour l'un ou l'autre inhibiteur. 

I.2.2. MRP1 et la sensibilité collatérale

I.2.2.1 Généralités

De nombreux efforts ont été entrepris dans la recherche de nouveaux modulateurs des transporteurs ABC afin de contrecarrer la chimiorésistance. Bien que de nombreux composés se soient révélés efficaces in vitro, leurs études cliniques ont conduit à de nombreux échecs.

L'ensemble de ces résultats a incité les scientifiques à orienter leurs recherches vers de nouvelles stratégies alternatives.

L'une d'entre elles a récemment vu le jour : le développement d'une hypersensibilité des cellules cancéreuses chimiorésistantes. En effet, il a été mis en évidence qu'en présence de certains composés, les cellules cancéreuses surexprimant MRP1 meurent par apoptose alors que les cellules saines ne sont pas affectées. Ce nouveau profil pharmacologique se nomme sensibilité collatérale. 112 Il devient alors possible de mettre au point de nouveaux composés capables de cibler sélectivement les cellules cancéreuses surexprimant un transporteur ABC.

Cette nouvelle stratégie thérapeutique présente ainsi l'avantage d'éviter les effets secondaires sur les cellules saines dus à l'action des agents anticancéreux. Cependant le mécanisme de ce nouveau profil pharmacologique reste encore mal connu. 385,386 Dans le cas du phénotype MDR, le premier cas de sensibilité collatérale a été observé en 1976 pour des cellules CHO pour lesquelles le degré de sensibilité collatérale semble être corrélé au degré de résistance des cellules cancéreuses à la colchicine et donc au taux d'expression de la P-gp. 387 La sensibilité collatérale liée à la surexpression de MRP1 est l'une des plus étudiées et semble liée au transport du glutathion.

I.2.2.2 Le glutathion, acteur principal de la sensibilité collatérale chez MRP1

Le glutathion (GSH) est un tripeptide formé par la condensation d'acide glutamique, de cystéine et de glycine (Figure 95). Grâce à la présence d'une fonction thiol, ce composé intervient dans le maintien du potentiel redox des cellules, leur permettant de se protéger contre le stress oxydatif. Présent en forte concentration au sein de l'ensemble des cellules, le GSH intervient dans un grand nombre de processus biochimiques tels que la prolifération cellulaire, la réponse immunitaire ou l'apoptose. 

I.2.2.3 Le vérapamil, inducteur de la sensibilité collatérale via par MRP1

Comme nous l'avons vu précédemment, MRP1 est capable de transporter le glutathion, ainsi que ses conjugués, exogènes ou endogènes. En 1986, il a été observé que le vérapamil (Figure 97), inhibiteur calcique et inhibiteur de référence de la protéine P-gp, 394 est capable d'induire une sensibilité collatérale au sein de cellules H69 surexprimant MRP1. 395 L'analogue iodé du vérapamil présente également un effet apoptotique important, issu de l'efflux massif de GSH via MRP1 (Figure 99). 399 

OBJECTIFS DES TRAVAUX PERSONNELS

Suite aux résultats encourageants obtenus pour les flavonoïdes, l'objectif de cette thèse a été de continuer cette investigation par la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux ligands de MRP1, dépourvus de toxicité, destinés à agir comme activateurs de MRP1 pour induire l'efflux du glutathion (GSH) aboutissant à terme à la mort cellulaire par apoptose.

II.2. CHOIX DES MOLÉCULES CIBLES

Les flavonoïdes constituent une famille de composés de choix pour le développement de nouveaux modulateurs de la protéine MRP1 dans le cadre du phénotype MDR. En effet, on retrouve un grand nombre de ces composés quasiment non cytotoxiques dans notre alimentation.

De plus, comme nous l'avons vu précédemment, de nombreuses études ont déjà souligné l'implication des flavonoïdes, et en particulier des flavones, dans la modulation des différents transporteurs ABC responsables du phénotype MDR, 375,405,406 conduisant à un premier travail de prospection, entrepris antérieurement au sein du laboratoire. Cette première étude a permis d'apporter de nouvelles informations quant aux relations structure-activité liées à MRP1 et a ainsi été poursuivie dans le cadre de cette thèse. 

II.3. PROCÉDÉS D'ÉVALUATION BIOLOGIQUE DES

ANALOGUES SYNTHÉTISÉS

L'efflux net de GSH ainsi que la cytotoxicité sur des lignées cellulaires contrôle et résistante induits par chaque composé ont été déterminés selon deux tests biologiques.

II.3.1. Détermination de l'efflux net de GSH

Ce test permet de déterminer la capacité des composés synthétisés à induire ou non un efflux massif de GSH. Il est réalisé sur les lignées cellulaires de hamster BHK (Baby Hamster La vitesse de la réaction peut être mesurée en suivant l'apparition de la coloration jaune. Le dimère 4e est actuellement en cours de tests in vivo, au sein de l'Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de l'Université Lyon 1. À partir de ces résultats, nous avons entrepris la conception et la synthèse de nouveaux homodimères dérivés de l'apigénine.

Trois points de pharmacomodulations ont été envisagés lors de cette étude :

la modulation du bras espaceur : variation de la longueur de la chaîne alkyle (n = 2 et

3) ; -la modulation de la nature du flavonoïde : synthèse d'homodimères de chalcones et de flavones ;

la substitution du cycle A : présence de groupement méthoxy en ortho et en para de la fonction carbonyle.

Au total, quatre homodimères ont été synthétisés et testés biologiquement (Figure 106).

Figure 106 : Homodimères de dérivés de l'apigénine mis au point au laboratoire.

II.4.2. Synthèse des dimères ciblés

II.4.2.1 Re-synthèse du dimère 4e

Le dimère 4e, excellent inducteur de sensibilité collatérale, est actuellement en phase de test Nous avons ainsi trouvé intéressant dans un premier temps de remplacer le groupement méthoxy par différents groupements alkyloxy afin d'en étudier l'impact sur le profil pharmacologique. Afin de simplifier les synthèses, nous avons réalisé ces modulations sur la 3-hydroxyflavone, disponible commercialement. Quatre groupements alkyles ont été utilisés : éthyle, propyle, isopropyle et benzyle (Figure 110). Nous avons également décidé de concentrer nos efforts sur l'impact pharmacologique de dérivés C-alkylés en position 3 de flavone (Figure 111). 

O O O R 50a, R = éthyl 50b, R = propyl 50c, R = isopropyl 50d, R = benzyl

II.5.2. Synthèse des analogues O-alkylés et C-alkylés en position 3 de la flavone

II.5.2.1 Synthèse des dérivés O-alkylés 50a à 50d

Ces composés ont été obtenus en une seule étape par alkylation de la fonction hydroxy de la 3-hydroxyflavone à l'aide de différents halogénoalcanes en condition basiques avec des rendements compris entre 17% et 67% (Schéma réactionnel 19). Une fois encore, cette alkylation phénolique est réalisée en présence de TBAB, jouant le rôle de catalyseur de transfert de phase.

Schéma réactionnel 19 : Synthèse des dérivés O-alkylés de la 3-hydroxyflavone.

II.5.2.2 Synthèse des dérivés C-alkylés 54a à 54d

La première voie explorée afin d'obtenir les dérivés de flavone C-alkylés souhaités a été la synthèse d'un intermédiaire de type chalcone conduisant, à l'issue d'une cyclisation oxydante, aux dérivés désirés (Schéma rétrosynthétique 3).

Schéma rétrosynthétique 3 via un intermédiaire de type chromone.

Dans un premier temps ont été synthétisés les dérivés de l'acétophénone présentant différents groupements R (composés 52a à 52c) (Schéma réactionnel 20).

O H OH OH OH R O OH R CH 2 Cl 2 25°C RCH 2 MgX Et 2 O 25°C 51a (25%) 51b (81%) 51c (88%) a (R = éthyl) b (R = propyl) c (R = isopropyl) MnO 2 52a (46%) 52b (41%) 52c (26%)
Schéma réactionnel 20 : Synthèse des dérivés de l'acétophénone 52a à 52c.

Leur synthèse s'effectue en deux étapes à partir du salicylaldéhyde engagé avec un réactif de Grignard en présence de différents bromures d'alkylmagnésium dans l'éther pour former les alcools secondaires 51a à 51c avec des rendement compris entre 25% et 88%. 418 Ces composés ont ensuite été oxydés par action de l'oxyde de manganèse (IV) afin d'obtenir les cétones 52a à 52c avec des rendements compris entre 26% et 46%. D'autres agents oxydants ont également été testés pour cette dernière étape, tels que le périodinane de Dess Martin ou le chlorochromate de pyridinium (PCC). Mais en raison, respectivement, de leur coût et de leur toxicité, nous avons privilégié l'utilisation de l'oxyde de manganèse (IV). 

II.5.3. Évaluation biologique des analogues O-alkylés et C-alkylés en position 3 de la flavone

II.5.3.1 Évaluation biologique des analogues O-alkylés 50a à 50d

Les composés 50a à 50d ont été dans un premier temps testés pour leur capacité à induire un efflux massif de GSH sur les cellules contrôles BHK-21wt et les cellules BHK- A l'exception du composé 50c qui ne présente aucun efflux de GSH détecté, les dérivés 50a, 50b et 50d présentent des efflux net de GSH de 26 à 30% à 20 µM, soit environ deux à trois fois inférieurs à la 3-méthoxychrysine et 3 à 4,5 inférieurs au vérapamil. Ainsi les tests de survie cellulaire n'ont pas été poursuivis pour ces composés.

En comparant ces résultats à l'efflux net de GSH induit par la 3-hydroxyflavone (12%), nous pouvons remarquer une faible augmentation de l'efflux apportée par l'alkylation du groupement hydroxylé. Mais cette amélioration reste tout de même modérée. Il aurait également été intéressant d'étudier différents dérivés O-alkylés en position 3 de la galangine.

II.5.3.2 Évaluation biologique des analogues C-alkylés 54a à 54d

Les composés 54a à 54d ont été testés dans un premier temps pour leur capacité à induire un efflux massif de GSH sur les cellules contrôles BHK-21wt et les cellules BHK- 

II.6.2.

Synthèse des dérivés ferrocéniques de flavonoïdes

II.6.2.1 Synthèse des dérivés chalcones ferrocéniques

Quatre analogues de chalcones ferrocéniques ont été synthétisés (Figure 116 La synthèse de cette première série de composés a été effectuée par une réaction de 

80°C Fe Fe R 1 R 2 R 1 R 2 55b (R 1 = OCH 3, R 2 = H) 55c (R 1 = H, R 2 = OCH 3 ) 56b (R 1 = OCH 3, R 2 = H, 95%) 56c (R 1 = H, R 2 = OCH 3, 32%)
Schéma réactionnel 25 : Synthèse des aurones 56a à 56d. 

Dans un premier temps

II.6.2.3 Synthèse des dérivés de flavones ferrocéniques

Dans un troisième temps, nous avons synthétisé la série des flavones ferrocéniques, ne possédant aucune substitution sur le cycle A, ainsi que les analogues méthoxylés en position 5 et/ou 7 (Figure 117). D'après ces résultats de survie cellulaire, les composés 58b et 58c sont les seuls à induire une sensibilité collatérale. En effet, ils présentent respectivement des ratios sélectifs de 7,6 et 6,2 (Figure 119).

II.6.3. Évaluation biologique des dérivés ferrocéniques de flavonoïdes

A) B)

Figure 119 : Courbes représentant l'évolution de la survie cellulaire en fonction de la concentration en composés 58b (A) et 58c (B) sur les cellules BHK-21wt (contrôles) et BHK-21-MRP1 (résistantes). 

III. Conclusion du chapitre 3

Ce travail a consisté en la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux modulateurs de la protéine MRP1, inducteurs de sensibilité collatérale via un efflux massif de Riches en produits phytochimiques tels que des alcaloïdes, des résines, des saponines, des tannins, des anthraquinones ou encore des flavonoïdes, cette plante est utilisée depuis longtemps en médecine traditionnelle en Afrique de l'Est et de l'Ouest afin de soigner un grand nombre de pathologies. 

I.2.2. Activités anthelminthiques

Plusieurs études sur les nématodes parasitaires ont démontré une activité anthelminthique de Nauclea latifolia. La plante sous forme d'extraits 50% aqueux/ 50% méthanol a démontré une activité inhibitrice de la glutathion S-transférase (GST), enzyme dont l'action permettrait de protéger le parasite d'agents cytotoxiques par une attaque membranaire des espèces réactives de l'oxygène. La présence de proanthocyanidines, polyphénols au pouvoir antioxydant, pourrait être responsable de cette activité antiparasitaire. 459 

I.2.6. Activités antinociceptives

Les décoctions des racines de Nauclea latifolia ont démontré des activités antinociceptives significatives sur différents modèles animaux classiques de la douleur. 

I.4. DÉCOUVERTE ET EXTRACTION DU TRAMADOL

Guidée par son activité antinociceptive, 473,475 l'extraction d'un extrait brut de l'écorce de Nauclea latifolia a conduit à l'isolement en 2011 au sein de notre laboratoire d'un composé alcaloïde, identifié comme étant le tramadol en version racémique. 443 Il s'agit du troisième cas reporté de l'occurrence d'un composé médicament synthétique au sein de sources naturelles.

On peut citer les benzodiazépines, isolés de plante en faibles concentrations 483,484 Ce composé a été recristallisé sous sa forme chlorhydrate dans l'acétonitrile. L'analyse par diffraction des rayons X confirme la structure proposée et permet la détermination de la stéréochimie des deux centres chiraux (Figure 128). 

II.2. VOIE BIOSYNTHETIQUE PROPOSÉE

Certaines parties de la structure du tramadol ont déjà été caractérisées au sein de différents produits naturels. Par exemple, le groupement N, N-diméthyle apparaît au sein de nombreux alcaloïdes et des structures possédant un groupement N, N-diméthyl-2-aminométhylcyclohexane sont connues. 486 De nombreux produits naturels phénoliques contiennent également un groupement méta-méthoxy, tels que l'acide férulique, la vanilline, les stilbènes et les aurones. 487 Nous proposons ainsi la biosynthèse du tramadol comme étant constituée de deux étapes clés.

La première étape est la condensation de la fonction énol de la 3-méthoxyacétophénone 59 sur 

II.2.2. Voie de biosynthèse de l'intermédiaire 60

Contenant une amine basique, le tramadol peut être classé dans la famille des alcaloïdes, pour lesquels la biosynthèse implique régulièrement un ou plusieurs précurseurs acides aminés, tels que la L-lysine, la L-arginine, la L-tyrosine, la L-phénylalanine ou le L-tryptophane.

L'intermédiaire 60 semble ainsi dériver de la L-lysine, classiquement décarboxylée en cadavérine (1,5-diaminopentane) par la lysine décarboxylase dans une première étape. Puis une seconde étape de désamination oxydante par l'amine oxydase à cuivre conduit à la formation du motif 5-aminopentanal (Figure 132). Ces deux étapes sont communes à la biosynthèse de plusieurs classes d'alcaloïdes. 499 Remarque : le borohydrure de sodium a également été utilisé comme agent réducteur à la place du cyanoborohydrure de sodium. Les deux composés conduisent à des résultats identiques.

H 2 N NH 2 Cadavérine H 2 N NH 2 CO 2 H L-Lysine N O H N HO (-)-Lupinine H 2 N NH 2 DO Motif 5-iminopentanal
Schéma réactionnel 33 : Étapes de conversion de 69 en tramadol.

La formation de tramadol résulte ainsi de l'énamine 65, issue de l'isomérisation de l'iminium Des analyses préliminaires par HPLC nous ont permis de confirmer la formation du (1R, 2R)tramadol et de son diastéréoisomère, le (1R, 2S)-tramadol au sein de nos bruts réactionnels.

Puis une purification par UHPLC-TOF-MS et des analyses RMN nous ont permis d'isoler le tramadol et de caractériser les isomères ainsi que les composés secondaires formés.

II.3. CARACTÉRISATION DU TRAMADOL AU SEIN DU BRUT RÉACTIONNEL ET ANALOGUES FORMÉS

Dans un premier temps, les bruts réactionnels de synthèse ont été soumis aux analyses HPLC et RMN afin de détecter la présence ou non du tramadol, puis une fois la présence de tramadol confirmée, une purification par HPLC préparative nous a permis d'isoler le tramadol et de déterminer les isomères formés.

Les analyses par HPLC ont été réalisées au sein de l'équipe du Dr. Thierry Lomberget de l'Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de l'Université de Lyon 1 tandis que les analyses RMN ont été effectuées par l'équipe du Dr. Emerson Ferreira Queiroz de la Section des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Genève.

II.3.1. Détection du tramadol au sein des bruts réactionnels

Les analyses LCMS préliminaires (0,5 mg/mL dans un mélange eau/acétonitrile 1/1) ont dans un premier temps démontré la présence de deux composés majoritaires, le produit de départ 

II.3.2. Purification et caractérisation du tramadol formé

À l'issue d'une purification par HPLC semi-préparative 504 des bruts réactionnels issus de la cyclisation de 69 en présence de diméthylamine puis de la réaction avec le cyanoborohydrure de sodium ou du borohydrure de sodium, 13 fractions ont été isolées et analysées par RMN 

III. Conclusion du chapitre 4

À partir d'une large recherche bibliographique et guidés par la répartition non statistique des atomes lourds tels que 13 o Nuclear magnetic resonance spectra 1 H and 13 C NMR spectra were recorded on a Bruker Advance 400 spectrometer (400 MHz or 500 MHz for 1 H and 100 MHz for 13 C NMR). Chemical shifts are given in ppm (δ) and were referenced to the internal solvent signal. Multiplicities are reported as follows: s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), dd (doublet of doublet), ddd (doublet of doublet of doublet), dt (doublet of triplet), m (multiplet). Coupling constants J are given in Hertz.

II. Synthesis protocols

II.1. SYNTHESIS OF ABCG2 DERIVATIVES

II.1.1. NMR analysis

Interpretation of 1 H and 13 C NMR spectra of many compounds were supported by the resolution of 2D COSY, HSQC and HMBC spectra of compounds 5-(4'-bromobenzyloxy)-4oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (3) and 5-methoxytryptamine hydrochloride. Protons and carbons of 3 are numbered as below:

From 1 H and 13 C NMR (Figure 138 and Figure 139), 2D HSQC (Figure 140) and HMBC (Figure 141) spectra of 3, the complete 1 H and 13 C assignments are given in Table 38 and Table 39. We did the same analysis for the commercially available 5-methoxytryptamine hydrochloride.

Protons and carbons are numbered as below:

From 1 H and 13 C NMR (Figure 142 and Figure 143), 2D COSY (Figure 144), HSQC (Figure 145) and HMBC (Figure 146) spectra of 5-methoxytryptamine hydrochloride, the complete 1 H and 13 C assignments are given in Table 40 and Table 41. 

II.1.2. General procedures

General procedure A. A solution of dihydroxyacetophenone (1 equiv.), potassium carbonate (6 equiv.) and tetrabutylammonium bromide (0.35 equiv.) in acetone (7 mL/mmol) was refluxed for 20 min. A solution of halogenated derivative (1.2 equiv.) in acetone (3 mL /mmol) was added dropwise and the resulting mixture was refluxed for 2-6 h. The resulting solution was cooled to room temperature and concentrated under reduced pressure. The residue was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure B. To a solution of sodium (6 equiv.) in a mixture of THF/anhydrous EtOH (1/1, 10 mL/mmol) under argon were added alkylated derivative (1 equiv.) and diethyloxalate (4 equiv.). The resulting mixture was refluxed for 2 h. The solution was cooled to room temperature and concentrated under reduced pressure. The residue was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in THF/EtOH (1/1, 10 mL/mmol) and 37% hydrochloric acid (1 mL/mmol) was added dropwise. The resulting mixture was refluxed for 2 h. The solution was cooled to room temperature and concentrated under reduced pressure. The residue was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure C. To a solution of ethyl ester (1 equiv.) in THF/EtOH (1/1, 9 mL/mmol) were added a solution of sodium bicarbonate (7%, 4 mL/mmol) and water (4 mL/mmol). The resulting mixture was refluxed for 2 h. The solution was cooled to room temperature and poured into 1M hydrochloric acid in order to form a solid which was filtered and washed with diethyl ether.

General procedure D1. To a solution of tryptamine derivative (1 equiv.) in DMF (10 mL/mmol) were added successively a solution of acid derivative (1 equiv.) in DMF (10 mL/mmol), HOBt (2 equiv.), triethylamine (4 equiv.) and EDCI (2 equiv.). The mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting mixture was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with sodium bicarbonate and water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure D2. To a solution of acid derivative (1 equiv.) in DMF (10 mL/mmol) were added successively a solution of tryptamine derivative (2 equiv.) in DMF (10 mL/mmol), TBTU (1.5 equiv.) and DIEA (5 equiv.). The mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting mixture was poured into sodium bicarbonate and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure D3. To a solution of tryptamine derivative (1 equiv.) in DMF ( 10mL/mmol) were added successively a solution of acid derivative (1 equiv.) in DMF ( 10mL/mmol), triethylamine (4 equiv.), EDCI (2 equiv.) and ethyl isonitrosocyanoacetate (2 equiv.). The mixture was stirred overnight at room temperature. The resulting mixture was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with sodium bicarbonate and water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure E. A solution of 17b (1 equiv.), potassium bicarbonate (3 equiv.) and an excess of tetrabutylammonium bromide in acetone (80 mL/mmol) was refluxed for 15 min and halogenated derivative (1 equiv.) was added dropwise. The resulting mixture was refluxed for 5 h. The solution was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure F. To a solution of tryptamine (1 equiv.) and triethylamine (2 equiv.) in dichloromethane (8 mL/mmol) was added dropwise ethylchloroformate (1 equiv.). The resulting mixture was stirred at room temperature for 20 min. The solution was poured into water and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with 1M hydrochloric acid and water, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated under reduced pressure.

General procedure G.

A solution of ethoxycarbonyltryptamine derivative (1 equiv.) and LiAlH4 (6 equiv.) in dry THF (10 mL/mmol) was refluxed for 16 h. The resulting mixture was cooled to room temperature and hydrolyzed with water (n ml/n g LiAlH4), 15% sodium hydroxide (n ml/ n g LiAlH4) and water (3n ml/ n g LiAlH4). The mineral precipitates of LiOH and Al(OH)3 were removed by filtration and the filtrate was concentrated under reduced pressure.

General procedure H. A solution of protected tryptamine derivative (1 equiv.) in dichloromethane (5mL/mmol) with sodium hydroxide (4 equiv.) and tetrabutylammonium bromide (cat.) was stirred at 0°C for 30 min. Then dimethylsulfate (1.5 equiv.) was added and the resulting mixture was stirred at room temperature for 16 h. The mixture was poured into water and extracted with dichloromethane. The combined organic layer was washed with 1M hydrochloric acid and water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure I. To a solution of propargylic derivative (1 equiv.) in DMF ( 30mL/mmol) were added azide (1.2 equiv.), sodium ascorbate (0.2 equiv.), and CuSO4.5H2O (0.1 equiv.). The resulting mixture was stirred at room temperature for 24 h. The solution was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure J.

A mixture of tryptamine derivative and tosylate derivative was stirred in DMF (10 mL/mmol) at room temperature for 24 h. The mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure K. To a solution of methyl ester derivative (1 equiv.) in tetrahydrofuran/methanol (1/1) (10 mL/mmol) was added a solution of lithium hydroxide (1 equiv.) in water (5 mL/mmol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 1 h.

The solution was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. , 61.44; H, 4.24; N, 5.12. Found C, 61.38; H, 4.23; N, 5.108.

II.1.3. Synthesis protocols for ABCG2 derivatives

II.1.3.1 Synthesis of MBL-II-141 (5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene

II.1.3.2 Modulation of para-bromobenzyloxy group position-Synthesis of compounds 7a and 7b

5-(4'-Bromobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (4a). The crude was prepared according to general procedure A starting from commercially available 2,5-dihydroxyacetophenone (2 g, C, 61.44; H, 4.24; N, 5.12. Found: C, 61.68; H, 4.13; N, 5.26. (m, 1H, H2'), 7.50 (m, 1H, H6'), 7.56 (m, 1H, H5'). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 33.0 (COCH3), 68.8 (OCH2), 103.4 and 109.7 (C3 and C5), 114.9 (C1), 116.9 and 117.0 (C6'), 117.5 and 117.7 (C5'), 124.7, 124.7, 124.8 and 124.8 (C2'), 133.7 (C4), 134.3, 134.3, 134.3, and 134.4 (C1'), 147.8 -148.2 (C3' or C4'), 150.2, 150.4, 150.5 and 150.6 (C3' or C4'), 157.8 and 159.5 (C2 and C6), 203.4 (COCH3). MS (ESI) m/z 277 [M-H] -. 

II.1.3.3 Modulation of nature and position of groups on the benzyloxy cycle -

5-(3'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (9b).

The crude was prepared according to general procedure B starting from 8b (3 g, 9.4 mmol) and washed with diethyl ether to afford 9b as a yellow solid (2 g, 50%). C19H15BrO5. m.p. 147-149°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.75 (t, 3H, J = 7.2 Hz, OCH2CH3), 4.80 (q, 2H, J = 7.2 Hz, OCH2CH3), 5.69 (s, 2H, OCH2), 7.22 (s, 1H, H3), 7.12 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H6 or H8), 7.25 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H6 or H8), 7.38 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H5'), 7.54 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H4'), 7.60 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H6'), 7.77 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H7), 7.92 (s, 1H, s, H2'). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 69.0 (OCH2), 109.0 and 110.6 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.5 (C3), 121.7 (C3'), 125.6 (C6'), 129.4 (C2'), 130.3 and 130.5 (C4' and C5'), 135.3 (C7), 139.6 (C1'), 150.2 (C2), 157.3 and 157.6 (C5 and C9), 160.0 (CO), 176.5 (C4). MS (ESI) m/z 425 ( 79 Br), 427 ( 81 Br) [M+Na] + .

5-(2'-Fluorobenzyloxy

)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (9c). The crude was prepared according to general procedure B starting from 8c (900 mg, 3.5 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (1:0 to 8:2) as eluent to afford 9c as a white solid (265 mg, 24%). C19H15FO5. m.p 156-157°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.29 (s, 2H, OCH2), 6.76 (s, 1H, H3), 7.18-7.31 (m, 4H, H6, H8, H3', H6'), 7.39-7.45 (m, 1H, H5'), 7.76 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 7.92 (dt, 1H, J = 1.5 Hz, J = 7.5 Hz, H4'). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 64.5 (OCH2), 109.1 and 110.7 (C6 and C8), 114.7, 114.9, 115.1, 115.4 (C3, C10 and C3' or C6'), 123.6 and 123.8 (C2'), 124.5 (C3' or C6'), 129.6, 129.7 and 129.9 (C1', C4' and C5'), 136.4 (C7), 150.2 (C2), 157.3 and 157.7 (C5 and C9), 158.4, 160.0 (CO), 160.9, 176.4 (C4). MS (ESI) m/z 343 [M+H] + , 365

[M+Na] + .

5-(3'-Fluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (9d).

The crude was prepared according to general procedure B starting from 8d (1.5 g, 5.7 mmol) to afford 9d as white solid (1.7 g, 87%). C19H15FO5. m.p. 108-109°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.30 (s, 2H, OCH2), 6.80 (s, 1H, H3), 7.11-7.26( m, 2H, H6 or H8, H4'), 7.26 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.41-7.47 (m, 2H, H5', H6'), 7.56 (d, 1H, J = 10.3 Hz, H2'), 7.76 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (COCH2CH3), 62.6 (COCH2CH3), 69.1 (OCH2), 109.0 and 110.6 (C6 and C8), 113.3 and 113.5 (C2'), 114.1 and 114.3 (C4'), 114.7 (C10), 115.4 (C3), 122.4 (C6'), 130.2 and 130.3 (C5'), 135.3 (C7), 139.7 and 139.8 (C1'), 150.2 (C2), 157.3 and 157.6 (C5 and C9), 160.0 (CO), 161.1 and 163.5 (C3'), 176.5 (C4). MS (ESI) m/z 343 [M+H] + .

5-(4'-Fluorobenzyloxy

)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (9e). The crude was prepared according to general procedure B starting from 8e (1.2 g, 4.6 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 9e as a yellowish solid (590 mg, 39%). C19H15FO5. m.p.

125-126°C

. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.2 Hz, OCH2CH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.77 (s, 1H, H3), 7.13 (d, 1H, J = 7.7 Hz, H6 or H8), 7.25 (m, 3H, H6 or H8, H3'), 7.66 (m, 1H, H2'), 7.75 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 69.4 (OCH2), 109.1 and 110.5 (C7 and C8), 114.7 (C10), 115.0, 115.2 and 115.5 (C3 and C3'), 128.9 and 129.0 (C2'), 132.9 (C1'), 135.3 (C7), 150.2 (C2), 157. 3 and 157.8 (C5 and C9), 160.1 (CO), no signal for C4 ', 176.4 (C4). MS (ESI) m/z 343 [M+H] + , 365 [M+Na] + .

5-(3',4'-Difluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (9f).

The crude was prepared according to general procedure B starting from 8f (900 mg, 3.2 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (100:0 to 50:50) as eluent to afford 9f as a white solid (200 mg, 18%). C19H14F2O5. m.p. 145-146°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.26 (s, 2H, OCH2), 6.80 (s, 1H, H3), 7.12 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H6 or H8), 7.25 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H6 or H8), 7.46-7.50 (m, 2H, H2', H5'), 7.75-7.80 (m, 2H, H6', H7). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 68.7 (OCH2), 109.0 and 110.7 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.5 (C3), 115.7 and 115.9 (C6'), 117.3 and 117.5 (C5'), 5-(2'-Fluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (10c). The crude was prepared according to general procedure C starting from 9c (265 mg, 0.8 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 10c as a white solid (157 mg, 65%). C17H11FO5. m.p. 213-214°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.29 (s, 2H, OCH2), 6.73 (s, 1H, H3), 7.16-7.31 (m, 4H, H6, H8, H3', H6'), 7.38-7.42 (m, 1H, H5'), 7.75 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 7.93 (td, J = 1.6 Hz, J = 7.6 Hz, H4'). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 64.5 (OCH2), 108. 9 and 110.8 (C6 and C8), 114.7, 115.0 and 115.2 (C3, C10, C3' or C6'), 123.7 and 123.8 (C2'), 124.5 and 124.6 (C3' or C6'), 129.7, 129.8 and 129.9 (C1', C4' and C5'), 135.3 (C7), 151.4 (C2), 157.4 and 157.7 (C5 and C9), 161.5 (CO), 176.8 (C4). MS (ESI) m/z 313 [M-H] -, 315 [M+H] + , 337 [M+Na] + .

5-(3'-Fluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (10d).

The crude was prepared according to general procedure C starting from 9d (1.2 g, 3.5 mmol) to afford 10d as a white solid (840 mg, 76%). C17H11FO5. m.p. 241-242°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.29 (s, 2H, OCH2), 6.76 (s, 1H, H3), 7.10-7.16 (m, 2H, H6 or H8, H4'), 7.22 (d, 1H, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.41-7.48 (m, 2H, H5', H6'), 7.56 (d, 1H, J = 10.2 Hz, H2'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7). 13 5-(4'-Fluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (10e). The crude was prepared according to general procedure C starting from 9e (500 mg, 1.5 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 10e as a yellowish solid (220 mg, 47%). m.p. 178-179°C.

C17H11FO5. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.24 (s, 2H, OCH2), 6.69 (s, 1H, H3), 7.10 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H6 or H8), 7.20 (d, 1H, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.22-7.26 (m, 2H, H3'), 7.65-7.69 (m, 2H, H2'), 7.72 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.3 (OCH2), 108.8 (C6 or C8), 110.6 (C6 or C8), 114.7 (C10), 115.0 (C3), 115.2 (C3'), 128.9 and 130.0 (C2' and C4'), 133.0 and 133.1 (C1'), 134.9 (C7), no signal for C2, 157. 5 and 157.8 (C5 and C9), 161.4 (COOH), 166.9 (C4). MS (ESI) m/z 313 [M-H] -.

5-(3', 4'-Difluorobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (10f).

The crude was prepared according to general procedure C starting from 9f (196 mg, 0.5 mmol) to afford 10f as a white solid (142 mg, 79%). C17H10F2O5. m.p. 198-199°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.74 (s, 1H, H3), 7.10 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H6 or H8), 7.23 (d, 1H, J = 7.7 Hz, H6 or H8), 7.46-7.48 (m, 2H, H2', H5'), 7.73-7.81 (m, 2H, H6', H7). 13 C NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 68.6 (OCH2), 108. 8 and 110.7 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.1 (C3), 115.7 and 115.8 (C6'), 117.3 and 117.5 (C5'), 123.2, 123.3, 123.3 and 123.3 (C2'), 134.7, 134.7, 134.7 and 134.8 (C1'), 135.2 (C7), 147.7, 147.8, 148.4 and 148.5 (C3'), 149.6, 149.7, 150.3 and 150.4 (C4'), 151.5 (C2), 157.4 and 157.5 (C5 and C9), 161.5 (COOH), 176.9 (C4). MS (ESI)

m/z 331 [M-H] -.
OCH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.69 (s, 1H, H3), 6.71 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, J = 8.7 Hz, He), 7.08 (d, 1H, J = 2.3 Hz, Hc), 7.10 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H6 or H8), 7.17 (d, 1H, J = 2.2 Hz, Ha), 7.23-7.27 (m, 2H, H6 or H8 and Hf), 7.46-7.50 (m, 2H, H2', H5'), 7.75-7.81 (m, 2H, H7, H6'), 9.19 (t, 1H, J = 5.8 Hz, CONH), 10.7 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 24.9 (NHCH2CH2), 30.7 (NHCH2CH2), 55.3 (OCH3), 68.6 (OCH2), 100.2 (Cc), 108.9 and 110.7 (C6 and C8), 111.1 and 111.2 (Cb and Cf), 112.0 and 112.1 (Ce and C3), 114.5 (C10), 115.7 and 115.9 (C6'), 117.3 and 117.5 (C5'), 123.2, 123.3, 123.3 and 123.3 (C2'), 123.4 (Ca), 127.5 (Ch), 131.4 (Cg), 134.6, 134.7, 134.7 and 134.8 (C1'), 135.0 (C7), 147.4, 147.5, 148.1 and 148.2 (C3'), 149.9, 150.0, 150.6 and 150.7 (C4'), 153.0 (Cd), 153.7 (C2), 157.0 and 157.5 (C5 and C9) : C, 66.65; H, 4.40; N, 5.55. Found: C, 66.57; H, 4.36; N, 5.49 C, 69.87; H, 5.26; N, 5.62. Found: C, 66.91; H, 5.09; N, 5.37. was purified by flash silica column chromatography using dichloromethane/ methanol (95:5) as eluent to afford to afford 17a as a white solid (80 mg, 31%). C27H21BrN2O4. m.p. 221°C.

II

1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.98 (t, 2H, J = 7.9 Hz, NHCH2CH2), 3.58 (m, 2H, NHH2CH2), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.67 (s, 1H, H3), 6.96-7.35 (m, 6H, H6, H8, Ha, Hd, He, Hf), 7.58-7.63 (m, 5H, H2', H3', Hc) C, 60.80; H, 3.97; N, 5.25. Found: C, 59.66; H, 3.76; N, 5.41. 

5-(4'-

N-BOCtryptamine (20a).

To a solution of tryptamine (free base, 500 mg, 3.1 mmol) in dichloromethane (6.5 mL/mmol) were added di-tert-butyl dicarbonate (763 mg, 3.5 mmol)

and triethylamine (941 mg, 9.3 mmol) and the resulting mixture was stirred at room temperature for 24h. The mixture was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to afford 20a as an orange oil with triethylamine (99%). C15H20N2O2. 

1-Methyl-N-BOCtryptamine (21a).

To a solution of 20a (500 mg, 1.9 mmol) in dichloromethane (10 mL) were added sodium hydroxide (308 mg, 7.7 mmol) and tetrabutylammonium bromide (310 mg, 1 mmol) and the resulting mixture was stirred at 0°C.

After 30 minutes, iodomethane (545 mg, 3.8 mmol) was added dropwise. The solution was stirred at room temperature for 16h. The resulting mixture was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (1:0 to 8:2) as eluent to afford 21a as a colorless oil (214 mg, 41%).

C16H22N2O2. (m, 4H, NH2CH2CH2), 3.71 (m, 3H, NCH3), 3.86 (m, 3H, OCH3), 6.86-7.20 (m, 4H, Ha, Hc, He, Hf). 13 2, 23.8, 32.9, 36.4, 48.1, 50.9, 64.9, 69.3, 109.0, 109.1, 110.1, 110.3, 110.4, 110.9, 111.3, 111.4, 111.7, 112.0, 114.3, 114.5, 117.5, 118.0, 118.2, 118.3, 120.6, 120.8, 121.0, 123.0, 123.5, 126.6, 127.2, 128.9, 131.2, 134.4, 134.7, 136.1, 136.2, 136.3, 136.4, 155.8, 156.2, 156.9, 157.2, 157.6, 157.7, 161.2, 161.6, 175.4, 175.8 63.29; H, 4.36; N, 5.27. Found: C, 63.45; H, 4.50; N, 5.22. H3), 6.39 (s, 0.4H, H3), 6.55-7.26 (m, 6H, H6, H8, Ha, Hc, He, Hf), 7.40-7.56 (m, 5H, H2', H3', H7). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 23.4, 32.2, 33.1, 50.8, 55.0, 55.4, 69.2, 99.4, 108.9, 109.1, 109.1, 110.2, 110.3, 110.4, 111.1, 111.9, 114.0, 120.5,120.6,127.2, 128.4, 128.9, 131.2, 131.8, 134.3, 136.5, 153.0, 155.4, 156.7, 157.2, 157.6, 158.8, 161.5, 175.3. MS (ESI) m/z 575 ( 79 Br), 577 ( 81 Br) [M+H] + . Anal. Calcd for C30H27BrN2O5: C, 62.61; H, 4.74; N, 4.87. Found: C, 55.93; H, 4.40; N, 3.60. 6.50-7.68 (m, 12H, H6, H7, H8, H2', H3', Ha, Hc, Hd, He, Hf), 10.80 (s, 0.6H, indole NH), 10.87 (s, 0.4H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 23.6, 32.8, 50.9, 69.0, 106.1, 106.2, 109.2, 109.5, 110.0, 111.3, 111.4, 117.4, 118.0, 118.2, 118.3, 120.2, 120.3, 120.8, 123.0, 123.5, 124.0, 124.4, 126.6, 127.2, 129.8, 131.4, 136.1, 136.2, 149.8, 155.5, 157.9, 158.3, 161.3, 161.7, 176.0, 176.3. MS (ESI) m/z 531 ( 79 Br), 533 ( 81 Br) [M+H] + , 553 ( 79 Br), 555 ( 81 Br) [M+Na] + . Anal. Calcd for C28H23BrN2O4: C, 63.29; H, 4.36; N, 5.27. Found: C, 62.34; H, 4.87; N, 5.24. 5.23 (s, 1.2H, OCH2), 6.03 (s, 0.7H, H3), 6.47 (s, 0.3H, H3), 6.86-7.70 (m, 12H, H6, H7, H8, H2', H3', Ha, Hc, Hd, He, Hf). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 23.5, 32.1, 33.0, 51.0, 68.9, 106.2, 109.4, 109.5, 109.6, 117.7, 118.1, 118.4, 120.1, 120.3, 120.9, 121.0, 121.1, 123.9, 124.0, 126.9, 127.8, 129.8, 131.4, 136.1, 136.4, 136.6, 149.7, 150.3, 155.5, 155.8, 157.8, 158.3, 161.3, 161.6, 175.8, 176.3. MS (ESI) m/z 545 ( 79 Br), 547 ( 81 Br) [M+H] + , 567 ( 79 Br), 569 ( 81 Br) [M+Na] + . Anal. Calcd for C29H25BrN2O4: C, 63.86; H, 4.62; N, 5.14. Found: C, 63.60; H, 4.67; N, 5.37.

5-(4'-

6-(4'-

II.1.3.6 Introduction of a triazolic ring -Synthesis of compounds 27a to 27c

5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid prop-2-ynylamide (26).

The crude was prepared according to general procedure D1 starting from propargylamine (73 mg, 1.3 mmol) C, 59.46; H, 3.88; N, 10.27. Found: C, 59.00; H, 3.91; N, 10.43. and washed with diethyl ether to afford 27b as a white solid (16 mg, 5%). C27H20Br2N4O4. 

5-(4'-

5-(4'-Bromobenzyloxy)-2-({[2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)-ethyl]-methyl-amino}-methyl)-

chromen-4-one (31b). The crude was prepared according to the general procedure J starting from 30 (100 mg, 1.9 mmol) and 19b (47 mg, 2.3 mmol) and was purified by flash silica column chromatography, using cyclohexane/acetone (9:1 to 7:3) as eluent to afford 31b as a white solid (403 mg, 38%). C29H27BrN2O4. m.p. 64-67°C. , 61.81; H, 5.20; N, 6.36. Found: C, 61.31; H, 5.26; N, 6.47.

II.2. SYNTHESIS OF MRP1 DERIVATIVES

II.2.1. Synthesis of flavonoid dimers

II.2.1.1 General procedures

General procedure L. To a solution of acetophenone (1 equiv.) in tetrahydrofuran (5 mL/ mmol) was added sodium hydride (60%, 4 equiv.). The resulting mixture was stirred at 25°C for 30 min. Then a solution of O-alkylated benzaldehyde (0.9 equiv.) in tetrahydrofuran (5 mL/ mmol) was added dropwise. The resulting solution was stirred at 25°C under argon for 2 h. The mixture was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure M. To a solution of chalcone (1 equiv.) in a minimum amount of dimethyl sulfoxide heated at 50°C was added diiode (cat.). The resulting mixture was stirred at 140°C for 4 h. The solution was cooled to 25°C, poured into water and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with a solution of sodium thiosulfate (0.1%), dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure N. To a solution of alkylated flavone (1 equiv.) and potassium carbonate (4 equiv.) in methanol (20 mL/mmol) was added dropwise palladium tetrakis(triphenylphosphine)(0) (cat.). The resulting mixture was refluxed for 2 h 30. The solution was cooled to 25 °C, poured into water and acidified to pH 4-5 with 1M hydrochloric acid at 0°C. The white formed precipitate was filtrated and washed with diethyl ether.

General procedure O.

A solution of sodium hydroxide (3.5 equiv.) in water (2.5 mL/mmol) was added at 0°C to a solution of ethylene glycol derivative (1 equiv.) in tetrahydrofuran (2.5 mL/mmol). A solution of p-toluenesulfonylchloride (2.2 equiv.) in tetrahydrofuran (4 mL/mmol) was added dropwise for 30 min. The resulting mixture was stirred at 0°C for 3 h.

The mixture was poured in a cold solution of 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with a saturated solution of sodium hydrogenocarbonate and water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure P. To a solution of dibenzaldehyde (1 equiv.) and acetophenone derivative (4 equiv.) in 96% ethanol (15 mL/mmol) was added dropwise a solution of 50% potassium hydroxide in water (2 mL/mmol). The resulting mixture was stirred at 90°C for 5 h and stirred at 25°C for 20 h. The mixture was poured into 1M hydrochloric acid and stirred a couple of hours to form a yellow solid. The solid was filtered, dried at 106°C for 1 h and washed with diethyl ether for 1 h to eliminate the excess of starting acetophenone. The solid was filtrated and dried at 100°C overnight. Because some traces of starting dibenzaldehyde were detected, the dried solid was washed with a solution of ethyl acetate, acetone and ethanol

(1/1/1) for 1 h, filtered and dried in oven overnight.

General procedure Q. 4-Hydroxybenzaldehyde (1 equiv.) was dissolved with potassium carbonate (6 equiv.) and tetrabutylammonium bromide (cat.) in dry N, N-dimethylformamide (5 mL/mmol). The mixture was heated to 80°C under argon. A solution of the tosylate derivative (0.5 equiv.) in N, N-dimethylformamide (5 mL/mmol) was added dropwise and the resulting mixture was stirred at 80°C under argon for 3 h-4 h. The mixture was cooled to 25°C

and poured into cold water to form a white solid. This solid was filtered, washed with water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. 

II.2.1.2 Synthesis of dimer 4e

3-Ethoxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one (50a).

The crude was prepared according to general procedure R starting from 3-hydroxyflavone (400 mg, 1.68 mmol) and bromoethane (202 mg, 1.1 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 50a as a colorless oil (134 mg, 30%). C17H14O3. 

II.2.2.2 Synthesis of C-alkylated derivatives of flavone o

General procedures

General procedure S. To a solution of salicylaldehyde (1 equiv.) in diethyl ether (5 mL/mmol) at 0°C was added dropwise alkylmagnesium bromide (5 equiv.). The resulting mixture was stirred at 0°C for 10 min and at 25 °C for 3 h. The solution was slowly poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure T. To a solution of alcohol (1 equiv.) in dichloromethane (10 mL/mmol) was added manganese dioxide (19 equiv.). The resulting mixture was stirred at 25°C for 6 h.

The solution was filtrated over a pad of celite. The filtrate was washed with water and extracted with dichloromethane. The combined organic layer were dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure U. To a solution of phenol (1 equiv.) in dichloromethane (10 mL/mmol) were added triethylamine (3 equiv.) and benzoyle chloride (1.6 equiv.). The resulting mixture was refluxed for 5 h. The solution was cooled to 25°C, poured into water and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with 15% sodium hydroxide and water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

General procedure V. To a stirred solution of sodium hydride (60%, 3 equiv.) in dimethyl sulfoxide (4 mL/mmol) was added dropwise a solution of ester (1 equiv.) Benzoic acid 2-butyryl-phenyl ester (53a). The crude was prepared according to general procedure U starting from 52a (274 mg, 1.7 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (100:0 to 9:1) eluent to afford 53a as a colorless oil (178 mg, 40%). C17H16O3. Benzoic acid 2-pentanoyl-phenyl ester (53b). The crude was prepared according to general procedure U starting from 52b (457 mg, 2.6 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (95:5) as eluent to afford 53b as a colorless oil (377 mg, 52%). C18H18O3. 7.60-7.69 (m, 3H, H4, H3'), 7.74-7.78 (m, 1H, H4'), 7.94 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.8 Hz, H6), 8.09-8.11 (m, 2H, H2'). 13 3-Ethyl-2-phenyl-chromen-4-one (54a). The crude was prepared according to general procedure V starting from 53a (178 mg, 0.7 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (100:0 to 9:1) as eluent to afford 54a as a colorless oil (26 mg, 15%). C17H14O2. 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (t, 3H, J = 7.3 Hz, CH2CH3), 2.58 (q, 2H, J = 7. 4 Hz, CH2CH3), 7.37-7.42 (m, 1H, H6), 7.43 (m, 1H, H8), 7.52-7.53 (m, 3H, H3', H4'), 7.60-7.67 (m, 3H, H7, H2'), 8.26 (dd, 1H, J = 1.3 Hz, J = 8.0 Hz, H5).

(C6), 125.9 (C5), 126.1 (C10), 128. 6 and 128.8 (C2' and C3') 

II.2.3. Synthesis of ferrocene derivatives

II.2.3.1 Synthesis of ferrocenyl chalcone

General procedure W. To a solution of acetophenone derivative (1 equiv.) in tetrahydrofuran (4 mL/mmol) was added sodium hydride (4 equiv.). The resulting mixture was stirred at 25°C for 30 min and ferrocene carboxaldehyde (1.5 equiv.) was added in tetrahydrofuran (4 mL/mmol) and the mixture was stirred at 25°C for 4-8 h. The solution was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

(E)-1-(2-Hydroxyphenyl)-3-ferrocenylpropenone (55a C, 66.68; H, 4.49. Found C, 66.2; H, 4.65.

General procedure Y. To a solution of benzofuranone (1 equiv.) in methanol (15 mL/mmol) were added a solution of potassium hydroxide (50% in H2O, 1.5 mL/mmol) and ferrocene carboxaldehyde (1.5 equiv.). The mixture was refluxed for 5h. The solution was cooled to 25°C and concentrated under reduced pressure. The residue was poured into water and 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

(Z)-4,6-Dimethoxy-2-ferrocenylidene-benzofuran-3-one (56d). The crude was prepared according to general procedure Y starting from 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (500 mg, 2.6 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (7:3) as eluent to afford 56d as a violet solid (763 mg, 76%). C21H18FeO4. (Z)-2-Ferrocenylidene-4-hydroxy-benzofuran-3-one (57a). To a solution of 56b (200 mg, 0.6 mmol) in dichloromethane (12 mL) was added aluminium chloride (228 mg, 1.7 mmol).

The resulting mixture was refluxed for 4h. The solution was cooled to 25 °C, poured into 6M hydrochloric acid at 0°C and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 57a as a violet solid (15 mg, 8%).

C19H14FeO3. m.p. 148-149°C. (Z)-4,6-Hydroxy-2-ferrocenylidene-benzofuran-3-one (57c). The crude was prepared according to general procedure B starting from 4,6-dihydroxyacetophenone (500 mg, 3 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (8:2 to 5:5) as eluent to afford 57c as a violet solid (26.5 mg, 3%). C19H14FeO4. m.p. 174-175°C.

1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.17 C, 63.00; H, 3.90. Found C, 58.60; H, 4.48.

II.2.3.3 Synthesis of ferrocenyl flavones

General procedure Z. To a solution of ferrocenyl aurone (1 equiv.) in ethanol (80 mL/mmol) was added potassium cyanide (3.8 equiv.). The resulting mixture was refluxed for 4 h. The solution was cooled to 25°C, poured into 15% sodium hydroxide and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

2-Ferrocenyl-chromen-4-one (58a). The crude was prepared according to general procedure Z starting from 56a (400 mg, 1.2 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (8:2) as eluent to afford 58a as a red solid (228 mg, 57%). C19H14FeO2. m.p. 144-146°C. [M+Na] + . Anal. Calcd for C19H14FeO2: C, 69.12; H, 4.27. Found C, 69.17; H, 4.09.

2-Ferrocenyl-7-methoxy-chromen-4-one (58b). The crude was prepared according to general procedure Z starting from 56c (96 mg, 0.3 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (85:15 to 7:3) as eluent to afford 58b as an orange solid (48 mg, 49%). C20H16FeO3. m.p. 177-178°C. Calcd for C20H16FeO3: C, 66.68; H, 4.49. Found C, 65.55; H, 4.69. 66). To a solution of bromoanisole (1 g, 5.3 mmol) in anhydrous THF (10 mL) at -78°C was added a 2.5 M solution of n-BuLi in hexanes (2.1 mL, 5.3 mmol) and the reaction mixture was stirred at -78°C for 45 minutes. A solution of cycloheptanone (545 mg, 4.9 mmol) in anhydrous THF (5 mL) was added and the mixture was stirred at -78°C for 2 hours. The solvents were removed under reduced pressure then the residue was diluted into distilled water and the mixture was extracted with dichloromethane.

2-Ferrocenyl

The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash silica column chromatography using dichloromethane (100%) to afford 66 as a colorless oil (984 mg, 92%).

C14H20O2. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1. 55-2.10 (m, 12H, CH2), 3.83 (s, 3H, OCH3), 6.80 (dd, 1H, J = 2.5 Hz, J = 8.0 Hz, H4'), 7.07-7.13 (m, 2H, H2', H6') dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to afford 67 as a yellow oil (750 mg, 95%). C14H18O. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1. 60-1.75 (m, 4H, CH2), 1.91 (m, 2H, CH2), 2.36 (m, 2H, CH2), 2.68 (m, 2H, CH2), 3.87 (s, 3H, OCH3), 6.19 (t, 1H, J = 6.8 Hz, H2), 6.83 (ddd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 2.5 Hz, J = 8.0 Hz, H4'), 6.95 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 2.5 Hz, H2'), 7.00 (ddd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 1.6 Hz, J = 8.0 Hz, H6'), 7.28 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H5'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 26.9 (CH2), 27.0 (CH2), 28.9 (CH2), 32.8 (CH2), 32.9 (CH2), 

1-(3-Methoxyphenyl)cycloheptane-1,2-diol (68).

To a solution of 67 (7.28 g, 36.0 mmol) in a mixture of tetrahydrofuran (150 mL) and water (50 mL) were added a 4% aqueous solution of OsO4 (11.5 mL) and a 50% aqueous solution of N-methylmorpholine-N-oxide (14 mL) and the mixture was stirred at 25 °C for 96 hours. A saturated aqueous solution of sodium bisulfite (50 mL) was added and the mixture was stirred at 25 °C for 30 minutes then extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluant to afford 68 as a white solid (8 g, 94%). C14H20O3. m.p. 103-104°C. 

7-(3-Methoxyphenyl)-7-oxoheptanal (69).

To a solution of 68 (8.00 g, 33.9 mmol) in a mixture of tetrahydrofuran (200 mL) and water (50 mL) was added sodium periodate (9.9 g, 46.3 mmol) and the mixture was stirred at 25 °C for 48 hours. The suspension was filtered and the solid was washed with ethyl acetate. The filtrate was washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash silica column chromatography using dichloromethane/methanol (99:1) as eluent to afford 69 as a brown oil (6.6 g, 84%). C14H18O3. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1. 40-1.47 (m, 2H, CH2), 1.69 (m, 2H, CH2), 1.76 (m, 2H, CH2), 2.47 (td, 2H, J = 1.7 Hz, J = 7.3 Hz, H6), 2.97 (t, 2H, J = 7.3 Hz, H2), 3.86 (s, 3H, OCH3), 7.10 (ddd, 1H, J = 0.9 Hz, J = 2.6 Hz, J = 7.9 Hz, H4'), 7.37 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H5'), 7.48 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, J = 2.6 Hz, H2'), 7.53 (ddd, 1H, J = 0.9 Hz, J = 1.5 Hz, J = 7.9 Hz, H6'), 9.78 (t, 1H, J = 1.7 Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 22.1 (C5), 24.2 (C3), 29.0 (C4), 38.5 (C2), 43.9 (C6), 55.6 (OCH3), 112.5 (C2'), 119.6 (C4'), 120.9 (C6'), 129.8 (C5'), 138.5 (C1'), 160.0 (C3'), 200.1 (C1), 202.8 (C7). (m, 1H, H5b), 1.38 (m, 1H, H4b), 1.39 (m, 1H, H6b), 1.45 (m, 1H, H7b), 1.77 (m, 1H, H6a), 1.91 (m, 1H, H5a), 1.96 (m, 1H, H4a), 2.00 (m, 1H, H7a) 

HRMS (ESI

III.2. SEMI-PREPARATIVE HPLC-UV ISOLATION FOR

ANALYSIS OF TRAMADOL

HPLC-UV preparative analysis was performed with an Armen modular spot prep II (Saint-Avé, France), equipped with a UV detector. The HPLC conditions were as follows: X-Bridge A) 

Abstract:

Resistance to chemotherapeutic agents (Multidrug Resistance or MDR) is a major hurdle for anticancer chemotherapy. Among different mechanisms involved in MDR, the overexpression of membrane proteins belonging to ABC family is the most relevant one. Among such proteins, ABCG2 and MRP1 are considered to play an important role. These transporters are able to induce a massive efflux of anticancer agents out of the cancer cells, reducing their intracellular concentration and their therapeutic potency. In order to overcome this resistance, novel modulators of ABCG2 and MRP1 were designed, synthetized and tested biologically. In this context, new derivatives of chromones as inhibitors of ABCG2 were developed in order to restore sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents. In addition, molecular modelling of new pharmacophores allowed us to gather new data exploring ABCG2-ligand interactions. New modulators of MRP1, derivatives of flavonoids, are able to induce a massive efflux of intracellular glutathione that is mediated by the protein, without being transported and causing selective apoptosis of cancer cells overexpressing MRP1. 

Keywords

Figure 1 :

 1 Figure 1 : Structure du méthotréxate.

Figure 2 :

 2 Figure 2 : Structure de l'irinotécan et du topotécan.

Figure 3 :Figure 4 Figure 4 :

 344 Figure 3 : Structure du cisplatine.

Figure 5 :

 5 Figure 5 : Structure de la vincristine, du paclitaxel et du docétaxel.

8

 8 

Figure 6 :

 6 Figure 6 : Structure de l'imatinib et du sorafénib.

Figure 7 :

 7 Figure 7 : Représentation des différents mécanismes de résistance de la cellule face aux agents anticancéreux.

  Les transporteurs ABC comportent tous un domaine transmembranaire variable (TMD pour « TransMembrane Domain ») et un domaine nucléotidique cytoplasmique (NBD pour « Nucleotide Binding Domain ») relativement conservé entre tous les transporteurs. Les transporteurs membranaires peuvent être divisés en deux groupes, les exportateurs et les importateurs. Tandis que les bactéries emploient les exportateurs et les importateurs ABC, les eucaryotes quant à eux possèdent, hormis quelques exceptions, uniquement des exportateurs.

  ont déjà été résolues permettant une meilleure compréhension de leur structure et de leur fonctionnement. Ces études ont permis l'identification d'acides aminés clés présents dans les motifs des NBDs. Les NBDs sont constitués d'un sous-domaine principal contenant les motifs Walker A et B et d'un sous-domaine hélicoïdal contenant la signature S. Ce dernier motif est attaché au premier de manière flexible par la boucle Q via son N-terminal et par la boucle Pro via son C-terminal (Figure8).[START_REF] George | Perspectives on the structure-function of ABC transporters: the Switch and Constant Contact models[END_REF] 

Figure 8 :

 8 Figure 8 : Structure d'un NBD. 36 Le sous-domaine principal est coloré en gris et le sous domaine hélicoïdal est coloré en vert. Certaines séquences consensus et motifs sont représentés ainsi qu'une molécule d'ATP.

35 -

 35 Le motif Walker B possède un résidu d'acide aspartique formant une liaison de coordination avec l'ion magnésium, cofacteur nécessaire à l'hydrolyse de l'ATP ; le motif Signature S (ou motif C) caractérisé par la séquence consensus LSGGQ, situé entre Walker A et Walker B. Ce motif est caractéristique des transporteurs ABC. Il permet une interaction avec le phosphate γ de l'ATP ; -la boucle H, impliquée dans la réaction catalytique d'hydrolyse de l'ATP ; -la boucle D permet l'interaction entre les 2 NBDs pendant la formation du complexe liant l'ATP et l'ion magnésium ; -la boucle Q relie les deux lobes des NBDs et est impliquée dans la transmission d'énergie aux TMDs ; -la boucle A aide à positionner l'ATP dans le site catalytique grâce aux interactions entre les noyaux aromatiques du résidu tyrosine et de l'ATP.

Figure 9 :

 9 Figure 9 : Topologie générale des transporteurs ABC.

49 II. 3 .

 493 transporteurs ABC. La plupart de ces structures ont été résolues dans leur conformation « inward-facing », pour laquelle les TMDs s'ouvrent vers le cytoplasme, en présence ou en absence de nucléotides. De plus, ont été observées différentes amplitudes de séparation des NBDs selon les espèces. Les structures cristallines des conformations « outward facing » pour lesquelles les TMDs s'ouvrent vers le milieu extracellulaire ont été observées uniquement chez deux protéines procaryotes liées à un nucléotide (Sav1866 et MsbA). La résolution récente de l'exportateur antibactérien McjD dans une conformation intermédiaire entre les conformations « outward-facing » et « inward-facing » permettra d'apporter de nouveaux éléments quant à la compréhension du mécanisme de transport de ces protéines ABC. MÉCANISME DE TRANSPORT DES PROTÉINES ABC Afin d'assurer leur fonction de transport, les protéines ABC doivent posséder deux NBDs. Ces deux NBDs forment un dimère symétrique de conformation « tête bêche » au sein duquel s'insèrent deux molécules d'ATP prises en « sandwich » dans deux cavités différentes. Au sein de ce qu'on appelle alors le « dimère sandwich », une molécule d'ATP se lie par l'intermédiaire du motif Walker A à NBD1 et par l'intermédiaire de la séquence signature à NBD2 et inversement pour la seconde molécule d'ATP (Figure11). La formation de ce dimère sandwich des NBDs apporte l'énergie nécessaire au changement conformationnel des TMDs.[START_REF] Chen | A tweezers-like motion of the ATP-binding cassette dimer in an ABC transport cycle[END_REF] 

Figure 11 :

 11 Figure 11 : Structure d'un dimère de NBDs. 36 Les sous-domaines principaux sont colorés en gris et les sousdomaines hélicoïdaux sont colorés en vert.

Figure 12 :

 12 Figure 12 : Schéma représentant les étapes du modèle « Switch » du cycle de transport d'un exportateur ABC. 58 En jaune et orange sont représentés les deux TMDs et en rose et bleu les deux NBDs.

Figure 13 :

 13 Figure 13 : Représentation du cycle catalytique d'hydrolyse de l'ATP selon le modèle « constant contact ».[START_REF] George | Perspectives on the structure-function of ABC transporters: the Switch and Constant Contact models[END_REF] 

Figure 14 :

 14 Figure 14 : Le modèle « Reciprocating twin channel » pour les exportateurs ABC. 57 Les TMDs sont représentés par des rectangles gris. La ligne verticale les démarquant sépare les deux voies de translocation, respectivement nommées voie 1 (à gauche) et voie 2 (à droite). Le point noir symbolise le substrat. Les sites de liaisons avec le substrat sont indiqués par des demi-cercles pour les conformations « inward-facing » et « outwar-facing », par des cercles pour les états liés au substrat et séquestrés au sein de la voie de translocation, puis sous la forme d'un losange pour les états non liés à un substrat. Les sites actifs des NBDs sont représentés par un rond blanc pour les sites ouverts et par un ovale noir pour les sites occupés. Le site NBD de gauche se nomme site 1 et le site NBD de droite site 2. Les lettres L et H réfèrent respectivement à basse affinité et haute affinité pour l'ATP.

  l'ADP est libéré du site 2 des NBDs pour adopter une conformation de faible affinité avec l'ATP. Le substrat au sein de la voie 2 est séquestré du côté cytosolique de la membrane. Le transporteur est alors capable d'hydrolyser l'ATP ; -étape 4 : les produits de l'hydrolyse de l'ATP (ADP et Pi) dans le site 1 stabilisent la configuration dans laquelle le substrat dans la voie 2 est séquestré du côté extracellulaire de la membrane ; -étape 5 : la liaison de l'ATP au site 2 provoque une isomérisation du transporteur qui entraîne l'ouverture du site 1 relié à l'ADP, bloque l'ATP dans le site 2, régénère la conformation de haute affinité « inward-facing » de la voie 1, et présente le substrat transporté par la voie 2 au milieu extracellulaire. Lors des étapes 6 à 8, les enchaînements se répètent réciproquement dans les voies 1 et 2 afin de compléter le cycle. Pour conclure, le mécanisme moléculaire des transporteurs est encore peu connu bien que beaucoup étudié. Les différentes théories avancées font l'objet d'un grand nombre de controverses. En effet, les structures cristallographiques des deux transporteurs humains, P-gp murine et ABCB10 (Figure 10) indiquent que les NBDs passent par une forme ouverte, favorisant ainsi l'hypothèse du modèle « Switch ». Cependant, ces structures représentent les images des protéines figées et donc potentiellement différentes de leur comportement dynamique. Une étude récente par microscopie électronique souligne la flexibilité de ces transporteurs lors du processus de transport et démontre les très nettes différences existantes entre deux modèles, MsbA et P-gp. 60 Il est ainsi considéré comme acquis que les mécanismes de transport diffèrent entre les transporteurs ABC et d'autres études sont ainsi nécessaires afin d'étayer les différentes hypothèses.

Figure 15 :

 15 Figure 15: Structures du vérapamil RS et de la cyclosporine A.

Figure 16 :

 16 Figure 16: Structures de SDZ PSC833 (Valspodar) et de S9788.

Figure 17 :

 17 Figure 17: Structures de l'élacridar, du tariquidar et du zosuquidar.

Figure 18 :Figure 19 :

 1819 Figure 18 : Topologie générale d'ABCG2.

Figure 20 :

 20 Figure 20 : Distribution d'ABCG2 au sein des tissus. La présence d'ABCG2 est indiquée par les lignes violettes. Les flèches noires indiquent la direction du transport des substrats par ABCG2. Les flèches vertes indiquent l'excrétion de ces substrats par l'organisme. (Figure adaptée des travaux de Van Herwaarden, 2006) 163

Figure 21 :

 21 Figure 21 : Rôle joué par ABCG2 au sein de la barrière hémato-encéphalique. 172 Les cellules endothéliales sont connectées via des jonctions étroites (TJ pour tight junction) et constituent une barrière empêchant les composés hydrophiles de pénétrer dans le cerveau. Les agents hydrophobes et les toxines sont capables de franchir cette barrière. La présence des transporteurs P-gp et ABCG2, exprimés dans la membrane apicale des cellules endothéliales (vers le compartiment sanguin) est responsable du transport d'une large variété de ces composés.

Figure 22 :Figure 23 :

 2223 Figure 22 : Inhibiteurs d'ABCG2 de 1 ère génération.

Figure 24 :

 24 Figure 24 : Inhibiteurs d'ABCG2 de 3 ème génération.

Figure 25 :

 25 Figure 25 : Structures des inhibiteurs 4b, 5b et 5c.

Figure 26 :

 26 Figure 26 : Inhibiteurs d'ABCG2 de 4 ème génération.

Figure 27 :

 27 Figure 27 : Récents inhibiteurs d'ABCG2.

Figure 28 :JoursFigure 29 :

 2829 Figure 28 : Structure du MBL-I-87, dérivé de l'élacridar.

Figure 30 :

 30 Figure 30 : Structure du MBL-II-141 et de ses précurseurs.

Figure 31 :Figure 32 :

 3132 Figure 31 : Résultats issus du test de survie cellulaire (test au MTT) du MBL-II-141 sur les cellules HEK293 surexprimant ABCG2 (■) et sur les cellules HEK293 contrôle (○) pour un traitement de 72 h. 239

Figure 33 :Figure 34 :

 3334 Figure 33 : Effet du MBL-II-141 et de l'irinotécan sur la croissance tumorale et la survie des souris SCID xénogreffées par des cellules humaines surexprimant ABCG2 et présentant des tumeurs fraîchement implantées. Les souris ont été traitées avec un vecteur vide constitué d'huile de maïs + 0,5% DMSO (courbes noires), MBL-II-141 à 10 mg/kg (courbes vertes), huile de maïs + 0,5% DMSO + irinotécan à 20 mg/kg (courbes orange) et MBL-II-141 à 10 mg/kg + irinotécan à 20 mg/kg (courbes bleues). Le traitement commençe au jour 21 et finit au jour 108. 240

Figure 35 :

 35 Figure 35 : Pharmacomodulations réalisées à partir de la structure du MBL-II-141.

Figure 36 :

 36 Figure 36 : Structure de l'intermédiaire 2'.

Figure 37 :

 37 Figure 37 : Spectre RMN 1 H de l'intermédiaire 2' dans le DMSO-d6.

Figure 38 :

 38 Figure 38 : Structures des composés 7a et 7b.

Figure 39 :

 39 Figure 39 : Structures des composés 11a à 11f.

Figure 40 :

 40 Figure 40 : Structure de l'isonitrosocyanoacétate d'éthyle.

Figure 41 :

 41 Figure 41 : Structure du composé 16.

Figure 42 :

 42 Figure 42 : Structures des composés 17a à 17f.

  d'hydroxyde de sodium et d'un ammonium quaternaire afin de former le composé 23, méthylé en position 1, avec un rendement de 70%. Le composé 23 a ensuite été réduit avec l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium pour conduire au composé 24 avec un rendement de 70%.

Figure 43 :

 43 Figure 43 : Structures des composés 25a à 25e.

Figure 44 :

 44 Figure 44 : Structures des composés 25g et 25h.

Figure 45 :

 45 Figure 45 : Cycle catalytique selon Sharpless de la cycloaddition 1,3-dipolaire catalysée par du cuivre (I) (CuAAC).250

Figure 46 :

 46 Figure 46 : Structures des composés 31b et 32a.

Figure 47 :

 47 Figure 47 : Structures des composés 35a à 35c.

Formule 1 :

 1 fluorescent. Son accumulation intracellulaire est quantifiée par cytométrie de flux sur les deux lignées sensibles (HEK293-pcDNA3.1 ou H460) et résistantes (HEK293-ABCG2 ou H460MX). L'inhibiteur de référence est le Ko143 qui permet d'obtenir une inhibition de 100%. Une première phase d'incubation est mise en oeuvre pendant laquelle la mitoxantrone (5 µM) s'accumule au sein des cellules pendant 30 min à 37°C en présence ou en absence de concentrations variables en composés inhibiteurs testés. Les cellules contrôles (HEK293-pcDNA3.1 ou H460) accumulent une quantité donnée de mitoxantrone tandis qu'au sein des cellules ABCG2-positive (HEK293-ABCG2 ou H460MX), le transporteur évacue le substrat fluorescent et induit une diminution de son accumulation intracellulaire et donc une diminution de la fluorescence globale de la cellule. L'incubation avec un inhibiteur donné bloque l'efflux de la mitoxantrone et ainsi induit une augmentation de la fluorescence des cellules ABCG2 positives. La fluorescence intracellulaire correspondant à la quantité de mitoxantrone non effluée est ensuite déterminée par cytométrie de flux. À partir de ces résultats expérimentaux, le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante : %inhibition = C-M * 100 Calcul du pourcentage d'inhibition. C correspond à la fluorescence intracellulaire des cellules résistantes (HEK293-ABCG2 ou H460MX) en présence de composés testés et de mitoxantrone, M correspond à la fluorescence intracellulaire des cellules résistances en présence uniquement de la mitoxantrone et Cev correspond à la fluorescence intracellulaire des cellules contrôles (HEK293-pcDNA3.1 ou H460) en présence de composés testés et de la mitoxantrone.

Figure 48 :

 48 Figure 48 : Principe du test MTT.

Figure 49 :

 49 Figure 49 : Représentation schématique de la mesure de l'activité ATPasique.

Figure 50 :Tableau 6 :

 506 Figure 50 : Modulation de la position du groupement benzyloxy porté par la chromone.

Figure 51 :Tableau 9 :

 519 Figure 51 : Modulation de la nature et de la position de l'halogène sur le cycle benzyloxy.

(Tableau 10 :

 10 composé 16). D'un point de vue stérique, le groupement méthoxy est équivalent au brome. De plus, il s'agit d'un groupement accepteur de liaison hydrogène, nous permettant ainsi d'étudier si une liaison hydrogène permet de favoriser l'interaction avec la protéine ABCG2. L'activité inhibitrice de l'efflux de la mitoxantrone du composé 16 figure dans le Tableau 10Inhibition de l'efflux de la mitoxantrone sur les cellules ABCG2 transfectées surexprimant ABCG2 (HEK293-ABCG2) du composé 16. Les valeurs représentent la moyenne ± la déviation standard sur un minimum de trois expériences indépendantes. La présence d'un groupement méthoxy en position 4' du benzyloxy entraîne une perte de l'inhibition d'un facteur 6 par rapport au MBL-II-141. Ceci suggère ainsi que la présence d'un groupement accepteur de liaison hydrogène en cette position tend à être légèrement défavorable pour l'activité inhibitrice. Les tests de cytotoxicité et de sélectivité et la détermination des activités ATPasique du composé 16 sont actuellement en cours d'évaluation biologique. antérieurs, nous avons décidé d'explorer le rôle du groupement méthoxy porté par le noyau indolique du MBL-II-141. 226 Dans le cadre de cette étude, le groupement méthoxy du MBL-II-141 a été remplacé par un atome d'hydrogène (composé 17a), un groupement hydroxy (composé 17b), éthyloxy (composé 17c), propyloxy (composé 17d) et isopropyloxy (composé 17e). Enfin, le groupement méthoxy a été déplacé de la position 5 à la position 6 (composé 17f) (Figure 52).

Figure 52 :

 52 Figure 52 : Modulation de la nature de la substitution en position 5 de l'indole.

Tableau 11 :

 11 Inhibition de l'efflux de la mitoxantrone sur les cellules ABCG2 transfectées surexprimant ABCG2 (HEK293-ABCG2) et les cellules sélectionnées H460MX et étude de la cytotoxicité des composés 17a à 17f.Les valeurs représentent la moyenne ± la déviation standard sur un minimum de trois expériences indépendantes. e.c. = en cours. La suppression du groupement méthoxy en position 5 de l'indole entraîne une diminution d'un facteur 8 de l'activité inhibitrice montrant ainsi l'importance du rôle joué par un groupement hydrophobe en cette position. Ceci est d'autant plus confirmé par le composé 17b, possédant un groupement hydrophile et conduisant à une activité inhibitrice 33 fois inférieure à celle du MBL-II-141. Les composés 17c, 17d, 17e et 17f présentent quant à eux des valeurs d'EC50 équivalentes au MBL-II-141. Nous pouvons ainsi conclure que la présence d'un groupement hydrophobe au niveau du cycle indolique joue un rôle dans le maintien de l'activité inhibitrice du transport de mitoxantrone. Nous pouvons également conclure que la position 5 de l'indole est tolérante d'un point de vue stérique. En effet, cette position accueille aussi bien un groupement méthoxy qu'un groupement propyloxy ou isopropyloxy. Le composé 17f, équivalent à notre chef de file en termes d'inhibition, est l'unique composé de la série dont les tests biologiques ont été approfondis. Ce composé est sélectif d'ABCG2 vis-à-vis de la P-gp et à MRP1. Cependant, il se révèle être bien plus toxique que le MBL-II-141 (Tableau 11).Ainsi, au vu des résultats obtenus, la substitution par un groupement méthoxylé en position 5 du cycle indolique reste à l'heure actuelle le meilleur compromis en termes de relations structure-activité. étudier l'influence du caractère donneur/accepteur des liaisons N-H sur le profil pharmacologique, nous nous sommes intéressés à la méthylation des azotes indolique et amidique de notre chef de file.

Figure 53 :

 53 Figure 53: Méthylation des azotes amidique et indolique.

Tableau 12 :Tableau 13 :Figure 54 Figure 54 :Tableau 14 :Tableau 15 :Figure 55 :Tableau 16 :Tableau 17 :

 121354541415551617 Figure 54 : Introduction d'un cycle indolique au sein de nos structures.

Figure 56 :

 56 Figure 56 : Structure du Ko143.

Figure 57 :Tableau 18 :La

 5718 Figure 57 : Introduction d'un motif acide aminé dans la chaîne centrale.

Figure 58 :

 58 Figure 58 : Schéma résumant les points importants issus de l'étude des relations de structure-activité par rapport à l'inhibition de l'efflux de substrats et les activités ATPasiques (MXR = mitoxantrone).

  ATPasiques semblent obéir à différents mécanismes et/ou induire différentes conformations de la protéine. En effet, comme nous l'avons vu précédemment, ces deux activités peuvent être modulées séparément par différentes modifications structurales des chromones synthétisées. Par exemple, alors que le MBL-II-141 ainsi que l'ensemble des autres composés inhibent l'activité ATPasique basale, le composé 7b est le seul capable de la stimuler. La corrélation existante entre l'inhibition de l'activité de transport d'ABCG2 et l'inhibition de l'activité ATPasique couplée suggère un couplage entre l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP et la translocation des substrats au sein du domaine transmembranaire. Cependant, peu d'informations existent sur le rôle joué par l'activité ATPasique basale. Il est possible que cette activité soit impliquée dans la flexibilité de la protéine, contribuant ainsi à la polyspécificité d'ABCG2 vis-à-vis d'une large variété de substrats.

  chaque cas, l'intermédiaire ester de méthyle ainsi que les dérivés couplés à la 5méthoxytryptamine seront testés. Nous pouvons aussi envisager d'autres amides puisque sur cette série, la présence du cycle indolique n'apparaît plus être si importante. De plus, suite aux résultats obtenus par le composé 11a, il sera intéressant de synthétiser cette nouvelle série avec un atome de brome en position 2' du cycle benzyloxy. Les études du MBL-II-141 vont également se poursuivre. Tout d'abord in vivo où un nouveau modèle animal sera mis en place afin de tester le chef de file sur des souris xénogreffées par des cellules, non plus transfectées mais sélectionnées, surexprimant ABCG2. Ce nouveau modèle animal, plus proche des cas cliniques, nous permettra de confirmer ou non l'efficacité du MBL-II-141. Ces tests seront réalisés au sein de l'équipe du Dr. Gottesman et du Dr. Ambudkar au National Cancer Institute (NCI) à Bethesda (États-Unis). La sélectivité du MBL-II-141 pour ABCG2, vis-à-vis de la P-gp sera également étudiée in vivo. Le MBL-II-141, parmi d'autres inhibiteurs, sera également utilisé dans la co-cristallisation de la protéine ABCG2 afin d'en établir sa structure cristalline 3D haute résolution. Ces études seront réalisées au sein de l'équipe du Dr. Pierre Falson de l'IBCP de Lyon. Des études pharmacocinétiques (métabolisation, biodisponibilité, …) du MBL-II-141 sont également actuellement en cours au sein de l'équipe du Pr. Jérôme Guitton de l'Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de Lyon. L'une des contraintes rencontrée avec le MBL-II-141 étant son hydrosolubilité, la présence de groupements salifiables, tels que des azotes, peut s'avérer bénéfique malgré une perte d'activité in vitro. Ainsi, il sera intéressant de tester in vivo de nouveaux composés salifiables, moins actifs que le chef de file mais sous forme de sel afin d'en étudier leur profil pharmacologique. Cependant, comme nous avons pu le constater, malgré un grand nombre de pharmacomodulations réalisées, nous arrivons à un stade où il devient difficile d'obtenir de meilleurs composés que le MBL-II-141. Il devient ainsi nécessaire de changer notre approche. Comme nous l'avons vu précédemment, les activités ATPasiques basale et couplée semblent obéir à différent mécanismes. Bien que le composé 7b soit l'unique dans cette série capable de stimuler cette activité, d'autres inhibiteurs actifs d'ABCG2 se sont révélés être également des stimulateurs de l'activité ATPasique basale. Parmi eux des dérivés hydroxyindénoindoles. Ceci atteste ainsi de la polyspécificité d'ABCG2 et de l'existence de plusieurs sites d'interaction. Comme nous le verrons dans la suite de ce chapitre, ces deux sites d'interaction semblent être proches l'un de l'autre. C'est pour cette raison que l'une des perspectives de ce projet consiste en la synthèse de nouveaux composés constitués d'une part du MBL-II-141, inhibiteur de l'activité ATPasique basale et, d'autre part, d'un motif hydroxy-indénoindole, stimulateur de l'activité ATPasique basale, les deux unités étant reliées par différents bras espaceurs (Figure 59). Ces nouveaux composés pourront permettre ainsi d'atteindre simultanément deux sites d'interaction et d'augmenter considérablement l'activité inhibitrice de l'efflux via ABCG2.

Figure 59 : 1 .Figure 60 :Tableau 19 :

 5916019 Figure 59 : Nouvelles séries de composés issus de dérivés hydroxy-indénoindoles et du MBL-II-141.

Figure 61 :

 61 Figure 61 : Schéma représentant les quatre sites d'interaction hypothétiques de la protéine ABCG2.

Figure 62 :

 62 Figure 62 : Structures du composé 142s, stimulateur de l'activité ATPasique basale interagissant avec le site 3 et du composé 18i, inhibiteur de l'activité ATPasique basale, interagissant avec le site 4. 256

Figure 63 :Figure 64 :

 6364 Figure 63 : Composés appartenant au site 3. A) bis-chalcones symétriques. B) Chalcones. C) Chromones. D) Hydroxyindénoindoles. E) Chalcones possédant des groupements quinoxalines.

Figure 65 :

 65 Figure 65 : Représentation des MIFs du MBL-II-141. A) MIF correspondant à la sonde H décrivant la forme. B) MIF correspondant à la sonde DRY décrivant les interactions hydrophobes. C) MIF correspondant à la sonde N1 décrivant les interactions hydrogènes donneurs. D) MIF correspondant à la sonde O décrivant les interactions hydrogènes accepteurs.

Figure 66 :

 66 Figure 66: Étapes du fonctionnement du logiciel VolSurf+.

Figure 67 :Figure 68 :

 6768 Figure 67 : A) Extraction des points à partir des champs d'interaction moléculaire. B) Formation des quadruplets.

Figure 69 :

 69 Figure 69 : Résultats obtenus à l'issue d'un criblage virtuel dans le logiciel FLAP. Exemple d'une courbe "enrichment plot" sur la droite de l'image.

1 . 20 :Tableau 21 :

 12021 Sélection des composés pour la création des pharmacophores pour les sites 3 et site4FLAP n'a besoin que de 3 à 5 composés pour générer un modèle pharmacophore fiable.265, 266 Ainsi une première étape de ce travail a consisté à choisir ces composés parmi les bases de données disponibles. Afin d'effectuer cette tâche, deux approches ont été envisagées : -une sélection dite « manuelle » réalisée par étude visuelle des structures des composés, en se basant sur nos connaissances de chimistes ; -une sélection dite « automatisée » réalisée par le logiciel VolSurf+. III.3.1.1 Sélection « manuelle » Dans un premier temps, les 3 à 5 molécules utilisées pour la génération du pharmacophore ont été choisies par une étude visuelle des structures des composés. Deux critères ont guidé ces choix : l'activité inhibitrice d'ABCG2 (EC50 ≤ 1,5 µM) et la structure des composés. Différentes combinaisons de composés ont été mise au point afin de s'assurer de couvrir le plus grand espace possible. o Sélection « manuelle » pour le site 3 (stimulation de l'activité ATPase basale) La banque de données disponible pour le site 3 comprend 162 composés. Parmi eux, une première sélection de 5 composés puis 3 combinaisons de 3 composés ont été déterminées selon la méthode de sélection « manuelle ». Les structures et composés choisis sont résumés dans le Tableau 20. Sélection "manuelle" des composés appartenant au site 3. o Sélection « manuelle » pour le site 4 (inhibition de l'activité ATPase basale) La banque de données disponible pour le site 4 comprend 25 composés. De la même manière que pour le site 3, une première sélection de 5 composés puis 3 combinaisons de 3 composés ont été déterminées selon la méthode de sélection « manuelle ». Les structures et composés choisis sont résumés dans le Tableau 21. Sélection "manuelle" des composés appartenant au site 4. III.3.1.2 Sélection « automatisée » Dans un second temps furent sélectionnés les composés grâce au logiciel VolSurf+. Pour chaque site, une sélection a été réalisée à partir des composés les plus actifs en termes d'inhibition par rapport à ABCG2 (EC50). Le but de cette application est de sélectionner, au sein d'une base de données, un certain nombre de composés de structure et propriétés pharmacochimiques et physico-chimiques différentes. o Sélection « automatisée » pour le site 3 (stimulation de l'activité ATPase basale) Parmi les 162 composés démontrant une stimulation de l'activité ATPase basale, 39 composés présentent une EC50 inférieure à 1,5 µM. La sélection a ainsi été réalisée à partir de cette banque de données. Les séries des 3 et 5 composés choisis par VolSurf+ sont résumées dans le Tableau 22. La Figure 70 représente la carte de projection des composés étudiés, issue du modèle PLS. Les points jaunes localisent les composés sélectionnés par VolSurf+.

Figure 70 :Tableau 22 :

 7022 Figure 70 : Sélection des composés du site 3 par le logiciel VolSurf+ dans l'espace chimique. Projection des composés dans le modèle PLS. Les points rouges représentent les composés les moins actifs (%inhibition ≤ 70% et EC50 > 1,5 µM), les points bleus représentent les composés les plus actifs (EC50 ≤ 1,5 µM), les points noirs représentent les composés possédant un pourcentage d'inhibition supérieur ou égal à 70% mais dont les EC50 n'ont pas été déterminés et les points jaunes représentent les composés sélectionnés par VolSurf+.

Figure 71 :Tableau 23 :

 7123 Figure 71 : Sélection des composés du site 4 par le logiciel VolSurf+ dans l'espace chimique (en jaune).

Figure 72 :Tableau 25 :

 7225 Figure 72 : Sites conservés entre les pharmacophores du site 3 (à gauche, modèle 5S et à droite, modèle 3S_VolSurf).

Tableau 26 :

 26 Tableau rassemblant les résultats issus des criblages pour les six meilleurs modèles sélectionnés.

  Les descripteurs N1*O et Glob-P présentent des différences au dixième près faisant de ces deux descripteurs de bons candidats. Le descripteur Glob-P présente un pourcentage de prédiction de composés actifs largement supérieur au descripteur N1*O. Pour finir le modèle 5I / 20_accepteur étudié en mode pseudo-champ présente une AUC de 0,86, un pourcentage de prédiction de faux-positifs de 63% également pour le descripteur Glob-Prod et un probe score de 0,555. Nous choisirons ainsi ce modèle pour le site 4. La représentation du modèle pharmacophore choisi par le logiciel de visualisation moléculaire PyMOL est présentée Figure 74.

Figure 74 :

 74 Figure 74 : Représentation sur PyMOL du pharmacophore sélectionné 5I / 20_accepteur (contrainte sélectionnée entourée en rouge). Les points rouges représentent les points pharmacophoriques accepteurs (O), les points bleus représentent le point pharmacophorique donneur (N1) et les points verts représentent les points pharmacophoriques hydrophobes (DRY).

3Figure 75 :

 75 Figure 75 : Représentation sur PyMOL des modèles pharmacophores pour les sites 3 et 4. A) Modèle pharmacophore du site 3. B) Modèle pharmacophore du site 4. C) Superposition des modèles des sites 3 et 4.

Figure 77 :

 77 Figure 77 : Topologie générale de MRP1.

Figure 78 :

 78 Figure78: Modèle par homologie 3D de MRP1 basé sur la structure de Sav1866.298 Les domaines TMD1-NBD1 sont représentés en rouge tandis que les domaines TMD2-NBD2 sont représentés en jaune.

Figure 79 :Figure 80 :I

 7980 Figure79: Modèle de MRP1 basé sur le modèle de la structure de la P-gp murine (en vert) ainsi que l'interaction avec TMD0 (en rouge) d'après le modèlede Rosenberg. 299 

Tableau 30 :

 30 -SG, bimane-SG, N-ethylmaleimide-SG, doxorubicin-SG, thiotepa-SG, cyclophosphamide-SG, melphalan-SG, chlorambucil-SG, acide éthacrynique-SG, metolachlor-SG, atrazine-SG, sulforaphane-SG, aflatoxin B1-epoxide-SG, 4nitroquinoline 1-oxide-SG, As(SG)3 Agents glucoronoconjugués Etoposide-Gluc, 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL)-3b-OGluc, SN-38-gluc, 4Substrats endogènes et exogènes connues de MRP1. nécessite aucune conjugaison. C'est le cas par exemple du méthotrexate (Figure 81A) ; -le transport nécessite une conjugaison au GSH (LTC4), au glucuronide (E217βG) ou au sulfate (Figure 81B) ; -le GSH stimule le transport de certains substrats sans être transporté lui-même. C'est le cas de l'estrone-3-sulfate (Figure 81C) ; 330le GSH est co-transporté avec le substrat : le transport de certains composés est accru en présence de GSH. (Figure81D) ;318, 320, 323, 331 le transport du GSH peut être stimulé par certains composés non transportés tels que le vérapamil ou l'apigénine (Figure81E).332, 333 

Figure 81 :

 81 Figure 81 : Représentation schématique des modes de transport de différents substrats de MRP1, adaptée des travaux de Cole. 334 A) Transport d'anions organiques non conjugués. B) Transport d'anions organiques conjugués au GSH, au glucoronide ou au sulfate. C) Stimulation du transport par le GSH sans que celui-ci ne soit transporté. D) Co-transport de xénobiotiques et de GSH. E) Modulateurs stimulant l'efflux de GSH.

Figure 82 :I

 82 Figure 82 : Modèle du cycle hypothétique du transport du LTC4 par MRP1. MSD0 n'est pas représenté sur ce modèle car il n'intervient pas dans le transport de certains substrats tels que le LTC4. 311

Figure 83 :

 83 Figure 83 : Structure de l'agostérol A.

Figure 84 :

 84 Figure 84 : Structures de quelques flavonoïdes, inhibiteurs connus de MRP1.

Figure 86 :

 86 Figure 86 : Structure du probénécide.

Figure 87 :Figure 88 :

 8788 Figure 87 : Pyrrolopyrimidines et indolopyrimidines comme inhibiteurs de MRP1.

Figure 89 :

 89 Figure 89 : Structures des inhibiteurs MK571 et ONO-1078.

Figure 91 :

 91 Figure 91 : Structures dérivées d'isoxalone et de quinoxalinone comme inhibiteurs sélectifs de MRP1 par rapport à la P-gp.

Figure 92 :Figure 93 :

 9293 Figure 92 : Structure d'un inhibiteur de la GST conjugué au GSH et à l'acide éthacrynique.

  384 

Figure 94 :

 94 Figure 94 : Structure générale des dérivés galloyls comme inhibiteurs de la P-gp et MPR1.

Figure 95 :Figure 96 :

 9596 Figure 95 : Structure du glutathion (GSH).

Figure 97 :Figure 98 :

 9798 Figure 97 : Structure du Vérapamil.

Figure 99 :Figure 100 :Tableau 31 :

 9910031 Figure 99 : Structure du dérivé iodé du vérapamil.

Figure 101 :

 101 Figure 101 : Structures présentant un profil de sensibilité collatérale.

Figure 102 :

 102 Figure 102 : Pharmacomodulations entreprises à partir de la flavone, ainsi que sa numérotation et la nomenclature de ses cycles.

Figure 103 :

 103 Figure 103 : Principe du dosage du GSH intracellulaire total.

Figure 105 :

 105 Figure 105 : Évolution de la survie cellulaire en fonction de la concentration en dimère 4e sur A) les cellules NCI-H69 (contrôles) et H69AR (résistantes) et B) les cellules BHK-21wt (contrôles) et BHK-21-MRP1 (résistantes).

40 Schéma réactionnel 15 :Schéma rétrosynthétique 2

 40152 in vivo chez nos collaborateurs biologistes de l'IBCP de Lyon. Il a ainsi été nécessaire d'en synthétiser plusieurs centaines de milligrammes. Nous avons ainsi suivi les conditions développées par l'équipede Wong et Chow (Schéma réactionnel 15). Synthèse du dimère 4e.La synthèse du dimère 4e s'effectue en cinq étapes. Une première étape consiste en la protection du 4-hydroxybenzaldéhyde par alkylation de la fonction phénol avec du bromure d'allyle en présence de carbonate de potassium et de bromure de tétrabutylammonium à reflux dans l'acétone afin d'obtenir le composé 36 avec un rendement de 67%. Le TBAB joue ici le rôle de catalyseur de transfert de phase. Il est nécessaire de protéger le 4hydroxybenzaldéhyde car, lors de la condensation avec l'acétophénone, la base forte utilisée déprotone également la fonction phénol du 4-hydroxybenzaldéhyde. Cette déprotection tend à enrichir le cycle aromatique en électron et à diminuer la réactivité de l'aldéhyde contrecarrant ainsi la formation de la chalcone. D'après la littérature, le groupement allyle, pouvant être retiré dans des conditions douces, a été choisi. En effet, un groupement se déprotégeant en milieu basique fort aurait été contradictoire avec la synthèse de la chalcone. De même, un groupement éliminé en milieu acide pourrait conduire à une déméthylation des groupements méthoxy. Une autre alternative aurait pu être l'utilisation des éthers de silyle.Le composé 36 ainsi obtenu est ensuite condensé avec la 2-hydroxy-5-méthylacétophénone par action de l'hydrure de sodium à température ambiante dans le THF afin de former la chalcone 37 avec un rendement de 52%. Une étape de cyclisation oxydante par action du diiode à reflux dans le DMSO permet de transformer la chalcone 37 en chromone 38 avec un rendement de 34%. Le groupement allyl est ensuite retiré en présence de palladium de tetrakis en milieu basique afin de conduire au monomère 39 de manière quantitative. Pour finir, une substitution nucléophile intermoléculaire avec le dérivé ditosylé 40 en milieu basique permet d'obtenir le dimère 4e avec un rendement de 14%. Le dérivé 40 a quant à lui été obtenu par activation du pentaéthylène glycol avec du chlorure de tosyle en milieu basique avec un rendement de 98% (Schéma réactionnel 16). pour la synthèse des homodimères cibles. La voie A débute par la formation d'un homodimère à partir du 4-hydroxybenzaldéhyde suivie d'une étape d'aldolisation-crotonisation et d'une étape de cyclisation. Au contraire, pour la voie B, le dérivé de l'apigénine est synthétisé dans un premier temps suivi par la formation de l'homodimère. o Synthèse par la voie A Dans un premier temps, nous avons suivi la voie A constituée de trois étapes à partir du 4hydroxybenzaldéhyde (Schéma réactionnel 17).

Figure 107 :

 107 Figure107: Évolution de la survie cellulaire en fonction des concentrations de 44a (A) et de 44b(B).

Figure 108 :Figure 109 :

 108109 Figure 108 : Structures de la galangine et du kaempferol.

Figure 110 :

 110 Figure 110 : Dérivés O-alkylés en position 3 de la flavone.

Figure 111 :

 111 Figure 111 : Analogues C-alkylés en position 3 de la flavone.

23 .Schéma réactionnel 23 :

 2323 Une fois les dérivés de l'acétophénone synthétisés, nous avons entrepris la synthèse des intermédiaires chalcones correspondants. Différentes conditions ont été utilisées telles que l'utilisation d'hydrure de sodium dans le THF à 25°C ou l'hydroxyde de potassium dans l'éthanol à 90°C. Malheureusement, aucune des conditions classiques n'a permis d'obtenir les intermédiaires chalcones souhaités. En effet, uniquement les produits de départ et de décomposition ont pu être observés (Schéma réactionnel 21). Schéma réactionnel 21 : Essais de synthèse des intermédiaires chalcones. Nous nous sommes ainsi intéressés à une seconde voie de synthèse à partir de la flavanone, Calkylée dans un premier temps puis oxydée afin de conduire aux dérivés souhaités (Schéma rétrosynthétique 4). Schéma rétrosynthétique 4 via la flavanone. Après plusieurs essais dans différentes conditions, telles que l'utilisation d'hydrure de sodium dans le DMF à 25°C ou de N,N-diisopropylamidure de lithium (LDA) dans le THF à -78°C, nous ne sommes pas parvenus à obtenir les dérivés alkylés souhaités. En effet, dans chaque cas, on a pu observer une ouverture de cycle conduisant à un dérivé chalcone (Schéma réactionnel 22). Schéma réactionnel 22 : Essais d'alkylation de la flavanone.Suite à cet échec, une nouvelle voie de synthèse a été tentée. En effet, plusieurs articles décrivent la synthèse de flavones C-alkylées en position 3 à partir d'ester de benzoate par le biais d'un intermédiaire de type dicétone (Schéma rétrosynthétique 5).419, 420 Schéma rétrosynthétique 5 via un intermédiaire de type dicétone.La synthèse correspondant à cette nouvelle voie d'accès est représentée dans le Schéma réactionnel Synthèse des dérivés 54a à 54d.Les esters de benzoate 53a à 53d ont été obtenus par estérification des dérivés 52a à 52c et de la 2-hydroxypropiophénone commerciale avec le chlorure de benzoyle, en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane avec des rendements compris entre 40% et 94%. Puis un réarrangement de Baker-Venkataraman 419, 420 (réaction de condensation de type Claisen) en présence d'hydrure de sodium dans le DMSO a conduit à la formation d'une dicétone intermédiaire, cyclisée ensuite par action d'acide acétique et d'acide sulfurique. Ceci permet l'obtention des flavones C-alkylées 54a à 54d souhaitées avec des rendements compris entre 6% et 17%.

Figure 114 :

 114 Figure 114 : Structures du tamoxifène, de l'hydroxytamoxifène et de l'hydroxyferrocifène.

Figure 115 :

 115 Figure 115 : Structures des dérivés ferrocéniques de flavonoïdes étudiés dans le cadre de cette thèse.

  ) : la chalcone ne présentant aucune substitution sur le cycle A (composé 55a), les dérivés mono-méthoxylés en ortho (composé 55b) et en para de la fonction carbonyle (composé 55c) et le dérivé diméthoxylé en ortho et para (composé 55d).

Figure 116 :

 116 Figure 116 : Structures des dérivés chalcones ferrocéniques.

o

  a été synthétisée l'aurone ferrocénique ne possédant aucune substitution sur le cycle A (composé 56a). Une première approche considérée fut une condensation aldolique entre la benzofuran-3(2H)-one commerciale et le ferrocène carboxaldéhyde en présence d'hydroxyde de potassium dans le méthanol à reflux. Malheureusement ces conditions ne nous ont pas permis d'obtenir le composé souhaité. Un second essai dans des conditions plus neutres, à l'aide d'oxyde d'aluminium dans le dichlorométhane à 25°C 440 a permis la synthèse de l'aurone 56a avec un rendement de 75%. Pour la synthèse des composés 56b et 56c, les dérivés benzofuran-3(2H)-one correspondant n'étant pas disponibles, nous sommes partis des dérivés chalcones ferrocéniques 55b et 55c correspondants et nous nous sommes inspirés des travaux réalisés par l'équipe d'Hillard et Jaouen. 441 Les aurones ferrocéniques 56b et 56c ont ainsi pu être obtenues par traitement des chalcones correspondantes 55b et 55c avec de l'acétate de mercure (II) dans la pyridine à 80°C avec des rendements de 95% et 32%. La 4,6-diméthoxybenzofuran-3(2H)-one étant disponible au sein du laboratoire, une condensation en milieu basique dans les conditions classiques avec le ferrocène carboxaldéhyde a été réalisée et a permis d'obtenir le composé 56d avec un rendement de 76%. Synthèse des analogues aurones hydroxylées Dans un second temps ont été synthétisés les analogues hydroxylés des aurones ferrocéniques. Plusieurs alternatives ont été testés afin d'obtenir ces composés. Le composé 57a présentant un groupement hydroxyle en position 4 a été obtenu par déméthoxylation de l'aurone méthoxylée 56b correspondante par action du chlorure d'aluminium dans le dichlorométhane à reflux mais avec un faible rendement (Schéma réactionnel 26). Schéma réactionnel 26 : Synthèse du dérivé 57a par déméthoxylation de l'aurone 56b. Le rendement obtenu n'étant que de 8%, nous avons employé d'autres méthodes afin d'obtenir les aurones ferrocéniques hydroxylées souhaitées. Les benzofuranones hydroxylées correspondantes étant disponibles commercialement, une condensation en milieu basique, en présence d'hydroxyde de potassium dans le méthanol à reflux a été réalisée avec le ferrocène carboxaldéhyde afin d'obtenir les dérivés 57b (hydroxylé en position 6) et 57c (hydroxylé en position 4 et 6) (Schéma réactionnel 27). Bien que les rendements obtenus (respectivement 4 et 3%) sont inférieurs à celui obtenu précédemment, ces réactions nous ont tout de même permis d'obtenir une quantité suffisante de composés pour les tests biologiques. Schéma réactionnel 27 : Synthèse des composés 57b et 57c par condensation basique.

Figure 117 :Schéma réactionnel 30 :

 11730 Figure 117 : Dérivés flavones ferrocéniques étudiés.

  Au contraire les composés 56b, 56d et 57a, intéressants en efflux de GSH, n'induisent aucune sensibilité collatérale, présentant des rations autour de 1 et 1,2. Les composés 56a et 58a quant à eux induisent préférentiellement une mort cellulaire des cellules contrôles et non des cellules résistantes. Dans ce cas de figure, on suppose que ses composés sont transportés par MRP1, protégeant ainsi la cellule de leurs effets. Les études de sensibilité collatérale des composés 55a et 55c sont actuellement en cours.Les dérivés de flavones méthoxylés sont ainsi les seuls capables d'induire une sensibilité collatérale. Le groupement méthoxy sera donc retenu comme un élément structural important.II.6.4. PerspectivesParmi les composés synthétisés, les flavones ferrocéniques méthoxylées semblent être les meilleurs candidats, capables d'effluer massivement le glutathion cellulaire mais également d'induire une sensibilité collatérale. L'étude biologique de ces composés sera donc poursuivie.L'étude de différents flavonoïdes a d'ores et déjà montré que la présence d'un groupement méthoxy en position 3 de la flavone est très favorable à la sensibilité collatérale. Il sera ainsi intéressant de synthétiser à l'avenir les analogues flavones ferrocéniques présentant un groupement méthoxy en position 3 (Figure120).

Figure 120 :

 120 Figure 120 : Futurs analogues à synthétiser.

  GSH hors des cellules cancéreuses surexprimant la protéine étudiée. Bien que les modulations portant sur les dimères de flavonoïdes et la position 3 de la flavone n'aient pas conduit à de résultats concluants, l'introduction d'un motif ferrocène à la place du cycle B de la flavone semble être prometteuse et il sera ainsi intéressant de poursuivre l'étude de cette pharmacomodulation. De plus, nous avons pu remarquer que certains composés, capables d'induire un efflux massif de GSH, ne conduisaient pas à une sensibilité collatérale. En effet, il semblerait que l'efflux de GSH soit une condition nécessaire mais non suffisante pour l'induction de mort cellulaire sélective. Ainsi, nous pouvons supposer l'existence de différentes cibles, la première étant MRP1 et conduisant à un efflux massif de GSH, tandis que d'autres cibles, impliquant d'éventuelles routes variées, conduiraient à la mort sélective par apoptose uniquement si les cellules sont dépourvues de GSH. L'implication d'autres voies cellulaires dans l'induction sélective d'apoptose reste ainsi encore à étudier. Ma participation à ce projet fait l'objet d'un article dans le journal Biochemical Pharmacology. 403

  publication en 2013 dans le journal Angewandte Chemie International Edition 443 de la découverte du tramadol dans les racines d'un arbuste africain, Nauclea latifolia, il était important pour le laboratoire d'étudier ensuite l'origine naturelle de cette molécule au sein de la plante. Ainsi, en parallèle à mon sujet principal de thèse s'articulant autour des transporteurs ABC et du traitement de la chimiorésistance, j'ai eu l'opportunité de poursuivre les travaux entrepris par le Dr. Romain Haudecoeur au sein du laboratoire et portant sur la synthèse biomimétique du tramadol. Ce travail m'a permis de m'intéresser à un nouveau projet, de travailler sur d'autres structures moléculaires et d'aborder un tout autre aspect, la synthèse biomimétique. Ce projet fut réalisé en collaboration avec le Dr. Richard Robins de l'Université de Nantes, le Dr. Thierry Lomberget de l'Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de l'Université de Lyon 1 et le Pr. Jean-Luc Wolfender de la Section des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Genève. ou (1RS, 2RS)-2-[(diméthylamino)méthyl]-1-(3-méthoxyphényl)cyclohexanol est un analgésique opioïde synthétique, développé originellement par la compagnie Grünenthal GmbH dans les années 1970, commercialisé en Allemagne en 1977 puis approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) en 1995 pour le traitement de la douleur, modérée à sévère. Ce composé est commercialisé sous sa forme pure notamment sous les marques Contramal®, Topalgic® ou encore Ixprim® dans lequel il est associé au paracétamol.

Figure 121 :

 121 Figure 121 : Structures de la morphine, de la codéine ainsi que des deux énantiomères de la base libre du (1RS, 2RS)-tramadol.

Figure 122 :

 122 Figure 122 : Photographie de l'arbuste Nauclea Latifolia à gauche, et de sa fleur à droite.

Figure 123 :Figure 124 :Figure 125 :Figure 126 :

 123124125126 Figure123: Structures de l'angustine, de l'angustoline, de la naucléfine et de la nauclétine, isolés à partir de l'écorce de la racine du Nauclea latifolia.

  et le fluorouracile, un agent anticancéreux, obtenu à partir de l'éponge marine Phakellia fusca. 485 Cependant, il s'agit du premier cas de découverte d'une occurrence naturelle d'un produit d'origine purement synthétique à de si fortes concentrations. I.4.1. Isolement du tramadol au sein de l'extrait de l'écorce de Nauclea latifolia Afin d'identifier ses substances actives, l'extrait méthanolique d'écorce de Nauclea latifolia a été soumis à un fractionnement HPLC, par l'intermédiaire d'une colonne en phase inverse. 443 Les fractions issues de cette séparation ont été testées pour leur activité antinociceptive. Les résultats révélent une bioactivité au sein des fractions 25 à 29, avec un maximum atteint au sein de la fraction 27. L'analyse de cette fraction par spectrométrie de masse-électrospraytemps de vol (MS-ESI-TOF) a conduit à une masse de 264.1972. A partir de ces données a été déduite la composition élémentaire de ce composé comme étant C16H26NO2, correspondant à cinq insaturations. L'analyse RMN 1H présente quatre protons aromatiques avec un benzène cyclique 1,3-disubstitué. La présence d'un groupement méthoxylé relié au cycle benzénique est déduite par la présence d'un signal à 3,77 ppm et une intégration de trois protons. La présence d'un groupe complexe de signaux entre 1,35 et 2,65 ppm suggére la présence d'une chaine héxyle cyclique. Les analyses RMN 13 C et DEPT révélent la présence de trois carbones quaternaires. À partir des spectres RMN 1D et 2D, le carbone quaternaire de déplacement chimique 75,68 ppm est attribué à un carbone relié à un atome d'oxygène. Suite à ces déductions, la structure est assignée au composé 2-(diméthylaminométhyl)-1-(3méthoxyphényl)cyclohexanol (Figure 127). 443

Figure 127 :

 127 Figure127: Spectres RMN 1 H de l'extrait purifié provenant de l'écorce de Nauclea latifolia (A) et de la base libre du tramadol commercial(B).

Figure 128 :Figure 129

 128129 Figure 128 : Structure cristallographique obtenue par diffraction des rayons X de la forme chlorhydrate de ce composé. L'atome de chlore est en violet, l'atome d'azote en bleu et les atomes d'oxygène en rouge.

l'aldéhyde du 5 -diméthylaminopentanal 60 .Schéma réactionnel 31 :

 56031 La seconde étape clé est la réaction de cyclisation finale s'effectuant par une réaction d'aldolisation entre une énamine issue de l'iminium 64 formé avec le carbone α du groupement phényle permettant ainsi d'obtenir le tramadol, étape au cours de laquelle la racémisation a lieu (Schéma réactionnel 31).488 Biosynthèse proposée du tramadol.Une étude bibliographique approfondie a permis l'hypothèse de cette voie biosynthétique du tramadol à partir des intermédiaires 59 et 60.Les acétophénones, telles que l'intermédiaire 59 et son précurseur la 3-hydroxyacétophénone sont fréquemment rencontrées chez les bactéries et les plantes tels que les racines de Urtica dioica 489 ou les huiles essentielles de Sideritis italica (Miller) Greuter et Burdet 490 ou biosynthétisées par certaines plantes afin de se protéger de certains champignons.491 De plus, un alcaloïde possédant un groupement 3-méthoxyphényle, dérivant probablement de la 3méthoxyacétophénone, a été identifié au sein de Lobelia siphilitica.492 Deux voies biosynthétiques peuvent être à l'origine du squelette de l'acétophénone. D'une part, les acétophénones peuvent provenir du métabolisme de la L-phénylalanine, acide aminé dérivant de l'acide shikimique. Grâce à la phénylalanine ammonia lyase (PAL), l'acide cinnamique est formé puis une succession de β-oxydations conduit au motif acétophénone (Figure130). Ceci est décrit chez le champignon Bjerkandera adusta 493 et chez la plante Camellia sinensis.494 

Figure 130 :

 130 Figure 130 : Hypothèse de biosynthèse d'acétophénone à partir de la L-phénylalanine dans le champignon Bjerkandera adusta 493 (PAL = Phénylalanine ammonia lyase).

Figure 131 :

 131 Figure 131 : Hypothèse de biosynthèse de l'intermédiaire 59.

Figure 132 :

 132 Figure 132 : Voie de biosynthèse de la (-)-lupinine, un alcaloïde quinolizidinique connu et voie de biosynthèse proposé pour l'intermédiaire 60.

64 ,

 64 subissant une addition intramoléculaire sur le carbonyle afin de former l'iminium 70, qui à la suite de la réduction, conduit au tramadol. Ce mécanisme s'inspire de la réaction de Hajos-Parrish-Eder-Sauer-Wiechert (6-enolexo), réaction d'aldolisation catalysée par la L-proline. 502 En effet, sur des dérivés dicarbonylés, la proline conduit à la formation sélective d'une énamine sur l'un des carbonyles. Il s'ensuit une attaque nucléophile intramoléculaire sur le second groupement carbonyle puis l'élimination de l'organocatalyseur par hydrolyse afin de conduire à l'aldol ou au cétol correspondant. Dans le cas du tramadol, la diméthylamine joue le rôle d'organocatalyseur, mais en quantité stoechiométrique afin de pouvoir réduire l'iminium formé in situ par des conditions classiques. L'aldolisation organocatalysée et l'amination réductrice de l'aldéhyde peuvent se faire ainsi en même temps. Des réactions analogues décrivant la réalisation d'une aldolisation à partir d'une énamine générée in situ, directement suivie d'une réduction de l'iminium formé en présence de trichlorosilane et d'une base de Lewis ont été récemment décrites. 503

(262, 2 [

 2 M+H] + ) et le tramadol (264,2 [M+H] + ). Puis, deux échantillons, A et B, issus de différents bruts réactionnels ont été analysés par HPLC sur phase chirale AD-H au sein d'un mélange isopropanol/heptane. Le profil HPLC de l'échantillon A présente deux pics de faible intensité à 6,365 et 8,867 minutes pouvant correspondre au (1RS, 2RS)-tramadol sous forme racémique. Ceci fut confirmé par comparaison avec l'analyse HPLC de la base libre du mélange racémique du (1RS, 2RS)-tramadol. Ce profil présente également deux pics de plus forte intensité à 6,693 et 6,873 minutes pouvant correspondre au mélange racémique du (1RS, 2SR)-tramadol. Le profil de l'échantillon B ne présente quant à lui que deux pics à 6,695 et 6,874 minutes, pouvant correspondre ainsi au mélange racémique du (1RS, 2SR)-tramadol. Le pic restant à 7,80 minutes semble vraisemblablement correspondre au produit de départ avant cyclisation (Figure 133).

Figure 133 : 73 (Figure 134 :

 13373134 Figure 133 : Profils HPLC des échantillons A et B, bruts issus de la réaction entre le composé 69 et la diméthylamine suivie de la réduction par le cyanoborohydrure de sodium ou le borohydrure de sodium dans le méthanol. A) Profil HPLC de la base libre du mélange commercial du (1RS, 2RS)-tramadol racémique. B) Profil HPLC de l'échantillon A. C) Profil HPLC de l'échantillon B.

1 HFigure 135 Figure 136 :Figure 137

 1135136137 Figure 135 : A) Structure annotée du tramadol. B) Analyses RMN 1 H obtenues dans le méthanol deutéré pour les 13 fractions isolées par HPLC préparative issues d'un brut réactionnel. La lettre A verte correspond au signal du composé A et la lettre B bleue correspond au signal du composé B.

  C ou 18 O (travaux publiés par nos collaborateurs au sein du journal PNAS), 498 nous sommes parvenus à proposer une synthèse biomimétique du tramadol. Bien que le rendement de conversion de 70 en tramadol soit faible (10%), nous avons pu démontrer qu'un intermédiaire clé de la synthèse hypothétique du tramadol pouvait être obtenu et converti par le biais de transformations en cascade en tramadol, et ceci sans processus enzymatiques généralement utilisés par les plantes. En effet, l'étape clé de cyclisation de cet intermédiaire en tramadol a été optimisée et le tramadol a pu être identifié, isolé et caractérisé par HPLC et RMN. La formation du cycle de manière non enzymatique permet d'expliquer l'occurrence du racémique naturel, résultat de l'attaque sur les deux faces re-et si-de l'électron sur le carbone C1. La formation minoritaire du (1R, 2S)-tramadol ainsi que le fait que ce composé ne soit pas synthétisé au sein de Nauclea Latifolia apporte un argument supplémentaire à l'origine naturelle du tramadol. L'ensemble de ces travaux a été publié dans le journal Chemical Communications. 505 Malgré ces résultats, l'équipe du Dr. Spiteller de l'Institut de la Recherche Environnementale de Dortmund associée à des équipes camerounaises remettent en question l'origine naturelle du tramadol et soutiennent l'hypothèse selon laquelle le tramadol dans Nauclea latifolia aurait pour origine une contamination anthropogénique des sols par les excréments des fermiers et de leur bétail. 506 En effet, d'après leurs études, d'autres extraits de la plante issus du nord du Cameroun contiennent dix milles fois moins de tramadol que nos extraits et des extraits provenant du sud de Cameroun n'en contiennent aucune trace détectable. D'après une étude locale, le tramadol serait facilement accessible aux fermiers sur de nombreux marchés locaux et serait ainsi fourni au bétail afin de leur permettre de travailler de longues journées sous la chaleur. De plus, différentes analyses des extraits du sol et des eaux proches des arbres confirment la présence de métabolites mammifères du tramadol indiquant ainsi une contamination externe du Nauclea latifolia par le tramadol. Malgré ces résultats, différentes zones d'ombre subsistent tels que les faibles connaissances quant au métabolisme du tramadol au sein du bétail. De plus, les extraits utilisés pour notre étude proviennent d'un parc national où tout élevage de bétail est interdit. Ainsi, des études complémentaires seront nécessaires afin de préciser et de confirmer l'origine du tramadol au sein de Nauclea latifolia. Des études de nutrition de la plante à l'aide de composés radiomarqués ou marqués par un isotope sont prévues et permettront ainsi de lever le voile sur ce mystère.CONCLUSION GÉNÉRALELes protéines membranaires ABCG2 et MRP1, appartenant à la famille des transporteurs ABC, sont impliquées dans le phénotype de résistance à de multiples drogues anticancéreuses (MDR). Ces protéines sont capables de transporter hors de la cellule un large panel de substrats endogènes et exogènes grâce à l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP. Cette caractéristique leur confère un grand nombre de rôles physiologiques. Cependant cette activité de transport est mise à profit par les cellules cancéreuses, capables de surexprimer ces protéines afin d'effluer hors des cellules les agents anticancéreux et ainsi se protéger de leurs effets. Afin de palier à ce phénomène de chimiorésistance, deux stratégies ont été envisagées pour chacune des protéines : -l'inhibition de l'activité de transport de la protéine ABCG2 afin de stopper l'efflux massif de l'agent anticancéreux et ainsi potentialiser son effet ; -la mise au point d'inducteurs sélectifs d'apoptose, capables de cibler sélectivement les cellules chimiorésistantes surexprimant MRP1. La première partie de ce travail de thèse a consisté en la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques de la protéine ABCG2. Nous avons choisi le composé MBL-II-141, inhibiteur de référence d'ABCG2, comme composé chef de file à partir duquel différentes pharmacomodulations ont été effectuées. Plusieurs parties de la molécule ont ainsi été modulées et 38 composés ont été synthétisés et testés pour leur activité d'inhibition du transport de la mitoxantrone via ABCG2, leur sélectivité vis-à-vis de la P-gp et de MRP1, leur cytotoxicité et leurs activités ATPasiques basale et couplée. À l'issue de ces tests biologiques, les composés synthétisés se sont révélés être des inhibiteurs plus ou moins efficaces. Cependant, aucun n'est parvenu à atteindre les résultats obtenus pour le MBL-II-141 à l'exception du composé 11a, dont l'atome de brome a été déplacé en ortho du groupement benzyloxy porté par la chromone. Cependant, malgré un grand nombre de pharmacomodulations réalisées, il devient difficile d'obtenir des composés plus efficaces en termes d'inhibition de l'activité de transport que le MBL-II-141. Notre attention se portera ainsi sur la synthèse de nouvelles structures plus complexes, jouant sur la polyspécificité de la protéine ABCG2 et pouvant atteindre simultanément plusieurs sites d'interaction. Les études in vitro et in vivo du MBL-II-141 seront également poursuivies. L'ensemble de ce travail a fait l'objet d'une revue dans le journal Future Medicinal Chemistry 269 et d'un article paru dans le Journal of Medicinal Chemistry. 254 Les tests in vivo du MBL-II-141, réalisés par nos collaborateurs biologistes ont également été publiés dans le journal Oncotarget 240 . Les derniers résultats de pharmacomodulations du MBL-II-141 sont en cours de rédaction en vue d'une publication dans un journal de chimie médicinale. Après la mise en évidence de l'existence d'au moins deux sites d'interaction de nos inhibiteurs avec ABCG2, l'un conduisant à une stimulation de l'activité ATPasique basale, l'autre à une inhibition de cette même activité, nous avons tenté de déterminer les différences structurales et la nature des interactions caractérisant chacun de ces deux sites. Nous avons ainsi entrepris la construction, grâce au logiciel de modélisation moléculaire FLAP, de deux pharmacophores pour chacun des deux sites d'interaction. Ces deux modèles ont ensuite été utilisés afin de mener un criblage virtuel d'une chimiothèque de composés disponibles commercialement. Les études biologiques de quelques composés issus de ce criblage virtuel sont actuellement en cours et nous permettront de valider ou non la structure de nos pharmacophores. Selon les résultats biologiques obtenus, cette approche jamais décrite pourra faire l'objet d'une publication de haut niveau. Une seconde partie de ce travail a consisté en la mise au point de nouveaux modulateurs de MRP1, capables d'induire la mort par apoptose sélectivement des cellules chimiorésistantes qui surexpriment la protéine. Appelée sensibilité collatérale, ce phénomène correspond à une hypersensibilité que développent les cellules cancéreuses face à certains agents anticancéreux. Dans le cas de MRP1, il s'agit d'un transport massif de glutathion hors des cellules. Ce dernier permettant aux cellules de lutter contre les phénomènes de stress oxydant, son efflux massif conduit à la mort par apoptose des cellules cancéreuses qui surexpriment MRP1. Le vérapamil, inhibiteur de référence de la P-gp, est un inducteur de sensibilité collatérale sur des lignées cellulaires surexprimant MRP1. Malheureusement sa cytotoxicité aux concentrations utilisées empêche la poursuite de son étude. Certains flavonoïdes, tels que l'apigénine ou la chrysine, se sont également révélés être de bons inducteurs de sensibilité collatérale. Dans le cadre de cette thèse, nous avons poursuivi cette étude par la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux dérivés de flavone comme modulateurs de la protéine MRP1. Trois grandes pharmacomodulations ont été entreprises à partir de la flavone : -la synthèse d'homodimères de flavonoïdes ; -l'étude de la C-alkylation et de l'O-alkylation en position 3 de la flavone ; -l'introduction d'un groupement ferrocène à la place du cycle B de la flavone. Alors que les deux premières pharmacomodulations citées n'ont pas permis l'obtention de nouveaux modulateurs efficaces, l'introduction d'un motif ferrocène a conduit à des résultats intéressants. Lors de cette étude, des analogues chalcones, aurones et flavones ferrocéniques ont été synthétisés. Bien que certains de ces composés étaient capables d'induire un efflux massif de glutathion, uniquement les flavones ferrocéniques, en particulier méthoxylées sur les positions 5 et/ou 7, se sont avérées également être des inducteurs de la mort sélective par apoptose des cellules chimiorésistantes surexprimant MRP1. Il sera ainsi intéressant de poursuivre l'étude de dérivés ferrocéniques.

o

  De plus, il semblerait que l'efflux de glutathion soit une condition nécessaire mais non suffisante pour l'induction de mort cellulaire sélective. Ainsi, nous pouvons ainsi supposer l'existence de différentes voies cellulaires, une impliquant MRP1 et l'efflux massif de glutathion, tandis que d'autres voies conduiraient à la mort sélective par apoptose uniquement si les cellules sont dépourvues de glutathion. Le mécanisme d'action de la sensibilité collatérale chez MRP1 est encore à étudier. Une partie des travaux réalisés sur ce projet a fait l'objet d'un article dans le journal Biochemical Pharmacology. 403 Alors que le premier volet de cette thèse porte sur la synthèse et l'étude pharmacologique de nouvelles molécules appartenant à la famille des flavonoïdes, substances d'origine naturelle, le second volet porte au contraire sur un composé synthétique bioactif, découvert en forte concentration dans une espèce végétale. En effet, notre laboratoire a démontré récemment l'occurrence naturelle du tramadol, médicament synthétique utilisé contre la douleur et commercialisé depuis la fin des années 1970, au sein d'un arbuste africain, le Nauclea latifolia. En se basant sur une voie biosynthétique plausible et validée partiellement par des analyses isotopiques fines, nous nous sommes intéressés à la synthèse biomimétique du tramadol et en particulier à une réaction de cyclisation issue de la réaction d'un énamine sur un carbonyle, étape clé de la synthèse biomimétique. Bien qu'obtenu avec un rendement relativement faible (10%), le tramadol a tout de même pu être isolé et caractérisé par RMN et HPLC, soutenant ainsi notre hypothèse d'une origine naturelle du tramadol. Ces travaux ainsi que ceux de nos collaborateurs ont fait l'objet d'un premier article dans le journal PNAS 498 puis d'un second article dans le journal Chemical Communications. 505 Cependant, les études menées par l'équipe du Dr. Spiteler de Dortmund viennent remettre en question notre hypothèse, soutenant une origine anthropogénique du tramadol au sein de l'arbuste africain. 506 Il sera ainsi nécessaire de compléter ces études afin de préciser et de confirmer l'origine du tramadol au sein de Nauclea latifolia. Sources for the consumables Solvents and reagents were purchased from Sigma Aldrich (Italy), Acros Organics (France), Alfa Aesar (Germany) and TCI (Japan). They were used without purification. Anhydrous reactions were performed using oven dried glassware with anhydrous solvents under an atmosphere of dry nitrogen. o Chromatography Reactions were monitored by thin layer chromatography (TLC) using commercial aluminium backed silica gel plates (Merck, Silica gel 60, F 254; Macherey-Nagel, Alugram ® Xtra SIL G/UV 254). TLC spots were viewed under ultraviolet light at 254 and 366 nm. Purifications were performed by gravity column flash chromatography using silica gel [Macherey-Nagel 60M, 0,04-0,063 mm (200-400 mesh)] or by using Reveleris® X2 flash chromatography system with Reveleris® Flash cartridges or GraceResolv® Flash cartridges. o Melting point Melting points (m.p.), expressed in degrees Celsius (°C), were obtained on a Büchi melting point B540. o Mass spectra and elemental analysis Electrospray ionization ESI mass spectra were acquired by the analytical service of Département de Chimie Moléculaire, Grenoble Alpes University, on an Esquire 300 Plus Brüker Daltonis instrument with a nanospray inlet. Elemental Analysis were performed by the analytical service of Département de Chimie Moléculaire, Grenoble Alpes University.

Figure 138 : 1 H

 1381 Figure 138 : 1 H NMR spectrum of 3 in DMSO-d6.

Figure 139 :

 139 Figure 139 : 13 C NMR spectrum of 3 in DMSO-d6.

Figure 140 :

 140 Figure 140 : 2D HSQC spectrum of 3 in DMSO-d6.

Figure 141 :

 141 Figure 141 : 2D HMBC spectrum of 3 in DMSO-d6.

Figure 142 : 1 H

 1421 Figure 142 : 1 H NMR spectrum of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

Figure 143 :

 143 Figure143:13 C NMR spectrum of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

Figure 144 :

 144 Figure 144 : 2D COSY spectrum of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

Figure 145 :

 145 Figure 145 : 2D HSQC spectrum of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

Figure 146 :

 146 Figure 146 : 2D HMBC spectrum of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

3 (

 3 The crude was prepared according to general procedure A starting from commercially available 2,6-dihydroxyacetophenone (2 g, 13 mmol) and 4-bromobenzyloxybromide (4 g, 16 mmol) and was triturated in diethyl ether to afford 1 as a white solid (2.8 g, 68%). C15H13BrO3. m.p. 116-117°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.50 (s, 3H, COCH3), 5.15 (s, 2H, OCH2), 6.54 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H3), 6.63 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H5), 7.31 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H4), 7.44 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H2'), 7.61 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H3'), 11.71 (s, 1H OH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 33.0 (COCH3), 69.OCH2), 103.4 (C5), 109.7 (C3), 114.7 (C1), 121.2 (C4'), 129.9 (C2'), 131.4 (C3'), 133.8 (C4), 135.9 (C1'), 158.0 (C6), 159.6 (C2), 203.4 (CO). MS (ESI) m/z 320 ( 79 Br), 322 ( 81 Br) [M] + . The crude was prepared according to general procedure B from 1 (2 g, 6.2 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 2 as a yellow solid (1.7 g, 69%). C19H15BrO5. m.p. 151-153°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.38 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.78 (dd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 7.9 Hz, H6), 7.11 (s, 1H, H3),7.24 (dd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 8.5 Hz, H8), 7.60 (m, 4H, H2', H3'), 7.75 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7).

13 C 0 ( 0 Hz,

 1300 NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3),62.6 (OCH2CH3),69.2 (OCH2), 109.0 and 110.5 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.4 (C3), 120.6 (C4'), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'),135.3 (C7), 136.2 (C1'), 150.2 (C2), 157.2 and 157.7 (C5 and C9), 160.0 (CO), 176.4 (C4). MS (ESI) The crude was isolated after the condensation of 2 and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate(7:3) as eluent to afford 2' as a yellow solid. C19H17BrO6. m.p. 115-117°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 2.77 (d, 1H, J = 15.9 Hz, H3), 3.22 (dd, 1H, J = 1.8 Hz, J = 15.9 Hz, H3), 4.20 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.17 (s, 2H, OCH2),6.64 (d, 1H, J = 7.6 Hz, H6 ou H8), 6.78 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 ou H8), 7.47-7.61 (m, 5H, H7, H2', H3'), 8.15 (s, 1H, OH).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 46.3 (C3), 61.8 (OCH2CH3), 68.9 (OCH2), 98.C2), 106.4 and 110.3 (C6 and C8), 110.6 (C10), 120.6 (C4'), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 136.2 and 136.5 (C7 and C1'), 158.2 and 158.8 (C5 and C9), 167.5 (CO), 187.5 (C4). MS (ESI) m/z 419 ( 79 Br), 421 ( 81 Br) [M-H] -; 443 ( 79 Br), 445 ( 81 Br) [M+Na] + . The crude was prepared according to general procedure C from 2 (1.7 g, 4.3 mmol) to afford 3 as a white solid (1.5 g, 90%). C17H11BrO5. m.p. >200°C (decomposition). 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.79 (s, 2H, OCH2), 6.29 (s, 1H, H3), 6.64 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H6 or H8), 6.76 (d, 1H, J = 8.H6 or H8), 7.15(m, 4H, H2', H3'), 7.28 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.2 (OCH2), 108.9 and 110.6 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.2 (C3), 120.6 (C4'), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 135.1 (C7), 136.3 (C1'), 151.2 (C2), 157.4 and 157.7 (C5 and C9), 161.5 (CO), 176.7 (C4). MS (ESI) m/z 374 (79 Br), 476 (81 Br) [M] + . The crude was prepared according to general procedure D1 from 3 (860 mg, 2.3 mmol) and 5-methoxytryptamine hydrochloride (430 g, 2.3 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using dichloromethane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford MBL-II-141 as a beige powder (566 mg, 45%). C28H23BrN2O5. mp 159-160 °C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.95 (t, 2H, J = 7.8 Hz, NHCH2CH2), 3.56 (q, 2H, J = 7.5 Hz, NHCH2CH2), 3.74 (s, 3H, OCH3), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.67 (s, 1H, H3),6.71 (dd, 2H, J = 2.4 Hz, J = 8 Hz, He), 7.07-7.26 (5H, m, H6, H8, Ha, Hc, Hf), 7.60 (m, 4H, H2', H3'), 7.76 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.18 (t, 1H, J = 5.8 Hz, CONH), 10.68 (s, 1H, indole NH).

13 C 2 (

 132 NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 24.9 (NHCH2CH2), under peak of DMSO (NHCH2CH2), 55.3 (OCH3), 69.2 (OCH2), 100.2 (Cc), 109.0 and 110.6 (C6 and C8), 111.1 and 111.2 (Cb and Cf), 112.1 (Ce and C3), 114.5 (C10), 120.6 (C4'), 123.4 (Ca), 127.5 (Ch), 128.9 (C2'), 131.C3'), 131.4 (Cg), 135.0 (C7), 136.3 (C1'), 153.0 and 153.6 (C2 and Cd), 157.0 and 157.7 (C5 and C9), 158.9 (CO), 176.6 (C4). MS (ESI) m/z 546 ( 79 Br), 548 ( 81 Br) [M] + . Anal. Calcd for C28H23BrN2O5: C

4 ( 2 ( 0 ( 6 ( 5 ( 4 ( 8 (

 4206548 13 mmol) and 4-bromobenzyloxybromide(4 g, 16 mmol), and was recrystallized in ethanol to afford 4a as a beige solid.(1.7 g, 40%). C15H13BrO3. m.p. 87-89°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.63 (s, 3H, COCH3), 5.08 (s, 2H, OCH2),6.90 (d, 1H, J = 9.0 Hz, H3), 7.24 (dd, 1H, J = 3.1 Hz, J = 9.0 Hz, H4),7.41 (m, 3H, H2, H2'), 7.59 (d, 2H, J = 6.6 Hz, H3'), 11.46 (s, 1H, OH).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 27.8 (COCH3), 69.1 (OCH2), 115.2 (C3), 118.C6), 120.1 and 120.8 (C1 and C4'), 124.3 (C4), 129.7 (C2'), 131.2 (C3'), 136.4 (C1'), 150.C5), 155.0 (C2), 203.6 (CO). MS (ESI) m/z 319 (79 Br), 321 (81Br) [M-H] -.4-(4'-Bromobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (4b).The crude was prepared according to general procedure A starting from commercially available 2,4-dihydroxyacetophenone (2 g, 13 mmol) and 4-bromobenzyloxybromide (4 g, 16 mmol) and was recrystallized in ethanol to afford 4b as a beige solid(3.6 g, 87%). C15H13BrO3. m.p. 143-144°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.56 (s, 3H, COCH3), 5.04 (s, 2H, OCH2), 6.50 (m, 2H, H3 and H5), 7.29 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H2'), 7.52 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H3'), 7.64 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H6), 12.72 (s, 1H, OH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 26.6 (COCH3), 68.7 (OCH2), 101.7 (C3), 107.7 (C5), 114.C1), 121.1 (C4'), 129.8 (C2'), 131.4 (C3'), 133.3 (C6), 135.7 (C1'), 163.9 (C4), 164.4 (C2), 203.1 (CO). MS (ESI) m/z 319 ( 79 Br), 321 ( 81 Br) [M-H] -. acid ethyl ester (5a). The crude was prepared according to general procedure B starting from 4a (2.2 g, 6.8 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 5a as a beige solid (820 mg, 30%). C19H15BrO5. m.p. 146-148°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.43 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.46 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.10 (s, 2H, OCH2), 7.11 (s, 1H, H3), 7.33 (m, 2H, H2'), 7.50 (d, 1H, J = 3.1 Hz, H5), 7.54 (dd, 1H, J = 3.1 Hz, J = 9.1 Hz, H7), 7.60 (m, 2H, H3'), 7.75 (d, 1H, J = 9.1 Hz, H8).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 69.0 (OCH2), 105.9 (C5), 112.8 (C3), 120.7 (C8), 121.1 (C4'), 124.6 (C10), 125.0 (C7), 129.8 (C2'), 131.4 (C3'), 135.9 (C1'), 150.2 (C9), 152.0 and 155.9 (C2 and C6), 160.0 (CO), 176.9 (C4). MS (ESI) m/z 403 (79 Br), 405 (81 Br) [M+H] + ; 425 (79 Br), 427 (81 Br) [M+Na] + . acid ethyl ester (5b). The crude was prepared according to general procedure B starting from 4b (1 g, 3.1 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 5b as a grey solid (1 g, 80%). C19H15BrO5. m.p. 179-181°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.34 (t, 3H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 4.39 (q, 2H, J = 7.1 Hz, OCH2CH3), 5.29 (s, 2H, OCH2), 6.89 (s, 1H, H3), 7.18 (dd, 1H, J = 2.3 Hz, J = 8.8 Hz, H6),7.33 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H8),7.44 (d, 2H, J = 8.3 Hz, H2'), 7.61 (d, 2H, J = 8.3 Hz, H3'), 7.96 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H5).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.OCH2CH3),69.3 (OCH2), 102.0 (C8), 114.0 (C3), 116.3 (C6), 117.9 (C10), 121.29 (C4'), 126.C5), 129.9 (C2'), 131.5 (C3'), 135.5 (C1'), 152.0 (C2), 157.2 and 160.0 (C7 and C9), 163.CO),176.3 (C4). MS (ESI) m/z 403 (79 Br), 405 (81 Br) [M+H] + . oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (6a). The crude was prepared according to general procedure C starting from 5a (1 g, 2.5 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 6a as a beige solid. (450 mg, 47%). C17H11BrO5. m.p. 252-254°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.22 (s, 2H, OCH2), 6.88 (s, 1H, H3), 7.45 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H2'), 7.49 (d, 1H, J = 3.1 Hz, H5), 7.54 (dd, J = 3.1 Hz, J = 9.2 Hz, H7), 7.60 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H3'), 7.72 (d, 1H, J = 9.1 Hz, H8). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.0 C2 and C6), 161.4 (CO), 177.3 (C4). MS (ESI) m/z 373 ( 79 Br), 375 ( 81 Br) [M-H] -.

  acid ethyl ester (9a). The crude was prepared according to general procedure B starting from 8a (273 mg, 0.8 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1 to 8:2) as eluent to afford 9a as a beige solid (150 mg, 44%). C19H15BrO5. m.p. 155 -157°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.35 (t, 3H, J = 7.1 Hz, COCH2CH3), 4.39 (q, 2H, J = 7.1 Hz, COCH2CH3), 5.23 (s, 2H, OCH2), 6.80 (s, 1H, H3), 7.15 (d, 1H, J = 8.0 Hz, H6 or H8), 7.28 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.32 (td, 1H, J = 1.7 Hz, J = 7.8 Hz, H4'), 7.50 (td, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.5 Hz, H5'), 7.67 (dd, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.1 Hz, H3'), 7.79 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.10 (dd, 1H, J = 1.5 Hz, J = 7.7 Hz, H6'). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.9 (OCH2CH3), 62.6 (OCH2CH3), 69.8 (OCH2), 108.9 and 110.8 (C6 and C8), 114.7 (C10), 115.5 (C3), 121.1 (C2'), 127.9 (C5'), 129.2 (C6'), 129.6 (C4'), 132.2 (C3'), 135.5 (C7), 135.7 (C1'), 150.3 (C2), 157.3 and 157.5 (C5 and C9), 161.0 (CO), 176.5 (C4). MS (ESI) m/z 403 ( 79 Br), 405 ( 81 Br) [M+H] + .

  C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.1 (OCH2), 108.8 and 110.6 (C6 and C8), 113.3 and 113.5 (C2'), 114.0 and 114.2 (C4'), 114.7 (C10), 115.2 (C3), 122.4 (C6'), 130.2 and 130.3 (C5'), 135.2 (C7), 139.8 and 139.9 (C1'), 151.2 (C2), 157.4 and 157.6 (C5 and C9), 161.5 (COOH), 163.5 (C3'), 176.8 (C4). MS (ESI) m/z 313 [M-H] -, 315 [M+H] + , 337 [M+Na] + .

  The crude was prepared according to general procedure D1 starting from 3 (200 mg, 0.5 mmol) and commercially available tryptamine hydrochloride (98 mg, 0.5 mmol) and

5 ( 6 (

 56 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 23.COCH3), 25.4 (NHCH2CH2), 40.0 (NHCH2CH2), 56.1 (OCH3), 100.6 (Cc), 112.2 and 112.Ce and Cf), 112.8 (Cb), 123.0 (Ca), 127.9 (Ch), 131.7 (Cg), 154.2 (Cd), 170.4 (CO). MS (ESI) m/z 255 [M + Na] + .

  ethyl]-amide (25b). To a solution of 22a (200 mg, 1.1 mmol) in DMF (4 ml) were added successively a solution of 3 (330 mg, 0.9 mmol) in DMF (4 ml), triethylamine(0.5 ml, 4.4 mmol) and bis (2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinic chloride (279 mg, 1.1 mmol). The mixture

  The crude was prepared according to general procedure D1 starting from 6a (150 mg, 0.4 mmol) and 24(75 mg, 0.4 mmol) and washed with diethyl ether to afford 25h as a white solid (mixture of rotamers (3:2)) (80 mg, 37%). C29H25BrN2O4. m.p.127-131°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.95-3.10 (m, 2H, NCH2CH2), 3.06 (s, 1.1H, NCH3), 3.08 (s, 1.9H, NCH3), 3.65-3.75 (m, 5H, NCH2CH2, NCH3), 5.22 (s, 0.8H, OCH2), 

  The crude was prepared according to general procedure I starting from 26 (210 mg, 0.5 mmol) and 4-bromobenzyl azide(1.2 ml, 0.6 mmol) 

4. 62 0 (

 620 (d, 2H, J = 5.2 Hz, OCH2CHCH2), 5.33 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 10.5 Hz, Hb), 5.43 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 17.2 Hz, Ha), 6.07 (m, 1H, OCH2CHCH2), 7.01 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H3), 7.82 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H2), 9.88 (s, 1H, CHO). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 69.

( m , 1 ( 1 -( 2 - 6 (

 m1126 2H, H3, H5),6.92-6.94 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.5 Hz, H6), 7.14-7.18 (ddd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 8.1 Hz, J = 9.0 Hz, H4),7.99 (s, 1H, OH).13 C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.,127.3 (C6), 129.0 (C4), 155.7 (C2). MS (ESI) m/z 161 [M-(H+H2O)] -, 179 [M-H] -. Hydroxy-3-methyl-butyl)-phenol (51c). The crude was prepared according to general procedure S starting from salicylaldehyde (1 g, 8.2 mmol) and isobutylmagnesium bromide (2M in diethyl ether) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 51c as a colorless oil (1.3 g, 88%). C11H16O2. 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.95 (d, 3H, J = 6.6 Hz, CHOHCH2CH(CH3)2), 0.98 (d, 3H, J = 6.6 Hz, CHOHCH2CH(CH3)2), 1.55-1.92 (m, 3H, CHOHCH2CH(CH3)2 and CHOHCH2CH(CH3)2), 2.46 (s, 1H, CHOHCH2CH(CH3)2), 4.92 (dd, 1H, J = 5.4 Hz, J = 8.9 H6), 12.41 (s, 1H, OH). 13 C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.0 (COCH2CH2CH2CH3), 22.The crude was prepared according to general procedure T starting from 51c (1.7 g, 9.7 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 52c as a colorless oil (445 mg, 26%). C11H14O2. 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.01 (d, 6H, J = 6.6 Hz, COCH2CH(CH3)2), 2.25-2.35 (m, 1H, COCH2CH(CH3)2), 2.84 (d, 2H, J = 6.9 Hz, COCH2CH(CH3)2), 6.87-6.91 (ddd, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.3 Hz, J = 8.1 Hz, H5), 6.97-6.99 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 8.4 Hz, H3), 7.44-7.48 (ddd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.4 Hz, J = 8.6 Hz, H4), 7.74-7.77 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 8.0 Hz, H6), 12.47 (s, 1H, OH).

1 H 3 (

 13 NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.88 (t, 3H, J = 7.4 Hz, COCH2CH2CH3), 1.66 (sex, 2H, J = 7.4 Hz, COCH2CH2CH3), 2.86 (t, 2H, J = 7.2 Hz, COCH2CH2CH3), 7.23 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 8.1 Hz, H3), 7.36 (td, 1H, J = 1.2 Hz, J = 7.7 Hz, H5), 7.50-7.58 (m, 3H, H4, H3'), 7.63-7.67 (m, 1H, H4'), 7.80 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.8 Hz, H6), 8.19-8.22 (m, 2H, H2'). 13 C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 13.8 (COCH2CH2CH3), 17.8 (COCH2CH2CH3), 43.9 (COCH2CH2CH3), 124.0 and 126.3 (C3 and C4), 128.8 (C3'), 129.4 (C1), 129.8 (C6), 130.4 (C2'), 132.0 (C1'), 133.0 and 133.9 (C4 and C4'), 149.1 (C2), 165.COO), 200.7 (CO). MS (ESI) m/z 291 [M+Na] + .

6 ( 8 (

 68 1 H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.79(t, 3H, J = 7.3 Hz, COCH2CH2CH2CH3), 1.17-1.27 (m, 2H, COCH2CH2CH2CH3), 1.44-1.51 (m, 2H, COCH2CH2CH2CH3), 2.90 (t, 2H, J = 7.2 Hz, COCH2CH2CH2CH3), 7.37 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 8.0 Hz, H3), 7.43-7.47 (td, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.6 Hz, H5), 7.60-7.64 (m, 2H, H3'), 7.65-7.69 (ddd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 8.0 Hz, J = 9.2 Hz, H4), 7.74-7.79 (m, 1H, H4'), 7.92 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.8 Hz, H6), 8.09-8.12 (m, 2H, H2'). 13 C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 13.6 (COCH2CH2CH2CH3), 21.6 (COCH2CH2CH2CH3), 25.7 (COCH2CH2CH2CH3), 40.COCH2CH2CH2CH3), 124.0 and 126.4 (C3 and C5), 128.9 (C1), 129.0 (C3'), 129.7 (C6), 129.C2'), 131.3 (C1'), 133.2 and 134.1 (C4 and C4'), 148.2 (C2), 164.5 (COO), 200.2 (CO). MS (ESI) m/z 283 [M+H] + , 305 [M+Na] + .

  The crude was prepared according to general procedure U starting from 52c (445 mg, 2.5 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate(95:5) as eluent to afford 53c as a colorless oil (321 mg, 45%). C18H18O3. 1 H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.82 (s, 3H, COCH2CH(CH3)2), 0.84 (s, 3H, COCH2CH(CH3)2), 2.02 (m, 1H, COCH2CH(CH3)2), 2.78 (d, 2H, J = 6.9 Hz, COCH2CH(CH3)2), 7.37 (dd, 1H, J = 1.0 Hz, J = 8.1 Hz, H3), 7.43-7.45 (td, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.6 Hz, H5), 

4 (

 4 C3 and C5), 128.9 (C1), 129.0 (C3'), 129.7 (C6), 129.8 (C2'), 131.5 (C1'), 133.1 and 134.0 (C4 and C4'), 148.2 (C2), 164.5 (COO), 200.0 (CO). MS (ESI) m/z 283 [M+H] + , 305 [M+Na] + .Benzoic acid 2-propanoyl-phenyl ester (53d). The crude was prepared according to general procedure U starting from 2'-hydroxypropiophenone and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (95:5) as eluent and recrystallized in cyclohexane to afford 53d as a white solid (8 g, 94%). C16H14O3. m.p. 58-59°C. 1 H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.97 (t, 3H, J = 7.2 Hz, COCH2CH3), 2.94 (q, 2H, J = 7.2 Hz, COCH2CH3), 7.37 (dd, 1H, J = 0.9 Hz, J = 8.1 Hz, H3), 7.46 (td, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.6 Hz, H5),7.61-7.62 (m, 2H, H3'), 7.65-7.69 (ddd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.9 Hz, J = 9.2 Hz, H4),7.74-7.78 (m, 1H, H4'), 7.95 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.8 Hz, H6), 8.10-8.13 (m, 2H, H2').13 C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 8.0 (COCH2CH3), 34.0 (COCH2CH3), 124.0 and 126.4 (C3 and C5), 128.9 (C1), 129.0 (C3'), 129.7 (C6), 129.8 (C2'), 130.9 (C1'), 133.2 (C4), 134.0 (C4'), 148.3 (C2), 164.6 (COO), 200.5 (CO). MS (ESI) m/z 277 [M+Na] + .

  The crude was prepared according to general procedure X starting from 55c (393 mg, 1.1 mmol) and was purified by flash silica column chromatography, using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 56c as a violet solid (123 mg, 32%). C20H16FeO3. m.p. 205-206°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.93 (s, 3H, OCH3), 4.21 (s, 5H, C5H5), 4.60 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hc), 4.91 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hb), 6.78 (s, 1H, H10), 6.83 (dd, 1H, J = 2.1 Hz, J = 8.6 Hz, H5), 7.11 (d, 1H, J = 2.1 Hz, H7), 7.65 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H4). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 56.3 (OCH3), 69.7 (Cb), 71.1 (C5H5),71.4 (Cc), 74.9 (Ca), 97.1 (C7), 112.4 and 114.4 (C5 and C10), 114.8 (C9), 125.2 (C4), 146.1 (C2), 166.9 and 167.2 (C6 and C8), 179.8 (CO). MS (ESI) m/z 361 [M+H] + . Anal. Calcd for C20H16FeO3:

  (s, 5H, C5H5), 4.50 (s, 2H, Hc), 4.81 (s, 2H, Hb), 6.00 (s, 1H, H5 or H7), 6.14 (s, 1H, H5 or H7),6.47 (s, 1H, H10).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.5 (Cb), 70.6 (C5H5), 70.7 (Cc), 75.5 (Ca), 90.4 (C5 or C7), 97.5 (C5 or C7), 103.3 (C9), 110.5 (C10), 146.6 (C2), 158.2 (C4 or C6), 166.9 and 167.4 (C4 or C6 and C8), 177.9 (CO). MS (ESI) m/z 361 [M-H] -. Anal. Calcd for C19H14FeO4:

1 H 5 ( 1 (

 151 NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.22 (s, 5H, C5H5), 4.63 (t, 2H, J = 1.9 Hz, Hc), 5.10 (t, 2H, J = 1.9 Hz, Hb),6.63 (s, 1H, H3), 7.45-7.49 (td, 1H, J = 1.0 Hz, J = 8.0 Hz, H6), 7.69 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.4 Hz, H8), 7.77-7.82 (m, 1H, H7), 8.02 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 7.9 Hz, H5).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 67.Cb), 70.0 (C5H5),71.4 (Cc), 74.6 (Ca), 105.1 (C3), 118.1 (C8), 123.6 (C10), 124.7 and 125.C5 and C6), 133.7 (C7), 155.7 (C9), 167.8 (C2), 175.9 (CO). MS (ESI) m/z 331[M+H] + , 353 

  -5,7-dimethoxy-chromen-4-one (58c). The crude was prepared according to general procedure Z starting from 56d (100 mg, 0.3 mmol) and was purified by flash silica colum chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (6:4 to 0:100) as eluent to afford 58c as a red solid (15 mg, 15%). C21H18FeO4. m.p. 180-181°C 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.93 (s, 3H, OCH3), 3.96 (s, 3H, OCH3), 4.17 (s, 5H, C5H5), 4.51 (s, 2H, Hc), 4.83 (s, 2H, Hb), 5.30 (s, 1H, H3), 6.38 (s, 1H, H6 or H8), 6.47 (s, 1H, H6 or H8). MS (ESI) m/z 391 [M+H] + . HRMS m/z Calcd for C21H18FeO4: 391.0640. Found 391.0633.

  , 7.27 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H5'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 22.8 (C3, C6), 29.3 (C4, C5), 43.4 (C2, C7), 55.4 (OCH3), 77.2 (C1), 110.9 and 111.7 (C2', C4'), 117.1 (C6'), 129.4 (C5'), 152.9 (C1'), 159.7 (C3'). HRMS (ESI) m/z calcd for C14H20O2 243.2972 [M+Na] + , found 243.1359. 1-(3-Methoxyphenyl)cyclohept-1-ene (67). To a solution of 66 (964 mg, 4.4 mmol) in dichloromethane (20 mL) was added trifluoroacetic acid (336 µL, 4.4 mmol) and the mixture was stirred at 25 °C for 1 hour. The mixture was poured into water and extracted with

55. 2 (

 2 OCH3), 111.6 (C2', C4'), 118.3 (C6'), 130.6 and 129.1 (C2, C5'), 145.0 (C1'), 146.6 (C1), 159.6 (C3'). HRMS (ESI) m/z calcd for C14H18O 203.3000 [M+H] + , found 203.1433, 405.5921 [2M+H] + , found 405.2787.

1 H

 1 NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.45-2.05 (m, 10H, CH2), 3.82 (s, 3H, OCH3), 3.96 (dd, 1H, J = 2.6 Hz, J = 10.5 Hz, H2), 6.79 (ddd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 2.5 Hz, J = 8.0 Hz, H4'), 7.04 (ddd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 1.6 Hz J = 8.0 Hz, H6'), 7.10 (dd, 1H, J = 1.6 Hz, J = 2.5 Hz, H2'), 7.28 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H5'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 20.1 (CH2), 22.8 (CH2), 26.7 (CH2), 29.8 (CH2), 39.0 (CH2), 55.3 (OCH3), 77.3 (C2), 78.9 (C1), 111.1 and 112.0 (C2', C4'), 117.0 (C6'), 129.5 (C5'), 150.3 (C1'), 159.8 (C3'). HRMS (ESI) m/z calcd for C14H20O3 259.2966 [M+Na] + , found 259.1304; 495.6034 [2M+Na] + , found 495.2717. Anal. Calcd for C14H20O3:C, 71.14, H, 8.55. Found: C, 71.21, H, 8.70. 

  ) m/z calcd for C14H18O3 235.2988[M+H] + , found 235.1335; 257.2807 [M+Na] extracts were analyzed at the Section of Pharmaceutical Sciences in Geneva.NMR spectroscopic data were recorded on Brüker AC-400 instrument (400 MHz) and at 400 and 500 MHz Varian Inova spectrometer.(+/-)-Tramadol. To a solution of 69 (269 mg, 1.1 mmol) in anhydrous tetrahydrofuran (86 ml) was added 2.0 M solution of diméthylamine in tetrahydrofuran (1.1 ml, 2.3 mmol) and the mixture was refluxed overnight and stirred at 25 °C for 48h. Sodium borohydride (108 mg, 2.8 mmol) or sodium cyanoborohydride (144 mg, 2.3 mmol) was then added and the resulting mixture was stirred at 25°C for 24h. Water was added and the solution was extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to afford a crude oil (241 mg) which was purified by semi-preparative HPLC. In order to localize the tramadol in the reaction mixture the crude material was analyzed by HPLC-PDA-ELSD-ESI-MS with an X-Bridge C18 column (5 μm, 250 x 4.6 mm i.d.; Waters). Two peaks, both with[M+H]+ ions at m/z 264, and eluting between 16-22 min were attributed to the presence of different stereoisomers of Tramadol. This deduction was confirmed by the HPLC-PDA-ESI-MS analysis of a Tramadol standard in the same conditions. The analytical HPLC conditions were scaled-up for semi-preparative HPLC using a gradient transfer method.504 Four injections were made from a solution at 20 mg/200 μL. A total of 13 fractions (F1-F13) were obtained from the region considered to contain the Tramadol isomers based on the LC-MS results. Fractions 1-3 yielded pure (±)-(1R,2S)-Tramadol and fraction 9 afforded pure (±)-(1R,2R)-Tramadol. Beside isomers of tramadol, compounds 72 and 73 were isolated and traces of opened Tramadol (71) was detected. MHz) δ 1.50 (qt, 1H, J = 3.7 Hz, J = 12.5 Hz, H4ax), 1.61 (dt, 1H, J = 3.4 Hz, J = 12.8 Hz, H5eq), 1.70 (m, 1H, H6eq), 1.72 (m, 1H, H3ax), 1.81 (m, 1H, H3eq), 1.82 (m, 1H, H5ax), 1.87 (m, 1H, H4eq), 1.88 (m, 1H, H6ax), 2.10 (ddt, 1H, J = 3.4 Hz, J = 9.0 Hz, J = 12.0 Hz, H2), 2.32 (d, 1H, J = 13.4 Hz, H7b), 2.40 (s, 6H, N(CH3)2), 2.70 (dd, 1H, J = 9.1 Hz, J = 13.4 Hz, H7a), 3.80 (s, 3H, OCH3), 6.81 (dd, 1H, J = 2.5 Hz, J = 7.9 Hz, H4'), 7.05 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H6'), 7.09 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H2'), 7.28 (t, 1H, J = 7.9 Hz, H5'). '). HRMS (ESI) m/z calcd for C16H25NO2 264.1964 [M+H] + , found 264.1951. MHz) δ 1.60 (m, 1H, H4eq), 1.63 (m, 1H, H3eq), 1.66 (m, 1H, H4ax), 1.69 (m, 1H, H5eq), 1.82 (m, 1H, H6eq), 1.86 (m, 1H, H5ax), 2.05 (m, 1H, H3ax), 2.07 (m, 1H, H6ax), 2.19 (dq, 1H, J = 5.0 Hz, J = 9.0 Hz, H2), 2.42 (dd, 1H, J = 5.0 Hz, J = 13.1 Hz, H7b), 2.58 (s, 6H, N(CH3)2), 3.04 (dd, 1H, J = 9.0 Hz, J = 13.1 Hz, H7a),3.81 (s, 3H, OCH3), 6.88 (ddd, 1H, J = 0.9 Hz, J = 2.5 Hz, J = 8.1 Hz, H4'), 7.12 (m, 1H, H6'), 7.15 (m, 1H, H2'), 7.31 (t, 1H, J = 8.1 Hz, H5').

  , CD3OD) δ 1.37

  , 2.31 (s, 6H, N(CH3)2), 3.16 (td, 1H, J = 3.0 Hz, J = 11.0 Hz, H3), 3.71 (td, 1H, J = 3.9 Hz, J = 11.0 Hz, H2),3.85 (s, 3H, OCH3), 7.19 (ddd, 1H, J = 1.2 Hz, J = 2.6 Hz, J = 8.0 Hz, H4'), 7.43 (t, 1H, J = 8.0 Hz, H5'), 7.52 (dd, 1H, J = 1.2 Hz, J = 2.6 Hz, H2'), 7.64 (dt, 1H, J = 1.2 Hz, J = 8.0 Hz, H6'). 13 C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 23.6 (C3), 26.0 (C5), 26.2 (C6), 32.4 (C4), 40.8 (N(CH3)2), 48.6 (C2), 55.7 (OCH3), 65.8 (C3), 113.8 (C2'), 120.2 (C4'), 121.7 (C6'), 130.7 (C5'), 139.1 (C1'), 161.4 (C3'), 204.8 (C1). HRMS (ESI) m/z calcd for C16H23NO2 262.1807, found 262-MS analyses were performed on a Waters Acquity UPLC system coupled to a Waters Micromass-LCT Premier Time of Flight Mass spectrometer (Milford, MA, USA), equipped with an electrospray interface (ESI). Compound separations were performed on a C18 column (Waters Acquity UPLC BEH C18, 150 mm x 2.1 mm i.d.; 1.7 μm, Waters, Milford, MA, USA). The mobile phase consisted of H2O (A) and acetonitrile (B), each containing 0.1% formic acid (v/v). For high resolution detection, the following gradient was used: from 5-95% B in 30 min at a flow rate of 460 μL. The auto sampler and the column oven were set at 10 and 40°C, respectively. Injection volume was 2 μL. Detection was performed in positive ionization mode in the 100-1300 Da range with acquisition times of 0.3 sec in W-mode. The ESI conditions were set as follows: capillary voltage 2400 V, cone voltage 40 V, source temperature 120°C, desolvation temperature 300°C, cone gas flow 20 L/h, desolvation gas flow 800 L/h, and MCP (micro channel plate) detector voltage 2500 V.

C18 column ( 5

 5 μm, 250 x 19 mm i.d.; Waters); solvent system: CH3CN-H2O, both containing 0.1% formic acid; gradient mode: 5% to 30% CH3CN in 40 min, 40% to 100% CH3CN in 5 min and 100% CH3CN in 5 min; flow rate: 15 mL/min; injection volume: 200 μL; sample concentration: 20 mg/mL in MeOH. The UV absorbance was measured at 210 and 254 nm. 13 fractions were collected in the zone supposed to contain the Tramadol.

  Base de données des molécules inhibitrices de l'activité ATPasique basale (site 4) (A) et des molécules stimulatrices de l'activité ATPasique (site 3) (B) (Pourcentage d'inhibition déterminé par cytométrie de flux. Ces valeurs correspondent à la moyenne ± la déviation standard issues de trois expériences. Les EC50 des composés dont les %inhibition sont inférieurs à 50% n'ont pas été déterminées (ND)) « ligand-based ». Valeurs des AUC (aire sous la courbe) et paramètres discriminant pour le site 3 (A) et le site 4 (B).

:

  ABCG2, MRP1, flavonoids, modulators, multidrug resistance, selective chemotherapy. a Équipe MedChem -Département de Pharmacochimie Moléculaire (DPM) -UMR 5063 -Bâtiment E Pôle Chimie -BP53 -38041 Grenoble Cedex 9 -France. b Section des Sciences Pharmaceutiques -Faculté des Sciences -Université de Genève -30, quai Ernest Ansermet -1211 Genève 4 -Suisse

  

Élucidation des propriétés des sites d'interaction de la protéine ABCG2 à l'aide de pharmacophores

  

	III. III.1.	LES DIFFÉRENTS TYPES D'INHIBITEUR D'ABCG2
		III.1.1. Mise en évidence de plusieurs sites d'interaction avec
		ABCG2
		III.1.2. L'hypothèse de quatre sites d'interaction avec ABCG2
		III.1.3. La construction de modèles pharmacophores afin de
		différencier les sites 3 et 4
	III.2.	MATÉRIEL ET MÉTHODES
		III.2.1. La base de données
		III.2.2. Les logiciels utilisés pour la détermination et l'analyse des
		MBL-II-141 pharmacophores
	III.3.	II.4.2. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS Relations structure-activité (RSA) issues de la
		pharmacomodulation 1 : modulation de la position du groupement III.3.1. Sélection des composés pour la création des pharmacophores
		para-bromobenzyloxy porté par la chromone pour les sites 3 et 4	102
		II.4.3.	RSA issues de la pharmacomodulation 2 : modulation de la
		nature et de la position du groupement sur le cycle benzyloxy	105
		II.4.4.	RSA issues de la pharmacomodulation 3 : modulation de la
		nature et de la position de la substitution du groupement porté par le
		cycle indolique	109
		II.4.5.	RSA issues de la pharmacomodulation 4 : méthylation des
		azotes indolique et amidique	111
		II.4.6.	RSA issues de la pharmacomodulation 5 : introduction d'un
		cycle triazolique	115
		II.4.7.	RSA issues de la pharmacomodulation 6 : suppression de
		l'amide central	117
		II.4.8.	RSA issues de la pharmacomodulation 7 : introduction d'un
		motif acide aminé	119
	II.5.	CONCLUSIONS DES ÉTUDES DE RELATIONS STRUCTURE-
	ACTIVITÉ	123
	II.6.	PERSPECTIVES

III.3.2. Génération des modèles pharmacophores pour les sites 3 et 4 III.3.3. Comparaison et sélection des meilleurs modèles pharmacophores III.3.4. Criblages virtuels basés sur les pharmacophores et sélection des composés pour les tests in vitro III.4. CONCLUSION

IV.

Conclusion du chapitre 2 CHAPITRE 3. MODULATION DE LA PROTÉINE MRP1 Avant-propos I. La protéine MRP1 : Structure, fonctions biologiques et implication dans le phénotype MDR

  Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde et le nombre de nouveaux cas détectés et de décès ne cessent d'augmenter chaque année. D'après l'Organisation Mondiale de la Santé, en 2012, on comptait approximativement 14 millions de nouveau cas de cancer et 8,2 millions de décès liés à cette maladie. Le nombre de décès pourrait augmenter jusqu'à 11,5 millions en 2030. Les principaux types de cancers sont les cancers du poumon, du foie, de l'estomac, du sein, de l'oesophage et le cancer colorectal. Le tabagisme, une mauvaise alimentation, le manque d'exercice physique ou encore la consommation d'alcool sont les principaux facteurs de risque. Plus de 60% des nouveaux cas de cancer surviennent en Afrique, en Asie, en Amérique Centrale et en Amérique Latine. Ces régions représentent 70% des décès par cancer dans le monde. Ainsi, la lutte contre ces maladies constitue un enjeu majeur. sur les cellules saines. Le vérapamil, inhibiteur de référence de la P-gp, s'avère être un très bon candidat pour la sensibilité collatérale de MRP1. Mais, en raison de sa forte cardiotoxicité aux concentrations thérapeutiques utilisées, de nombreuses études se sont tournées vers les flavones. En effet, des travaux antérieurs ont démontré l'efficacité de certains dérivés de flavone dans l'induction de la sensibilité collatérale. Dans le cadre de cette thèse, nous avons ainsi conduit un travail de pharmacomodulation afin de mettre au point de nouveaux ligands de MRP1 capables d'induire une sensibilité collatérale sur des cellules cancéreuses résistantes.Le dernier volet de ce travail, minoritaire et absent du cadre initial de cette thèse, porte sur la synthèse biomimétique du tramadol, alcaloïde conçu et produit par synthèse, découvert en

		I.1.2.	Topologie de la membrane de MRP1
		I.1.3.	Élucidation de la structure et modèle par homologie	127
		I.1.4.	Les résidus identifiés de MRP1
	I.	I.1.5. Le cancer et le phénotype MDR Expression de MRP1
			CHAPITRE 1.
			RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
				165
				167
	169 Afin de pallier au phénomène de chimiorésistance, le développement de nouveaux
	modulateurs de ces protéines est au coeur de nombreuses études. Au sein du Département de
	Pharmacophimie Moléculaire, nous nous intéressons particulièrement aux protéines ABCG2
	et MRP1. La conception et la synthèse de nouveaux ligands issus de la famille des
	I.1.	STRUCTURE ET FONCTIONS BIOLOGIQUES DE MRP1
		I.1.1.	Découverte de la protéine

La chimiothérapie est l'un des traitements les plus utilisés pour lutter contre les cancers généralisés et/ou métastatiques. Malheureusement, celle-ci se heurte à un problème de taille : le développement d'une résistance des cellules cancéreuses face à de nombreux agents anticancéreux, rendant ainsi ce type de traitement inefficace. Ce phénomène se nomme phénotype de résistance à de multiples drogues (MDR pour MultiDrug Resistance). Plusieurs mécanismes peuvent être à l'origine de ce phénotype. L'un d'entre eux est la surexpression de protéines membranaires, appartenant à la famille des transporteurs ABC, jouant le rôle de pompes à efflux capables de transporter activement les agents anticancéreux hors des cellules cancéreuses. Parmi les transporteurs ABC impliqués dans cette chimiorésistance, on retrouve la glycoprotéine-P (ABCB1/P-gp), la Multidrug Resistance associated Protein 1 (ABCC1/MRP1) et la Breast Cancer Resistance Protein (ABCG2/BCRP). flavonoïdes ciblant ces protéines constituent l'axe principal de mes travaux de thèse. Les flavonoïdes rassemblent une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols. Ces composés sont largement présents au sein de nombreuses plantes agents anticancéreux forte concentration au sein d'extraits d'un arbuste africain, le Nauclea latifolia. Nous sommes parvenus, dans le cadre de cette étude, à proposer et valider partiellement une synthèse biomimétique du tramadol, venant soutenir fortement l'hypothèse d'une origine naturelle du composé au sein de la plante. Dans ce manuscrit, nous allons aborder les travaux soulignés ci-dessus selon le plan suivant : après une introduction sur le cancer et ses généralités, sur les transporteurs ABC ainsi que sur le phénotype de résistance, les travaux réalisés sur les protéines ABCG2 et MRP1 sont présentés. L'étude de chacune des deux protéines constitue un chapitre indépendant (chapitre 2 et 3). Le dernier chapitre porte sur les travaux entrepris sur la synthèse biomimétique du tramadol. Pour finir, la partie expérimentale, la bibliographie puis les annexes viennent clore ce manuscrit. I.1.

La protéine ABCG2 : structure, fonctions biologiques et implication dans le phénotype MDR.

  L'analyse de la litérature montre qu'à l'heure actuelle, seuls des inhibiteurs de la protéine Pgp ont atteint les tests cliniques. Les avancées biologiques et biochimiques réalisées sur les protéines MRP1 et ABCG2 et leurs structures ont ravivé l'intérêt suscité par la découverte de modulateurs ciblant MRP1 et ABCG2. Ainsi la recherche de nouveaux inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques de transporteurs ABC reste encore d'actualité et d'un grand intérêt, en particulier pour ABCG2. En effet, la présence de cette protéine dans les cellules souches, impliquées dans certains cancers, en fait une cible biologique de choix. cancéreuses à la doxorubicine en diminuant l'expression de la P-gp, permettrait de lutter contre la chimiorésistance due aux protéines ABC. De plus, les protéines kinases sont impliquées dans la régulation de l'expression des transporteurs ABC, telles que la protéine kinase C qui régule la P-gp. Il devient alors possible de diminuer l'expression des Dans une deuxième partie, nous aborderons la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux modulateurs de MRP1 capables d'induire une sensibilité collatérale et ainsi la mort sélective par apoptose des cellules chimiorésistantes surexprimant la protéine.

	Avant-propos
	transporteurs en régulant l'activité de ces protéines kinases ;
	-	l'altération de la membrane plasmique : certains agents sont capables de modifier la
	membrane plasmique et ainsi prévenir la surexpression de la protéine P-gp ;
	-	l'encapsulation d'agents anticancéreux dans des liposomes, variant selon le type de
	II.4.3.2 cellules ciblées, est un moyen de contrecarrer le phénotype MDR. De plus, en supposant que Méthodes alternatives développées contre le phénotype MDR L'un des deux axes principaux de cette thèse repose sur le développement de nouveaux
	Au vue de l'échec au stade clinique d'un grand nombre d'inhibiteurs de la protéine P-gp, de inhibiteurs de la protéine ABCG2, fortement impliquée dans le phénotype MDR. Suite à la les transporteurs ABC ne reconnaissent leur substrat que lors de leur passage à travers la membrane, l'utilisation de nanoparticules lipophiles capables d'entraîner le principe actif dans découverte au sein du laboratoire du MBL-II-141, un inhibiteur actif, sélectif et non toxique I.1. STRUCTURE ET FONCTIONS BIOLOGIQUES D'ABCG2
	I.1.1.	Découverte de la protéine
	I.1.2.	Topologie et structure d'ABCG2
	ABCG2 est un transporteur de 72 kDa constitué de 655 acides aminés.

nouvelles méthodes ont vu le jour afin de contrecarrer la chimiorésistance. Un grand nombre d'entre elles ont pour cible l'ARN messager (ARNm). L'ensemble de ces techniques sont largement décrites dans la littérature.

110 

Parmi ces méthodes, on distingue :

les oligonucléotides antisens : il s'agit de séquences d'acides nucléiques capables de se fixer sur le brin d'ARNm, permettant de stopper la synthèse de la protéine ciblée telle que la protéine P-gp. Cette méthode a permis de resensibiliser un carcinome humain à la doxorubicine en réduisant la synthèse de la P-gp ; -les ribozymes « Hammerhead » : il s'agit de modules d'ARN pouvant catalyser une réaction de clivage à un site spécifique de l'ARN. Ceci aura pour objectif de réduire l'expression des transporteurs ABC ; -Les interférences sur les ARN : les petits ARN interférents (siRNA) peuvent se lier spécifiquement à une séquence d'ARNm et ainsi empêcher l'expression de gènes en clivant cet ARN. Les siRNA ont déjà montré leur efficacité sur différents transporteurs ABC tels qu'ABCB1, ABCB4, ABCC2, ABCC3 et ABCG2. Les « short hairpin RNA » sont des brins d'ARN qui se replient sur eux-mêmes en formant une boucle en épingle à cheveux. Une fois sorti du noyau, le brin sens est dégradé et le brin antisens cible la séquence complémentaire de l'ARNm et entraine le blocage de la traduction de la protéine. Cette technique a su faire ses preuves in vitro sur ABCB1, ABCC2 et ABCG2 mais également in vivo sur ABCB1. D'autres méthodes ont également été développées telles que la régulation transcriptomique, l'altération de la membrane plasmique, l'encapsulation et les anticorps : 110 -la régulation transcriptomique : différentes stratégies ont été développées afin d'altérer les voies de signalisation régulant l'expression des transporteurs ABC. La modulation de certains gènes, tels que LANCL2 impliqué dans l'augmentation de la sensibilité des cellules le cytoplasme puis de le relarguer permettrait d'éviter son efflux via les transporteurs ABC ; -les anticorps monoclonaux, usuellement utilisés pour détecter les transporteurs ABC, peuvent également être capables de les inhiber. C'est le cas de UIC2 pour la protéine P-gp. 111 Un grand nombre des méthodes mentionnées précédemment a conduit à d'excellents résultats in vitro. Cependant, à l'heure actuelle, peu ont été testées in vivo. De plus, suite aux échecs des études cliniques sur les inhibiteurs de la protéine P-gp, pourtant très actifs in vitro, il est devenu nécessaire de trouver de nouvelles méthodes alternatives. Depuis plusieurs années, une nouvelle stratégie est en train d'émerger. Celle-ci se base sur l'hypersensibilité que développent les cellules cancéreuses chimiorésistantes lors des traitements par des agents anticancéreux. 112 Il devient alors possible de cibler et d'éliminer sélectivement les cellules chimiorésistantes surexprimant un transporteur ABC. Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux protéines ABCG2 et MRP1 comme cibles. Le but ultime est de mettre au point de nouvelles molécules capables de sensibiliser les tumeurs résistantes aux traitements ou d'induire un effet cytotoxique ciblant sélectivement les cellules tumorales. Ces deux projets vont être développés dans les deux chapitres suivants. Dans un premier temps, après une introduction décrivant ABCG2 et son rôle dans la chimiorésistance, nous nous intéresserons à la conception, la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques d'ABCG2.

Puis un travail de modélisation moléculaire sera décrit permettant de mieux comprendre les interactions entre la protéine et ses inhibiteurs. d'ABCG2, mon travail a consisté en la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d'analogues du MBL-II-141, issus de différentes pharmacomodulations. Ceci a été réalisé dans le but, d'une part d'améliorer l'activité biologique, et d'autre part, d'étudier les relations structure-activité de ces ligands. La totalité des synthèses a été effectuée au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire de Grenoble. Ce travail a été réalisé en étroite collaboration avec l'équipe du Dr. Attilio Di Pietro de l'Institut de Biologie et de Chimie des Protéines (IBCP) de l'Université Lyon 1 pour l'ensemble des tests in vitro sur les composés synthétisés ainsi qu'avec les docteurs Léa Payen et Mylène Honorat de l'Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques de l'Université Lyon 1 pour les tests in vivo du MBL-II-141. Après la découverte par nos collaborateurs biologistes de l'existence de plusieurs sites d'interaction entre ABCG2 et ses inhibiteurs, une seconde partie de ce projet de thèse a consisté en la construction, via le logiciel de modélisation moléculaire FLAP, de deux pharmacophores modélisant deux des sites d'interaction d'ABCG2. Ce travail a été réalisé au sein de la Section des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Genève en collaboration avec le Dr. Laura Goracci du Département de Chimie, Biologie et Biotechnologie de l'Université de Pérugia. I. Suite aux découvertes des transporteurs P-gp et MRP1, différentes études reportent une résistance induite par un nouveau transporteur sur des lignées cellulaires sélectionnées résistantes à la mitoxantrone. De plus, ces lignées cellulaires montrent une résistance à la doxorubicine et à l'étoposide mais aucune résistance à la vinblastine ni au cisplatine.

113, 114 En 1998, Doyle et ses collègues sont les premiers à cloner ce transporteur à partir de lignées cellulaires issues du carcinome du sein (MCF7/AdVp) et le nomment BCRP pour Breast Cancer Resistance Protein. 92 Simultanément à cette découverte, l'équipe d'Allikmets décrit un gène codant pour une protéine quasiment identique dans les cellules du placenta et le nomme ABCP pour ABC transporter in placenta. 93 Pour finir, l'équipe de Miyake en 1999 clone un gène codant pour une protéine responsable du phénotype de résistance à la mitoxantrone sur une lignée cellulaire de carcinome du colon. Ce gène est nommé MXR pour mitoxantrone resistance gene. 94 Étant le second membre de la sous famille G des transporteurs ABC, ce gène est par la suite nommé ABCG2. 115 Deux caractéristiques uniques le distinguent des transporteurs P-gp et MRP1. En premier lieu, ABCG2 est un demi-transporteur composé uniquement d'un seul domaine transmembranaire (TMD) constitué de 6 hélices α transmembranaires et d'un seul domaine nucléotidique cytoplasmique (NBD). Puis, ABCG2 possède une organisation inverse aux autres transporteurs. En effet, le TMD est du côté C-terminal tandis que le NBD est du côté Nterminal (Figure

  117 

  transport de la mitoxantrone et de la prazosine-BODIPY. Néanmoins, il est intéressant de noter que la mutation avec un résidu alanine n'a aucune influence sur l'activité de transport. Il semble ainsi que le motif GXXXG joue un rôle dans la dimérisation d'ABCG2 et en particulier, dans l'arrangement correct des deux sites de liaisons à l'ATP.128 

	I.1.3.	La dimérisation
	ABC NBD Comme nous l'avons vu précédemment, la présence d'au moins deux NBDs est nécessaire COOH TMD Membrane cellulaire Cytoplasme NH 2 afin de permettre la liaison et l'hydrolyse de l'ATP pour assurer l'activité de transport d'ABCG2. La protéine doit ainsi au minimum s'homodimériser pour être active. L'équipe de Sarkadi en 2001 est la première à mettre en évidence cette hypothèse en démontrant qu'ABCG2 exprimée seule dans les cellules membranaires d'insectes Sf9 (cellules ovariennes de l'insecte Spodoptera frugiperda) est capable de fonctionner sans la présence de protéine partenaire, supposant ainsi l'hypothèse de la formation d'au moins un homodimère. 118 L'année suivante, l'équipe de Kage confirme la formation d'homodimères d'ABCG2 pontés par des liaisons disulfures. I.1.4. Les résidus importants d'ABCG2 L'ensemble des études de mutagénèse dirigée réalisées sur les transporteurs ABC est détaillé dans la base de données ABCMdb (http://abcmutations.hegelab.org) créée par l'équipe de Gyimesi en 2012. résidu polaire thréonine 402 (Thr402) localisé dans TM1 joue un rôle important pour l'activité de transport de la protéine. 133 La proline 485 (Pro485), située dans TM3, introduit une flexibilité au sein de la poche d'interaction de la protéine pouvant contribuer à la spécificité impliqués dans la formation de l'homodimère d'ABCG2. 124, 125 I.1.5. Les substrats d'ABCG2 ABCG2 est connue pour transporter un large spectre de molécules thérapeutiques appartenant à des classes chimiques différentes, telles que les statines, les agents antibactériens, du substrat. Pour finir, comme nous l'avons vu précédemment, les résidus cystéines 592, 603 et 608 sont antinéoplasiques ou antiviraux, les inhibiteurs de la tyrosine kinase, les agents

119 Plus tard, l'étude réalisée par Xu et ses collaborateurs démontre la conformation sous forme d'oligomères d'ABCG2, pouvant aller jusqu'à une structure constituée de 12 monomères liés et dont la forme homotétramère est dominante. 120 Ceci est confirmé par les études de McDevitt qui décrivent une organisation en tétramères comportant quatre homodimères 121 et celles de Dezi et Rosenberg qui observent une conformation sous la forme de tétramère majoritaire. 117, 122 L'équipe de Ni démontre la formation de dimères/oligomères in vivo dans des cellules intactes par des études de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET). 123 Par la suite, plusieurs équipes se sont concentrées sur les acides aminés impliqués dans cette dimérisation/oligomérisation. Des études de mutagénèse dirigée ont mis en évidence l'implication de trois résidus cystéines, localisés au sein de la boucle extracellulaire ECL3 comprise entre TM5 et TM6. La cystéine 603 (Cys603) est impliquée dans la formation de ponts disulfures intermoléculaires au sein de l'homodimère d'ABCG2 mais n'est pas essentiel à l'expression de la protéine et à son bon fonctionnement. De plus, la présence unique de Cys603 n'est pas suffisante pour assurer l'oligomérisation. 123 Deux autres résidus cystéines localisés aux positions 592 et 608 de l'ECL3 (Cys592 et Cys608) permettent la formation de ponts disulfures intramoléculaires influençant ainsi la spécificité du substrat de la protéine. 124- 126 Néanmoins, bien que ces liaisons covalentes disulfures soient nécessaires au maintien de la forme active d'ABCG2 en dimères/oligomères, il semblerait qu'elles ne soient pas essentielles pour assurer la fonction de transport de la protéine. 127 Pour finir, le motif GXXXG, présent au sein de TM1 est impliqué dans le maintien de la structure de la protéine ABCG2. En effet, la substitution d'un seul ou des deux résidus glycine par une leucine conduit à une perte de l'activité de transport de la rhodamine 123 ainsi qu'à une diminution du 129 Cette base de données rassemble ainsi les mutations mettant en évidence les résidus acides aminés ainsi que les motifs structuraux responsables de l'activité de transport d'ABCG2 et de la reconnaissance de ses substrats. Un grand nombre de ces mutations a également été répertorié dans la revue de Szafraniec et ses collaborateurs en 2014. 130 Parmi les résidus mis en évidence, l'arginine 482 (Arg482) est un acide aminé essentiel pour la sélectivité des substrats d'ABCG2 et a fait l'objet d'un grand nombre d'études de mutagénèse. Des cellules sauvages d'ABCG2 avec Arg482 ne transportent pas la daunorubicine et la rhodamine 123. Cependant, ces composés sont d'excellents substrats des mutants R482T et R482G. 131 Le méthotrexate est un substrat uniquement des cellules sauvages d'ABCG2 tandis que la mitoxantrone, la prazosine-BODIPY et le colorant Hoechst 33342 sont des substrats de la lignée sauvage et des deux lignées mutantes. 132 Arg482 est localisée au sein de TM3, proche de l'interface cytoplasmique et fait partie de la poche d'interaction avec les substrats. D'autres études de mutagénèse ont été réalisées sur différents résidus appartement au domaine transmembranaire et sont également importants pour la fonction de transport d'ABCG2. Le 134 De même, la mutation d'autres résidus tels que l'acide glutamique 446 (Glu446) localisé dans la boucle extracellulaire reliant TM1 et TM2, 135 la leucine 554 (Leu554) présente dans la boucle intracellulaire reliant TM4 et TM5 119 , la lysine 86 (Lys86) et l'acide glutamique 211 (Glu211) appartenant au domaine nucléotidique cytoplasmique, 136-138 entraîne une perte de l'activité de transport. immunosuppresseurs ou encore les inhibiteurs nucléosidiques et non nucléosidiques de la transcriptase inverse. ABCG2 peut également transporter des molécules naturelles soulignant ainsi le rôle physiologique détoxifiant joué par la protéine. Par ailleurs, ABCG2 transporte également des anions organiques conjugués sulfatés 139, 140 et glucuronidés 141 tels que l'estrone-3-sulfate, ou le 17β-estradiol-17-(β-D-glucoronide) (E217βG). De manière générale, les composés conjugués sulfatés semblent être de meilleurs substrats que les dérivés conjugués au glutathion et au glucoronide. ABCG2 joue ainsi un rôle de détoxification et de régulation physiologique. Ce rôle a été mis en évidence in vivo par le transport de phytooestrogènes sulfatés via ABCG2. 142

Enfin, une variété de photosensibiliseurs, tels que le phéophorbide A ou la protoporphyrine IX sont également des substrats d'ABCG2 suggérant ainsi la responsabilité de la protéine dans la résistance cellulaire aux traitements par thérapie photodynamique.

Le Tableau 3 rassemble une partie des substrats les plus connus d'ABCG2.

.7.1 La première ligne de défense contre les xénobiotiques ABCG2

  , fortement exprimée au sein des cellules du tractus intestinal, joue un rôle majeur dans l'absorption et la biodisponibilité des xénobiotiques et permet ainsi d'assurer une première ligne de défense contre ces composés issus de médicaments ou de toxines.

	Cerveau I.1Des études sur l'absorption et la biodisponibilité du topotécan, substrat d'ABCG2, en Foie Glandes mammaires
	présence de GF120918, inhibiteur d'ABCG2, réalisées chez la souris KO (knock out) pour le
	gène Mdr1a 174 puis chez l'humain, 175 soulignent l'implication de la protéine dans la limitation
	Tumeurs de l'absorption et dans l'excrétion du topotécan.	Intestins
	Reins ABCG2 permet également à l'organisme de se défendre contre certaines toxines présentes grêles
	dans notre alimentation, telles que le phéophorbide a, dérivé de la chlorophylle 153 ou encore
	Compartiment		Colon
	hématopoïétique	Placenta

certains carcinogènes tels que PhIP

(2-amino-1-méthyl-6-phénylimidazo[4,5-b]

pyridine),

176 

IQ

(2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]

quinoline), Trp-P-1

(3-amino-1,4-dimethyl-5H- pyrido[4,3-b]

indole) et l'aflatoxine B1. 177 I.1.7.2 Rôle d'ABCG2 au sein du placenta ABCG2 est très fortement exprimée au sein de la membrane apicale des syncytiotrophoblastes qui composent le placenta. D'autres transporteurs ABC, tels que la P-gp et MRP2 y sont également exprimés. 157 Les cellules du syncytiotrophoblaste constituent une barrière entre les circulations sanguines du foetus et de la mère et constituent le passage de divers nutriments. ABCG2, exposée du côté maternel, est ainsi impliquée dans le transport de différentes drogues et toxines de la circulation sanguine foetale vers celle de la mère permettant ainsi la protection du foetus. Ceci est démontré par plusieurs études sur souris KO du gène Abcg2 étudiant l'exposition foetale au topotécan et aux toxines issues de l'alimentation maternelle. 178, 179 I.1.

7.3 Rôle d'ABCG2 au sein de la barrière hémato-encéphalique

  

	ABCG2 est exprimée dans la membrane apicale des cellules endothéliales de la barrière
	hémato-encéphalique.

7.5 Rôle d'ABCG2 au niveau des glandes mammaires ABCG2

  est fortement exprimée au sein de la membrane apicale des cellules épithéliales alvéolaires des glandes mammaires des souris, des vaches et des humains en période de lactation. En effet, cette expression augmente pendant la période de gestation, atteint son maximum lors de la lactation puis diminue rapidement au moment du sevrage.190 Les cellules épithéliales alvéolaires étant le principal lieu de production de lait, plusieurs études démontrent la responsabilité d'ABCG2 dans la sécrétion de xénobiotiques et toxines tels que l'agent carcinogène PhIP, l'agent anticancéreux topotécan, la cimétidine utilisée dans le traitement de l'ulcère, 190 l'antibiotique nitrofurantoine 191 ou sous la forme de fluoroquinolones. nous l'avons vu précédemment, une perte de l'activité de transport, elle peut en effet être la cause de l'accumulation de l'acide urique dans le sang. Des études récentes suggèrent que dans les cas d'accumulation d'acide urique, l'implication d'ABCG2 ne se fait pas au niveau des reins, mais plutôt au niveau des intestins.196 En effet, des études Cette implication semble apparaître au sein des tumeurs solides humaines.206, 207 En effet, la chimiorésistance due à la surexpression d'ABCG2 a déjà été observée pour différents agents anticancéreux tels que la mitoxantrone, le topotécan, le flavopiridol ou l'imatinib et ne semble pas être dépendant de l'expression de la P-gp et de MRP1.208 Un grand nombre de ces études porte en particulier sur le rôle joué par ABCG2 dans les leucémies myéloïdes aigües (AML) et souligne les nombreux désaccords à ce sujet. Alors que certaines attestent de l'expression d'un fort taux d'ABCG2, d'autres, au contraire, n'en détectent pas une trace.[209][210][211][212][213] Cette maladie est considérée comme une maladie des cellules souches, due à une éradication incomplète des cellules souches leucémiques CD34+/CD38-.Ainsi, en raison de son rôle de protection, ABCG2 est fortement impliquée dans le développement de la résistance de ces cellules souches leucémiques.

	montrent que les souris KO pour le gène Abcg2 présentent une sécrétion rénale d'acide urique
	élevée au niveau des reins mais considérablement diminuée au niveau des intestins suggérant
	ainsi que le dysfonctionnement d'ABCG2 et l'accumulation d'acide urique sont liés à la
	diminution de la sécrétion intestinale. 197
	I.1.8.2	Les maladies neurodégénératives
	diabète.	
	ABCG2 est exprimée au sein de la membrane apicale des cellules épithéliales au niveau des
	reins 160 et est capable de transporter activement l'acide urique contribuant ainsi à sa
	sécrétion. 193 Selon différentes études, des mutations au sein d'ABCG2 (Q126X et Q141K)
	seraient à l'origine d'un dysfonctionnement du transport de l'acide urique entraînant ainsi une

I.1.7.4 ABCG2 au sein des cellules souches ABCG2 est fortement exprimée au sein des cellules souches et en particulier au sein des cellules souches hématopoïétiques définissant la « side population » (SP), caractérisée par leur capacité à effluer le colorant fluorescent Hoechst 33342. Plusieurs études démontrent qu'ABCG2 est capable de transporter activement Hoechst 33342. Ainsi ABCG2 définie le phénotype SP au sein des cellules souches hématopoïétiques. 156, 186, 187 Lors de la différentiation des cellules, l'expression d'ABCG2 diminue, faisant ainsi d'ABCG2 un marqueur efficace des cellules souches. 186 De plus ABCG2 joue un rôle de protection des cellules souches. D'une part, la protéine permet de protéger les cellules contre certains agents cytotoxiques tels que la mitoxantrone. 188 D'autre part, ABCG2 participe à la survie des cellules souches en conditions d'hypoxie en permettant le transport d'hèmes (porphyrines impliquées dans le transport de l'oxygène et la respiration cellulaire au sein de l'hémoglobine) et en évitant ainsi leur accumulation délétère. 189 Néanmoins, malgré ce rôle de protection, il est intéressant de noter qu'ABCG2 n'intervient pas directement dans la fonction et la différentiation des cellules souches. 188 I.1.192 ABCG2 est également impliquée dans le transport de la riboflavine (vitamine B2) dans le lait, nutriment important dans la croissance du nourrisson. Cependant, des études montrent que des souris KO pour le gène Bcrp1 se développent correctement. 190 Le rôle physiologique d'ABCG2 au niveau de glandes mammaires reste encore en partie incompris. I.1.8. Les pathologies associées à ABCG2 I.1.8.1 La goutte La goutte est une maladie chronique liée à un taux anormalement élevé d'acide urique dans le sang (hyperuricémie). L'acide urique est l'un des déchets produit naturellement par l'organisme. Néanmoins, en cas d'excédent, il se dépose graduellement sous forme de cristaux, entre autre dans les articulations, la peau et les reins, conduisant à des arthrites inflammatoires, des néphropathies et des calculs rénaux. L'hyperuricémie est également liée à d'autres maladies telles que des maladies vasculaires, des maladies chroniques rénales et le élévation du niveau d'acide urique et donc la goutte. 194 En effet, d'après Woodward en 2009, 10% des cas de goutte seraient imputables à la variation Q141K d'ABCG2. 195 Cette mutation entraînant, comme Parmi les transporteurs ABC, pas moins de treize, dont ABCG2, sont impliqués dans le transport de lipides au sein du cerveau et contribuent ainsi à certaines maladies neurodégénératives, en particulier la maladie d'Alzheimer. L'une des caractéristiques de cette pathologie est l'accumulation et la déposition de peptides amyloïdes Beta (Aβ) sous forme de plaques séniles au sein du cerveau. Les peptides Aβ étant activement transportés à travers la barrière hémato-encéphalique, 198 de nombreuses études suggèrent l'implication des transporteurs ABC, localisés au sein des cellules endothéliales de la barrière hématoencéphalique, dans la maladie d'Alzheimer. En effet, tout comme la P-gp, ABCG2 agit tel un « gardien » empêchant les peptides Aβ de pénétrer dans le cerveau via la barrière hématoencéphalique. 199 Ce rôle fut confirmé in vitro et in vivo démontrant la capacité d'ABCG2 à restreindre l'accès des peptides Aβ du sang au cerveau tout en leur permettant d'être transportés dans le sang. 200, 201 De plus, il apparaît qu'ABCG2 est capable de contrôler le niveau de peptides Aβ. Ainsi l'altération de son expression ou de son activité fonctionnelle pourraient être à l'origine de l'agrégation de ces peptides au sein des cellules endothéliales du cerveau et donc conduire à un risque accru de développement de la maladie d'Alzheimer. 202, 203 I.1.8.3 La chimiorésistance Étant capable de transporter un grand nombre d'agents anticancéreux, tout comme les protéines P-gp et MRP1, de nombreuses études se sont portées sur le rôle joué par ABCG2 dans le phénotype MDR. Ces travaux font souvent l'objet de controverses. 204, 205 214 Ainsi ABCG2 joue un rôle important dans la formation et la prolifération des cellules souches cancéreuses. De plus, étant un marqueur de ces cellules souches, ABCG2 semble présenter de nombreuses applications potentielles dans la thérapie des cellules souches et des tumeurs. 215 I.2.

LA PROTÉINE ABCG2 COMME CIBLE BIOLOGIQUE DANS LE TRAITEMENT DE LA CHIMIORÉSISTANCE I.2.1. Inhibition de la protéine ABCG2

  

  'ayant pas encore à disposition la structure cristalline 3D d'ABCG2, une première difficulté consiste en l'impossibilité d'utiliser, à l'heure actuelle, une approche rationnelle afin de concevoir de nouveaux inhibiteurs. Une seconde difficulté provient de la large variété chimique et structurale des substrats d'ABCG2. Ainsi, afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques, il est nécessaire de cribler un grand nombre de

	molécules afin d'identifier des composés dits chefs de file et de réaliser différentes
	pharmacomodulations afin d'optimiser l'activité inhibitrice d'une part et de mieux
	comprendre les relations structure-activité d'autre part.
	I.2.2.	Inhibiteurs connus d'ABCG2
	Plusieurs approches thérapeutiques peuvent être utilisées afin d'inverser le phénotype MDR
	liés aux transporteurs ABC. ABCG2 étant l'un des transporteurs impliqués dans ce
	phénomène, l'une de ces stratégies consiste à bloquer l'efflux d'agents anticancéreux afin

Comme nous l'avons vu dans le chapitre précédent, la chimiorésistance est actuellement un problème majeur auquel se heurtent les traitements chimiothérapeutiques. Il devient ainsi urgent de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées, alternatives ou complémentaires aux traitements actuels. d'augmenter leur concentration intracellulaire et donc leur efficacité. Ainsi l'association d'un inhibiteur d'ABCG2 à un agent anticancéreux permettra de rendre à nouveau sensibles les cellules cancéreuses au traitement et ainsi de potentialiser l'effet du médicament. NDepuis sa découverte, différentes générations d'inhibiteurs d'ABCG2, de structures chimiques très différentes, ont été mis au point

De nombreux inhibiteurs de la protéine P-gp s'avérant inhiber également ABCG2, l'une des premières stratégies mise en place a été le développement de nouveaux inhibiteurs spécifiques et non compétitifs d'ABCG2 à partir d'inhibiteurs connus de la P-gp. Il s'agit des inhibiteurs de première génération. En effet, les études de l'élacridar (GF120918) et du tariquidar (XR9576) ont révélé que ces inhibiteurs connus de la P-gp étaient également capables d'inhiber ABCG2.

216 

On peut également citer d'autres inhibiteurs tels que la cyclosporine A, le tacrolimus ou le sirolimus, agents immunosuppresseurs découverts en 1970 (Figure

22

).

101, 

La combinaison de 10 mg/kg de MBL-II-141 avec l'irinotécan bloque complètement la croissance de 90% de tumeurs fraîchement implantées (Figure 33).

  

	Pour finir, l'effet du MBL-II-141 sur l'hydrolyse de l'ATP a été étudié sur des membranes
	cellulaires d'insectes Sf9 surexprimant ABCG2. Tout comme le Ko143, le MBL-II-141 est
	capable d'inhiber l'activité ATPasique couplée, activité stimulée par la présence de
	quercétine. Mais il a également été observé que ce composé est capable d'inhiber l'activité
	ATPasique basale, activité mesurée sans transport de substrat.
	A l'issue de ces résultats in vitro prometteurs, le MBL-II-141 s'est révélé être un excellent
	candidat pour des études in vivo 240 et a été testé sur des souris SCID xénogreffées par des
	cellules humaines résistantes à ABCG2.

Travaux personnels : conception, synthèse et évaluation biologique de nouveaux inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques d'ABCG2 II.1. OBJECTIFS DES TRAVAUX PERSONNELS

  

	Cette expérience démontre bien l'efficacité du MBL-II-141 à potentialiser à nouveau l'effet
	d'un anticancéreux sur une lignée chimiorésistante en milieu biologique. L'ensemble de ces
	données pharmacologiques font du MBL-II-141 le meilleur inhibiteur mis au point à ce jour
	et un bon candidat pour le développement clinique. Cependant, malgré ces résultats II.
	prometteurs, le MBL-II-141 présente des problèmes d'hydrosolubilité. Il est ainsi nécessaire
	de poursuivre son étude afin de tenter d'améliorer ses propriétés physico-chimiques et
	pharmacocinétiques.
	Comme nous l'avons vu précédemment, le MBL-II-141 est le meilleur inhibiteur d'ABCG2
	mis au point à ce jour. Il est ainsi intéressant de poursuivre et d'approfondir les études de
	relations structure-activité de cette structure afin d'optimiser son activité biologique ainsi que
	ses propriétés physico-chimiques et pharmacocinétiques. De plus, aucune structure
	cristallographique d'ABCG2 n'étant encore disponible, empêchant ainsi toute étude in silico,
	les informations apportées par l'étude approfondie du comportement des analogues du MBL-
	II-141 vis-à-vis de la protéine permettront d'enrichir l'étude fondamentale de la protéine et de
	proposer de nouvelles hypothèses quant aux mécanismes d'inhibition mis en jeu.
	). 240

II.2. CHOIX DES MOLÉCULES À SYNTHÉTISER

  

	-	la présence d'un motif tryptamine, montrant des résultats bien plus efficaces que des
	groupements tels que la phénylpipérazine, la pyridylpipérazine, la benzylpipérazine ou le
	diméthoxyphényle.
	Une première étude de relations structure-activité, réalisée antérieurement au laboratoire 238 et
	conduisant à la découverte du MBL-II-141, a d'ores et déjà permis d'identifier trois éléments
	structuraux nécessaires à une inhibition maximale :
	-	la présence d'un motif chromone, présentant une inhibition 2 à 3 fois plus efficace
	que les motifs flavones, acridones, boeravinones ou d'autres types de flavonoïdes ;
	-	un groupement para-bromobenzyloxy porté par la chromone. En effet, la taille et
	l'hydrophobicité de ce groupement semblent constituer des critères importants pour
	l'inhibition d'ABCG2 et en particulier pour la cytotoxicité. Un groupement hydrophobe et de
	taille raisonnable semble convenir pour la substitution présente sur le groupement benzyle ;

). II.3. SYNTHÈSE DES ANALOGUES DU MBL-II-141 II.3.1. Re-synthèse du MBL-II-141 La synthèse du MBL-II-141, mise

  

	inhibitrice d'ABCG2, nous avons décidé de moduler sa nature et sa position sur l'indole afin
	d'en étudier l'impact sur le profil pharmacologique. Le groupement méthoxy fut remplacé par
	un hydrogène, puis des groupements hydroxy, éthyloxy, propyloxy et isopropyloxy. Le
	groupement méthoxy fut également déplacé en position 6 de l'indole (pharmacomodulation
	3). De plus, nous avons jugé opportun d'étudier l'influence du caractère donneur/accepteur
	des liaisons N-H en méthylant les azotes indolique et amidique de notre chef de file
	(pharmacomodulation 4).
	Pour finir, la chaîne centrale du MBL-II-141 a également été l'objet de certaines modulations
	telles que l'introdution de cycles triazoliques différemment substitués, souvent utilisés en
	chimie médicinale (pharmacomodulation 5). L'amide central a également été remplacé par
	une fonction amine tertiaire afin d'étudier son influence sur l'inhibition d'ABCG2
	(pharmacomodulation 6). Puis un dernier jeu de pharmacomodulations a consisté en
	l'introduction de différents motifs acides aminés, tels que la valine, la leucine et l'isoleucine,
	Introduction d'un motif acide aminé dans la partie centrale de nos composés (pharmacomodulation 7au point et utilisée depuis plusieurs années au
	laboratoire, 238 se divise en 4 étapes à partir de la 2,6-dihydroxyacétophénone commerciale.
	Elle présente un rendement global de 19% (

Schéma réactionnel 1). Schéma réactionnel 1 : Synthèse du MBL-II-141.

  

	d'HOBt hydraté n'a pas d'influence sur la valeur du rendement d'amidification. Néanmoins,
	nous verrons plus tard que d'autres conditions sont excellentes pour le couplage entre l'acide
	3 et certaines amines, non dérivées de tryptamine.			
	Agents de couplages	Base	Solvant Rendement
	Chlorure de Bis (2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphonique (BOP-Cl)	Et3N	DMF	30%
	Tétrafluoroborate de N,N,N′,N′-Tétraméthyl-O-(benzotriazol-1-yl)uronium (TBTU)	DIEA	DMF	24%
	EDCI, isonitrosocyanoacétate d'éthyle a	Et3N	DMF	50%
	Tableau 4 : Essais de couplage peptidique entre l'acide 3 et le chlorhydrate de la 5-méthoxytryptamine. a Ce
	réactif remplace HOBt anhydre qui n'est plus disponible à l'heure actuelle chez les fournisseurs classiques.
	la fonction carbonyle permet d'expliquer la formation du produit mono-alkylé seul. Ce dérivé
	alkylé 1 est ensuite condensé avec l'oxalate de diéthyle en présence d'éthanolate de sodium,
	généré in situ par action du sodium dans l'éthanol anhydre, puis déshydraté en milieu acide
	afin de former l'ester 2, hétérocycle de la famille des chromones, avec un rendement de
	69%. 242, 243 Le groupement éthoxycarbonyle porté en position 2 de la chromone est ensuite
	saponifié par action d'hydrogénocarbonate de sodium à reflux afin de fournir l'acide
	carboxylique 3 avec un rendement de 90%. Pour finir l'acide 3 est engagé dans une réaction
	de couplage peptidique avec le chlorhydrate de la 5-méthoxytryptamine en présence
	d'hydroxybenzotriazole (HOBt), de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDCI)
	et de triéthylamine dans le DMF afin d'obtenir le MBL-II-141 avec un rendement de 45%. 244
	Nous avons tenté d'améliorer ce dernier rendement par plusieurs essais d'amidification avec
	différents agents de couplages (Tableau 4). Cependant, nous ne sommes pas parvenus à
	l'optimiser de manière significative. Nous avons donc choisi de conserver ces conditions
	classiques d'amidification (HOBt, EDCI et triéthylamine dans le DMF) lors des réactions de
	couplage réalisées entre les dérivés de l'acide 3 et les dérivés de la tryptamine. L'utilisation

La 2,6-dihydroxyacétophénone subit dans un premier temps une mono-alkylation par action du carbonate de potassium en présence de 1,2 équivalents du bromure de para-bromobenzyle dans l'acétone.

241 

Cette étape nécessite l'ajout de bromure de tétrabutylammonium jouant le rôle de catalyseur de transfert de phase. La chélation d'une fonction phénol avec l'oxygène de

II.3.3. Synthèse des analogues issus de la pharmacomodulation 2

  

	47% et 70%. Pour finir, ces acides sont soumis à une réaction de couplage peptidique en
	présence du chlorhydrate de la 5-méthoxytryptamine à température ambiante dans le DMF
	pour conduire à la formation des composés finaux 7a et 7b avec des rendements de 41% et
	45%. Les composés 7a et 7b ont finalement été obtenus avec des rendements globaux
	respectivement de 2,3% et 23% sur les 4 étapes.
	2,4-
	dihydroxyacétophénone pour le composé 7b. La première étape d'alkylation est réalisée dans
	les conditions classiques et fournit les dérivés mono-alkylés 4a et 4b avec des rendements de
	40% et 87%. Ces dérivés mono-alkylés sont ensuite soumis à la réaction de cyclisation décrite
	précédemment pour le MBL-II-141 pour conduire aux hétérocycles souhaités 5a et 5b avec
	des rendements de 30% et 80%. L'hydrolyse de l'ester est réalisée dans les conditions
	classiques et permet l'obtention des acides carboxyliques 6a et 6b avec des rendements de

MBL-II-141, à partir des bromures de benzyle ou chlorures de benzyle commerciaux correspondants. L'étape d'alkylation a ainsi été réalisée dans les conditions classiques et a permis d'obtenir les dérivés mono-alkylés 8a à 8f souhaités avec des rendements compris entre 27% et 73%. Puis l'étape de cyclisation a

  

	Remarque : lors de l'étape de couplage peptidique conduisant à la synthèse du composé 11e,
	nous avons utilisé, à la place de l'HOBt, l'isonitrosocyanoacétate d'éthyle, également appelé
	Oxyma Pure.
	permis d'obtenir les dérivés 9a à 9f correspondant avec des rendements compris entre 18% et
	87%. La saponification réalisée dans les mêmes conditions que le MBL-II-141 a conduit à la
	synthèse des acides carboxyliques désirés 10a à 10f avec des rendements de 47% à 79%. Pour
	finir, l'étape de couplage peptidique a été conduite en suivant les conditions classiques.
	Différents essais de purification ont été entrepris pour les composés finaux. Certains ont été
	lavés avec de l'éther diéthylique, d'autres purifiés sur colonne ou encore recristallisés. En
	effet, les analogues 11c et 11f ont été recristallisés dans l'acétonitrile conduisant à de très
	faibles rendements (respectivement 7% et 5%). Ainsi les rendements globaux des composés
	11a à 11f sont compris entre 0,2% et 17% sur les 4 étapes de synthèse.

Schéma réactionnel 7 : Synthèse des composés 19a et 19b.

  

					5-méthoxytryptamine mono-méthylés
	sur l'amine primaire (composés 19a et 19b), il est nécessaire, lors d'une première étape,
	d'introduire un groupement éthoxycarbonyle par action du chloroformiate d'éthyle en
	présence de triéthylamine dans le dichlorométhane à température ambiante. 245 Puis les
	carbamates 18a et 18b sont réduits par action de l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium
	dans le THF à reflux afin d'obtenir les composés mono-méthylés 19a et 19b avec des
	rendements respectifs de 72% et 80% (Schéma réactionnel 7). 246	
					O	
	NH 2 .HCl		O	HN	O	HN
	R 1	Cl	O Et 3 N	R 1	LiAlH 4	R 1
	N H	CH 2 Cl 2 25°C	N H	THF Reflux	N H
				R 1 = H (18a, 90%)		R 1 = H (19a, 72%)
				R 1 = OCH 3 (18b, 90%)	R 1 = OCH 3 (19b, 80%)
	Afin d'obtenir les dérivés de la tryptamine et de la 5-méthoxytryptamine mono-méthylés sur
	l'azote indolique (composés 22a et 22b), il est nécessaire dans un premier temps de protéger
	l'amine primaire (étape 1). Pour cela, différents groupements protecteurs (GP) peuvent être
	utilisés tels que le groupement tert-butyloxycarbonyle (BOC) 247 ou le groupement acétyle.
	Une seconde étape consiste à méthyler l'azote indolique en milieu basique (étape 2).
	Différents agents méthylant peuvent être employés, tels que l'iodométhane ou le diméthyle
	sulfate. Pour finir, la déprotection permet d'obtenir les amines primaires souhaitées (étape 3)
	(Schéma					

réactionnel 8). Schéma réactionnel 8 : Méthylation de l'azote indolique (GP = Groupement Protecteur). Le Tableau 5 décrit l'ensemble des conditions utilisées ainsi que les rendements obtenus pour la synthèse des analogues 22a et 22b.

  

	formation du composé 20b avec un rendement de 59%. Ce composé a ensuite été méthylé en
	présence d'iodométhane et d'hydroxyde de sodium dans les conditions décrites
	précédemment pour former le composé 21b avec un rendement de 62%. La déprotection est
	ensuite réalisée en milieu basique par action d'hydroxyde de sodium à reflux dans un mélange
	éthanol/eau afin de former le composé 22b avec un rendement de 56%.		
			ÉTAPE 1 -Protection	ÉTAPE 2 -Méthylation	ÉTAPE 3 -Déprotection
	R1	GP	Conditions Rendement	Agent méthylant	Conditions	Rendement Conditions Rendement
	H	BOC	Et3N CH2Cl2 25°C	99% (20a)	Me2SO4	NaOH/TBAB CH2Cl2 25°C	41% (21a)	TFA CH2Cl2 25°C	23% (22a)
	OCH3 Acetyl	K2CO3 EtOAc/H2O 25°C	59% (20b)	CH3I	NaOH/TBAB CH2Cl2 25°C	62% (21b)	NaOH EtOH/H2O Reflux	56% (22b)
	Tableau 5 : Conditions utilisées pour la synthèse des dérivés N-méthylés de la tryptamine 22a et de la 5-
	méthoxytryptamine 22b. GP = Groupement Protecteur.				
	Ainsi le composé 22a a été obtenu à partir de la tryptamine sous forme de base libre, protégée
	par un groupement BOC par action de l'anhydride de BOC en présence de triéthylamine dans
	le dichlorométhane afin d'obtenir le composé 20a. Ce dérivé a ensuite été méthylé par action
	du diméthylsulfate dans le dichlorométhane en présence d'hydroxyde de sodium et d'un
	ammonium quaternaire afin de conduire au composé 21a avec un rendement de 41%. Ce
	dernier est ensuite déprotégé dans les conditions classiques par action de l'acide
	trifluoroacétique afin d'obtenir l'amine primaire 22a avec un rendement de 23%. 248	
	Le composé 22b a quant à lui été obtenu à partir du chlorhydrate de la 5-méthoxytryptamine,
	N-acétylé selon une variante de la réaction de Schotten-Baumann : l'amine basique du dérivé
	tryptamine, libérée in situ par action du carbonate de potassium dans un milieu biphasique
	(eau/acétate d'éthyle) est amidifiée par le chlorure d'acétyle à 0°C pour conduire à la

réactionnel 14 : Synthèse des dérivés 35a, 35b et 35c.

  

	Une première étape consiste à coupler l'acide 3 avec les esters des acides aminés
	commerciaux en présence de TBTU et de DIEA dans le DMF. Ces conditions de couplage,
	différentes de celles utilisées pour les autres analogues du MBL-II-141, conduisent aux
	composés 33a à 33d avec des rendements compris entre 79% et 95%. Les esters obtenus sont
	ensuite hydrolysés par action de l'hydroxyde de lithium dans un mélange méthanol/eau/THF
	afin de conduire aux acides correspondants 34a à 34c avec des rendements compris entre 32%
	et 72%. Pour finir ces acides carboxyliques sont eux-mêmes couplés avec la 5-
	méthoxytryptamine de nouveau en présence de TBTU et DIEA dans le DMF pour fournir les
	composés finaux 35a à 35c avec des rendements compris entre 7% et 29%.
	Au total, 38 composés ont été synthétisés et testés au sein de l'Institut de Biologie et de
	Chimie des Protéines (IBCP) de l'Université Lyon 1. Les résultats et analyses de ces tests sont
	décrits dans les paragraphes suivants.
	29%)
	R' = CH(CH 3 )CH 2 CH 3, 35c (7%)

R

Schéma

II.

4. ÉVALUATION BIOLOGIQUE DES NOUVEAUX ANALOGUES DU MBL-II-141 II.4.1. Procédés d'évaluation biologique des analogues du MBL-II-141

  

	Les différents tests biologiques ont été effectués à l'IBCP de Lyon au sein de l'équipe
	« Mécanisme et modulation de la résistance aux médicaments » dirigée par le Dr. Attilio Di
	Pietro. Ces tests ont été réalisés sur les lignées cellulaires HEK293 issues de cellules
	embryonnaires de rein humain (Human Embryonic Kidney) transfectées, soit avec le vecteur
	vide (HEK293-pcDNA3.1, appelées cellules sensibles), soit avec le vecteur contenant le gène
	codant pour ABCG2 (HEK293-ABCG2, appelées cellules résistantes). Certains de ces
	composés ont également été testés sur les lignées cellulaires H460 issues de cellules de cancer
	du poumon humain à grandes cellules (contrôle) et les cellules sélectionnées H460MX
	surexprimant ABCG2 et résistantes à la mitoxantrone. Différents tests ont été effectués afin
	de déterminer l'activité d'inhibition du transport de la mitoxantrone, leur cytotoxicité, leur
	sélectivité vis-à-vis d'ABCG2 et pour finir leurs activités ATPasiques.

II.4.1.4 Détermination des activités ATPasiques

  

	Comme
	précédemment, la fluorescence intracellulaire correspondant à la quantité de substrat non
	efflué a été déterminée par cytométrie de flux. Les pourcentages d'inhibition ont été calculés
	par rapport aux inhibiteurs de référence de la P-gp (5 µM d'élacridar) et de MRP1 (35 µM de
	vérapamil).
	Les transporteurs ABC utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP afin d'assurer leur
	fonction de transporteur. Cette réaction implique une molécule d'ATP et une molécule d'eau
	pour conduire à la production d'une molécule d'ADP et d'une molécule de phosphate
	inorganique (Pi). Ainsi, la quantification du phosphate inorganique libéré après un temps
	donné d'incubation permet de déterminer la vitesse de réaction correspondant à l'activité du
	transporteur. Le phosphate inorganique (Pi) pouvant réagir avec le molybdate d'ammonium
	afin de produire une intense coloration détectable par UV, cette mesure est donc un moyen
	fiable pour détecter les interactions existantes entre différents composés et la protéine ABCG2

II.4.2. Relations structure-activité (RSA) issues de la pharmacomodulation 1 : modulation de la position du groupement para-bromobenzyloxy porté par la chromone

  

		. Après une
	incubation de 30 minutes à 37°C, le phosphate inorganique est révélé par un mélange
	molybdate d'ammonium/acide ascorbique (1:4) et l'absorbance est mesurée à 880 nm (valeur
	d'absorbance du composé bleu formé) après 30 minutes à 25°C. Cette réaction permet de
	mesurer la quantité de phosphate libéré pendant l'hydrolyse de l'ATP issu de l'activité du
	transporteur. Une gamme de phosphate effectuée dans les même conditions permet
	d'extrapoler la concentration en phosphate inorganique de chaque échantillon et donc de
	mesurer l'activité ATPasique du transporteur. Les résultats sont exprimés en nmoles de
	phosphate libéré par mg de protéines et par minutes.
	A l'issue de cette expérience, deux activités ATPasiques sont déterminées :
	-	l'activité ATPasique basale qui constitue l'activité ATPasique observée sans
	transport de substrat ;
	-	l'activité ATPasique couplée observée en présence de 0,2 µM de quercétine, substrat
	d'ABCG2.
	Les résultats biologiques issus de ces différents tests pour chacune des pharmacomodulations
	réalisées sont détaillés dans les paragraphes suivants.
	Une première pharmacomodulation envisagée dans le cadre de ce projet a été le déplacement
	du groupement porté par la chromone en position 6 (composé 7a) et en position 7 (composé
	7b) (Figure

Tableau 7. Référence % Activité ATPasique basale Inhibition activité ATPasique couplée EC50 (µM) MBL-II-141

  

	La sélectivité du composé 7a a également été évaluée et tout comme le MBL-II-141, ce
	composé est sélectif pour ABCG2. En effet, à 1 et 5 µM, il n'est pas capable d'inhiber
	l'activité d'efflux ni de la rhodamine 123 via la P-gp, ni de la calcéine-AM via MRP1 (valeurs
	de pourcentage d'inhibition obtenues proche de 0).	
	Les activités ATPasiques basale et couplée obtenues pour les composés 7a et 7b sont
	présentées dans le 62 ± 17	0,38
	Ko143	26 ± 32	0,17
	Quercetine	420 ± 24	/
	Nilotinib	323 ± 4	/
	Prazosine	243 ± 24	/
	7a	92 ± 4	0,53
	7b	211 ± 24	0,01
	Tableau 7 : Activités ATPasiques basale et couplée des composés 7a et 7b. L'activité ATPasique basale est
	mesurée également pour MBL-II-141, Ko143 et différents substrats transportés : quercétine (2 µM), nilotinib
	(0,1 µM) et prazosine (20 µM).		
	Il est intéressant de noter que le déplacement du groupement benzyloxy en position 6
	(composé 7a) induit une baisse de l'inhibition de l'activité ATPasique basale en accord avec
	le fait que l'on observe une légère baisse de l'EC50 pour l'efflux de la mitoxantrone. En
	revanche, son déplacement en position 7 entraîne une stimulation de l'activité ATPasique
	basale (2,1 fois), de manière similaire à des substrats transportés tels que la quercétine (4,1
	fois), le nilotinib (3,2 fois) ou la prazosine (2,4 fois). À ceci vient s'ajouter le fait que le
	composé 7b présente une inhibition de l'activité ATPasique couplée beaucoup plus forte que
	celle observée pour le MBL-II-141, le Ko143 ou le composé 7a, avec une EC50
	respectivement 38, 17 et 53 fois plus faible. Ces résultats peuvent être corrélés au profil de
	substrat et non d'inhibiteur du composé 7b bien qu'aucune preuve concrète n'a pu permettre
	de prouver ou non le transport du composé 7b via ABCG2.	

II.4.3. RSA issues de la pharmacomodulation 2 : modulation de la nature et de la position du groupement sur le cycle benzyloxy II.4.3.1 Résultats antérieurs

  

	Comme nous l'avons déjà abordé dans les paragraphes précédents, la comparaison des
	analogues du MBL

-II-141 modulés

  en para du cycle benzyloxy tend à montrer l'importance d'un atome de brome sur cette position (Tableau

8). 238 Référence R EC50 (µM) Cytotoxicité IG50 (µM)

  

	Chromone 6f	H	0,18	35
	MBL-II-141	Br	0,13 ± 0,09	>100

Tableau 8 :

 8 Études antérieures de modulation de la nature de la substitution en para du groupement benzyloxy.

	Activités inhibitrices (EC50) correspondantes (Inhibition de l'efflux de la mitoxantrone au sein de cellules
	transfectées surexprimant ABCG2) et étude de la cytotoxicité. Résultats issus des travaux de Valdameri. 239
	À la lecture de ces résultats,

alors que le MBL-II-141 et le composé 6f sont équivalents en termes d'inhibition du transport de la mitoxantrone

  

, l'introduction du brome permet de réduire considérablement la cytotoxicité. La présence d'un halogène étant bénéfique pour les caractéristiques pharmacochimiques, nous avons jugé opportun d'étudier l'influence et la position de l'halogène sur le groupement benzyloxy.

.2. MATÉRIEL ET MÉTHODES III.2.1. La base de données

  Afin de réaliser ce travail de modélisation moléculaire, une base de données de composés nous a été fournie par nos collaborateurs biologistes de l'IBCP de Lyon. Cette base de

données est constituée de 162 composés capables de stimuler l'activité ATPasique basale (Site 3) et de 25 composés capables d'inhiber l'activité APTasique basale (Site 4). Les composés interagissant avec le site 3 sont des bis-chalcones symétriques, 235 des chalcones, 230, 257 des chromones, 238 des hydroxyindénoindoles 256 et des chalcones possédant des groupements quinoxalines. 234 Les structures des différentes familles de composés utilisés sont regroupées dans la Figure 63. Ces composés sont numérotés de 1s à 157s, la lettre « s » faisant référence à « Stimulateur » de l'activité ATPasique basale.

  Afin d'extraire, de rationaliser et d'interpréter les informations obtenues par ces descripteurs, VolSurf+ met à disposition des outils statistiques, utilisés en chimiométrie, tels que l'analyse en composantes principales (PCA, Principal Component Analysis) ou la régression par les moindres carrés partiels (PLS, Partial Least Squares).

		la taille et la forme moléculaire ;
	-	la description des régions hydrophiles et hydrophobes ;
	-	les moments amphiphiles, la balance hydrophile-lipophile ;
	-	la diffusivité moléculaire, la solubilité, la flexibilité moléculaire ;
	-	des modèles ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme et Excrétion) ;

Tous les détails concernant ces 128 descripteurs sont regroupés en annexe II.

o

  Validation du pharmacophore par le criblage virtuelUne fois le pharmacophore obtenu, il est nécessaire de le valider à l'aide d'un criblage virtuel. Un criblage virtuel est une procédure au cours de laquelle des structures candidates

	sont comparées à un modèle (pharmacophore ou récepteur biologique) afin de générer un
	degré de similarité, obtenu pour chaque sonde ou descripteur pris individuellement (H, DRY,
	O, N1) ou leur combinaison (ex : H*O*N1). Ces degrés de similarité correspondent au probe
	score décrit précédemment, c'est-à-dire au degré de superposition des champs d'interaction
	moléculaire correspondant à chaque descripteur (ou à leur combinaison) entre, cette fois-ci
	une molécule candidate et le modèle pharmacophore. Ces degrés de similarité sont ensuite
	utilisés afin de classer les molécules de la plus similaire à la moins similaire au modèle. Un

criblage virtuel permet ainsi de vérifier si le modèle est capable ou non de discriminer les structures candidates selon le profil recherché et selon quel(s) descripteur(s). Afin de valider un modèle pharmacophore, un criblage virtuel est effectué sur une base de données nommée training set, consituée de molécules actives connues et de molécules dites « leurres » ou inactives envers la cible étudiée. Chaque criblage pourra être réalisé en mode « champs », c'est-à-dire par superposition des champs d'interaction moléculaire ou bien en mode « pseudo-champs » par superposition des pseudo-champs d'interaction moléculaire. À l'issue du criblage, une courbe appelée « enrichment plot » est obtenue pour chaque descripteur. Cette courbe représente le pourcentage de vrais positifs (axe des ordonnées) en fonction du pourcentage de faux positifs (axe des abscisses) pour une certaine série d'objets ordonnés.

Stimulation de l'activité ATPasique basale » -Site 3

  La seconde étape de ce travail a été la réalisation des modèles pharmacophoriques à partir de chacune des bases de données sélectionnées par le logiciel FLAP. Afin de créer un modèle pharmacophorique, il est nécessaire de générer dans un premier temps les bases de données au sein de FLAP. FLAP est capable de générer l'ensemble des conformations, formes stéréoisomères et tautomères et états de transition (grâce au logiciel MoKa, 267, 268 incorporé au sein de FLAP) de chaque composé inclu dans la base de données mais également leurs MIFs.Pour la création de nos bases de données, les dix tautomères à pH 7,4 de chaque composé ont été utilisés. Les analyses conformationnelles ont été réalisées, de manière aléatoire, en

	5S	3_1S	3_2S
			3
	3_3S	5S_VolSurf	3S_VolSurf
	Site « Inhibition de l'activité ATPasique basale » -Site 4	
	5I	3_1I	3_2I
	3_3I	5I_VolSurf	3I_VolSurf
	Tableau 24 : Représentation des pharmacophores correspondant à chacune des bases de données générées. Les
	points blancs représentent les points pharmacophoriques hydrophobes, les points rouges représentent les points
	pharmacophoriques liaison hydrogène-accepteur et les points bleus représentent les points pharmacophoriques
	liaison hydrogène-donneur.		
	Une fois ces modèles générés, il est maintenant indispensable de sélectionner et de valider un
	unique pharmacophore pour chacun des deux sites. Ceci est rendu possible grâce à un criblage
	virtuel.		

choisissant 50 conformères par molécules, éliminant ceux possédant un RMSD (Root Mean Square Deviation, mesure de la distance moyenne entre les atomes de deux molécules superposées) inférieur à 0,2 Å l'un de l'autre. Pour la génération des MIFs, les sondes GRID choisies sont H, DRY, N1 et O avec une résolution de 0,75 Å pour la forme de la grille. L'étape suivante consiste en la construction des modèles pharmacophoriques à partir de chacune des bases de données créées. Ainsi au total, 6 modèles pharmacophoriques ont été générés pour chacun des sites (Tableau 24). Site « III.3.

3. Comparaison et sélection des meilleurs modèles pharmacophores

  Afin de choisir et de valider un pharmacophore pour les sites 3 et 4, il est nécessaire de réaliser un criblage virtuel. Un criblage basé sur les pharmacophores générés a été réalisé sur une base de données de composés actifs et inactifs connus (training set). Ceci nous a ainsi permis de vérifier si nos pharmacophores étaient capables de distinguer les composés du site 3 et du site 4 et de sélectionner le meilleur modèle parmi les 6 générés pour chaque site.

	III.3.3.

1 Mise au point de la base de données utilisée pour le criblage (training set)

  Afin de réaliser le criblage virtuel, il était nécessaire de mettre en place une base de données Le criblage virtuel de la librairie « training set » a été réalisé pour chacun des six modèles pharmacophores générés pour le site 3 afin de déterminer lequel est capable de discriminer au mieux les composés du site 3 des composés du site 4.

	Dans ce cas, les composés appartenant au site 3 ont été caractérisés comme « actifs » et les
	composés appartenant au site 4 comme « leurres » ou « inactifs ».

constituée d'inhibiteurs actifs d'ABCG2 appartenant au site 3 ainsi qu'au site 4. Parmi les 25 composés appartenant au site 4 disponibles, 19 se révèlent être des inhibiteurs actifs d'ABCG2 (EC50 ≤ 1,5 µM). Parmi les 39 inhibiteurs actifs d'ABCG2 appartenant au site 3, 19 ont ainsi également été sélectionnés par le logiciel VolSurf+. Les 38 composés formant le training set sont décrits en annexe III. III.3.3.2 Criblage virtuel basé sur le pharmacophore Lors de la réalisation d'un criblage virtuel, il est possible d'ajouter des contraintes au pharmacophore afin d'imposer, lors du criblage, une ou deux caractéristiques au modèle. En effet, certains points pharmacophoriques sont conservés entre les différents modèles pour un même site. Il est donc intéressant d'imposer ces points dans la recherche du meilleur modèle. o Sélection du pharmacophore du site 3

  De ces valeurs, nous pouvons conclure que le modèle capable de prédire le plus grand nombre de composés actifs (appartenant au site 3) est le modèle 3S_VolSurf / 1_accepteur. En effet, ce modèle présente des AUC égales à 0,94/0,93 et est capable de prédire correctement 58%/63% des composés actifs du training set respectivement pour le mode champs avec pour descripteur H*DRY et pour le mode pseudo-champs avec pour descripteur DRY.

	-	pour chaque modèle, les paramètres associés aux meilleures conditions sont les
		paramètres O, N1 et H. Ceci suppose ainsi que des propriétés de formes et de polarité
		caractérisent la cavité du site 4.
	D'après les résultats obtenus par le criblage virtuel, six modèles présentent des valeurs d'aire
	sous la courbe supérieures à 0,90% :
	La représentation du modèle pharmacophore choisi par le logiciel de visualisation moléculaire -5I sans contrainte ;
	PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3 Schrödinger, LLC) est -5I avec pour contrainte 19_accepteur ;
	présentée Figure 73. -5I avec pour contrainte 20_accepteur ;
	-	3I_1 sans contrainte ;
	-	3I_1 avec pour contrainte 1_accepteur ;
	-	3I_2 sans contrainte.
	Tout comme pour le site 3, il est possible d'ajouter des contraintes au pharmacophore afin
	d'imposer, lors du criblage, une ou deux caractéristiques au modèle. Contrairement au site 3,
	moins de points sont conservés entre les modèles pharmacophores. Ainsi pour chaque modèle,
	toutes les contraintes correspondant aux points liaisons hydrogène donneur/accepteur ont été
	testées. Les résultats de l'ensemble des criblages réalisés pour le site 4 sont résumés dans le
	tableau B en annexe IV.

Figure 73 : Représentation sur PyMOL du pharmacophore sélectionné 3S_VolSurf / 1_accepteur en mode pseudo-champs (contrainte sélectionnée entourée en rouge). Les points orange représentent les points pharmacophoriques accepteurs (O), le point rose représente le point pharmacophorique donneur (N1) et les points bleus représentent les points pharmacophoriques hydrophobes (DRY). o Sélection du pharmacophore du site 4 Un criblage virtuel a été réalisé pour chacun des six pharmacophores générés pour le site 4 afin de déterminer lequel était capable de discriminer au mieux les composés du site 4 des composés du site 3. D'après ces résultats, nous pouvons déduire que : -les contraintes localisées au niveau des sites accepteurs conduisent à de meilleurs résultats que les contraintes localisées au niveau des sites donneurs ; Le Tableau 26 rassemble les résultats obtenus pour chacun de ces modèles, observés pour les modes champs et pseudo-champs. Pour chacun des modèles sont attribuées les valeurs des aires sous la courbe (AUC), les pourcentages de composés actifs correctement prédits par chaque modèle (% (vrai positifs)), le meilleur descripteur ainsi que le score probe correspondant.

  D'après ces valeurs, il apparaît clairement que l'un des modèles de choix capable de prédire le plus grand nombre de composés actifs (appartenant au site 4) est le modèle 5I / 20_accepteur en ce qui concerne le mode champs. En effet, ce modèle présente une AUC égale à 0,95 et est capable de prédire correctement 95% des composés actifs du training set. Il est nécessaire d'étudier plus en détails ce modèle afin de déterminer la crédibilité de ces résultats. En effet, comme on peut le voir, le score probe correspondant au descripteur H*O*N1 est de 0,064.

	Ainsi la variation des résultats est de l'ordre du centième. Une modification au centième
	n'étant pas significative, le modèle H*O*N1 peut être considéré comme un artefact.
	Deux autres paramètres conduisent également à de bons résultats à partir de ce modèle :
	N1*O et Glob*Prod. Les résultats associés à ces différents paramètres sont résumés dans le
	Tableau 27.				
	Modèle	Descripteur	AUC	% (vrais positifs)	Probe Score
		H*O*N1	0,95	95%	0,064
	5I 20_accepteur	N1*O	0,90	37%	0,140
		Glob-Prod	0,89	74%	0,306

Tableau 27 : Les trois meilleurs paramètres issus du criblage du modèle 5I / 20_accepteur en mode champs d'interaction.

4. Criblages virtuels basés sur les pharmacophores et sélection des composés pour les tests in vitro

  Les deux modèles pharmacophores étant désormais choisis pour chacun des sites, l'étape suivante consiste à réaliser un criblage sur une large banque de données (SPECS) afin de sélectionner les composés les plus actifs selon chaque modèle et tester ces derniers in vitro.Afin de valider nos modèles et de vérifier leur prédictibilité, les composés sélectionnés, identifiés à partir des modèles pharmacophores comme appartenant à chacun des deux sites, seront testés in vitro par nos collaborateurs biologistes de l'IBCP de Lyon afin de déterminer

	Site 3	Site 4
	Pharmacophore	
	Forme du pharmacophore (sonde H)	
	Interactions hydrophobes (sonde DRY)	
	Interactions hydrogène-donneur (sonde N1)	
	Interactions hydrogène-accepteur (sonde O)	

Figure 76 : Comparaison des champs d'interaction moléculaire entres les deux modèles pharmacophores des sites 3 et 4.

III.3.

leur activité ATPasique basale dans un premier temps, puis leur inhibition de l'activité de transport d'ABCG2. Ces résultats nous permettront ainsi de valider ou non nos pharmacophores.

III.3.4.1 Base de données utilisée

La banque de données SPECS est une banque de données de composés disponibles commercialement et couvrant une large diversité structurale (www.specs.net, 15/01/15). Cette banque de données, de taille conséquente, a été pré-filtrée à l'aide du logiciel FLAP, en prenant en compte la masse molaire. En effet, l'ensemble des composés actifs à notre disposition et appartenant au site 3 présente une masse moléculaire comprise entre 400 et 600 g.mol -1 tandis que les composés appartenant au site 4 présentent une masse molaire comprise entre 300 and 650 g.mol -1 . Nous choisirons ainsi ces mêmes limites pour nos criblages. Ainsi, à l'issue de ces pré-filtrages, une base de données de 197478 composés a été utilisée pour être criblée virtuellement en utilisant comme modèle chacun des deux pharmacophores sélectionnés pour chaque site. Les formes protomères d'abondance inférieure à 20% à pH 7,4 ont été supprimées de la banque de données dans le but d'accélérer le criblage.

III.3.

4.2 Sélection du set de composés pour le site 3 Le

  

	L'ensemble des structures se trouve en annexe V.		
	En comparant les composés sélectionnés, nous remarquons que trois composés sont en
	commun entre les deux criblages virtuels effectués. Ces trois molécules seront ainsi
	sélectionnées pour les tests in vitro.		
	De plus, après une inspection visuelle, nous avons sélectionné trois composés issus du
	criblage selon le descripteur H*DRY et trois composés issus du criblage selon le descripteur
	DRY, couvrant la plus grande diversité structurale.		
	Référence	Structure	Référence	Structure
	AE-641/00187058	AK-968_14004089	
	AP-355/41582938	AG-690/36932102	
	AN-646/41051369	AE-562/12222653	
	AE-641/02605026	AK-087/42718243	
	AN-646/41051368			
	Tableau 28 : Composés sélectionnés soumis aux tests in vitro pour le site 3 (en vert sont les trois composés
	communs aux criblages virtuels en modalité PIFs et pseudo-PIFs).	

meilleur modèle pharmacophore pour le site 3 est le modèle 3S_VolSurf possédant la contrainte 1_accepteur. Concernant les PIFs, le descripteur sélectionné est H*DRY. Pour les pseudo-PIFs, le descripteur sélectionné est DRY. L'ensemble des 9 structures sélectionnées sont résumées dans le Tableau 28.

Ces composés sont actuellement en cours de tests biologiques afin de déterminer leur activité ATPasique basale puis leur activité inhibitrice du transport d'ABCG2.

III.3.

4.3 Sélection du set des composés pour le site 4

  Le meilleur modèle pharmacophore pour le site 4 est le modèle 5I possédant la contrainte 20_accepteur. Le descripteur choisi pour ce modèle est Glob-P, en mode champs (PIFs) et pseudo-champs (pseudo PIFs).Neuf composés, présentant la plus grande diversité structurale parmi ces 20 composés ont été sélectionnés par inspection visuelle pour être testés in vitro (Tableau 29).Ces composés sont actuellement en cours de tests biologiques afin de déterminer leur activité ATPasique basale puis leur activité inhibitrice du transport d'ABCG2.

	III.4. IV.	CONCLUSION Conclusion du chapitre 2
	Comme pour le site 3, un premier criblage virtuel a été réalisé sur les 200 premiers composés A l'issue de ce travail, nous avons créé deux modèles pharmacophores à l'aide du logiciel
	issus du pré-filtrage à l'aide de notre modèle pharmacophore. Les 20 premières solutions FLAP pour décrire les sites d'interaction 3 et 4 de la protéine ABCG2. A l'heure actuelle, il
	selon le descripteur Glob-Prod ont été sélectionnées. s'agit de la première étude portant sur ces deux sites d'interaction, mis en évidence très Ce travail a consisté d'une part en la synthèse puis en l'évaluation biologique de nouveaux
	récemment. Grâce à ce travail, nous avons pu observer des différences structurales entre les inhibiteurs actifs, sélectifs et non toxiques d'ABCG2, analogues du MBL-II-141. La
	deux sites d'interaction. Le site 3, conduisant à une stimulation de l'activité ATPasique découverte de plusieurs sites d'interaction avec la protéine ainsi que des
	pharmacomodulations complémentaires permettront d'orienter nos futures synthèses afin
		Référence	Structure	Référence	Structure
	AG-205/13322024				AN-465/42887422
						NH
						HN
	AG-690/36158029				AO-022/43453359	O	O	Cl
						O
						O
			N	O	O	N
	AH-487/41976616			N	AP-970/42525892
				S	O
	AN-465/42885850				AQ-090/41728837
	AN-465/42887252			

Tableau 29 : Composés sélectionnés soumis aux tests in vitro pour le site 4. basale, semble être gouverné par des interactions hydrophobes, tandis que ce sont les interactions polaires qui semblent dominer dans le site 4, conduisant à une inhibition de l'activité ATPasique basale. La base de donné SPECS a été criblée sur les deux pharmacophores. Ce criblage a permis de sélectionner deux jeux de 9 composés qui, respectivement stimulent/inhibent l'activité ATPasique basale d'ABCG2. Dans l'hypothèse où les tests biologiques permettent de confirmer ces activités et donc l'efficacité de nos modèles pharmacophores, cette approche nous permettra d'une part, de prédire le comportement de nos futurs composés synthétisés et d'autre part de cribler différentes bases de données moléculaires et d'identifier de nouvelles structures pouvant constituer de potentiels nouveaux modulateurs d'ABCG2. d'améliorer l'activité inhibitrice. De plus, des études biologiques supplémentaires permettront de compléter la caractérisation ainsi que le comportement in vivo du MBL-II-141. La recherche de nouveaux inhibiteurs d'ABCG2 a fait l'objet d'une revue dans le journal Future Medicinal Chemistry 269 et d'un article paru dans le Journal of Medicinal Chemistry. 254 L'ensemble des tests in vivo du MBL-II-141, réalisés par nos collaborateurs biologistes ont également fait l'objet d'un article dans le journal Oncotarget 240 . Un nouvel article est également en cours d'écriture afin de décrire les nouveaux composés encore non publiés.

Une seconde partie de ce projet a porté sur la modélisation de deux modèles pharmacophores pour chacun des deux principaux sites inhibiteurs d'ABCG2. Cette étude nous a permis de tirer quelques hypothèses préliminaires quant aux types d'interaction existantes entre chacun des sites et nos composés. L'étude biologique de l'activité ATPasique des nouveaux composés issus de la base de données SPECS et choisis par ces deux modèles nous permettra de confirmer ou non nos hypothèses.

  301, 302 Il a également été démontré que la septième boucle cytoplasmique joue un rôle important dans le passage du signal entre les domaines NBDs et les sites d'interaction des substrats au sein des TMDs.303 Des études de mutagénèses récentes ont suggéré la participation de quatre résidus chargés (Lys513, Lys516, Glu521 et Glu535), situés dans la cinquième boucle cytoplasmique, dans les interactions inter-domaines, nécessaires pour le bon repliement de la protéine.302 Au sein des cellules polarisées, MRP1 est localisée de manière prédominante au sein de la membrane basolatérale 304-307 contrairement à de nombreux autres transporteurs ABC situé au sein de la membrane apicale. Cependant, MRP1 peut également être exprimée au sein de la membrane apicale dans certaines cellules spécifiques telles que les cellules du placenta (syncytiotrophoblastes) et les cellules endothéliales des capillaires du cerveau.308, 309 MRP1 est également retrouvée du côté basal des cellules de Sertoli et de Leydig 310 et les cellules tubulaires proximales.313, 314 Ainsi MRP1 pourrait jouer un rôle dans la faible pénétration dans le cerveau d'inhibiteurs de la protéase HIV ainsi que d'autres médicaments ou agents toxiques. Cependant, la fonction physiologique de MRP1 au sein de la barrière hémato-encéphalique reste floue. MRP1 est détectée du côté apical des cellules endothéliales des micro-vaisseaux du cerveau et des capillaires.309, 315 Cette localisation diffère de celle retrouvée généralement au niveau basolatérale dans les autres tissus ainsi que dans les cellules épithéliales polarisées. Cette MRP1 est capable de transporter une large gamme de substrats aux structures diverses. Parmi ces substrats, de nombreuses études se sont concentrées sur le transport de xénobiotiques, impliqués dans les phénomènes de chimiorésistance et la protection de l'organisme contre des agents toxiques. MRP1 est également responsable du transport de substrats endogènes conférant à la protéine un certain nombre de fonctions physiologiques.Le premier composé à avoir été identifié comme substrat endogène de MRP1 est l'agent proinflammatoire leucotriène C4 (LTC4) avec une très haute affinité.317, 318 MRP1 est également impliquée dans le transport de nombreux produits cytotoxiques naturels tels que les anthracyclines, les vinca alkaloïdes, 319, 320 les anti-folates, 321 ou certains métaux lourds comme l'arsenic.

	I.1.6.	Les substrats de MRP1
	I.1.5.	Expression de MRP1
	différence de localisation indique ainsi l'implication éventuelle de MRP1 dans la réduction du
	transfert d'anions organiques dans le cerveau. 309, 316

306

MRP1 est largement exprimée au sein de divers tissus avec de haut niveau d'expression dans les poumons, les testicules, les reins, les muscles squelettiques et cardiaques, le placenta et les macrophages.

311, 312 

MRP1 est faiblement exprimée dans le foie humain adulte. Cependant, son expression augmente dans les hépatocytes en prolifération et dans les lignées cancéreuses thérapeutiques. 304 MRP1 est également exprimée au sein des cellules gliales du cerveau in vivo.

322 

Certains de ces composés sont transportés conjugués au glutathion (GSH, γ-L-glutamyl-Lcystéinylglycine), au glucuronide ou au sulfate, d'autres non.

280 

Ainsi MRP1 contribue à l'efflux hors des cellules d'agents hydrophobes, tels que l'antifongique carcinogène aflatoxin B1 323 ou cationiques. Le GSH est également lui-même transporté par MRP1 ainsi que sa forme dimérique oxydée GSSG. MRP1 est impliquée dans le transport de prostaglandines, 324, 325 de stéroïdes, de vitamines (B9 et B12) et de sels biliaires.

326, 327 

Elle possède également d'autres fonctions physiopathologiques. En effet, MRP1 est impliquée dans le transport d'antibiotiques, de plusieurs statines impliquées dans le traitement de maladies cardiovasculaires 328 et de l'amyloïde-β.

329 

  Comme nous l'avons vu précédemment, MRP1 est capable de transporter de nombreux agents antinéoplasiques hydrophobes et hydrophiles, réduisant leur concentration cellulaire et donc leur efficacité conduisant les cellules tumorales à devenir résistantes.[355][356][357] Un grand nombre de ces agents anticancéreux sont transportés uniquement par MRP1 et souvent en présence de GSH, une propriété que ne possède pas la protéine P-gp.332 Ainsi, la présence de GSH au sein des cellules de l'organisme augmente considérablement le spectre des substrats transportés par MRP1.Cependant, il reste difficile de définir précisément l'implication de MRP1 dans le phénotype de chimiorésistance en raison de certaines limitations expérimentales et ceci malgré le nombre d'études portant sur ce sujet.Des niveaux élevés de MRP1 ont été détectés dans une large variété de tumeurs solides. Ces études suggèrent que la diminution de l'activité ou l'inhibition de la protéine pourrait avoir des effets bénéfiques sur certains patients. MRP1 constitue ainsi un indicateur puissant et une cible de choix dans le traitement de cette maladie.359, 360 MRP1 joue ainsi un rôle non négligeable dans la chimiorésistance et la modulation de cette protéine constitue l'une des stratégies les plus utilisées afin de palier au phénotype MDR. 'émergence de résistance des cellules tumorales face aux traitements par chimiothérapie et la corrélation de cette résistance à la surexpression de protéines membranaires telles que MRP1 a conduit au développement de nouveaux agents capables d'inhiber ces protéines. Alors que plusieurs inhibiteurs de la P-gp ont atteint les tests cliniques, peu d'inhibiteurs spécifiques à MRP1 se sont révélés aussi efficaces.Les structures et fonctionnalités de la P-gp et de MRP1 étant similaires, un grand nombre de modulateurs de la P-gp ont été criblés sur MRP1. Cependant, un grand nombre de ces modulateurs se sont révélés inactifs pour MRP1. Le fait que les substrats de la P-gp soient des molécules hydrophobes et que MRP1 ne reconnaisse que des substrats hydrophiles peuvent expliquer cet échec. L'exception est le dérivé quinoline MS-209, capable d'inhiber les deux protéines. 361 D'autres inhibiteurs ont été mis au point afin de contrecarrer le phénotype MDR dû à la surexpression de MRP1. L'agostérol A, un stérol polyhydroxylé naturel ainsi que certains de ses dérivés en font partis (Figure83).362, 363 

	I.2.	IMPLICATION DE MRP1 DANS LA CHIMIORÉSISTANCE
	I.2.1.	Inhibition de la protéine MRP1
		338, 340-343 sont capables de stimuler l'activité
	ATPasique de MRP1.

Comme nous l'avons vu précédemment, les deux domaines NBDs de MRP1 ne sont pas équivalents. En effet, plusieurs différences structurales démontrent que l'affinité de NBD1 311 Les leucémies myéloïdes aigües et les leucémies lymphoblastiques aigües font parties des tumeurs hématologiques pour lesquelles MRP1 semble être fortement impliquée dans l'échec du traitement.

358 

Une résistance due à la surexpression de MRP1 est observée pour des tumeurs solides telles que le cancer du poumon non à petites cellules, le cancer de la prostate ou certains cancers du sein. 311 L'un des cas où l'importance de MRP1 d'un point de vue clinique est incontestable est son implication dans le neuroblastome, une tumeur maligne solide extra-cérébrale, la plus fréquente chez le jeune enfant. L

  Tableau 32 : Efflux net de GSH du dimère 4e sur les cellules BHK-21. Les valeurs représentent la moyenne ± la déviation standard sur un minimum de trois expériences indépendantes.De plus, le dimère 4e présente un profil de sensibilité collatérale. En effet, il est capable d'induire sélectivement la mort par apoptose des cellules résistantes surexprimant MRP1 par rapport aux cellules contrôles et ceci sur deux lignées cellulaires distinctes (Figure105).

	La protéine P-gp possédant des propriétés structurales et fonctionnelles similaires à MRP1,
	cette même équipe a poursuivi ses travaux en appliquant une approche identique à l'activité
	de transport de MRP1. 407				
	Efflux net de GSH = Efflux de GSH (BHK-21-MRP1) -Efflux de GSH (BHK-21wt)	
	Remarque : Les dimères testés dans le cadre de l'étude de la P-gp ne sont quasiment pas
	II.3.2. actifs sur MRP1 suggérant ainsi que les sites d'interaction de MRP1 ne sont pas localisés de Détermination de la cytotoxicité
	la même manière que sur la P-gp.				
	Ce test permet de vérifier la corrélation entre l'efflux de GSH et la mort cellulaire et de
	détecter un profil de sensibilité collatérale. Ce test n'est réalisé que sur les composés D'après les résultats issus de cette étude, le dimère 4e (Figure 104) s'avère être un excellent
	provoquant un efflux de GSH supérieur à 40%. Le principe de ce test est expliqué dans le modulateur de MRP1, non cytotoxique. En effet, ce composé présente la plus faible valeur
	chapitre 2, paragraphe II.4.1 (page 100). Il est réalisé sur la lignée cellulaire NCI-H69 issue d'EC50 (73 ± 13 nM) pour l'inversion de la résistance à la doxorubicine régulée par MRP1 et
	de cellules sensibles du cancer du poumon humain à petites cellules et sur la lignée H69AR est respectivement 36, 247 et 6849 fois plus actif que le vérapamil, le MK571 et le
	issue de cellules résistantes, surexprimant MRP1, obtenues par exposition des cellules NCI-probénécide, trois modulateurs connus de MRP1.
	H69 à la doxorubicine.				
	II.4.	PHARMACOMODULATION	1 :	LES	DIMÈRES	DE
		FLAVONOÏDES				
	II.4.1.	Les dimères d'apigénine, inducteurs de sensibilité collatérale chez
		MRP1				
	De nombreux exemples dans la littérature attestent de l'efficacité de l'emploi de ligands
	bivalents ou multivalents capables de se lier simultanément à plusieurs récepteurs d'une
	même protéine. 409, 410 En effet, ces ligands sont connus pour être biologiquement plus actifs et
	l'absorbance est lue à 412 nm toutes les 30 secondes pendant 2 minutes. Le contenu total en sélectifs que les ligands monovalents correspondants.
	GSH est finalement quantifié par comparaison avec une courbe d'étalonnage de La protéine P-gp présentant plusieurs sites d'interaction, de nombreuses études se sont
	% Efflux net GSH concentrations connues de GSH. La concentration intracellulaire totale en glutathion est intéressées à la synthèse de ligands polyvalents. En particulier, différents homodimères se 0,1 µM 0,5 µM 2 µM exprimée en nmol par mg de protéine et les tests sont réalisés en duplicata ou triplicata. efficace que les monomères correspondants. 411, 412 En particulier, les travaux réalisés par Le pourcentage d'efflux de GSH au sein des cellules contrôles et des cellules transfectées par sont avérés être capable d'inverser le phénotype MDR chez la P-gp, d'une manière bien plus 51 ± 7 58 ± 5 59 ± 5
	MRP1 est exprimé en pourcentage, les cellules non traitées présentant un pourcentage de l'équipe de Wong et Chow ont prouvé l'efficacité d'homodimères de l'apigénine, espacée par
	quatre motifs éthylène glycol dans la modulation de l'activité de la P-gp pour le traitement du
	phénotype MDR. 413, 414				

Cette

vitesse étant proportionnelle à la quantité en GSH, il est alors possible de doser le GSH total (GSH + GSSG) d'un échantillon. La quantité de GSH intracellulaire total est mesurée au sein des cellules contrôles et des cellules transfectées par MRP1. Après 3 heures d'incubation, les cellules, en absence ou en présence de 5 et 20 µM de chaque molécule étudiée, sont lysées. A ce lysat cellulaire sont ajoutés le NADPH, la GSH réductase ainsi que le DTNB, puis GSH de 100%. Le pourcentage d'efflux de GSH induit par les composés testés est ainsi déterminé pour chaque lignée cellulaire puis l'effet spécifique de chaque composé sur les cellules transfectées par MRP1 est corrigé de l'effet induit sur les cellules contrôles afin d'obtenir l'efflux net de GSH. L'efflux net de GSH correspond ainsi à la formule suivante : Figure 104 : Structure du dimère 4e.

D'après les études in vitro, réalisées au sein de l'IBCP de Lyon, le dimère 4e est capable d'induire un efflux massif de GSH au sein des cellules BHK-21 transfectées avec MRP1. En effet, un efflux net de GSH de 51 ± 7% est observé pour une concentration de dimère 4e de 0,1 µM (Tableau 32).

  Cependant, les différents essais de cyclisation oxydante, à savoir l'utilisation de la DDQ et de diiode à chaud dans différents solvants sur les bischalcones 44a et 44b se sont soldés par des échecs. Nous avons donc envisagé la voie B. 2-hydroxy-4,6-méthoxyacétophénone 43 est condensée avec le 4-allylbenzaldéhyde 36 en condition basique afin de conduire à la chalcone 45 avec un rendement de 60%. Puis une cyclisation oxydante en présence de diiode dans le DMSO permet d'obtenir la chromone 46

	correspondante avec un rendement de 21%. Pour finir le groupement allyle est retiré en
	o présence de Pd(PPh3)4 en milieu basique afin de conduire au monomère 47 avec un rendement Synthèse par la voie B
	de 96%.			
	La synthèse des dimères par la voie B se réalise en deux étapes, dans un premier temps la
	formation du monomère, dérivé de l'apigénine, puis une seconde étape d'homodimérisation Dans un second temps, l'étape d'homodimérisation du dérivé 47 est réalisée par une réaction
	(Schéma réactionnel 18). Cette voie présente l'avantage de pouvoir moduler plus facilement de dialkylation avec un demi-équivalent d'un dérivé bitosylé, possédant une chaîne éthyle
	les dimères en modifiant, lors de la dernière étape, la nature du bras espaceur reliant les deux (41) ou propyle (48), en présence de carbonate de potassium dans le DMF à chaud, afin
	unités des dérivés de l'apigénine. d'obtenir respectivement les homodimères 49a et 49b.
	II.4.3.	Évaluation biologique des dimères ciblés
		Référence		% Efflux net GSH
			2 µM	5 µM	20 µM
		Dimère 4e	59,4	/	/
		Vérapamil	/	66,1	96,8
		44a	/	10,2	5,6
		44b	/	3,7	1,8
		49a	/	4,1	2,5
		49b	/	14,4	27,2
	Pour former ces dimères, le 4-hydroxybenzaldéhyde est mis en réaction avec un agent
	dialkylant : le composé 41 pour n = 2 issu de l'activation de l'éthylène glycol avec du Tableau 33 : Efflux net de GSH sur les cellules BHK-21. Le dimère 4e et le vérapamil sont utilisés comme
	chlorure de tosyle et avec le 1,3-dibromopropane pour n = 3. Cette dimérisation est réalisée en composés de référence.
	milieu basique en présence de carbonate de potassium et d'un ammonium quaternaire afin de
	former les bisaldéhydes 42a et 42b avec des rendements respectifs de 86% et 38%. Puis les Les quatre dimères synthétisés induisent un efflux net de GSH relativement faible par rapport
	bischalcones 44a et 44b ont été préparées par une réaction d'aldolisation-crotonisation en au vérapamil et au dimère 4e. En effet, à 20 µM, les composés 44a, 44b, 49a et 49b induisent

Schéma réactionnel 17 : Synthèse des homodimères cibles par la voie A. milieu basique entre les composés 42a et 42b et l'acétophénone 43 issue de la diméthoxylation de la 2,4,6-trihydroxyacétophénone. Cette diméthoxylation est réalisée à température ambiante dans l'acétone en présence de carbonate de potassium et de diméthylsulfate comme agent alkylant. Schéma réactionnel 18 : Synthèse des homodimères cibles par la voie B. La Les résultats biologiques issus du dosage intracellulaire du GSH pour les quatre composés testés à 5 et 20 µM sur les cellules contrôles (BHK-21wt) et les cellules surexprimant MRP1 (BHK-21-MRP1) sont résumés dans le Tableau 33. un efflux net de GSH respectivement 17, 54, 39 et 3,5 fois inférieur au vérapamil. La cytotoxicité des dimères de chalcones 44a et 44b a tout de même été évaluée grâce au test MTT sur les cellules sensibles (NCI-H69) et les cellules surexprimant MRP1 (H69AR). Les courbes représentant l'évolution de la survie cellulaire en fonction de la concentration en composés 44a et 44b sont représentées Figure 107.

  Tableau

			21-MRP1,
	surexprimant MRP1 (Tableau 34).		
	Référence	% Efflux net GSH 5 µM 20 µM
	Vérapamil	66,1	96,8
	3-Méthoxychrysine	19,1	65,6
	50a	13,1	26,6
	50b	2,6	31,0
	50c	0,0	-0,9
	50d	13,6	26,1

34 : Efflux net de GSH sur les cellules BHK-21. Le niveau de GSH intracellulaire a été déterminé au sein des cellules sensibles BHK-21 contrôle et des cellules résistantes BHK-21-MRP1.

  Ainsi les sels ferricénium formés par l'oxydation du ferrocène sont stables mais sensibles en solution et présentent des activités antitumorales. En effet, l'état d'oxydation du Fe 3+ serait responsable des effets cytotoxiques.

	% Efflux net GSH interaction compétitive au récepteur oestrogène qui empêche ainsi la transcription de l'ADN Référence 5 µM 20 µM régulée par l'oestradiol. Malheureusement, certaines cellules cancéreuses du sein se révèlent
	Vérapamil être résistantes au tamoxifène car elles n'expriment pas le récepteur oestrogène ([ER(-)]) ou 66,1 96,8
			54a	1,7	0,0			
	54b bien car elles ont développé une résistance au médicament sur le long terme. L'activité 1,2 23,8
	54c thérapeutique du tamoxifène et de l'hydroxytamoxifène est donc limitée. Au contraire, 15,5 20,7
	54d l'hydroxyferrocifène, dérivé ferrocénique de l'hydroxytamoxifène possède également un effet 17,5 24,0
	antioestrogénique envers les cellules cancéreuses du sein [ER(+)] mais un effet cytotoxique
	Tableau 35 : Efflux net de GSH sur les cellules BHK-21. Le niveau de GSH intracellulaire a été déterminé au Figure 112 : Transfert d'un électron au sein du système Fe 2+ /Fe 3+ . sur les cellules [ER(+)] et [ER(-)], lui conférant ainsi une fenêtre thérapeutique très large. 432
	sein des cellules sensibles BHK-21 contrôle et des cellules résistantes BHK-21-MRP1. La cytotoxicité observée pour les dérivés ferrocéniques semble provenir des propriétés redox
	Grâce à l'ensemble de ses propriétés, le ferrocène constitue ainsi un bioisostère de choix du du ferrocène, c'est-à-dire de l'oxydation in situ du Fe 2+ en Fe 3+ conduisant à la formation
	groupement phényle en chimie médicinale et nombreux sont les exemples montrant métabolique d'ions ferrocénium toxiques. 433
	l'efficacité de l'introduction de ce groupement en termes d'activité biologique (propriétés
	anti-HIV, 424, 425 antibactériennes 426 et antiparasitaires 427-429 ), d'élargissement du spectre
	thérapeutique 430 et dans le contournement de phénomène de résistance aux médicaments.
			OCH 2 CH 2 N(CH 3				
	II.6.	PHARMACOMODULATION 3 : INTRODUCTION D'UN
		MOTIF FERROCÈNE				
	II.6.1.	Le	groupement	ferrocène,	pionnier	de	la	chimie
		bioorganométallique					
	Le ferrocène est un complexe organométallique appartenant à la famille des métallocènes. Il
	s'agit d'un métal de transition, le fer, de degré d'oxydation II associé à deux anions
	cyclopentadiényles. La structure du ferrocène fut découverte en 1951 par Kealy et Pauson 421
	et confirmée par Wilkinson en 1952. 422 Les ferrocènes sont également fortement impliqués dans la recherche de nouveaux
	anticancéreux. Dans le cas du cancer du sein on peut citer le ferrocifène, l'analogue
	La ferrocène est un composé stable et lipophile. Il peut être facilement fonctionnalisé, par le ferrocénique du tamoxifène. Le tamoxifène (Figure 114) est utilisé pour traiter les cancers du

21-MRP1, surexprimant MRP1 afin de déterminer leur efflux net de GSH (Tableau 35). D'après les résultats obtenus, le composé 54a portant un groupement éthyle en position 3 ne présente aucun efflux de GSH. A 20 µM, les composés 54b à 54d présentent des efflux net de GSH compris entre 21 et 24% soit environ 5 fois inférieurs au vérapamil. Ces composés n'ont ainsi pas été jugés suffisamment actifs pour pouvoir être soumis au test de survie cellulaire. Cette pharmacomodulation ne sera donc pas retenue comme la plus intéressante sur les modulations de la flavone nue en position 3. Une fois encore, cette pharmacomodulation pourrait s'avérer intéressante sur la galangine hydroxylée en positions 5 et 7. biais de réactions de Friedel-Craft ou de lithiation. De plus, le ferrocène est non toxique 423 et stable en milieu physiologique. Pour finir, le ferrocène présente des propriétés redox grâce au couple redox Fe II /Fe III stable. En effet, l'oxydation ou la réduction à un électron est réversible et n'entraîne pas de variations structurales (Figure 112). Un exemple illustrant les apports du ferrocène est la ferroquine, 427, 428 dérivé ferrocénique de la chloroquine (Figure 113). Alors que la chloroquine, antipaludique découvert dans les années 1930, connait des problèmes de résistance, son analogue ferrocényle, la ferroquine, est active sur plusieurs souches. La ferroquine est ainsi actuellement développée par Sanofi et se trouve en phase II de tests cliniques. 431

Figure 113 : Structures de la chloroquine et de la ferroquine.

sein hormono-dépendant, c'est-à-dire les cancers du sein pour lesquels le récepteur oestrogène est présent ([ER(+)]). L'action antiproliférative de la forme hydroxylée du tamoxifène (l'hydroxytamoxifène) provient principalement de l'effet antioestrogénique causée par une

36 et sur la Figure 118.

  

	Référence A 5 µM, les composés les plus actifs semblent être l'aurone 56b méthoxylée en position 4 R1 R2 % Efflux net GSH 5 µM 20 µM (52%), l'aurone 4,6-diméthoxylée 56d (49%) et la flavone 7-méthoxylée 58b (61%) avec des Structure Référence R1 R2 EC50 (µM) RS NCI-H69 H69AR
	Vérapamil RS pourcentages d'efflux équivalents au vérapamil. / Vérapamil RS /	/	/	>100 µM	66,1	6,7	96,8 >14,8
		55a 55a	H	H	H	H		e.c.		20 ± 2	e.c.	76 ± 11	/
	55b A 20 µM, les chalcones 55a (76%) et 55c (67%), les aurones 56a (55%), 56b (73%) et 56d OCH3 / 17 ± 5 31 ±
	55c (60%) non hydroxylées, l'aurone 57a hydroxylée en position 4 (53%) et les flavones 58a / OCH3 22 ± 7 67 ± 55c H OCH3 e.c. e.c. /
		55d	OCH3	OCH3			2 ± 1	19 ±
	56a (64%), 58b (61%) et 58c (51%) présentent des efflux nets de GSH proches ou supérieurs à / / 16 ± 2 55 ± 56a H H 2,6 23,5 0,1
	50%.	56b 56b	OCH3 OCH3	H	/		12,5		52 ± 7	10,0	73 ± 11 1,2
		56c 56d	OCH3	/	OCH3 OCH3	10,4		7 ± 3	8,7	46 ± 14 1,2
	56d On remarque clairement que les aurones méthoxylées présentent une activité d'efflux de GSH OCH3 OCH3 49 ± 0 60 ± 57a OH H 55,0 55,0 1,0
	57a plus importante que les aurones hydroxylées. En effet, 56b est 2,1 et 1,4 fois plus actif que OH / 24 ± 5 53 ± 58a H H 3,6 13,6 0,3
		57b 58b	H	/	OCH3	OH	53,0		26 ± 8	7,0	21 ±	7,6
		57c 58c	OH OCH3	OCH3	OH	54,0		9 ± 9	8,7	12 ±	6,2
		58a		/		/				21 ± 5	64 ±
		58b		/	OCH3			61 ± 9	61 ±
		58c	OCH3	OCH3		28 ± 11	51 ±
		CHALCONES	AURONES	AURONES	FLAVONES
			MÉTHOXYLÉES	HYDROXYLÉES		

L'ensemble des dérivés ferrocéniques a été testé dans un premier temps pour leur capacité à induire un efflux massif de GSH sur les cellules contrôles BHK-21wt et les cellules BHK-21-MRP1, surexprimant MRP1. Les résultats sont résumés dans le Tableau Tableau 36 : Efflux net de GSH sur les cellules BHK-21. Expériences réalisées en triplicata.

Figure 118 : Diagramme représentant les efflux net de GSH des dérivés ferrocéniques testés à 5 (bleue) et 20 µM (orange). Ces résultats sont exprimés en % d'efflux net de GSH. Les valeurs représentent la moyenne ± la déviation standard sur un minimum de trois expériences indépendantes. 57a respectivement à 5 et à 20 µM. Bien que 3,7 fois plus actif que son analogue méthoxylé 56c à 5 µM, le composé hydroxylé 57b est 2,2 moins actif à 20 µM. Pour finir 57c, un analogue hydroxylé est 5,3 et 5 fois moins actif que 56d respectivement à 5 et à 20 µM. Ainsi on peut conclure que la méthoxylation en R1 et R2 semble plus favorable pour l'activité d'efflux de GSH, la stabilité des composés hydroxylés pouvant être mise en cause. On peut ainsi en déduire qu'à 20 µM certains analogues chalcones, aurones méthoxylées ou nues ainsi que les flavones méthoxylées sont de meilleurs inducteurs d'efflux de GSH que les aurones hydroxylées et constituent ainsi des meilleurs candidats pour les tests de sensibilité collatérale. Sur ces quatorze dérivés, les neufs composés présentant un efflux net de GSH supérieur à 50% à 20 µM ont été soumis au test de survie cellulaire afin d'étudier leur profil de sensibilité collatérale. La cytotoxicité de ces analogues a été évaluée grâce au test MTT sur les cellules sensibles (NCI-H69) et les cellules résistantes surexprimant MRP1 (H69AR). Les valeurs des EC50 correspondantes sont rassemblées dans le Tableau 37. Tableau 37 : Cytotoxicité des composés sur les cellules H69AR surexprimant MRP1 et les cellules contrôles NCI-H69. Les valeurs des EC50 (concentration requises pour obtenir 50% de l'effet maximal) ont été calculées à partir de courbes doses-réponses. RS est le rapport de sélectivité. Les valeurs représentent la moyenne ± la déviation standard sur un minimum de trois expériences indépendantes. e.c. = étude en cours d'évaluation biologique.

  Nauclea latifolia, le nombre d'oeufs générés a diminué de 93,8%, soit de manière équivalente à une dose unique de 5 mg/kg d'albendazole, antiparasitaire de référence(94,1%).Des extraits méthanoliques de feuilles et écorces du tronc de Nauclea latifolia ont démontré une large zone d'inhibition de la prolifération bactérienne sur des souches Gram positives telles que Staphylococcus aureus (Concentration minimale inhibitrice (CMI) = 64 µg/mL) et Gram négative telles que Pseudonomas aeruginosa (CMI = 64 µg/mL). De plus, une CMI de 2 µg/mL a été observée contre la levure Candida albicans, démontrant ainsi une activité anticandidale.462 Une nouvelle fois, les extraits éthanoliques présentent des activités antibactériennes contre un plus large spectre de souches bactériennes (9 souches sur 11) que les extraits dans l'eau froide (3 souches sur 11) ou dans l'eau chaude (aucune souche).463 Nauclea latifolia se sont avérés être de bons candidats pour le traitement du diabète pendant une grossesse.466 Certaines plantes, connues pour leurs propriétés antidiabétiques, sont de bonnes sources d'agents antioxydants. C'est le cas des fruits et des feuilles de Nauclea latifolia, présentant des propriétés antioxydantes mise en évidence lors de différents tests classiques et corrélées à la présence de polyphénols, de flavanols et de flavonols.467 En plus de ses activités hypoglycémiques, des extraits méthanoliques de fruits de Nauclea latifolia présentent une activité hypocholestérolémique.En effet, une réduction du cholestérol sanguin de 136,25 à 100,76 mg/dL a été observée chez des rats nourris avec 40% des fruits de la plante en complément alimentaire. La présence de saponines pourrait expliquer cette activité hypocholestérolémique.468 En effet, une diminution de l'activité motrice a été observée chez des souris lors du test d'activité motrice spontanée, test permettant de mesurer le niveau d'excitabilité du système nerveux central. De plus ces extraits atténuent le comportement exploratoire indiquant une activité sédative.469 Ils sont également capables d'augmenter la durée du sommeil induit par du diazépam indiquant une activité dépresseur du système nerveux central.469, 470 Cette activité aurait pour origine une interférence avec la neurotransmission dopaminergique centrale, due à la présence de saponines, présentes en abondance dans la plante.

	I.2.3.	Activités antibactériennes
	I.2.5.	Activités neuropharmacologiques
	De fortes doses d'extraits aqueux de l'écorce des racines de la plante (50-200 mg/kg)
	présentent des propriétés sédatives.
	I.2.4.	Activités hypoglycémique et hypocholestérolémique
	La suppression de la production d'oeufs par l'extrait suggère un effet inhibiteur sur la synthèse
	protéique des parasites. 460 De plus, les extraits éthanoliques de Nauclea latifolia présentent
	une activité anthelminthique supérieure aux extraits aqueux. 461

L'efficacité anthelminthique in vivo de Nauclea latifolia chez des moutons cliniquement infestés par des nématodes gastrointestinaux a été évaluée en mesurant la quantité d'oeufs de nématodes présente dans les excréments des animaux. Après cinq jours de traitement à l'aide d'une dose de 1,6 g/kg d'extrait de Différentes parties de Nauclea latifolia sont prescrites en médecine traditionnelle comme remède contre le diabète. L'administration d'extraits aqueux des feuilles de la plante (200 mg/kg) permet de réduire de 45% le niveau sanguin de glucose chez des rats diabétiques sur une période de 4 h après l'administration de la plante. Le traitement de rats non diabétiques dans les mêmes conditions ne présente, au contraire, aucune activité hypoglycémique. Cette activité est différente pour le glibenclamide, médicament antidiabétique de référence, entrainant une diminution du niveau sanguin de glucose chez les rats diabétiques et chez les rats sains.

464 

Un comportement similaire est observé pour les extraits éthanoliques de feuilles de Nauclea latifolia (400 mg/kg) capables de diminuer le taux de glucose sanguin de 36,9% chez les rats diabétiques et de 30,9% chez les rats normaux. Les extraits de la plante dans l'hexane quant à eux ne présentent aucune activité hypoglycémique.

465 

De plus, des extraits butanoliques du tronc et des racines de 469 D'autres études ont démontré une activité antidépresseur des écorces de racines de Nauclea latifolia comparable à la fluoxétine, agent antidépresseur de référence, ainsi que des propriétés myorelaxantes. Les activités de l'arbuste semblent être corrélées à une augmentation de la concentration des récepteurs GABA et/ou à la modulation des niveaux sérotoninergiques au sein du système nerveux central. 471 L'utilisation des racines de Nauclea latifolia dans les traitements de la fièvre, de la malaria, de l'insomnie, de l'anxiété et de l'épilepsie peut s'expliquer également par ses activités anticonvulsive, antiépileptique et sédative. De plus, la plante semble posséder une activité anxiolytique proche du diazépam à forte dose, associée à une activité antipyrétique.

470 

Cette dernière activité semble également être caractéristique des feuilles de Nauclea latifolia où elle s'accompagne d'une activité antiinflammatoire. En effet, l'extrait de feuilles, tout comme l'extrait de racines, est capable d'inhiber l'augmentation d'un oedème de pied induit chez le rat.

472 

Nauclea latifolia présente ainsi un large panel d'activités neuropharmacologiques auxquelles viennent s'ajouter des propriétés antinociceptives décrites dans le paragraphe suivant et justifiant ainsi son utilisation en médicine traditionnelle en Afrique de l'Ouest.

  473, 474 Nauclea latifolia a été testé dans un modèle de douleur tonique, le test à la formaline. Ce test consiste à injecter une solution diluée de formaline dans la patte arrière de la souris, provoquant une réponse nociceptive en deux phases : une première phase neurogénique ou aiguë (de 0 à 5 minutes) au cours de laquelle est libérée la substance P puis une phase intermédiaire d'inhibition active suivie d'une seconde phase inflammatoire(15 à 30 minutes). Le traitement des souris à l'aide de Nauclea latifolia produit une très nette inhibition dose-dépendante de la douleur induite par la formaline. L'effet analgésique de l'extrait de la plante à une dose de 160 mg/kg est efficace lors de la première et de la seconde phase (respectivement 60,7% et 64,2% d'inhibition), tout comme 5 mg/kg de morphine (respectivement64,8% et 73,1% d'inhibition). De plus, un prétraitement avec la naloxone (2 mg/kg), antagoniste non spécifique des récepteurs opioïdes, inverse complètement l'effet antinociceptif de la décoction de Nauclea latifolia.Des racines de Nauclea latifolia se sont révélées présenter une activité antivirale, inhibant des souches HSV-2 (Herpes simple virus de type 2) sensibles et résistantes à l'acyclovir avec des IC50 respectivement équivalentes à 5,38 µg/mL et 7,17 µg/mL.476 De plus, les propriétés antivirales de Nauclea latifolia ont été étudiées sur des oeufs d'embryons de poules atteints du virus de la maladie de Newcastle, maladie touchant les oiseaux et en particulier les volailles domestiques. Les extraits des fruits de la plante sont toxiques pour des concentrations de 50 et 100 mg/oeufs pour les extraits éthanoliques et 100 mg/oeufs pour les extraits aqueux.Du fait de son utilisation en médecine traditionnelle ainsi que ses différentes activités biologiques, Nauclea latifolia représente une source naturelle de substances pharmacologiques actives. En effet, diverses analyses phytochimiques ont détecté la présence en fortes concentrations de saponines, d'alcaloïdes, de carbohydrates, de tannins, de résines mais également d'anthraquinones, de flavonoïdes, de dérivés de la quinone, de glycosides et de phénols. En 1975 ont été isolés de l'écorce de la racine plusieurs alcaloïdes de structure indoloquinolizidine. Parmi eux, deux sont identiques à l'angustine et à l'angustoline puis deux nouveaux composés ont été isolés : la naucléfine et la nauclétine (Figure123).478 

	I.2.7. I.3.	Activités antivirales COMPOSÉS EXTRAITS DE NAUCLEA LATIFOLIA
	Cependant, à une concentration de 12,5 mg/oeufs, les extraits éthanoliques et les extraits
	aqueux des feuilles de la plante sont capables d'induire une réduction virale d'environ 98,4%
	et 95% respectivement. 477
	I.2.8.	Activités antipyrétiques
		8,0 ± 0,3 minutes), semblable
	à 5 mg/kg de morphine (8,1 ± 0,5 minutes). Pour finir, les souris ont été soumises au test de
	contractions abdominales par injection d'acide acétique au cours duquel est mesuré le nombre
	de contractions abdominales et d'étirements du corps. L'effet antinociceptif observé fut dose-sont prélevées 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 et 6 heures après l'administration de la plante. Les données
	dépendant avec un maximum atteint pour 160 mg/kg de la plante et une protection observée obtenues ont révélé que 160 mg/kg de la décoction de Nauclea latifolia permettent une
	de 61,7% comparable à la morphine (66,2%). 473 Pour finir, des fractions alcaloïdes de réduction significative de la température corporelle 1 heure après l'administration de la plante.
	Nauclea latifolia se sont révélées présenter des effets antiallodynique et antihyperalgésique Si l'on compare l'effet de la plante (160 kg/mg) avec le composé de référence, l'acide
	sur un modèle de douleur neuropathique chez le rat. 475 acétylsalicylique, on observe respectivement une diminution de la fièvre au bout d'1 heure de
	0,8 °C et de 0,5 °C. 473, 474

Le modèle de la plaque chaude a également été employé, modèle au cours duquel l'animal est placé sur une plaque métallique chauffée brusquement ou graduellement. On mesure alors le temps d'apparition de réponses comportementales de l'animal qui se lèche, se secoue les pattes et/ou saute. Les comportements de léchage sont associés à une activité réflexe tandis que les sauts correspondent à une réponse intégrée au niveau supraspinal. Les décoctions de Nauclea latifolia (160 mg/kg) protègent la souris de la chaleur pendant un temps maximal de 56,1 ± 3,9 minutes, 3 heures après l'injection de la plante. La morphine (5 mg/kg) protège la souris pendant 62,7 ± 1,9 minutes après 4 heures.

Le test de retrait de la queue (tail-flick test) est un test au cours duquel la queue de l'animal est immergée dans de l'eau chaude dont la température augmente progressivement. On mesure le temps que met l'animal pour retirer sa queue. Cette méthode permet de mesurer un réflexe nociceptif spinal. 60 minutes après l'injection de 160 mg/kg de Nauclea latifolia, on peut observer une augmentation du temps de retrait de la queue (Nauclea latifolia fut également utilisé en médecine traditionnelle pour son activité antipyrétique, c'est-à-dire contre le symptôme de la fièvre. L'administration de la décoction de racines de Nauclea latifolia conduit à une altération de la température rectale de souris testées. En effet, alors que les souris contrôles auxquelles a été injectée de l'eau distillée ne présentent aucun changement de température corporelle, les souris tests auxquelles ont été injectées des doses de 80 et 160 mg/kg de la plante présentent une diminution de leur température corporelle 1 heure, 2 heures et 3 heures après l'administration. Après 24 heures, les températures reprennent une valeur normale. Un test antipyrétique a également été entrepris, consistant à induire une fièvre par injection d'une suspension de levure de bière (20 mg/kg) sous-cutanée au niveau de la nuque. 18 heures après l'injection de la levure, les souris sont traitées avec une décoction de racines de Nauclea latifolia et les températures rectales

  Le caractère racémique de ce mélange est préservé indépendamment de la procédure d'extraction et du solvant utilisé et n'est pas le résultat d'un processus de racémisation ayant lieu lors de l'extraction. Cette découverte a été validée au sein de trois laboratoires différents, sur trois échantillons différents collectés en différentes périodes de l'année. Tous confirment la présence de tramadol au sein de l'écorce de Nauclea latifolia. Cependant, le tramadol n'a pas été détecté dans d'autres parties supérieures de la plante telles que les feuilles, le tronc ou les branches. La présence d'un azote basique au sein de la structure confère les caractéristiques alcaloïdales. En plus du tramadol, la présence d'autres alcaloïdes déjà décrit au sein de Nauclea latifolia ont été identifiés dans cet extrait : la déméthoxycarbonylnaucléchine, la naucléfine, la vinconsamide et la naucléamide E. Afin d'exclure le risque d'une contamination de l'écorce par du tramadol synthétique, un extrait

	II.	Travaux personnels : synthèse biomimétique du
		tramadol
	II.1.	OBJECTIFS DES TRAVAUX PERSONNELS

issu de l'intérieur de l'écorce a été analysé et la présence de tramadol aux mêmes concentrations a été confirmée. Pour finir la quantité de tramadol au sein de l'extrait éthanolique d'écorce de Nauclea latifolia a été déterminée par RMN et évalué à 3,9% en masse soit une concentration de 0,4% en masse au sein de l'écorce séchée.

443 

Suite à cette découverte, nous avons entrepris de comprendre l'origine du tramadol au sein de Nauclea latifolia. En particulier, nous avons émis l'hypothèse que le tramadol serait produit par la plante elle-même. Nous avons ainsi entrepris dans ce projet la synthèse biomimétique du tramadol. Cette étude fut débutée par le Dr. Romain Haudecoeur lors de sa thèse au sein du Département de Pharmacochimie Moléculaire de Grenoble et poursuivit lors des travaux présentés dans cette thèse.

Afin d'étudier l'origine du tramadol au sein de la plante Nauclea latifolia, nous avons émis dans un premier temps l'hypothèse d'une voie de biosynthèse du tramadol sur la base de données issue de la littérature. Puis, dans un second temps, nous avons validé certaines étapes clés critiques de cette biosynthèse par le biais de synthèses biomimétiques réalisées au laboratoire, afin de vérifier si ces étapes pouvaient être réalisées sans catalyse enzymatique.

Table 38 :

 38 The 1 H chemical shifts (δ, ppm) multiplicities and coupling constants (J, Hertz in parenthesis) of 3 in DMSO-d6.

			H3		H6/H8	H7		H2'/H3'		OCH2		
			6.29 s	6.64 d (8.2 Hz) 6.76 d (8.0 Hz)	7.28 t (8.4 Hz)	7.15 m		4.79 s		
	Note: The signal of H7 is a doublet of doublet appearing as a triplet on the spectrum. Thus,
	this signal is assigned as a triplet in the experimental part.				
	C2	C3	C4	C5/C9	C6/C8	C7	C10	C1'	C2'/C3'	C4'	OCH2	COOH
	151.2	115.2	176.7	157.4 157.7	108.9 110.6	135.1	114.7	136.3	128.9 131.2	120.6	69.2	161.5

Table 39 :

 39 The13 C chemical shifts (δ, ppm) of 3 in DMSO-d6.

Table 40 :

 40 The 1 H chemical shifts (δ, ppm) multiplicities and coupling constants (J, Hertz in parenthesis) of 5-

					methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.		
	C2	C3	C4	C5	C6	C7	C8	C9	CH2CH2N	CH2CH2N	OCH3
	123.9	109.2	100.1	153.0	111.2	112.1	131.4	127.0	23.0	Under peak of DMSO	55.3

Table 41 :

 41 The13 C chemical shifts (δ, ppm) of 5-methoxytryptamine hydrochloride in DMSO-d6.

4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid [2-(5-methoxy-1H-indol- 3-yl)-ethyl]-amide (7a). The

  

	and C6), 158.9 (CO), 176.9 (C4). MS (ESI) m/z 545 ( 79 Br), 547 ( 81 Br) [M-H] -. Anal. Calcd
	for C28H23BrN2O5: C, 61.44; H, 4.24; N, 5.12. Found: C, 60.91; H, 4.22; N, 4.89.
	). The crude was
	prepared according to general procedure C starting from 5b (700 mg, 1.7 mmol) and was
	washed with diethyl ether to afford 6b as a grey solid (457 mg, 70%). C17H11BrO5. m.p. 226-
	228°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5.29 (s, 2H, OCH2), 6.84 (s, 1H, H3), 7.17 (dd, 1H,
	J = 2.2 Hz, J = 8.8 Hz, H6), 7.33 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H8), 7.44 (d, 2H, J = 8.3 Hz, H2'), 7.61 7-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid [2-(5-methoxy-1H-indol-
	(d, 2H, J = 8.3 Hz, H3'), 7.96 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H5). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.3 3-yl)-ethyl]-amide (7b). The crude was prepared according to general procedure D1 starting
	(OCH2), 102.0 (C8), 113.6 (C3), 116.0 (C6), 117.8 (C10), 121.3 (C4'), 126.4 (C5), 129.9 (C2'), from 6b (450 mg, 1.2 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 7b as a white solid
	131.5 (C3'), 135.5 (C1'), 153.2 (C2), 157.3 (C7), 161.4 (C9), 163.2 (CO), 176.6 (C4). MS (ESI) (295 mg, 45%). C28H23BrN2O5. m.p. 227-229°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.95 (t,
	m/z 373 ( 79 Br), 375 ( 81 Br) [M-H] -. 2H, J = 7.6 Hz, NCH2CH2), 3.58 (q, 2H, J = 6.8 Hz, NCH2CH2), 3.74 (s, 3H, OCH3), 5.27 (s,
	2H, OCH2), 6.71 (dd, 1H, J = 2.0 Hz, J = 8.4 Hz, He), 6.77 (s, 1H, H3), 7.07 (d, 1H, J = 1.8
	Hz, Hc), 7.16-7.24 (m, 4H, H6, H8, Ha, Hf), 7.45 (d, 2H, J = 8.0 Hz, H2'), 7.63 (d, 2H, J = 8.4
	Hz, H3'), 7.97 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H5), 9.17 (t, 1H, J = 5.2 Hz, CONH), 10.68 (s, 1H, indole
	NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 24.9 (NHCH2CH2), under DMSO peak
	(NHCH2CH2), 55.3 (OCH3), 69.2 (OCH2), 100.1 (Cc), 101.9 (C8), 110.5 (C3), 111.1 and 111.2
	(Cb and Ce), 112.1 (Cf), 115.7 (C6), 117.8 (C10), 121.3 (C4'), 123.4 (Ca), 126.5 (C5), 127.5
	(Ch), 129.9 (C2'), 131.4 (Cg), 131.5 (C3'), 135.4 (C1'), 153.0 (Cd), 155.5 (C2), 156.8 (C7), 158.9
	(C9), 163.1 (CO), 176.4 (C4). MS (ESI) m/z observed for C27H20BrN2O5, 532 ( 79 Br), 534 6-(crude was prepared according to general procedure D1 starting ( 81 Br) [M+H]
	from 6a (450 mg, 1.2 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 7a as a white solid
	(269 mg, 41%). C28H23BrN2O5. m.p. 192-194°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.96 (t,
	2H, J = 7.5 Hz, NHCH2CH2), 3.57 (q, 2H, J = 6.9 Hz, NHCH2CH2), 3.73 (s, 3H, OCH3), 5.23
	(s, 2H, OCH2), 6.71 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, J = 8.8 Hz, He), 6.81 (s, 1H, H3), 7.08 (d, 1H, J =
	2.3 Hz, Hc), 7.17 (d, 1H, J = 2.2 Hz, Ha), 7.23 (d, 1H, J = 8.8 Hz, Hf), 7.46 (d, 2H, J = 8.4
	Hz, H2'), 7.51 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H5), 7.58 (dd, 1H, J = 3.2 Hz, J = 9.2 Hz, H7), 7.62 (d, 2H,
	J = 8.4 Hz, H3'), 7.69 (d, 1H, J = 9.2 Hz, H8), 9.24 (t, 1H, J = 5.6 Hz, CONH), 10.69 (s, 1H,
	indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 24.9 (NHCH2CH2), under DMSO peak
	(NHCH2CH2), 55.3 (OCH3), 69.1 (OCH2), 100.2 (Cc), 106.0 (C5), 109.5 (C3), 111.0 and 111.2
	(Ce and Cb), 112.0 (Cf), 120.4 (C8), 121.1 (C4'), 123.4 (Ca), 124.4 (C10), 124.7 (C7), 127.5
	(Ch), 129.8 (C2'), 131.4 (C3' and Cg), 135.9 (C1'), 149.9 (C9), 153.0 (Cd), 155.6 and 155.8 (C2

+ . 

Anal. Calcd for C28H23BrN2O5:

  

Synthesis of compounds 11a to 11f and 16

  

	C2', C4'), 123.6 and 123.7 (C6'), 130.5 and 130.6 (C5'), 133.7 (C4), 139.4 and 139.5 (C1'),
	157.8 and 159.4 (C2 and C6), 160.9 and 163.4 (C3'), 203.4 (CO). MS (ESI) m/z 259 [M-H] -.
	o	Synthesis of compounds 11a to 11f
	6-(4'-Fluorobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (8e). The crude was prepared according to
	general procedure A starting from 2,6-dihydroxyacetophenone (2 g, 13 mmol) and 4-
	6-(2'-Bromobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (8a). The crude was prepared according to fluorobenzylbromide (3 g, 16 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 8e as a
	general procedure A starting from 2,6-dihydroxyacetophenone (2 g, 13 mmol) and 2-beige solid (1.7 g, 50%). C15H13FO3. m.p. 137-139°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.47
	bromobenzyloxybromide (4 g, 16 mmol) and was purified by flash silica column (s, 3H, COCH3), 5.14 (s, 2H, OCH2), 6.51 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H3 or H5), 6.65 (d, 1H, J = 8.4
	chromatography, using cyclohexane/ethyl acetate (100:0 to 98:2) as eluent to afford 8a as a Hz, H3 or H5), 7.22 (m, 2H, H3'), 7.31 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H4), 7.51 (m, 2H, H2'). 13 C NMR
	yellow solid (1.5 g, 36%). C15H13BrO3. m.p. 68-70°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.45 (100 MHz, DMSO-d6) δ 33.1 (COCH3), 69.4 (OCH2), 103.4 and 109.6 (C3 and C5), 114.7
	(s, 3H, COCH3), 5.17 (s, 2H, OCH2), 6.54 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.3 Hz, H3 or H5), 6.64 (C1), 115.2 and 115.4 (C3'), 130.1 and 130.2 (C2'), 132.8 (C1'), 133.9 (C4), 158.2 (C6), 159.7
	(dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.4 Hz, H3 or H5), 7.32 (m, 2H, H4, H4'), 7.44 (td, 1H, J = 1.2 Hz, J = (C2), 160.6 and 163.1 (C4'), 203.5 (CO). MS (ESI) m/z 259 [M-H] -.
	7.5 Hz, H6'), 7.59 (dd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 7.6 Hz, H5'), 7.69 (dd, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.9 Hz,
	H3'), 11.67 (s, 1H, OH). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 32.8 (COCH3), 69.9 (OCH2), 103.1
	and 109.7 (C3 and C5), 114.6 (C1), 122.9 (C2'), 127.9 (C5'), 130.3 and 130.5 (C3' and C4'),
	132.6 (C6'), 133.8 (C4), 135.2 (C1'), 157.8 and 159.5 (C2 and C6), 203.3 (CO). MS (ESI) m/z
	321 ( 79 Br), 323 ( 81 Br) [M+H] + , 319 ( 79 Br), 321 ( 81 Br) [M-H] -.
	6-(	
	6-(3'-Bromobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (8b). The crude was prepared according to
	general procedure A starting from 2,6-dihydroxyacetophenone (2 g, 13 mmol) and 3-
	bromobenzyloxybromide (4 g, 16 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 8b as a
	beige solid (3 g, 73%). C15H13BrO3. m.p. 131-133°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.49
	(s, 3H, COCH3), 5.17 (s, 2H, OCH2), 6.52 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H3 or H5), 6.61 (d, 1H, J = 8.3
	Hz, H3 or H5), 7.29 (t, 1H, J = 8.3 Hz, H4), 7.37 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H5'), 7.46-7.55 (m, 2H,
	H4' and H6'), 7.68 (s, 1H, H2'), 13.58 (s, 1H, OH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 33.0

3',4'-Difluorobenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (8f). The

  

	crude was prepared
	according to general procedure A starting from 2,6-dihydroxyacetophenone (5 g, 33 mmol)
	and 3,4-difluorobenzylbromide (8.2 g, 40 mmol) and was washed with diethyl ether to afford
	PEB2-13 as a white solid (2.5 g, 27%). C15H12F2O3. m.p. 127-128°C. 1 H NMR (400 MHz,
	DMSO-d6) δ 2.48 (s, 3H, COCH3), 5.14 (s, 2H, OCH2), 6.52 (dd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 8.3 Hz,
	H3 or H5), 6.62 (dd, 1H, J = 0.6 Hz, J = 8.3 Hz, H3 or H5), 7.30 (t, 1H, J = 8.3 Hz, H4), 7.34

,

  158.9 (CO), 176.6 (C4). MS (ESI) m/z 503 [M-H] -, 505 [M+H] + , 527 [M+Na] + .

Anal. Calcd for C28H22F2N2O5

  

4'-Methoxybenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (14). The

  .

	o 5-Hydroxy-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid ethyl ester (13). To a solution of 2 (2 g, Synthesis of compound 16 5-(4'-Methoxybenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid (15). The crude was 5.0 mmol) in anhydrous ethanol under argon was added activated Pd/C (0.1 g/mmol). The prepared according to general procedure C starting from 14 (373 mg, 1.1 mmol) and was resulting mixture was stirred at room temperature for 3 hours under H2 environment. The washed with diethyl ether to afford 15 as a cream solid (231 mg, 62%). C18H14O6. m.p. 130-Pd/C was filtered through a pad of celite and the filtrate was concentrated under reduced 131°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.76 (s, 3H, OCH3), 5.17 (s, 2H, OCH2), 6.71 (s, pressure. The obtained solid was washed with diethyl ether to afford 13 as a yellow solid (676 1H, H3), 6.96 (m, 2H, H3'), 7.10 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H6 or H8), 7.19 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or mg, 58%). C12H10O5. m.p. 143-145°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.35 (t, 3H, J = 7.2 H8), 7.50 (m, 2H, H2'), 7.71 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 55.1 Hz, OCH2CH3), 4.39 (q, 2H, J = 7.2 Hz, OCH2CH3), 6.88 (dd, 1H, J = 0.6 Hz, J = 8.2 Hz, H6 (OCH3), 69.9 (OCH2), 109.0 and 110.3 (C6 and C8), 113.7 (C3'), 114.7 (C10), 115.1 (C3), or H8), 6.98 (s, 1H, H3), 7.18 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.75 (t, 1H, J = 8.4 128.6 (C7 and C2'), 135.0 (C1'), 151.4 (C2), 157.4, 158.0 and 158.8 (C5, C9 and C4'), 161.5 Hz, H7), 12.16 (s, 1H, OH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.8 (OCH2CH3), 62.9 (OCH2CH3), 107.9 (C6 or C8), 111.2 (C10), 111.6 (C6 or C8), 112.7 (C3), 137.1 (C7), 153.2 (CO), 176.7 (C4). MS (ESI) m/z 325 [M-H] -, 327 [M+H] + , 349 [M+Na] + .
	(C2), 155.6 and 159.4 (C5 and (C9), 159.7 (COO), 183.4 (C4). MS (ESI) m/z 235 [M+H] + , 257
	[M+Na] + .
	6-(4'-Methoxybenzyloxy)-2-hydroxyacetophenone (12). The crude was prepared according
	to general procedure A starting from 2,6-dihydroxyacetophenone (2 g, 1.3 mmol) and 4-5-(
	methoxybenzyl chloride (244 mg, 1.6 mmol) and was purified by flash silica column
	chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (8:2) as eluent to afford 12 as a cream coloured solid (1.3 g, 36%). C16H16O4. m.p. 125-127°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5-(crude was prepared according to general procedure A starting from 13 (500 mg, 2 mmol) and
	4-methoxybenzylchloride (376 mg, 2.4 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 14 2.50 (s, 3H, COCH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 5.08 (s, 2H, OCH2), 6.50 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H3 or H5), 6.66 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H3 or H5), 6.95 (dd, 2H, J = 1.9 Hz, J = 8.4 Hz, H2'), 7.31 (t, 1H, as a creamy brown solid (390 mg, 55%). C20H18O6. m.p. 127-130°C. 1 H NMR (400 MHz,
	J = 8.1 Hz, H4), 7.40 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H3'), 11.80 (s, 1H, OH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 1.33 (t, 3H, J = 7.2 Hz, OCH2CH3), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.37 (q, 2H, J = 7.2 Hz,
	CDCl3) δ 33.1 (COCH3), 55.1 (OCH3), 70.0 (OCH2), 103.4 and 109.4 (C3 and C5), 113.8 OCH2CH3), 5.17 (s, 2H, OCH2), 6.73 (s, 1H, H3), 6.95 (m, 2H, H3'), 7.11 (d, 1H, J = 8.4 Hz,
	H6 or H8), 7.20 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.49 (d, 2H, J = 8.8 Hz, H2'), 7.72 (t, 1H, J = 8.4 (C3'), 114.3 (C1), 128.3 and 129.7 (C2' and C4), 134.1 (C1'), 158.5, 159.1 and 160.0 (C2, C6 and C4'), 203.7 (CO). MS (ESI) m/z 271 [M-H] -. Hz, H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 13.5 (OCH2CH3), 55.1 (OCH3), 62.5
	(OCH2CH3), 69.9 (OCH2), 109.2 and 110.3 (C6 and C8), 113.7 (C3'), 114.8 (C10), 115.4 (C3),
	128.5 and 128.6 (C2' and C7), 135.2 (C1'), 150.1 (C2), 157.3 and 158.1 and 158.8 (C5, C9 and
	C4'), 160.0 (CO), 176.3 (C4). MS (ESI) m/z 377 [M+Na] + .

4'-Methoxybenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid [2-(5-methoxy-1H- indol-3-yl)-ethyl]-amide (16). The

  

	153.5 (C2 and Cd), 157.0 and 158.0 (C5 and C9), 158.8 (CO), 158.9 (C4'), 176.5 (C4). MS
	(ESI) m/z 521 [M+Na] + . Anal. Calcd for C29H26N2O6:
	crude was prepared according to general procedure D1
	starting from 15 (201 mg, 0.6 mmol) and 5-methoxytryptamine hydrochloride (114 mg, 0.6
	mmol) to afford 16 as a cream solid (61 mg, 20%). C29H26N2O6. m.p. 202-204°C. 1 H NMR
	(400 MHz, DMSO-d6) δ 2.95 (t, 2H, J = 7.4 Hz, NCH2CH2), 3.56 (q, 2H, J = 6.6 Hz,
	NCH2CH3), 3.73 (s, 3H, OCH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 5.18 (s, 2H, OCH2), 6.65 (s, 1H, H3),
	6.71 (dd, 1H, J = 2.0 Hz, J = 8.4 Hz, He), 6.96 (d, 2H, J = 8.5 Hz, H3'), 7.07 (d, 1H, J = 2.2
	Hz, Hc), 7.11 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.16 (d, 1H, J = 1.9 Hz, Ha), 7.22 (m, 2H, H6 or
	H8, Hf), 7.51 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H2'), 7.74 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.17 (t, 1H, J = 7.2 Hz,
	CONH), 10.68 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 24.9 (NHCH2CH2),
	under peak of DMSO (NHCH2CH2), 55.1 (OCH3), 55.3 (OCH3), 69.9 (OCH2), 100.2 (Cc),
	109.1 and 110.3 (C6 and C8), 111.1 and 111.2 (Cb and Cf), 112.0 (Ce and C3), 113.7 (C3'),
	114.5 (C10), 123.4 (Ca), 127.5 (Ch), 128.5 (Cg), 128.6 (C2'), 131.4 (C7), 134.9 (C1'), 153.0 and

  H3),6.68 (dd, 1H, J = 2.0 Hz, J = 8.4 Hz, He), 7.06 -7.24 (m, 5H, H6, H8, Ha, Hc, Hf), 

	MHz) δ 1.28 (t, 3H, J = 6.8 Hz, OCH2CH3), 2.92 (t, 2H, J = 7.2 Hz, NHCH2CH2), 3.53 (q,
	2H, J = 6.8 Hz, NHCH2CH2), 3.94 (q, 2H, J = 6.8 Hz, OCH2CH3 ), 5.23 (s, 2H, OCH2), 6.64
	(s, 1H, 7.58 (m, 4H, H2', H3'), 7.74 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.15 (t, 1H, J = 5.6 Hz, CONH), 10.64 ( s,
	1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 14.9 (OCH2CH3), under peak of DMSO 5-Methoxy-N-methyltryptamine (19b). The crude was prepared according to general
	(NHCH2CH2), 24.8 (NHCH2CH2), 63.3 (OCH2CH3), 69.2 (OCH2), 101.2 (Cc), 109.0 and procedure G from 19a (500 mg, 1.9 mmol) to afford 19b as a yellow oil (387 mg, 80%).
	110.6 (C6 and C8), 111.2 and 111.5 (Cb and Cf), 111.9 and 112.0 (Ce and C3), 114.5 (C10), C12H16N2O. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.45 (s, 3H, NHCH3), 2.89-2.98 (m, 4H,
	120.6 (C4'), 123.5 (Ca), 127.6 (Ch), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 131.4 (Cg), 134.9 (C7), 136.3 NHCH2CH2), 3.86 (s, 3H, OCH3), 6.85 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, J = 8.8 Hz, He), 7.00 (s, 1H, Ha),
	(C1'), 152.1 and 153.6 (C2 and Cd), 157.0 and 157.7 (C5 and C9), 158.9 (CONH), 176.5 (C4). 7.07 (d, 1H, J = 2.4 Hz, Hc), 7.24 (dd, 1H, J = 0.4 Hz, J = 8.8 Hz, Hf), 8.13 (s, 1H, indole
	MS (ESI) m/z 561 ( 79 Br), 563 ( 81 Br) [M+H] + ; 583 ( 79 Br), 585 ( 81 Br) [M+Na] + . Anal. Calcd NH). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 25.7 (NHCH2CH2), 36.4 (NHCH3), 52.1 (OCH3), 56.1
	for C29H25BrN2O5: C, 62.04; H, 4.49; N, 4.99. Found: C, 61.82; H, 4.28; N, 4.75. (NHCH2CH2), 100.9 (Cc), 112.0 and 112.3 (Ce and Cf), 113.8 (Cb), 122.9 (Ca), 128.0 (Ch),
	131.7 (Cg), 154.1 (Cd). MS (ESI) m/z 203 [M-H] -.
	5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid [2-(5-propyloxy-1H-indol-
	3-yl)-ethyl]-amide (17d).The crude was prepared according to general procedure E starting
	from 17b (200 mg, 0.4 mmol) and 1-iodopropane (60 mg, 0.4 mmol) and was purified by
	flash silica column chromatography using dichloromethane/methanol (99:1) as eluent to
	afford 17d as a white solid (67 mg, 31%). C30H27BrN2O5. m.p. 203-206°C. 1 H NMR
	(DMSO-d6, 400 MHz) δ 0.94 (t, 3H, J = 7.6 Hz, OCH2CH2CH3), 1.66 (sex, 2H, J = 7.2 Hz,
	OCH2CH2CH3), 2.93 (t, 2H, J = 7.2 Hz, NHCH2CH2), 3.55 (q, 2H, J = 6.4 Hz, NHCH2CH2),
	3.86 (t, 2H, J = 6.4 Hz, OCH2CH2CH3), 5.23 (s, 2H, OCH2), 6.66 (s, 1H, H3), 6.70 (dd, 1H, J
	= 2.0 Hz, J = 8.8 Hz, He), 7.15 (m, 5H, H6, H8, Ha, Hc, Hf), 7.60 (m, 4H, H2', H3'), 7.76 (t, 1H,
	J = 8.8 Hz, H7), 9.17 (t, 1H, J = 5.6 Hz, CONH), 10.66 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR
	(DMSO-d6, 100 MHz) δ 10.4 (OCH2CH2CH3), 22.2 (OCH2CH2CH3), 24.8 (NHCH2CH2),
	). The crude was prepared according to general procedure E starting under peak of DMSO (NHCH2CH2), 69.1 and 69.4 (OCH2CH2CH3 and OCH2), 101.1 (Cc),
	from 17b (200 mg, 0.4 mmol) and iodoethane (56 mg, 0.4 mmol) and was purified by flash 108.9 and 110.5 (C6 and C8), 111.2 and 111.4 (Cb and Cf), 111.9 and 112.0 (C3 and Ce), 114.4
	silica column chromatography, using dichloromethane/methanol (99:1) as eluent to afford 17c (C10), 120.5 (C4'), 123.3 (Ca), 127.5 (Ch), 128.8 (C2'), 131.1 (C3'), 131.3 (Cg), 134.8 (C7),
	as a white solid (36.5 mg, 17%). C29H25BrN2O5. m.p. 234-236°C. 1 H NMR (DMSO-d6, 400 136.2 (C1'), 152.2 (Cd), 153.5 (C2), 156.9 (C9), 157.6 (C5), 158.8 (CO), 176.4 (C4). MS (ESI)

  Ha),7.11-7.23 (m, 2H, He and Hf), 7.30 (d, 1H, J = 8.2 Hz, Hf), 7.59 (d, 1H, J = 7.9 Hz, Hc).

	1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.44 (s, 9H, OC(CH3)3), 2.94 (t, 2H, J = 6.7 Hz,
	NHCH2CH2), 3.45 (m, 2H, NHCH2CH2), 3.76 (s, 3H, NCH3), 4.60 (s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H,
	13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 25.8 (NHCH2CH2), 28.6 (OC(CH3)3), 32.7 (NCH3), 41.2
	(NHCH2CH2), 58.7 (OC(CH3)3), 109.4 (Cb and Cf), 119.0 and 119.1 (Cc and Ce), 121.8 (Ca 1-Methyltryptamine (22a). Trifluoroacetic acid (2.3 g, 20 mmol) was added to a solution of
	and Cd), 126.9 (Ch), 137.3 (Cg), 156.1 (CO). MS (ESI) m/z 297 [M+Na] + . 21a (1.4 g, 5 mmol) in dichloromethane (8 mL/mmol). The resulting mixture was stirred at
	room temperature overnight. The mixture was poured into water and extracted with
	dichloromethane. The combined organic layers were washed with 15% sodium hydroxide and
	water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced
	pressure. The crude was purified by flash silica column chromatography, using
	dichloromethane/methanol (98:2 to 8:2) as eluent to afford 22a as a colorless oil (200 mg,
	N-Acetyl-5-methoxy-1-methyltryptamine (21b). To a solution of 20b (500 mg, 2.1 mmol) 23%). C11H14N2. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.87-2.96 (m, 4H, NH2CH2CH2), 3.70 (s, 3H,
	dissolved in dichloromethane/tetrahydrofuran (20 ml, 1:1) were added tetrabutylammonium NCH3), 6.86 (s, 1H, Ha), 7.06-7.22 (m, 2H, Hd and He), 7.25-7.27 (m, 1H, Hf), 7.54 (d, 1H, J
	bromide (cat) and sodium hydroxyde (230 mg, 5.7 mmol) at 0°C. The resulting mixture was = 7.9 Hz, Hc). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 22.9 (NH2CH2CH2), 32.3 (NCH3), under
	stirred at 0°C for 1 hour and iodomethane (300 mg, 2.1 mmol) was added dropwise. The peak of DMSO (NH2CH2CH2), 108.8 and 109.7 (Cf and Cb), 118.3 and 118.6 (Cc and Cd),
	solution was stirred at 0°C for 1 hour and at room temperature overnight. The mixture was 121.3 (Ce), 127.1 (Ca), 127.7 (Ch), 136.7 (Cg). MS (ESI) m/z 175 [M+H] + .
	poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic
	layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and
	concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash silica column
	chromatography using cyclohexane/acetone (6:4) as eluent to afford 21b as a yellow powder
	(318 mg, 62%). C14H18N2O2. m.p. 98°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.81 (s, 3H, COCH3)
	2.77 (t, 2H, J = 7.4 Hz, NHCH2CH2), 3.29 (q, 2H, J = 6.9 Hz, NHCH2CH2), 3.70 (s, 3H, 5-methoxy-1-methyltryptamine hydrochloride (22b). To a solution of 21b (252 mg, 1
	NCH3), 3.77 (s, 3H, OCH3), 6.78 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, J = 8.8 Hz, He), 7.04 (d, 1H, J = 2.4 mmol) in ethanol/water (50 ml/mmol, 1:1) was added sodium hydroxide (1.2 g, 30 mmol) and
	Hz, Hc), 7.07 (s, 1H, Ha), 7.27 (d, 1H, J = 8.8 Hz, Hf), 7.94 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NH). 13 C the resulting mixture was refluxed overnight. The solution was poured into 6M hydrochloric
	NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 22.7 (NHCH2CH2), 25.1 (COCH3), 32.4 (NCH3), under peak acid and extracted with diethyl ether. The aqueous layers were neutralised with potassium
	of DMSO (NHCH2CH2), 55.4 (OCH3), 100.4 (Cc), 110.3, 110.8 and 111.0 (Cb, Ce and Cf), carbonate and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed
	127.6 (Ca), 127.9 (Ch), 132.0 (Cg), 153.1 (Cd), 169.0 (CO). MS (ESI) m/z 245 [M-H] -, 247 [M with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered, concentrated under reduced
	+ H] + , 269 [M+Na] + . pressure to afford 22b as a yellow oil (115 mg, 56%). C12H16N2O. 1 H NMR (400 MHz,
	CDCl3) δ 2.84-3.06

Anal. Calcd for C28H23BrN2O4: C,

  . MS (ESI) m/z 531 ( 79 Br), 533 ( 81 Br) [M+H] + ; 553 ( 79 Br), 555 ( 81 Br) [M+Na] + .

  ). The crude was prepared according to general procedure D1 starting from

	6a (150 mg, 0.4 mmol) and 19a (70 mg, 0.4 mmol) and was washed with petroleum ether to
	afford 25g as a white solid (mixture of rotamers (6:4)) (89 mg, 42%). C28H23BrN2O4. m.p.
	179-180°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.97-3.06 (m, 5H, NCH3, NCH2CH2),
	3.64-3.71 (m, 2H, NCH2CH2), 5.22 (s, 1.2H, OCH2), 5.23 (s, 0.8H, OCH2), 6.16 (s, 0.6H,
	H3), 6.46 (s, 0.4H, H3),

7 Removal of central amide -Synthesis of compounds 31b and 32a 5-(4'-Bromobenzyloxy)-2-(hydroxymethyl)-4H-chromen-4-one (29

  The resulting mixture was stirred for 5 hours at room temperature, poured into 1M hydrochloric acid and extracted with dichloromethane. The combined organic layers were washed with sodium hydrogenocarbonate and water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and MS (ESI) m/z 515 (79 Br), 517 (81 Br) [M+H] + .

	m.p. 211-214°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.51 (d, 2H, J = 5.6 Hz, CONHCH2), 5.22 (s, 2H, OCH2), 5.53 (s, 2H, NCH2), 6.66 (s, 1H, H3), 7.07 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H8), 7.22 (dd, 1H, J = 0.4 Hz, J = 8g.4 Hz, H6), 7.26 (m, 2H, H2"), 7.53-7.61 (m, 6H, H3", H2', H3'), 7.73 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.08 (s, 1H, Hb), 9.60 (t, 1H, J = 6 Hz, CONH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 34.7 (CONHCH2), 52.0 (NCH2), 69.2 (OCH2), 108.9 and 110.6 (C6 and C8), 112.3 (C3), 114.5 (C10), 120.6 (C4'), 121.4 (C4"), 123.4 (Cb), 128.9 (C2'), 130.2 (C2"), 131.2 (C3'), 131.6 (C3"), 135.0 (C7), 135.4 (C1"), 136.3 (C1'), 144.32 (Ca) 153.3 (C2), 157.0 and 157.7 (C5 and C9), 159.0 (CO), 176.5 (C4). MS (ESI) m/z 645 ( 79 Br), 647 ( 81 Br) [M+Na] + . Anal. Calcd for C27H20Br2N4O4: C, 51.95; H, 3.23; N, 8.97. Found: C, 51.81; H, 3.41; N, 9.89. 5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid [1-(2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-1H-(1,2,3)triazol-4-ylmethyl]-amide (27c). The crude was prepared according to general procedure I starting from 26 (360 mg, 0.9 mmol) and 28 (198 mg, 1 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 27c as a white solid (52 mg, 10%). C30H24BrN5O4. m.p. 169-171°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.25 (t, 2H, J = 7.6 Hz, NCH2CH2), 4.51 (d, 2H, J = 6.0 Hz, CONHCH2), 4.60 (t, 2H, J = 7.2 Hz, NCH2CH2), 5.24 (s, 2H, OCH2), 6.68 (s, 1H, H3), 6.93-7.05 (m, 2H, Hd and He), 7.09-7.50 (m, 4H, H6, H8, Ha, Hc and Hf), 7.60 (m, 4H, H2', H3'), 7.75 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.04 (s, 1H, Hb'), 9.62 (t, 1H, J = 5.6 Hz, CONH), 10.85 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 34.6 (CONHCH2), under peak of DMSO (NCH2CH2), 50.0 (NCH2CH2), 69.1 (OCH2), 108.8 (C6 or C8), 109.9 (Cf), 110.5 (C6 or C8), 111.3 (Cb), 112.2 (C3), 114.4 (C10), 118.0 and 118.2 (Cc and Ce), 120.5 (C4'), 120.9 (Cd), 123.0 and 123.1 (Ca and Cb'), 126.8 (Ch), 128.8 (C2'), 131.1 (C3'), 134.9 (C7), 136.0 (C1'), 136.2 (Cg), 143.8 (Ca'), 153.2 (C2), 156.9 and 157.6 (C5 and C9), 158.9 (CO), 176.4 (C4). MS (ESI) m/z 596 ( 79 Br), 598 ( 81 Br) [M-H] -. Anal. Calcd for C30H24BrN5O4: C, 60.21; H, 4.04; N, 11.70. Found: C, 58.62; H, 4.32; N, 11.31. 3-(2-azidoethyl)-1H-indole (28). To a solution of 3-(2-bromoethyl)-1H-indole (100 mg, 0.45 mmol) in DMF (5 ml) was added sodium azide (37 mg, 0.6 mmol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 24h. The solution was poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to afford 28 as a brown (Cf), 112.4 (Cb), 118.6 (Cc), 119.6 (Cd), 122.3 and 122.4 (Ca, and Ce), 127.2 (Ch), 136.4 (Cg). MS (ESI) m/z 185 [M-H] -. 108.6 and 108.9 (C6 and C8), 110.2 (C3), 114.2 (C10), 120.5 (C4'), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 134.1 (C7), 136.5 (C1'), 157.6 and 157.7 (C5 and C9), 166.9 (C2), 176.3 (C4). MS (ESI) m/z 359 ( 79 Br), 361 ( 81 Br) [M-H] -. concentrated under reduced pressure. The residue was purified by flash silica column oil (42 mg, 50%). C10H10N4. 8.16 (s, 1H, NH). 13 C NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 25.2 (CH2CH2N3), 51.8 (CH2CH2N3), 111.4 chromatography, using cyclohexane/acetone (9:1 to 8:2) as eluent to afford 30 as a white solid (322 mg, 45%). C24H19BrO6S. m.p. 133-135°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.35 (s, 3H, CH3), 5.14 (s, 2H, SOCH2), 5.23 (s, 2H, OCH2), 6.27 (s, 1H, H3), 6.95 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H6 or H8), 7.04 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.41 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H2"), 7.58 (m, 4H, H2', H3'), 7.66 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 7.82 (d, 2H, J = 8.4 Hz, H3"). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 21.0 (CH3), 67.5 (SOCH2), 69.2 (OCH2), 108.9 and 110.1 (C6 and C8), 113.4 (C10), 120.6 (C4'), 125.5 (C3 or C1''), 127.9 (C2"), 128.0 (C3 or C1''), 128.9 (C2'), 130.1 (C3"), 131.2 (C3'), 134.6 (C7), 136.3 (C1'), 145.4 (C4"), 157.4, 157.5 and 157.6 (C2, C5 and C9), 176.8 II.1.3.4 (CH2OH), 69.2 (OCH2), (C4).

1 

H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.07 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2CH2N3), 3.58

(t, 2H

, J = 7.2 Hz, CH2CH2N3),

7.08 (s, 1H, Ha), 7.15 (t, 1H, J = 8.0 Hz, Hf), 7.22 (t, 1H, J = 6.8 Hz, Hc), 7.38 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Hd), 7.60 (d, 1H, J = 8.0 Hz, He)

, ). To a solution of 2 (500 mg, 1.2 mmol) in anhydrous methanol (25ml) was added sodium borohydride (171 mg, 4.5 mmol.). The resulting mixture was stirred at room temperature for 20 min. The solvent was removed and the residue was added to a solution of sodium dihydrogen phosphate hydrate (1.1 g in 30 ml of water) and extracted with chloroform. The combined organic layers were dried over anhydrous magnesium sulfate, concentrated under reduced pressure and washed with diethyl ether to afford 29 as a white solid (116 mg, 26%). C17H13BrO4. m.p. 144-146°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.37 (dd, 2H, J = 0.8 Hz, J = 6.4 Hz, CH2OH), 5.22 (s, 2H, OCH2), 5.74 (t, 1H, J = 6.4 Hz, OH), 6.17 (s, 1H, H3), 7.03 (dd, 1H, J = 0.4 Hz, J = 8.0 Hz, H6 or H8), 7.11 (dd, 1H, J = 0.8 Hz, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.58

(m, 4H, H2', H3'), 7.65 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7)

.

13 

C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 59.

5-(4'-Bromobenzyloxy)-2-(tosyloxymethyl)-4H-chromen-4-one (30).

To a solution of 29 (500 mg, 1.4 mmol) and triethylamine (448 mg, 4.4 mmol) in dichloromethane at 0°C was added dropwise a solution of tosylchloride (590 mg, 3.1 mmol) in dichloromethane.

1.3.8 Introduction of an amino acid in the central chain -Synthesis of compounds 33a to 35c

  Hβ),3.69 (s, 3H, COOCH3), 4.30 (t, 1H, J = 7.8 Hz, Hα), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.70 (s, 1H, H3), 7.11 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.34 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.61(m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.16 (d, 1H, J = 7.9 Hz, CONH).

	methoxytryptamine hydrochloride (127 mg, 0.7 mmol) and was washed with diethyl ether to
	afford 35b as a white solid (64 mg, 29%). C34H34BrN3O6. m.p. 130-131°C . 1 H NMR (400
	MHz, DMSO-d6) δ 0.88 (2d, 2×3H, J = 6.2 Hz, Hδ), 1.54-1.73 (m, 3H, Hγ, Hβ), 2.79 (t, 2H, J
	13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 19.0 and 19.1 (Cγ), 29.4 (Cβ), 51.9 (COOCH3), 58.5 (Cα), = 7.4 Hz, NHCH2CH2), 3.39 (m, 2H, NHCH2CH2), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.46-4.50 (m, 1H,
	69.2 (OCH2), 109.0 (C6 and C8), 112.7 (C3), 114.6 (C10), 120.6 (C4'), 129.0 (C2'), 131.2 (C3'), Hα), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.69-6.71 (m, 2H, H3, He), 7.01 (d, 1H, J = 2.3 Hz, Hc), 7.09-7.12
	1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.39 (s, 3H, NCH3), 2.66-2.75 (m, 2H, Hb'), 2.84-2.88 (m, 2H, Hc'), 3.58 (s, 2H, Ha'), 3.68 (s, 3H, OCH3), 5.22 (s, 2H, OCH2), 6.22 (s, 1H, H3), 6.67-7.19 (m, 6H, H6, H8, Ha, Hc, He, Hf), 7.57-7.64 (m, 5H, H7, H2', H3'), 10.60 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 22.8 (Cc'), 42.1 and 42.8 (NCH3 and Ca'), 57.4 and 57.8 (Cb' and OCH3), 69.2 (OCH2), 99.9 (Cc), 108.6 and 110.3 (C6 and C8), 110.9 and 117.7 (Cb and Cf), 111.9 (Ce and C3), 114.2 (C10), 5-(4'-Bromobenzyloxy)-2-({[2-(1H-indol-3-yl)-ethyl]-methylamino}-methyl)-chromen-4-one hydrochloride (32a). The crude was prepared according to general procedure J starting from 30 (100 mg, 1.9 mmol) and 19a (120 mg, 2.3 mmol) and was purified by flash silica column chromatography, using cyclohexane/acetone (9:1 to 7:3) and the chlorhydrate salt was form to afford 32a as a white solid (333 mg, 31%). C28H26BrClN2O3. m.p. 158-160°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.38 (s, 3H, NCH3), 2.72-2.77 (m, 2H, Hb'), 2.87-2.91 (m, 2H, Hc'), 3.58 (s, 2H, Ha'), 5.22 (s, 2H, OCH2), 6.20 (s, 1H, H3), 6.92-7.48 (m, 7H, H6, H8, Ha, 134.9 (C7), 136.3 (C1'), 153.0 (C2), 157.0 and 157.6 (C5 and C9), 159.7 (CONH), 171.3 (COOCH3), 176.4 (C4). MS (ESI) m/z 486 ( 79 Br), 488 ( 81 Br) [M-H] -, 488 ( 79 Br), 490 ( 81 Br) [M+H] + . Anal. Calcd for C23H22BrNO6: C, 56.57; H, 4.54; N, 2.87. Found: C, 56.42; H, 4.49; N, 3.01. D2 starting from 3 (500 mg, 1.3 mmol) and L-leucine methylester hydrochloride (484 mg, 2.7 mmol) and was purified by flash silica column chromatography, using cyclohexane:acetone (8:2 to 5:5) as eluent to afford 33b as a white solid (531 mg, 79%). C24H24BrNO6. m.p. 135-138°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.90 (2d, 2×3H, J = 5.6 Hz, Hδ), 1.64 (m, 2H, Hβ), 1.84 (t, 1H, J = 9.6 Hz, Hγ), 3.67 (s, 3H, COOCH3), 4.54 (m, 1H, Hα), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.70 (s, 1H, H3), 7.11 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.30 (d, 1H, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.61 (m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.33 (d, 1H, J = 7.6 Hz, CONH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 21.1 and 22.8 (Cδ), 24.3 (Cβ), one pic under DMSO (Cγ), 50.9 (Cα), 52.1 (COOCH3), 69.2 (OCH2), 109.0 and 110.7 (C6 and C8), 112.6 (C3), 114.5 (C10), 120.6 (C4'), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 135.0 (C7), 136.3 (C1'), 152.8 (C2), 157.0 and 157.7 (C5 and C9), 159.4 (CONH), 172.1 (COOCH3), 176.4 (C4). MS (ESI) m/z 500 ( 79 Br), 502 ( 81 Br) [M-H] -, 502 ( 79 Br), 504 ( 81 Br) [M+H] + . Anal. Calcd for C24H24BrNO6: C, 57.38; H, 4.82; N, 2.79. (m, 2H, H6 or H8, Ha), 7.20 (d, 1H, J = 8.7 Hz, Hf), 7.34 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H6 or H8), 7.61 5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid {1-[2-(5-methoxy-1H-2-[(5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carbonyl)-amino]-3-methylpentanoic (m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.21 (t, 1H, J = 5.4 Hz, CONHCH2CH2), 9.00 indol-3-yl)-ethylcarbamoyl]-2-methylpropyl}-amide (35a). The crude was prepared acid methyl ester (33c). The crude was prepared according to general procedure D2 starting (d, 1H, J = 8.3 Hz, CONHCHC), 10.63 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) according to general procedure D2 starting from 34a (263 mg, 0.55 mmol) and 5-from 3 (500 mg, 1.3 mmol) and L-Isoleucine methylester hydrochloride (484 mg, 2.7 mmol) δ 21.4 and 23.0 (Cδ), 24.4 (NHCH2CH2), 30.72 (Cβ), under peak of DMSO (NHCH2CH2, Cγ), methoxytryptamine hydrochloride (211 mg, 1.1 mmol) and was purified by flash silica and was recrystallized in acetonitrile to afford 33c as a white solid (668 mg, 95%). column chromatography using cyclohexane/acetone (8:2 to 5:5) as eluent to afford 35a as a 51.9 (Cα), 55.4 (OCH3), 69.2 (OCH2), 100.1 (Cc), 109.0 and 110.9 (C6 and C8), 111.0 and C24H24BrNO6. m.p. 159-160°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.86-0.92 (m, 2×CH3, Hγ , 111.4 (Cb and Cf), 112.0 and 112.5 (Ce and C3), 114.6 (C10), 120.6 (C4'), 123.4 (Ca), 127.5 white solid (62.5 mg, 18%). C33H32BrN3O6. m.p. 170-171°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-Hε), 1.22-1.55 (m, 2H, Hδ), 1.99-2.06 (m, 1H, Hβ), 3.68 (s, 3H, OCH3), 4.37 (t, 1H, J = 7.2 (Ch), 129.0 (C2'), 131.3 (C3'), 131.4 (Cg), 135.0 (C7), 136.3 (C1'), 153.0 and 153.3 (C2 and Cd), d6) δ 0.90 (d, 2×3H, J = 6.7 Hz, Hγ), 2.14 (m, 1H, Hβ), 2.81 (t, 2H, J = 7.2 Hz, NHCH2CH2), Hz, Hα), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.70 (s, 1H, H3), 7.11 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.34 (d, 1H, (Cβ), 51.9 (OCH3), 57.3 (Cα), 69.2 (OCH2), 109.0 and 110.9 (C6 and C8), 112.8 (C3), 114.6 (C10), 120.6 (C4'), 129.0 (C2'), 131.3 (C3'), 135.0 (C7), 136.3 (C1'), 153.0 (C2), 157.1 and 157.7 (C5 and C9), 159.7 (CONH), 171.4 (COOH), 176.5 (C4). MS (ESI) m/z 500 ( 79 Br), 502 ( 81 Br) [M-H] -, 536 ( 79 Br), 538 ( 81 Br) [M+Cl] -, 502 ( 79 Br), 504 ( 81 Br) [M+H] + . Anal. Calcd for C24H24BrNO6: C, 57.37; H, 4.82; N, 2.79. Found: C, 57.29; H, 5.01; N, 3.11. 2-[5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carbonyl)-amino]-3-methylbutyric acid tert-butyl ester (33d). The crude was prepared according to general procedure D2 starting from 3 (500 mg, 1.3 mmol) and L-valine tertbutylester hydrochloride (560 mg, 2.7 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 33d as a white solid (496 mg, 93%). C26H28BrNO6. 3.42 (m, 2H, NHCH2CH2), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.26 (t, 1H, J = 8.3 Hz, Hα), 5.25 (s, 2H, δ 19.2 and 19.6 (Cγ), 25.4 (NHCH2CH2), 30.7 (Cβ), under peak of DMSO (NHCH2CH2), 55.9 (OCH3), 59.8 (Cα), 69.8 (OCH2), 100.6 (Cc), 109.9 and 111.4 (C6 and C8), 111.6 and 111.8 (Cb and Cf), 112.6 and 113.0 (Ce and C3), 114.9 (C10), 121.2 (C4'), 124.0 (Ca), 127.9 (Ch), 129.6 (C2'), 131.8 (C3'), 131,9 (Cg), 135.7 (C7), 136.6 (C1'), 153.5 and 153.8 (C2 and Cd), 157.5 and 158.1 (C5 and C9), 159.7 (CONHCHC), 170.9 (CONHCH2CH2), 177.6 (C4). MS (ESI) m/z 644 ( 79 Br), 646 ( 81 Br) [M-H] -, 646 ( 79 Br), 648 ( 81 Br) [M+H] + . Anal. Calcd for C33H32BrN2O6: C, 61.31; H, 4.99; N, 6.50. Found: C, 61.27; H, 5.48; N, 5.81. 157.1 and 157.7 (C5 and C9), 159.1 (CONHCHC), 171.1 (CONHCH2CH2), 176.6 (C4). MS Hc, Hd, He, Hf), 7.57-7.66 (m, 5H, H2', H3', H7), 10.81 (s, 1H, indole NH). 2-[(5-(4'-Bromobenzyloxy)4-oxo-4H-chromene-2-carbonyl)-amino]-3-methylbutyric acid (ESI) m/z 658 ( 79 Br), 660 ( 81 Br) [M-H] -, 660 ( 79 Br), 662 ( 81 Br) [M+H]
	120.5 (C4'), 123.2 (Ca), 127.5 (Ch), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 131.3 (Cg), 134.1 (C7), 136.5 methyl ester (33a). The crude was prepared according to general procedure D2 starting from Found: C, 57.00; H, 5.12; N, 2.87. m.p. 176-177°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.97 (2d, 2×3H, J = 7.2 Hz, Hγ), 1.44 (s,

(C1'), 152.9 (Cd), 157.

7 and 157.8 (C5 and C9), 164.5 (C2), 176.2 (C4)

. MS (ESI) m/z 545 (

79 Br)

, 547 (

81 Br) 

[M-H] -. Anal. Calcd for C29H27BrN2O4:

C, 63.63; H, 4.97; N, 5.12. Found: C, 63.81; H, 5.00; N, 5.23. 13 

C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 15.1 (Cc'),

54.7 (NCH3), 55.6 (Cb'), 64.9 (Ca'), 69.3 (OCH2), 108.7 and 110.4 (C6 and C8), 111.6 (C3), 112.0 (Cb and Cf), 114.2 (C10), 118.3 and 118.5 (Cc and Cd), 120.6 (C4'), 121.2 (Ce), 123.3 (Ca), 126.7 (Ch), 128.9 (C2'), 131.2 (C3'), 134.6 (C7), 136.2 and 136.3 (C1' and Cg)

, no signal for C2, C9 and Cg, 157.7 (C5), 175.9 (C4). MS (ESI) m/z 517 (

79 Br)

, 519 (

81 Br) 

[M+H] + . Anal. Calcd for C28H26BrClN2O3•2H2O:

C, 57.01; H, 5.12; N, 4.75. Found: C, 57.33; H, 5.1, N, 4.52

.

II.

3 (500 mg, 1.3 mmol) and L-valine methylester hydrochloride (446 mg, 2.7 mmol) and was washed with diethyl ether to afford 33a as a white solid (540 mg, 83%). C23H22BrNO6. m.p.

151-152°C.

1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 0.96 (2d, 2×3H, J = 6.7 Hz, Hγ), 2.23 (m, 1H, 2-[(5-(4'-Bromobenzyloxy)4-oxo-4H-chromene-2-carbonyl)-amino]-4-methylpentanoic acid methyl ester (33b). The crude was prepared according to general procedure J = 8.4 Hz, H6 or H8), 7.61 (m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 9.16 (d, 1H, J = 7.6 Hz, CONH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 10.8 and 15.4 (Cε and Cγ), 25.1 (Cδ), 35.5 9H, OC(CH3)3), 2.19-2.24 (m, 1H, Hβ), 4.21 (t, 1H, J = 7.8 Hz, Hα), 5.25 (s, 2H, OCH2), 6.70 (s, 1H, H3), 7.11 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.34 (dd, 1H, J = 0.7 Hz, J = 8.5 Hz, H6 or H8), 7.61 (m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.92 (d, 1H, J = 7.9 Hz, OCH2), 6.69 (d, 1H, J = 2.4 Hz, He), 6.70 (s, 1H, H3), 7.01 (d, 1H, J = 2.3 Hz, Hc), 7.10-7.12 (m, 2H, H6 or H8, Ha), 7.20 (d, 1H, J = 8.8 Hz, Hf) 7.35 (d, 1H, J = 7.9 Hz, H6 or H8), 7.61 (m, 4H, H2', H3'), 7.77 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.32 (t, 1H, J = 5.6 Hz, CONHCH2CH2), 8.77 (d, 1H, J = 4.8 Hz, CONHCHC), 10.64 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid {1-[2-(5-methoxy-1Hindol-3-yl)-ethylcarbamoyl]-3-methylbutyl}-amide (35b). The crude was prepared according to general procedure D2 starting from 34b (163 mg, 0.3 mmol) and 5-+ . Anal. Calcd for C34H34BrN3O6:

C, 61.81; H, 5.20; N, 6.36. Found: C, 60.49; H, 5.22; N, 6.16. 

5-(4'-Bromobenzyloxy)-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid {1-[2-(5-methoxy-1H- indol-3-yl)-ethylcarbamoyl]-2-methylbutyl}-amide (35c). The

  

	14.7 (Cγ), 25.1 (NHCH2CH2), 25.7 (Cδ), under peak of DMSO (NHCH2CH2, Cβ), 55.3
	(OCH3), 57.1 (Cα), 69.2 (OCH2), 99.2 (Cc), 100.1 and 109.0 (C6 and C8), 110.9 and 111.4 (Cb
	and Cf), 112.0 and 112.6 (Ce and C3), 114.5 (C10), no signal for C4', 123.4 (Ca), 127.5 (Ch),
	129.0 (C2'), 131.3 (C3'), 131.4 (Cg), 135.0 (C7), 136.4 (C1'), 152.9 and 153.3 (C2 and Cd),
	157.1 and 157.7 (C5 and C9), 159.0 (CONHCHC), 170.1 (CONHCH2CH2), 176.5 (C4). MS
	(ESI) m/z 660 ( 79 Br), 662 ( 81 Br) [M+H] + , 682 ( 79 Br), 684 ( 81 Br) [M+Na] + . Anal. Calcd for
	C34H34BrN3O6: C
	crude was prepared
	according to general procedure D2 starting from 34c (151.5 mg, 0.3 mmol) and 5-
	methoxytryptamine hydrochloride (118 mg, 0.6 mmol) and was purified by flash silica
	column chromatography using cyclohexane:ethyl acetate (9:1 to 5:5) as eluent to afford 35c as
	a white solid (14 mg, 7%). C34H34BrN3O6. m.p. 117-119°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6)
	δ 0.81-0.88 (m, 2×CH3, Hγ ,Hε), 1.07-1.49 (m, 2H, Hδ), 1.94 (m, 1H, Hβ), 2.80 (t, 2H, J = 7.3
	Hz, NHCH2CH2), under peak of H2O (2H, NHCH2CH2), 3.75 (s, 3H, OCH3), 4.29-4.44 (m,
	1H, Hα), 5.24 (s, 2H, OCH2), 6.68-6.71 (m, 2H, H3, He), 7.01 (d, 1H, J = 2.3 Hz, Hc), 7.10-

7.12 (m, 2H, H6 or H8, Ha), 7.20 (d, 1H, J = 8.7 Hz, Hf), 7.35 (d, 1H

, J = 7.9 Hz, H6 or H8), 7.61 (m, 4H, H2', H3'), 7.76 (t, 1H, J = 8.4 Hz, H7), 8.30 (m, 1H, CONHCH2CH2), 8.70 (m, 1H, CONHCHC), 10.63 (s, 1H, indole NH). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 10.7 (Cε),

  The resulting mixture was stirred at room temperature for 30 min and then was refluxed for 3h30. The resulting mixture was poured into 1M hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude oil was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane:ethyl acetate (95:5) as eluent to afford 36 as a yellow oil (876 mg, 67%). C10H10O2.

	O	2		
	H	1	3	Ha
			4	
			O	Hb
	4-Allyloxybenzaldehyde (36). In a round bottom flask were dissolved allylbromide (1.2 g,
	9.8 mmol), potassium carbonate (3.4 g, 24.6 mmol) and tetrabutylammonium bromide (cat) in
	acetone (15 ml). Then was added dropwise a solution of 4-hydroxybenzaldehyde (1 g, 8.2
	mmol) in acetone (15 ml).			

1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ

4-(2-(4-Formylphenyloxy)ethyloxy)benzaldehyde (42a). The

  MS (ESI) m/z 707 [M+H] + . Anal. Calcd for C42H42O10:C, 71.36; H, 6.00. Found: C, 71.24; H, 5.97. 

	). To a solution of 39 (331 mg, 1.3 mmol) in N,N-dimethylformamide (10 mL) were added potassium carbonate (452 mg, 3.3 mmol), tetrabutylammonium bromide (cat) and a solution of 40 (450 mg, 0.7 mmol) in N,N-dimethylformamide (10 mL). The mixture was stirred at 100°C for 4h. The mixture was cooled to 25°C, poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered, concentrated under reduced pressure and was purifed by flash silica column chromatography using dichloromethane:methanol (99:1 to 97:3) as eluent to afford dimer 4e as a yellowish solid (135 mg, 14%). C42H42O10. m.p 109-110°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.40 (s, 6H, CH3), 3.52-3.60 (m, 12H, CH2), 3.75-3.77 (m, 4H, CH2), 3.16-3.18 (m, 4H, CH2), 6.86 (s, 2H, H3), 7.08 (m, 4H, H3'), 7.57-7.63 (m, 4H, H7, H8), 7.78 (s, 2H, H5), 7.98-8.00 (m, 4H, Synthesis of compounds 44a and 44b p-Toluenesulfonicacid-2-(p-toluenesulfonyloxy)-ethylester (41). The crude was prepared according to general procedure O starting from ethylene glycol (1 g, 16.1 mmol) to afford 41 as a white solid (4.9 g, 83%). C16H18O6S2. m.p. 119-127°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.46 (s, 6H, CH3), 4.18 (s, 4H, CH2CH2), 7.34 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3), 7.73 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2). crude was prepared according to general procedure Q starting from 4-hydroxybenzaldehyde (720 mg, 5.9 mmol) and 41 (1 g, 2.7 mmol) to afford 42a as a white solid (630 mg, 86%). C16H14O4. m.p. 110-130°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.45 (s, 4H, CH2CH2), 7.06 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2), 7.87 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3), 9.91 (s, 2H, COH). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 66.58 (CH2CH2), 114.94 (C2), 130.46 (C4), 132.04 (C3), 163.45 (C1), 190.74 (CHO). MS (ESI) m/z 293 [M+Na] + . 4-(3-(4-Formylphenyloxy)propyloxy)benzaldehyde (42b). The crude was prepared according to general procedure Q starting from 4-hydroxybenzaldehyde (2 g, 16.4 mmol) and 1,3-dibromopropane (1.65 g, 8.2 mmol) and was washed in a mixture of ether/petroleum ether (1:1) to afford 42b as a white solid (1.8 g, 38%). C17H16O4. m.p. 135-137°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.29 (q, 2H, J = 6.0 Hz, CH2CH2CH2), 4.24 (t, 4H, J = 6.0 Hz, CH2CH2CH2), 7.02 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2), 7.84 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3), 9.86 (s, 2H, CHO). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 29.0 (CH2CH2CH2), 64.6 (CH2CH2CH2), 114.8 (C2), 130.2 (C4), 132.0 (C3), 163.8 (C1), 190.4 (CHO). MS (ESI) m/z 307 [M+Na] + . 2-Hydroxy-4,6-methoxyacetophenone (43). 2,4,6-trihydroxyacetophenone (10 g, 53.7 mmol) was dissolved with potassium carbonate (17 g, 12.1 mmol) in acetone (60 ml) at 0°C. Dimethylsulfate (13.5 g, 107.4 mmol) was added dropwise and the resulting mixture was stirred at room temperature for 2h. The excess of potassium carbonate was filtrated. The filtrate was concentrated under reduced pressure and the residue was extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude solid was washed with cyclohexane and filtered to afford 43 as a white solid (8.2 g, 77%). C10H12O4. m.p. 88-89°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.60 (s, 3H, COCH3), 3.80 (s, 3H, OCH3), 3.84 (s, 3H, OCH3), 5.90 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H3), 6.04 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H5). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 32.9 (COCH3), 55.5 (OCH3), 90.7 (C3), 93.4 (C5), 106.0 (C1), 162.9 (C6), 166.0 (C2); 167.5 H2'). II.2.1.3 (C4), 203.1 (CO). MS (ESI) m/z 195 [M-H] -.

13 

C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 20.4 (CH3), 67.5 (CH2), 68.7 (CH2), 69.8 (CH2), 69.9 (CH2), 105.2 (C3), 114.9 (C3'), 118.1 (C8), 122.9 and 123.3 (C10 and C1'), 124.0 (C5), 128.0 (C2'), 134.8 and 135.0 (C6 and C7), 153.8 (C2), 161.3 and 162.3 (C2 and C4'), 176.8 (CO). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 21.4 (CH3), 66.5 (CH2CH2), 127.7 (C2), 129.7 (C3), 132.1 (C1), 145.0 (C4). MS (ESI) m/z 393 [M+Na] + .

-(2-Hydroxy-4,6-dimethoxy-phenyl)-3-[4-(3-{4-[3-(2-hydroxy-4,6-dimethoxy-phenyl)-3- oxo-propenyl]-phenyloxy}-propyloxy)-phenyl]-propenone (44b). The

  

	II.2.1.4	Synthesis of compounds 49a and 49b
	3-(4-Allyloxy-phenyl)-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxy-phenyl)-propenone (45). The crude
	). The crude was prepared was prepared according to general procedure L starting from 43 (2.3 g, 11.5 mmol) and 36
	according to general procedure P starting from 42a (516 mg, 1.9 mmol) and 43 (1.5 g, 7.6 (1.9 g, 11.5 mmol) to afford 45 as a yellow solid (1.55 g, 40%). C20H20O5. m.p. 110-117°C.
	mmol) to afford 44a as a yellow solid (934 mg, 78%). C36H34O10. m.p. 220-227°C. 1 H NMR 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.84 (s, 3H, OCH3), 3.92 (s, 3H, OCH3), 4.58 (d, 2H, J = 5.3
	(400 MHz, DMSO-d6) δ 3.81 (s, 6H, OCH3), 3.90 (s, 6H, OCH3), 4.37 (s, 4H, CH2CH2), 5.94 Hz, OCH2CHCH2), 5.33 (d, 1H, J = 10.5 Hz, Hb), 5.43 (d, 1H, J = 1.2 Hz, J = 17.2 Hz, Ha),
	(d, 2H, J = 2.0 Hz, H3 or H5), 6.08 (d, 2H, J = 2.4 Hz, H3 or H5), 6.96 (d, 4H, J = 8.8 Hz, 5.96 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H3 or H5), 6.07 (m, 1H, OCH2CHCH2), 6.11 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H3
	or H5), 6.94 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H3'), 7.55 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H2'), 7.79 (d, 2H, J = 1.8 Hz,
	Hα, Hβ).	
		crude was prepared
	according to general procedure P starting from 42b (300 mg, 1 mmol) and 43 (785 mg, 4
	mmol) to afford 44b as a yellow solid (245 mg, 38%). C37H36O10. m.p. 192-200°C. 1 H NMR
	(400 MHz, DMSO-d6) δ 2.30 (q, 2H, J = 6.0 Hz, CH2CH2CH2), 3.82 (s, 6H, OCH3), 3.90 (s,
	6H, OCH3), 4.21 (t, 4H, J = 6.0 Hz, CH2CH2CH2), 5.94 (d, 2H, J = 2.4 Hz, H3 or H5), 6.09
	(d, 2H, J = 2.4 Hz, H3 or H5), 6.92 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3'), 7.54 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2'), 7.77
	(d, 4H, J = 3.6 Hz, Hα, Hβ). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) Problem of solubility in DMSO,
	inconclusive results. MS (ESI) m/z 641 [M+H] + . Anal. Calcd for C37H36O10: C, 69.36; H,
	5.66. Found: C, 68.94; H, 5.66.

H3'),

7.55 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2'), 7.77 (d, 4H, J = 3.6 Hz, Hα, Hβ)

.

13 

C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ Problem of solubility in DMSO, inconclusive results. MS (ESI) m/z 627 [M] + . Anal. Calcd for C36H34O10: C, 68.94; H, 5.47. Found: C, 68.64; H, 5.62.

113 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 55.7 (OCH3), 56.0 (OCH3), 69.0 (OCH2CHCH2), 91.3 and 93.9 (C3 and C5), 106.5 (C1), 115.2 (C3'), 118.2 (OCH2CHCH2), 125.3 (Cα or Cβ), 128.6 (C1'), 130.2 (C2'), 132.9 (OCH2CHCH2), 142.5 (Cα or Cβ), 160.5 (C4'), 162.6 and 166.2 (C4 and C6), 168.5 (C2), 192.7 (CO). MS (ESI) m/z 341 [M+H] + , 363 [M+Na] + .

2-(4-Allyloxy-phenyl)-5,7-dimethoxy-chromen-4-one (46). The

  dimethylformamide(6 mL) were added potassium carbonate (470 mg, 3.4 mmol), tetrabutylammonium bromide (cat.) and a solution of 47 (405 mg, 1.4 mmol) in N,Ndimethylformamide (6 mL). The mixture was stirred at 25°C for 30 min and at 80°C for 5h.

	The mixture was poured into water to form a solid which was filtrated and dried in oven. A
	2-(4-Hydroxy-phenyl)-5,7-dimethoxy-chromen-4-one (47). The crude was prepared solution of this solid in N,N-dimethylformamide (4 mL) was then added dropwise to a
	according to general procedure N starting from 46 (1 g, 3 mmol) to afford 47 as a green solid solution of allylbromide (51 mg, 0.4 mmol) and carbonate potassium (133 mg, 1 mmol) in
	(856 mg, 97%). C17H14O5. m.p. 289-295°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.82 (s, 3H, N,N-dimethylformamide (2 mL). The mixture was stirred at 25°C for 30min and at 60°C for
	OCH3), 3.89 (s, 3H, OCH3), 6.49 (s, 1H, H6 or H8), 6.59 (s, 1H, H3), 6.83 (s, 1H, H6 or H8), 4h until the complete consumption of 47. The mixture was cooled to 25°C and poured into
	6.90 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H3'), 7.88 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H2'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 1M hydrochloric acid to form a pale green solid which was filtered, dried in oven and washed
	55.8 (OCH3), 55.9 (OCH3), 93.2 and 96.0 (C6 and C8), 105.9 (C10), 108.1 (C3), 115.7 (C3'), with diethyl ether and dichloromethane to afford 49a as a pale green solid (45 mg, 5%).
	121.0 (C1'), 127.7 (C2'), 159.0, 160.0, 160.1 and 160.6 (C2, C5, C7 and C4'), 163.4 (C9), 175.5 C36H30O10. m.p. 265-275°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.82 (s, 6H, OCH3), 3.89 (s,
	(CO). MS (ESI) m/z 299 [M+H] + , 321 [M+Na] + . 6H, OCH3), 4.46 (s, 4H, CH2CH2), 6.50 (d, 2H, J = 2.0 Hz, H6 or H8), 6.68 (s, 2H, H3), 6.86
	p-Toluenesulfonicacid-2-(p-toluenesulfonyloxy)-propylester (48). The crude was prepared
	according to general procedure O starting from 1,3-propanediol (500 mg, 6.6 mmol) and was
	washed with diethyl ether and cyclohexane to afford 48 as a white solid (599 mg, 24%).
	C17H20O6S2. m.p. 99-102°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.98 (q, 2H, J = 6.0 Hz,
	CH2CH2CH2), 2.44 (s, 6H, CH3), 4.05 (t, 4H, J = 6.0 Hz, CH2CH2CH2), 7.34 (d, 4H, J = 8.8
	Hz, H2), 7.73 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 21.7 (CH3), 28.7
	crude was prepared (CH2CH2CH2), 65.9 (CH2CH2CH2), 127.9 (C2), 130.0 (C3), 132.7 (C1), 145.12 (C4). MS (ESI)
	according to general procedure M starting from 45 (309 mg, 0.9 mmol) to afford 46 as a m/z 407 [M+Na] + .
	yellow solid (235 mg, 77%). C20H18O5. m.p. 178-183°C. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.91
	(s, 3H, OCH3), 3.96 (s, 3H, OCH3), 4.62 (d, 2H, J = 5.2 Hz, OCH2CHCH2), 5.34 (d, 1H, J =
	10.5 Hz, Hb), 5.46 (d, 1H, J = 17.2 Hz, Ha), 6.12 (m, 1H, OCH2CHCH2), 6.38 (d, 1H, J = 2.2
	Hz, H6 or H8), 6.56 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H6 or H8), 6.62 (s, 1H, H3), 7.01 (d, 2H, J = 8.7 Hz,
	H3'), 7.82 (d, 2H, J = 8.7 Hz, H2'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 55.8 (OCH3), 56.5
	(OCH3), 69.0 (OCH2CHCH2), 92.9 and 96.1 (C6 and C8), 107.8 (C3), 109.3 (C10), 115.1 (C3'),

118.2 (OCH2CHCH2), 124.0 (C1'),

127.6 (C2'), 132.6 (OCH2CHCH2), 159.9, 160.7, 160.9 and 161.1 (C2, C5, C7 and C4'), 163.9 (C9), 177.69 (CO)

. MS (ESI) m/z 339 [M+H] + .

5,7-Dimethoxy

-2-(4-{2-[4-(5,7-dimethoxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-phenyloxy]-ethyloxy}phenyl)-chromen-4-one (49a). To a solution of 41 (252 mg, 0.7 mmol) in N,N-(d, 2H, J = 2.4 Hz, H6 or H8), 7.16 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3'), 8.01 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2'). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): Problem of solubility in DMSO, inconclusive results. MS (ESI) m/z 623 [M+H] + , 645 [M+Na] + . Anal. Calcd for C36H30O10

: C, 69,45; H, 4.86. Found: C, 59.40; H, 5.37. 

5,7-Dimethoxy-2-(4-{3-[4-(5,7-dimethoxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-phenyloxy] propyloxy}-phenyl)-chromen-4-one (49b). To

  CDCl3) Problem of solubility in DMSO, inconclusive results. MS (ESI) m/z 637 [M+H] + , 659[M+Na] + . Anal. Calcd for C37H32O10:C, 69.80; H, 5.07. Found: C, 59.18; H, 5.37. 

	II.2.2.	Synthesis of O-
	dimethylformamide (6 mL) were added potassium carbonate (460 mg, 3.3 mmol),
	tetrabutylammonium bromide (cat.) and a solution of 47 (398 mg, 1.3 mmol) in N,N-
	dimethylformamide (6 mL). The mixture was stirred at 25°C for 30 min, at 80°C for 5h and at
	25°C for 20h. The mixture was poured into water to form a solid which was filtrated, dried in
	oven and washed with diethyl ether to afford 49b as a pale green solid (316 mg, 37%).
	C37H32O10. m.p. 230-240°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.22 (q, 2H, J = 6.0 Hz,
	CH2CH2CH2), 3.82 (s, 6H, OCH3), 3.89 (s, 6H, OCH3), 4.25 (t, 4H, J = 6.0 Hz,

a solution of 48 (258 mg, 0.67 mmol) in N,N-CH2CH2CH2), 6.48 (d, 2H, J = 2.4 Hz, H6 or H8), 6.65 (s, 2H, H3), 6.83 (d, 2H, J = 2.4 Hz, H6

or H8),

7.11 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H3'), 7.97 (d, 4H, J = 8.8 Hz, H2')

.

13 

C NMR (100 MHz,

alkylated and C-alkylated derivatives of flavone II.2.2.1 Synthesis of O-alkylated derivatives of flavone 50a to 50d

  

	General procedure R. A solution of 3-hydroxyflavone (1 equiv.), potassium carbonate (3
	equiv.) and tetrabutylammonium bromide (cat.) in acetone (15 mL/mmol) was refluxed for 30
	min. A solution of halogenated derivative (1.1 equiv.) in acetone (5 mL/mmol) and potassium
	iodide (cat.) were added. The resulting mixture was refluxed for 2-5 h. The solution was
	cooled to 25°C, poured into water and extracted with ethyl acetate. The combined organic
	layers were washed with water, dried over magnesium sulfate, filtered and concentrated under
	reduced pressure.

  in dimethyl sulfoxide(8 mL/mmol). The reaction mixture was stirred at 25°C for 3 h then poured into 1M hydrochloric acid and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure to afford the intermediate diketone. This residue was directly dissolved in acetic acid (3.7 mL/mmol) and sulfuric acid (0.04 mL/mmol). The resulting mixture was heated at 95°C H5),6.93-6.95 (dd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 7.5 Hz, H6), 7.14-7.19 (ddd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 7.4 Hz, J = 8.1 Hz, H4),7.95 (s, 1H, phenol).13 C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 13.9

	for 1 h. The solution was cooled to 25°C and poured carefully into a saturated solution of sodium bicarbonate at 0°C and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with saturated sodium bicarbonate, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure. o Synthesis of compounds 54a to 54d 2-(1-Hydroxy-butyl)-phenol (51a). The crude was prepared according general procedure S starting from salicylaldehyde (1.5 g, 12.3 mmol) and propylmagnesium chloride (2M in (CHOHCH2CH2CH3), 117.3 (C3), 119.7 (C5), 127.3 (C6), 127.6 (C1), 128.9 (C4), 155.7 (C2). MS (ESI) m/z 165 [M-H] -. 2-(1-Hydroxy-pentyl)-phenol (51b). The crude was prepared according to general procedure S starting from salicylaldehyde (1.5 g, 12.3 mmol) and butylmagnesium bromide (2M in diethyl ether) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1) as eluent to afford 51b as a colorless oil (1.2 g, 81%). diethyl ether, 61.4 mmol) to afford 51a as an yellow oil (607 mg, 25%). C10H14O2. (CHOHCH2CH2CH3), 19.1 (CHOHCH2CH2CH3), 39.4 (CHOHCH2CH2CH3), 76.2 C11H16O2.

1 H NMR

(400 MHz, CDCl3) δ 0.95

(t, 3H, J = 7.3 Hz, CHOHCH2CH2CH3), 1.29-1.54 (m, 2H, CHOHCH2CH2CH3), 1.73-1.95 (m, 2H, CHOHCH2CH2CH3)

, 2.56 (s, 1H, 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.90 (t, 3H, J = 7.0 Hz, CHOHCH2CH2CH2CH3),

1.23-1.45 (m, 4H, CHOHCH2CH2CH2CH3), 1.74-1.94 (m, 2H, CHOHCH2CH2CH2CH3)

, 2.74 (s, 1H, CHOHCH2CH2CH2CH3), 4.81 (t, 1H, J = 6.7 Hz, CHOHCH2CH2CH2CH3),

6.80-6.87 

  , 130.1 (C4'),133.3 (C7), 134.1 (C1'), 156.0 (C9), 161.7 (C2), 178.6 (C4). MS (ESI) m/z 265 [M+H] + . Anal. Calcd for C18H16O2:C, 81.79; H, 6.10. Found C, 78.93; H, 6.67. The crude was prepared according to general procedure V starting from 53d (1.2 g, 4.7 mmol) to afford 54d as a yellow oil (382 mg, 6%). C16H12O2. m.p. 74-75°C. 1 H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.17 (s, 3H, CH3),7.38-7.42 (m, 1H, H6), 7.45 (dd, 1H, J = 0.4 Hz, J = 8.4 Hz, H8), 7.52-7.54 (m, 3H, H3', H4'), 7.63-7.68 (m, 3H, H7, H2'), 8.26 (dd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 8.0 Hz, H5).

	3-Methyl-2-phenyl-chromen-4-one (54d).

13 

C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 11.9 (CH3), 117.7 (C3), 118.0 (C8), 122.7 (C10), 124.9 (C6), 126.0 (C5), 128.6 and 129.1 (C2' and C3'), 130.3 (C4'), 133.5 (C7), 133.6 (C1'), 156.3 (C9), 161.2 (C2), 179.0 (C4). MS (ESI) m/z 237 [M+H] + , 259 [M+Na] + . Anal. Calcd for C16H12O2

: C, 81.34; H, 5.12. Found C, 81.44; H, 5.29. 

)-1-(2-Hydroxy-6-methoxyphenyl)-3-ferrocenyl-propenone (55b).

  ). The crude was prepared according to general procedure W starting from commercially available 2-hydroxyacetophenone (640 mg, 4.7 mmol) and was recrystallized in cyclohexane to afford 55a as a violet solid (1.2 g, 74%). C19H16FeO2. m.p. 160-161 °C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.21 (s, 5H, C5H5),4.61 (s, 2H, Hc), 4.91 (s, 2H, Hb), 6.97-7.01 (m, 2H, H3, H5), 7.55-7.58 (m, 2H, Hα, H4), 7.82 (d, 1H, J = 15.0 Hz, Hβ), 8.16 (d, 1H, J = 7.5 Hz, H6), 12.9 (s, 1H, OH).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.6 (Cb), 69.7 (C5H5), 71.9 (Cc),78.7 (Ca), 117.7, 117.9, 119.0 and 120.4 (C1, C3, C5 and Cα), 130.4 (C6), 135.9 (C4), 148.1(Cβ), 162.1 (C2), 192.6 (CO). MS (ESI) m/z 332 [M] + , 355 [M+Na] + . Anal. Calcd for C19H16FeO2: C, 65.53; H, 4.64. Found C, 68.41; H, 4.99. The crude was prepared according to general procedure W starting from 2-hydroxy-6-methoxyacetophenone (1 g, 6 mmol) and was recrystallized in cyclohexane/ethyl acetate (8:2) to afford 55b as a violet solid (1.6 g, 72%). C20H18FeO3. m.p. 129-130 °C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.74 (s, 3H, OCH3), 4.18 (s, 5H, C5H5), 4.50 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hc), 4.69 (t, 2H, J = 1.7 Hz,Hb), 6.55 (d, 2H, J = 9.0 Hz, H3, H5),6.64 (d, 1H, J = 15.8 Hz, Hα), 7.14 (d, 1H, J = 15.8 Hz, Hβ), 7.22 (t, 1H, J = 8.3 Hz, H4), 10.26 (s, 1H, OH).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 55.6 C, 66.31; H, 5.02. Found C, 66.29; H, 5.07. afford 56b as a violet solid (786 mg, 95%). C20H16FeO3. m.p. 204-205°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.91 (s, 3H, OCH3), 4.20 (s, 5H, C5H5), 4.60(t, 2H, J = 1.7 Hz, Hc), 4.90 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hb), 6.74 (s, 1H, H10), 6.80 (d, 1H, J = 8.3 Hz, H5 or H7), 7.02 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H5 or H7), 7.69 (t, 1H, J = 8.2 Hz, H6).13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 56.1 (OCH3), 69.7 (C5H5), 71.1 (Cb), 71.4 (Cc), 75.0 (Ca), 104.7 and 105.7 (C5 and C7), 110.7 (C9), 114.1 (C10), 138.5 (C6), 145.2 (C2), 157.9 (C4), 165.7 (C8), 179.2 (CO). MS (ESI) m/z 361 [M+H] + , 383 [M+Na] + . Anal. Calcd for C20H16 FeO3:C, 66.68; H, 4.49. Found C, 65.16; H, 

	(OCH3), 69.0 (Cb), 69.6 (C5H5), 71.4 (Cc), 78.4 (Ca), 102.2 (C5), 108.9 (C3), 115.9 (C1), 125.7
	(Cα), 131.1 (C4), 147.0 (Cβ), 156.6 and 157.8 (C2 and C6), 193.9 (CO). MS (ESI) m/z 385
	[M+Na]

(E+ . Anal. Calcd for C20H18FeO3:

  m.p. 193-194°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.87 (s, 3H, OCH3), 3.91 (s, 3H, OCH3), 4.18 (s, 5H, C5H5), 4.55 (s, 2H, Hc), 4.86 (s, 2H, Hb), 6.31 (s, 1H, H10), 6.62 (s, 1H, H5 or H7), 6.67 (s, 1H, H5 or H7). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 56.3 and 56.4 (OCH3), 69.5 (C5H5), 70.7 (Cb), 71.0 (Cc), 75.1 (Ca), 89.7 and 94.1 (C5 and C7), 104.8 (C9), 112.2 (C10), 146.1 (C2), 158.7 (C4 or C6), 167.6 and 168.3 (C4 or C6 and C8), 177.6 (CO). MS (ESI) m/z 391 [M+H] + , 413 [M+Na] + . Anal. Calcd for C22H18FeO4:C, 64.63; H, 4.66. Found C, 62.29; H, 4.39. 

  1 H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.19 (s, 5H, C5H5), 4.57(t, 2H, J = 1.7 Hz, Hc), 4.86 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hb), 6.59 (d, 1H, J = 8.2 Hz, H5 or H7), 6.76 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H5 or H7), 6.85 (s, 1H, H10), 7.49 (t, 1H, J = 8.2 Hz, H6), 7.90 (s, 1H, OH).13 C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 70.1 (C5H5), 71.7 and 72.1 (Cb and Cc), 74.9 (Ca), 103.7 and 109.4 (C5 and C7), 110.6 (C9), 116.9 (C10), 138.5 (C6), 145.6 (C2), 156.8 (C4), 164.4 (C8), 183.9 (CO). MS (ESI) m/z 369 [M+Na] + . Anal. Calcd for C19H14FeO3: C, 65.92; H, 4.08. Found C, 64.99; H, 4.07. The crude was prepared according to general procedure Y starting from 6-hydroxy-2,3-hydrobenzo[b]furan-3-one (300 mg, 2 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1 to 8:2) as eluent to afford 57b as a violet solid (31 mg, 4%). C19H14FeO3. m.p. 271-272°C. 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 4.19 (s, 5H, C5H5), 4.57 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hc), 4.88 (t, 2H, J = 1.7 Hz, Hb), 6.65 (dd, 1H, J = 1.7 Hz, J = 8.5 Hz, H5), 6.68 (s, 1H, H10), 6.72 (d, 1H, J = 1.7 Hz, H7), 7.56 (d, 1H, J = 8.4 Hz, H4). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 69.6 (Cb), 71.0 (C5H5), 71.2 (Cc), 75.1 (Ca), 98.6 (C7), 112.8 and 113.4 (C5 and C10), 113.7 (C9), 125.6 (C4), 146.3 (C2), 166.0 and 167.2 (C6 and C8), 179.9 (CO). MS

	(Z)-2-Ferrocenylidene-6-hydroxy-benzofuran-3-one (57b).

(ESI) m/z 345 [M-H] -. Anal. Calcd for C19H14FeO3:

C, 65.92; H, 4.08. Found C, 66.30; H, 4.83. 

  1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3.93 (s, 3H, OCH3), 4.21 (s, 5H, C5H5), 4.60 (t, 2H, J = 1.9 Hz, Hc), 5.07 (t, 2H, J = 1.9 Hz, Hb),6.55 (s, 1H, H3), 7.04 (dd, 1H, J = 2.4 Hz, J = 8.8 Hz, H6), 7.20 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H8), 7.90 (d, 1H, J = 8.8 Hz, H5). 13 C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 56.1 (OCH3), 67.4 (Cb), 70.1 (C5H5), 71.3 (Cc), 74.9 (Ca), 100.7 (C8), 104.9 (C3), 114.3 (C6), 117.3 (C10), 126.2 (C5), 157.5 (C9), 163.6 (C7), 167.2 (C2), 175.5 (CO). MS (ESI) m/z 361 [M+H] + . Anal.

  13 C NMR (CD3OD, 126 MHz) δ 22.2 (C4),22.3 (C5),25.3 (C3),35.8 (C6), 43.3 (C2), 44.1 (N(CH3)2), 55.5 (OCH3), 59.9 (C7),74.9 (C1), 113.2 (C4'), 113.4 (C2'), 119.3 (C6'), 130.3 (C5'), 148.9 (C1'), 161.2 (C3'). HRMS (ESI) m/z calcd for C16H25NO2264.1964, found 264.1951 [M+H] + . H5), 1.75 (m, 2H, H6), 2.30 (m, 2H, H4), 2.37 (m, 2H, H7), 3.83 (s, 3H, OCH3), 6.63 (tt, 1H, J = 1.7 Hz, J = 3.8 Hz, H3), 7.10 (ddd, 1H, J = 1.1 Hz, J = 2.5 Hz, J = 7.8 Hz, H4'), 7.12 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H2'), 7.15 (dt, 1H, J = 1.1 Hz, J = 7.8 Hz, H6'), 7.35 (t, 1H, J = 7.8 Hz, H5'). 13 C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 22.5 (C5), 22.9 (C6), 24.7 (C7), 26.8 (C4), 55.7 (OCH3), 114.8 (C2'), 118.2 (C4'), 122.3 (C6'), 130.1 (C5'), 139.5 (C2), 141.0 (C1'), 146.1 (C3), 160.8 (C3'), 199.8 (C1). HRMS (ESI) m/z calcd for C14H16O2 217.1229, found 217.1220 [M+H] + .

	Cyclohexen-1-yl-(3-methoxyphenyl)methanone (72). C14H16O2. 1 H NMR (500 MHz,
	CD3OD) δ 1.69 (m, 2H,

  FLORINE LECERF-SCHMIDT a,b CONCEPTION ET DÉVELOPPEMENT DE NOUVEAUX LIGANDS DES TRANSPORTEURS ABCG2 ET MRP1 DANS LE CADRE DE LA RÉSISTANCE À DE MULTIPLES DROGUES ANTICANCÉREUSES. : La résistance à de multiples drogues anticancéreuses (Multidrug Resistance ou MDR) est actuellement un problème majeur dans le cas de nombreuses chimiothérapies. Parmi les mécanismes à l'origine de la MDR, la surexpression de protéines membranaires de type ABC est le plus étudié. Les deux protéines ABCG2 et MRP1 sont parmi les protéines membranaires impliquées. Ces transporteurs sont capables d'induire un efflux massif des agents anticancéreux hors des cellules cancéreuses, réduisant ainsi leur concentration intracellulaire et donc leur efficacité thérapeutique. Afin de contrecarrer cette chimiorésistance, notre objectif s'est concentré sur le développement de nouveaux modulateurs d'ABCG2 et de MRP1. Dans ce cadre, de nouveaux inhibiteurs d'ABCG2, dérivés de chromones, ont été conçus afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses aux agents anticancéreux. De plus, la modélisation de modèles pharmacophores nous a permis d'obtenir de nouvelles informations quant aux interactions ABCG2-ligands. Les nouveaux modulateurs de MRP1, dérivés de flavonoïdes, sont capables quant à eux d'induire un efflux massif de glutathion cellulaire via MRP1, sans être transportés eux même, entraînant l'apoptose sélective des cellules cancéreuses surexprimant le transporteur. Mots clé : ABCG2, MRP1, flavonoïdes, modulateurs, chimiorésistance, chimiothérapie ciblée. DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEW LIGANDS OF ABCG2 AND MRP1 TRANSPORTERS TARGETING THE MULTIDRUG RESISTANCE (MDR).

	B) H)	17_D O Spectre HMBC de la fraction 6 Br Spectre COSY	0,57	H*O*H	0,61	Glob-Sum
			1_A ET 18_A		0,72	H*O*H	0,74	N1*DRY
	AP-355/42008318	1_A ET 17_D O		0,65	DRY*O AP-355/40779894	0,64	H
			18_A ET 17_D NH		0,75	Glob-Sum	0,75	Glob-Sum
		Br	/ O	Cl	0,86	H*DRY/DRY	0,84	DRY
	AP-355/42539334 Résumé	1_A 14_A O		0,94 0,84	H*DRY DRY AN-646/41051368	0,93 0,73	DRY DRY
		Modèles Pharmacophores 3S_VolSurf	1_A ET 14_A Contraintes 13_D NH		AUC 0,60 CHAMPS Paramètres H*O*DRY 0,60 O	AUC 0,65 PSEUDO-CHAMPS Paramètres H*N1*H 0,65 H*O*RY
	AK-830/13217104	/ 1_A ET 13_D		0,85 0,76	DRY N1*DRY AE-562/12222653	0,78 0,73	DRY H*DRY*H
			1_A 14_A ET 13_D		0,84 0,75	DRY Glob-Sum	0,77 0,73	DRY H*N1*H
			21_A		0,80	O	0,78	DRY
	5S AP-355/40779892 B)	20_D		0,64	Distance_1 AK-087/42718243	0,78	DRY
		Modèles pharmacophores	1_A ET 21_A 1_A ET 20_D 21_A ET 20_D Contraintes		0,63 0,76 0,75 AUC	DRY DRY*O Glob-Sum CHAMPS Paramètres	0,73 0,66 0,75 PSEUDO-CHAMPS Glob-Prod Distance_1 Glob-Sum AUC Paramètres
			/ /		0,73 0,97	DRY H*O*N1	0,63 0,84	DRY Glob-Prod
			1_A 5_A		0,79 0,89	DRY H*O*N1	0,64 0,85	H*O*N1 Glob-Prod
			9_A 19_A		0,75 0,99	O N1*O	0,71 0,84	H*N1 O
		3_1S 5I	8_D 20_A		0,63 0,95	N1*O H*O*N1	0,61 0,86	H*O*H Glob-Prod
	C)	Spectre HSQC	1_A ET 9_A 9_D 1_A ET 8_D 14_D		0,70 0,67 0,65 0,69	N1 DRY*O H*O*H Glob-Prod	0,74 0,65 0,63 0,68	O N1 DRY*O Glob-Prod
			9_A ET 8_D 19_A ET 20_A		0,75 0,69	Glob-Sum Glob-Sum	0,78 0,68	Glob-Sum Glob-Sum
			/ /		0,79 0,95	DRY H*O*N1	0,72 0,75	DRY Glob-Prod
		3_1I	1_A 1_A		0,72 0,92	DRY H	0,71 0,77	DRY Glob-Prod
			9_A 19_D		0,76 0,70	O Glob-Prod	0,69 0,68	DRY H*O*N1
		3_2S	8_D /		0,58 0,93	DRY H*N1*H	0,62 0,71	H O
		3_2I	1_A ET 9_A 9_A		0,57 0,82	H*O*H H*N1*H	0,69 0,73	N1 Distance_1
			1_A ET 8_D 10_10		0,68 0,64	H*O Glob-Sum	0,61 0,71	H*N1*H O
		3_3I	9_A ET 8_D / / 12_A		0,75 0,87 0,75 0,72	Glob-Sum DRY H H	0,75 0,83 0,76 0,74	Glob-Sum DRY O O
			1_A /		0,95 0,78	DRY H*N1*H	0,86 0,74	DRY O
		3_3S 5I_VolSurf	13_A 12_D 1_A 15_A		0,81 0,57 0,71 0,85	DRY DRY*O H*N1 H	0,73 0,64 0,75 0,75	Glob-Prod Glob-Prod O O
			1_A ET 13_A 1_A ET 15_A		0,82 0,70	H*O*N1 H*DRY	0,83 0,73	DRY H*O*H
			1_A ET 12_D /		0,72 0,85	H*N1 H	0,72 0,82	H*O*DRY Glob-Prod
		3I_VolSurf	13_A ET 12_D 18_A		0,75 0,87	Glob-Sum H	0,69 0,80	Glob-Sum Distance_1
			/ 6_D		0,88 0,69	DRY Glob-Prod	0,83 0,72	DRY O
		5S_VolSurf	1_A		0,88	DRY	0,91	DRY
			18_A		0,80	O	0,69	H*DRY*N1

composés (5S)

Ainsi, un premier criblage virtuel a été réalisé sur les 200 premiers composés issus du préfiltrage à l'aide de notre modèle pharmacophore en mode champs. Les 20 premières solutions selon le descripteur H*DRY ont été sélectionnées. Ce même travail a été réalisé en mode pseudo-champs et les 20 premières solutions selon le descripteur DRY ont été sélectionnées.

pour l'ATP est deux à trois fois supérieure à celle du NBD2, ce dernier étant le site d'hydrolyse de l'ATP. Des résultats de modélisation moléculaire du dimère NBD1/NBD2 combiné à des simulations de dynamique moléculaire suggèrent que NBD1 est capable d'hydrolyser l'ATP avec une très faible efficacité et que le taux de largage de l'ADP par NBD1 pourrait être l'étape limitante du cycle de transport de MRP1. 344I.1.10. Les rôles physiologiques de MRP1La diversité des substrats transportés ainsi que son expression étendue au sein de l'organisme suggèrent différents rôles physiologiques joués par MRP1. L'un des substrats les plus transporté par la protéine est le LCT4. Les cystéinyls leucotriènes (LTC4 mais également LTD4 et LTE4 issus de la conversion de LTC4) sont impliqués dans un grand nombre de pathologies telles que les réactions inflammatoires et anaphylactiques, l'asthme, les réactions allergiques, l'hypertension et les crises cardiaques.[345][346][347][348][349][350][351] La présence de MRP1 au sein des barrières hématologiques placentaires, cérébrales et testiculaires indique un rôle de protection des sites vitaux de l'organisme par le transporteur.En effet, il a été observé chez les souris mrp1-/-une augmentation du passage de substrats de MRP1 du sang vers le liquide cérébrospinal. Au sein du placenta, MRP1 serait capable de protéger le foetus des xénobiotiques et permettrait la prévention de l'accumulation foetale d'endobiotiques tels que E217βG.307, 308 Pour finir, l'efflux d'estrone sulfate par les cellules de Leydig permettrait d'aider les testicules à se protéger des effets féminisants de l'estrogène.330 Du fait de son implication dans le transport du GSH et du GSSG, MRP1 permettrait également de maintenir le potentiel redox des cellules.352, 353 En effet, MRP1 protègerait les astrocytes de rats contre une exposition au H2O2 353 et serait impliqué dans le transport de substrats produits lors des périodes de stress oxydatif tels que le 4-hydroxynonenal-GS, composé toxique issu de la peroxidation lipidique.354 

Schéma réactionnel 16 : Synthèse du composé 40. II.4.2.2 Synthèse des dimères 44a/b et 49a/b D'après les travaux de Wong et Chow, 407 deux voies rétrosynthétiques sont possibles afin de synthétiser les dimères souhaités à partir du 4-hydroxybenzaldéhyde (Schéma rétrosynthétique 2).

Schéma réactionnel 29.441 

Le tramadol est utilisé par voie orale, parentérale ou rectale pour des doses comprises entre 50 et 100 mg. Après une administration orale, le tramadol est rapidement et complètement absorbé. Les comprimés à libération prolongée libèrent le principe actif sur une période de 12 heures, atteignant la concentration maximale de libération après 4,9 heures et présentent une biodisponibilité de 87-95% en comparaison aux capsules. Le tramadol ainsi que l'ensemble de ses métabolites sont conjugués à l'acide glucuronique avant leur excrétion par les reins. La durée de demi-vie moyenne est d'environ 6 heures.L'utilisation de tramadol entraine l'apparition de certains effets secondaires tels que des vertiges, des nausées, de la somnolence, des vomissements et des céphalées. Contrairement aux autres opiacés, le tramadol présente un risque faible de détresse respiratoire aux doses thérapeutiques. De plus, en raison de sa faible affinité avec les récepteurs opioïdes, les risques de pharmacodépendances sont amoindris.451, 452 Le tramadol présente également des effets antidépresseurs,453 et est utilisé pour le traitement des troubles psychiatriques, de l'anxiété 454 et de l'éjaculation précoce. 455 I.2. NAUCLEA LATIFOLIA, UNE PLANTE AUX MILLE VERTUS Nauclea Latifolia Smith, connu sous le nom de pécher africain, est un arbuste de la famille des rubiacées abondamment répandu dans toute l'Afrique tropicale. Il peut pousser jusqu'à

II.2.3.2 Synthesis of ferrocenyl aurones

(Z)-2-Ferrocenylidene-benzofuran-3-one (56a). To a solution of benzofuran-3(2H)-one (500 mg, 3.7 mg) in dichloromethane (75 mL) were added ferrocene carboxaldehyde (1.2 g, 5.6 mmol) and neutral aluminium oxide (15 g, 4 g/mmol). The resulting mixture was stirred at room temperature for 8h. The solution was filtered through a pad of celite and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The crude was recrystallized in cyclohexane to afford 56a as a violet solid (898 mg, 75%). C19H14FeO2. General procedure X. To a solution of ferrocenyl chalcone (1 equiv.) in pyridine ( 18mL/mmol) was added mercury (II) acetate (2.5 equiv.). The resulting mixture was refluxed for 5 h. The solution was cooled to 25°C, poured into 6M hydrochloric acid at 0°C and extracted with ethyl acetate. The combined organic layers were washed with water, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.

(Z)-2-Ferrocenylidene-4-methoxy-benzofuran-3-one (56b). The crude was prepared according to general procedure X starting from 55b (782 mg, 2.2 mmol) and was purified by flash silica column chromatography using cyclohexane/ethyl acetate (9:1 to 8:2) as eluent to