), ein Mitglied der Familie der Herpesviridae

Keywords: ist ein weltweit verbreiteter Infektionserreger. Es verursacht Erkrankungen des Respirationstraktes, hinaus die Möglichkeit, geimpfte von feldinfizierten Markerimpfung und Markerdiagnostik sind jedoch mit Problemen behaftet, die sich beispielsweise infektiöses künstliches bakterielles Chromosom (Bacterial Artificial Chromosome, -Technologie, die in den letzten Jahren die Bisher sind vier Bovine Herpesviren wird darum auch als bovines orphan-Herpesvirus erkrankten, oder in der Inkubation befindlichen, sowie latent infizierten Tieren. Darüber hinaus spielen belebte und unbelebte Vektoren eine Rolle. Die Inkubationszeit beträgt Nasenausfluss, der progressiv seromukös und final, als Folge von bakteriellen Superinfektionen, mukopurulent wird. Diese äußerlichen klinischen Erscheinungen werden Infektion als Exanthem der kutanen Vulvovaginal-bzw. Präputialschleimhaut. Beide BHV-1-Subtypen stehen darüber hinaus im kausalen Zusammenhang mit Aborten sowie Konjunktivitis oder Keratokonjunktivitis Ganglion, um dort eine Latenz zu etablieren und in dieser zu verbleiben. Während der Latenzphase unterbleibt die virale Replikation, und es werden keine BHV-1-Virionen gebildet. Einmal infizierte Tiere sind somit lebenslange Virusträger. Durch Immunsuppression und natürlich auftretende Stresssituationen wie Transport, Geburt und klinische Erkrankung kann die latente Infektion reaktiviert werden. BHV-1 gelangt dann durch einen einheitlichen Aufbau gekennzeichnet und bestehen aus vier morphologisch unterscheidbaren Strukturen, dem Core, dem Kapsid, dem Tegument und der Virushülle ein Nukleoprotein, mit dem das doppelsträngige, lineare DNA-Genom assoziiert ist, ist umschlossen von dem ikosaedrischen Kapsid, das aus bilden gemeinsam das Nukleokapsid, und werden von einer Proteinmatrix, dem sogenannten Tegument umgeben, das wiederum umhüllt ist von einer Lipidmembran zellulären Ursprungs, in die virale (Glyko)Proteine inseriert sind (Mettenleiter, 2002). Nach biologischen Kriterien wird die Familie der Herpesviridae von dem International Alphaherpesviren zählen neben BHV-1, das Herpes simplex Virus Typ 1

___________________________________________________________________ 5. Diskussion 79 5.1 Charakterisierung des infektiösen BHV-1-BAC-Klones BHV-1∆gE in vitro 79 5.2 Charakterisierung der Doppelmutante BHV-∆gE-gG in vitro 81 5.3 Charakterisierung der Doppelmutante BHV-1∆gE-gM in vitro 84 5.

 [START_REF] Van Regenmortel | Virus taxonomy. Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses[END_REF]. Alphaherpesviren sind durch ein relativ weites Wirtsspektrum, kurze Replikationszyklen und rasches Viruswachstum in vitro gekennzeichnet (Roizman et al., 1981).

Hinsichtlich ihrer genomischen Organisation werden Herpesviren in die Gruppen A-F eingeteilt. Das ca. 136 Kilobasenpaare (kbp) umfassende BHV-1-Genom setzt sich zusammen aus singulären (unique) Segmenten unterschiedlicher Länge. Das kürzere der beiden Segmente, die sog. Unique Short-Region (U S ) wird von zwei identischen repetitiven Genomabschnitten, den Internal bzw. Terminal Repeats (IR, TR) flankiert. Die IR-Region trennt die U S von der sogennanten Unique Long-Region (U L ) (Abbildung 1). Diese Organisation entspricht der eines herpesviralen Genoms der Gruppe D [START_REF] Roizman | Herpesviridae[END_REF]. Die zur Gruppe D der herpesviralen Genome gehörenden Spezies bilden während der Replikation zwei äquimolare Formen der DNA, die sich hinsichtlich der Orientierung der Unique Short relativ zur Unique Long unterscheiden [START_REF] Wirth | The three major immediate-early transcripts of bovine herpesvirus 1 arise from two divergent and spliced transcription units[END_REF] Literaturübersicht ___________________________________________________________________

BHV-1-Immunologie

Die BHV-1-Infektion provoziert sowohl eine unspezifische als auch eine spezifische Immunantwort [START_REF] Babiuk | Immunology of bovine herpesvirus 1 infection[END_REF]. Als Ausdruck der unspezifischen Immunität produzieren infizierte Zellen Interferon α und β. Die parakrin sezernierten Interferone diffundieren in das umgebende Gewebe und binden an zelluläre Interferonrezeptoren. Diese Bindung löst in den Zielzellen eine Signalkaskade aus, die in der Etablierung eines antiviralen Status, der Reprimierung des Zellzyklus und der Freisetzung weiterer Zytokine resultiert. Die Faktoren des Komplementsystems stellen weitere lösliche Mediatoren der unspezifischen BHV-1 Immunität dar. Verschiedene Zelltypen wie Makrophagen, neutrophile Granulozyten und Natürliche Killerzellen sind ebenfalls an unspezifischen Abwehrmechanismen beteiligt [START_REF] Campos | Role of interferon-gamma in inducing cytotoxicity of peripheral blood mononuclear leukocytes to bovine herpesvirus type 1 (BHV-1)-infected cells[END_REF][START_REF] Denis | Infectious bovine rhinotracheitis (bovine herpesvirus 1): Helper T cells, cytotoxicity T cells and NK cells[END_REF].

Die spezifische Immunantwort basiert neben der Bildung von Antikörpern durch B-Lymphozyten (humorale Immunität) auf der T-Zell-Immunität. Innerhalb von 2 Wochen post infectionem (p. i.) sind im Serum Immunglobuline (Ig), zunächst IgM später IgG, detektierbar, die über Jahre persistieren können [START_REF] Van Der Poel | Persistence of bovine herpesvirus-1-specific antibodies in cattle after intranasal vaccination with a live virus vaccine[END_REF]. Gegen die BHV-1-Hauptimmunogene, die Glykoproteine B und D (gB und gD), sind bereits 8 bis 14 Tage p. i. Antikörper nachweisbar, gegen das weniger immunogene gE erst nach 14 bis 35 Tagen [START_REF] Kaashoek | Virulence, immunogenicity and reactivation of bovine herpesvirus 1 mutants with a deletion in the gC, gG, gI, gE, or in both the gI and gE gene[END_REF]. In den Schleimhäuten werden als primäre Barriere gegen die Infektion lokal Immunglobuline der Klasse A (IgA) sezerniert, die etwa 6 bis 8 Wochen persistieren. Nach einer Reinfektion oder -aktivierung eines latent infizierten Tieres kommt es zu einer sekundären anamnestischen Immunantwort mit einem erneuten Anstieg der Antikörpertiter innerhalb weniger Tage. Kälber BHV-1-positiver Kühe erhalten über die Kolostralmilch Antikörper, die monatelang nachweisbar sind. Diese maternalen Antikörper schützen die Neonaten zwar vor einer klinischen Erkrankung, behindern aber auch die Ausbildung einer aktiven Immunität nach Vakzination [START_REF] Lemaire | Effects of bovine herpesvirus type 1 infection in calves with maternal antibodies on immune response and virus latency[END_REF].

Die neutralisierende Wirkung virusspezifischer Antikörper beruht darauf, dass die Virionen, infolge der Bindung der Immunglobuline an Glykoprotein C (gC), gB und gD nicht mehr an die Wirtszelle adsorbieren können (McLain und Fuller, 1994). Diese Fähigkeit der Antikörper zur Virusneutralisation ist aber nur bis zum Auftreten erster entzündlicher Läsionen effektiv, da sich das Virus nun unbeeinflusst von zirkulierenden Antikörpern von Zelle zu Zelle (cellto-cell spread, CTCS) ausbreiten kann [START_REF] Babiuk | Immunology of bovine herpesvirus 1 infection[END_REF] Infektionen [START_REF] Babiuk | Immunology of bovine herpesvirus 1 infection[END_REF].

Vakzinierung gegen BHV-1-Infektionen

Da bei einer BHV-1-Infektion therapeutische Erfolge auf die Bekämpfung von Symptomen und die Verhinderung bakterieller Sekundärinfektionen durch Antibiotikagaben beschränkt sind, ist die prophylaktische Impfung der Rinder ein wichtiges Instrument der BHV-1-Bekämpfung. Die Impfung schützt die Tiere zwar zuverlässig vor einer klinischen Erkrankung, verhindert aber nicht die permissive oder latente Infektion mit dem Feldvirus (Kaashoek et al., 1996). Durch den Impfschutz kann jedoch die Ausscheidung von Feldviren soweit reduziert werden, dass die Ansteckung von Nachbartieren eingeschränkt wird. Zum Einsatz kommen Lebendimpfstoffe oder inaktivierte Vakzinen (Van Oirschot et al., 1996a).

Lebendimpfstoffe besitzen den Vorteil, dass sie auch zur Notimpfung eingesetzt werden können, um eine weitere Ausbreitung im Bestand zu verhindern. Die schnellste Wirkung wird bei intranasaler Applikation des Lebendimpfstoffes erzielt, die bereits innerhalb von Stunden zu einer lokalen Schleimhautimmunität führt (Kaashoek und Van Oirschot, 1996). Inaktivierte Vakzinen schützen vor klinischer Erkrankung, sollten aber nur in Beständen ohne aktuelles klinisches Geschehen eingesetzt werden.

Aufgrund der gesetzlichen Regelung dürfen in der Bundesrepublik Deutschland zur Impfung gegen BHV-1 nur noch Markervakzinen mit einer Deletion des Glykoprotein E eingesetzt werden. Nur in Ausnahmefällen wird der Einsatz von konventionellen Impfstoffen in Mastbeständen und zur Reagentenimpfung gestattet. Markervakzinen sind Impfstoffe basierend auf Vakzinestämmen, die strukturell so verändert sind, dass Vakzine-und Feldvirus durch die Provokation eines heterologen Antikörperprofils unterscheidbar sind (Van Oirschot et al., 1996b). In der EU werden diese Impfstoffe akronymisch als DIVA-Vakzinen (differentiating infected from vaccinated animals) bezeichnet [START_REF] Van Oirschot | Diva vaccines that reduce virus transmission[END_REF]. Es existieren in der Veterinärmedizin verschiedene Ansätze für Markerimpfstoffe: Positiv-Marker-und Subunit-Vakzinen sowie Negativ-Markervakzinen. Positiv-Marker-Vakzinen unterscheiden sich von Feldviren darin, dass sie ein zusätzliches Immunogen beinhalten. Ein Literaturübersicht ___________________________________________________________________ großer Nachteil dieses Markerprinzips ist, dass Feldvirusinfektionen post vaccinationem (p. v.) nicht mehr nachgewiesen werden können. Von Subunit-Impfstoffen spricht man, wenn nur einzelne, besonders immunogene Proteine des Erregers als Vakzine verwendet werden.

Für das, durch virale (Adeno-und Bakulovirus) Vektoren exprimierte, Glykoprotein D (gD) konnte eine Eignung als BHV-1-Subunit-Vakzine gezeigt werden [START_REF] Literatur Abdelmagid | Evaluation of baculovirus-expressed bovine herpesvirus-1 (BHV-1) glycoproteins for detection and analysis of BHV-1-specific antibody responses[END_REF][START_REF] Gogev | Induction of protective immunity to bovine herpesvirus type 1 in cattle by intranasal administration of replication-defective human adenovirus type 5 expressing glycoprotein gC or gD[END_REF]. Die in ein Expressionsplasmid klonierte, für gD kodierende Nukleotidsequenz wurde darüber hinaus erfolgreich als DNA-Vakzine eingesetzt [START_REF] Lewis | Induction of immune responses to bovine herpesvirus type 1 gD in passively immune mice after immunization with a DNA-based vaccine[END_REF][START_REF] Loehr | Priming by DNA immunization augments T-cell responses induced by modified live bovine herpesvirus vaccine[END_REF]. Negativ-Markervakzinen basieren auf Virusstämmen, bei denen ein Gen teilweise oder vollständig deletiert ist (Deletionsmutanten). Solche Mutanten können auf natürlichen Wege entstehen oder gentechnisch hergestellt werden. Beim Einsatz der Negativ-Markervakzinen ist eine Feldvirus-Infektion auch p. v. detektierbar. Einen weiteren Vorteil bietet die Möglichkeit, sowohl Lebend-, als auch inaktivierte Impfstoffe herzustellen.

Summiert man die Vor-und Nachteile der unterschiedlichen Markerprinzipien, stellt sich der Einsatz von Negativ-Markervakzinen das erfolgversprechendste Konzept dar.

Die gE-deletierten Impfviren, die bis heute in der EU als Negativ-Markervakzine eingesetzt werden, gehen sämtlich auf nicht-gentechnisch entstandene BHV-1-Labormutanten zurück, deren genetische Information für das Glykoprotein E (gE) durch in vitro-Passagierung verloren ging [START_REF] Kaashoek | A conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and safe vaccine[END_REF][START_REF] Rijsewijk | Characterization of a DNA rearrangement found in the unique short region of the Za strain of bovine herpesvirus type 1 and the vaccine properties of this strain[END_REF][START_REF] Van Engelenburg | A glycoprotein E deletion mutant of bovine herpesvirus 1 is avirulent in calves[END_REF] Eigenschaften der BHV-1-Glykoproteine G, K und M (gG, gK und gM) ist bisher wenig bekannt. Interessanterweise wurde bei EHV-1 eine gM-Deletionsmutante beschrieben, die eine effektivere Immunantwort evoziert hat, als der Ausgangsstamm RacH [START_REF] Osterrieder | Deletion of gene 52 encoding glycoprotein M of equine herpesvirus type 1 strain RacH results in increased immunogenicity[END_REF].

Replikation der Alphaherpesviren

Die Replikation aller Herpesviren verläuft nach einem prinzipiell gleichen Schema. Initial adsorbieren die Virionen an bestimmte Strukturen der Zelloberfläche. Für dieses sogenannte Attachment bilden virale Oberflächen-(Glyko)proteine die Voraussetzung. Beim BHV-1 sind bis heute zehn für Glykoproteine (g) kodierende offene Leserahmen (open reading frames, ORFs) mit einer geringen bis hohen Homologie zu HSV-1, dem Prototyp der Alphaherpesvirinae, identifiziert worden (gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gK, gL, gM;Schwyzer Literaturübersicht ___________________________________________________________________ und Ackermann, 1996). Das von den ORFs abgeleitete Molekulargewicht der BHV-1-Glykoproteine liegt zwischen 17 kDa (Kilodalton) (gL) und 101 kDa (gB). Das tatsächliche Molekulargewicht liegt jedoch meist deutlich darüber, da die Vorläuferproteine ko-und posttranslational im endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi-Apparat durch N-Glykosilierung, oder die seltenere O-Glykosilierung sowie durch Phosphorilierung und die Addition von Lipidresten modifiziert werden können. Einige bilden darüber hinaus Homo-(gB) oder Heterodimere (gE/gI, gH/gL, gM/U L 49.5; [START_REF] Schwyzer | Molecular virology of ruminant herpesviruses[END_REF][START_REF] Wu | Bovine herpesvirus 1 glycoprotein M forms a disulfide-linked heterodimer with the U(L)49.5 protein[END_REF]. Art und Ausmaß der Glykosilierung werden weitgehend durch die Konformation des Proteins bestimmt. Durch die Inhibierung der N-Glykosilierung mit Tunicamycin kann die Bildung infektionstüchtiger Viren verhindert werden (Van Drunen Littel-Van Den Hurk und [START_REF] Van Drunen Littel-Van Den Hurk Und Babiuk | Effect of tunicamycin and monensin on biosynthesis, transport, and maturation of bovine herpesvirus type-1 glycoproteins[END_REF]. Für das Attachment sind gB, gC und gD von Bedeutung, allerdings ist keines dieser Glykoproteine allein hierfür verantwortlich, da entsprechende Deletionsmutanten noch immer an die Wirtszelle adsorbieren können. Glykoprotein C bindet an der Zelloberfläche Heparansulfat. In Abwesenheit von gC kann die Heparansulfatbindung bei HSV-1, nicht aber bei BHV-1 und PRV, von gB übernommen werden [START_REF] Shukla | Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry[END_REF]. Mit der Bindung von gD an weitere zelluläre Rezeptoren geht die heparinsensitive, erste Phase der Adsorption in eine heparinresistene, zweite über [START_REF] Karger | Glykoproteins gIII and gp50 play dominant roles in biphasic attachment of pseudorabies virus[END_REF]. Diese Rezeptoren gehören unterschiedlichen Proteinsuperfamilien (Mannose-6-Phosphat-Rezeptor, HveA-D = herpesvirus entry mediator A-D) an und können nicht von allen Alphaherpesviren in gleicher Weise genutzt werden [START_REF] Geraghty | Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor[END_REF]Spear et al., 2000). An das biphasische Attachment schließt sich die Penetration der Viren in die Zelle an.

Hierbei verschmelzen die Membranen der Zelle und der Virionen miteinander, und das Nukleokapsid gelangt gemeinsam mit dem Tegument in das Zytosol. Für diesen Prozess ist die Fusionsvermittlung der Glykoproteine B und D, sowie des gH/gL-Komplexes essentiell [START_REF] Meyer | Bovine herpesvirus type 1 glycoprotein H is essential for penetration and propagation in cell culture[END_REF][START_REF] Schröder | Bovine herpesvirus 1 requires glycoprotein H for infectivity and direct spreading and glycoproteins gH(W450) and gB for glycoprotein D-independent cell-to-cell spread[END_REF]. Daneben ist bei HSV-1 das Glykoprotein G für die Penetration polarisierter, epithelialer Zellen erforderlich [START_REF] Tran | A herpes simplex virus 1 recombinant lacking the glycoprotein G coding sequences is defective in entry through apical surfaces of polarized epithelial cells in culture and in vivo[END_REF]. Der Übergang von der Adsorption zur Penetration, die gemeinsam als viraler Entry bezeichnet werden, findet rasch statt, da die Virionen einer Inaktivierung durch neutralisierende Antikörper oder sauren pH-Wert schon bald nicht mehr zugänglich sind [START_REF] Highlander | Neutralizing monoclonal antibodies specific for herpes simplex virus glycoprotein D inhibit virus penetration[END_REF]. Sobald das Nukleokapsid frei im Zytosol liegt, wird es entlang der Mikrotubuli unter Nutzung des Dynein-Motors Energie-(ATP) abhängig zum Nukleus transportiert [START_REF] Sodeik | Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus[END_REF].

Durch Mikrotubuli depolymerisierende oder -stabilisierende Drogen wie Nocodazol oder

Taxol kann dieser Transport geblockt werden [START_REF] Elliott | Herpes simplex virus type 1 tegument protein VP22 induces the stabilization and hyperacetylation of microtubules[END_REF][START_REF] Kotsakis | Microtubule reorganization during herpes simplex virus type 1 infection facilitates the nuclear localization of VP22, a major virion tegument protein[END_REF][START_REF] Sodeik | Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus[END_REF]. Das virale Genom wird durch die Kernporen in das Karyoplasma Literaturübersicht ___________________________________________________________________ entlassen, und zirkularisiert dort sofort zu Episomen [START_REF] Poffenberger | A noninverting genome of a viable herpes simplex virus 1: presence of head-to-tail linkages in packaged genomes and requirements for circularization after infection[END_REF]. Die zirkuläre DNA wird nach dem Prinzip des rolling circle repliziert. Dabei entstehen lineare Konkatemere, d. h. mehrere aneinander gereihte Genome, die an pac-Signalsequenzen innerhalb der IR-Bereiche geschnitten werden [START_REF] Varmuza | Signals for site-specific cleavage of HSV DNA: maturation involves two separate cleavage events at sites distal to the recognition sequences[END_REF]. Die geschnittenen Monomere werden anschließend als genomische DNA in Nukleokapside verpackt [START_REF] Al Kobaisi | The herpes simplex virus UL33 gene product is required for the assembly of full capsids[END_REF][START_REF] Jacob | Anatomy of herpes simplex virus DNA. XII. Accumulation of head-to-tail concatemers in nuclei of infected cells and their role in the generation of the four isomeric arrangements of viral DNA[END_REF][START_REF] Ladin | Replication of herpesvirus DNA. V. Maturation of concatemeric DNA of pseudorabies virus to genome length is related to capsid formation[END_REF] und akquirieren durch Knospung (budding) an der inneren Kernmembran eine primäre Hüllmembran [START_REF] Granzow | Ultrastructural analysis of the replication cycle of pseudorabies virus in cell culture: a reassessment[END_REF][START_REF] Granzow | Egress of alphaherpesviruses: comparative ultrastructural study[END_REF][START_REF] Mettenleiter | Herpesvirus assembly and egress[END_REF]. Über die nachfolgenden Schritte bei der Reifung der Herpesviren besteht seit Jahren ein Dissens. Ein Modell geht in der weiteren Virusausschleusung (Egress) von einer in situ-Reifung der primär umhüllten Virionen entlang des sekretorischen Pathways und der finalen Exozytose infektionstüchtiger Viren aus [START_REF] Campadelli-Fiume | Origin of unenveloped capsids in the cytoplasm of cells infected with herpes simplex virus 1[END_REF][START_REF] Darlington | Herpesvirus envelopment[END_REF][START_REF] Johnson | Herpes simplex virus gE/gI sorts nascent virions to epithelial cell junctions, promoting virus spread[END_REF]. Ein alternatives Modell, dass in letzter Zeit durch zahlreiche Experimente untermauert wurde, folgt der Vorstellung des sogenannten De-Envelopment/Re-Envelopment [START_REF] Gershon | Intracellular transport of newly synthesized varicella-zoster virus: final envelopment in the trans-Golgi network[END_REF][START_REF] Granzow | Ultrastructural analysis of the replication cycle of pseudorabies virus in cell culture: a reassessment[END_REF]. Danach verlieren die im perinukleären Spalt gelegenen Virionen durch Fusion mit der äußeren Kernmembran bzw. dem endoplasmatischen Retikulum ihre primäre Hülle und gelangen in das Zytoplasma. Die nackten Nukleokapside werden dann nach Addition der Tegumentproteine an den Membranen des Golgi-Apparates sekundär behüllt (Secondary Envelopment), und durch Exozytose der Golgi-Vesikel freigesetzt [START_REF] Granzow | Egress of alphaherpesviruses: comparative ultrastructural study[END_REF][START_REF] Mettenleiter | Herpesvirus assembly and egress[END_REF]. Beide Hypothesen gehen aber davon aus, dass für den Egress, genauso wie für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung (cell-to-cell spread, CTCS), die Behüllung der Virionen notwendig ist. Der cell-to-cell spread ist ein Prozeß bei dem, wie bei der Penetration, die Membranfusion das zentrale Ereignis darstellt. Dennoch bestehen zwischen den Fusionsphänomenen Entry, Egress und CTCS grundsätzliche Unterschiede. Am Egress oder Secondary Envelopment beteiligen sich neben gB und dem gH/gL-Komplex auch gM und gK. Darunter ist für diesen Prozess aber nur das letztgenannte als essentiell beschrieben [START_REF] Foster | Genetic analysis of the role of herpes simplex virus type 1 glycoprotein K in infectious virus production and egress[END_REF][START_REF] Klupp | Pseudorabies virus glycoprotein gK is a virion structural component involved in virus release but is not required for entry[END_REF]. Das Glykoprotein M ist für das Wachstum in vitro entbehrlich [START_REF] König | Glycoprotein M of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) is nonessential for replication in cell culture and is involved in inhibition of bovine respiratory syncytial virus F protein induced syncytium formation in recombinant BHV-1 infected cells[END_REF], es konnte aber bei PRV gezeigt werden, dass Virusmutanten mit einer gleichzeitigen Deletion des gM und des gE/gI-Komplexes, infolge einer mangelhaften sekundären Behüllung, in ihrem Wachstum erheblich eingeschränkt sind [START_REF] Brack | Inhibition of virion maturation by simultaneous deletion of glycoproteins E, I, and M of pseudorabies virus[END_REF][START_REF] Dijkstra | Identification and characterization of pseudorabies virus glycoprotein gM as a nonessential virion component[END_REF][START_REF] König | Glycoprotein M of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) is nonessential for replication in cell culture and is involved in inhibition of bovine respiratory syncytial virus F protein induced syncytium formation in recombinant BHV-1 infected cells[END_REF]. Die Glykoproteine E und I sind außerdem maßgeblich in den cell-to-cell spread involviert, ohne aber essentiell zu sein. Folgerichtig manifestiert sich der Phänotyp gE-bzw. gI-deletierter Virusmutanten in einer deutlich verminderten Größe der Virusplaques in vitro (Nakamichi et Literaturübersicht ___________________________________________________________________ al., 2000;[START_REF] Rebordosa | Glycoprotein E of bovine herpesvirus type 1 is involved in virus transmission by direct cell-to-cell spread[END_REF]. Das gleiche gilt für gG, allerdings ist der Defekt analysierter Deletionsmutanten weniger deutlich [START_REF] Nakamichi | Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is required for viral growth by cell-to-cell infection[END_REF]. In einer kürzlich erschienenen Publikation wird spekuliert, BHV-1-gG und -gE würden beim CTCS synergistisch agieren, da gG die Lokalisation von gE an den basolateralen Membranen, insbesondere an den tight junctions fördere [START_REF] Nakamichi | Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is necessary for maintaining cell-to-cell junctional adherence among infected cells[END_REF]. Das Glykoprotein D ist a priori essentiell für den CTCS, durch serielle Passagen in Zellkultur erfahren gD-negative BHV-1-Mutanten aber genomische Umordnungen, die in einem gD-unabhängigen Entry und CTCS resultieren [START_REF] Fehler | Glycoprotein IV of bovine herpesvirus 1-expressing cell line complements and rescues a conditionally lethal viral mutant[END_REF][START_REF] Schröder | Bovine herpesvirus 1 requires glycoprotein H for infectivity and direct spreading and glycoproteins gH(W450) and gB for glycoprotein D-independent cell-to-cell spread[END_REF].

Die Expression der viralen Gene erfolgt kaskadenartig, was durch zahlreiche positive und negative Feedback-Mechanismen durch die Interaktion viraler Proteine mit Gen-Promotoren gewährleistet wird. Bis etwa 4 h post infectionem (p. i.) werden die immediate early (IE)-oder α-Gene exprimiert. Sie können unabhängig von viralen Proteinen von der zellulären RNA-Polymerase II transkribiert werden, was bedeutet, dass die nackte Virus-DNA per se infektiös ist [START_REF] Graham | A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA[END_REF]. Dennoch wird die Expression der α-Gene durch virale Transaktivatoren, wie das Tegumentprotein VP16 bzw. αTIF (alpha-trans inducing factor) stimuliert [START_REF] Campbell | DNA sequences which regulate the expression of the pseudorabies virus major immediate early gene[END_REF]. Durch das Antibiotikum Cycloheximid, das die Initiations-und Elongationsreaktionen der Protein-Biosynthese hemmt, kann die Gen-Expression in vitro auf Ebene der IE-Expression arretiert werden [START_REF] Engelhardt | Identification and characterization of the bovine herpesvirus 5 US4 gene and gene products[END_REF].

Die IE-Genprodukte haben eine regulatorische Funktion und initiieren die Transkription der early-(E)-oder β-Gene [START_REF] Smith | Characterization of the regulatory functions of the equine herpesvirus 1 immediate-early gene product[END_REF]. Early-Gene kodieren hauptsächlich für Proteine des Nukleinsäurestoffwechsels, wie z. B. die Thymidinkinase und die virale DNA-Polymerase und sind bis etwa 8 h p. i. nachweisbar. Ab ca. 4 h p. i. beginnt die Translation der late (L)-oder γ-Gene, die für virale Strukturproteine kodieren, die während und nach der DNA-Replikation synthetisiert werden [START_REF] Gray | Regulation of equine herpesvirus type 1 gene expression: characterization of immediate early, early, and late transcription[END_REF]. In der Latenzphase der Alphaherpesvirusinfektion liegt die virale DNA als extrachromosomales Episom im Karyoplasma vor. Im Gegensatz zu den 70 bis 80 exprimierten Genen während einer lytischen Infektion, ist in latent infizierten Neuronen nur ein einziges Transkript, das sog. latencyassociated transcript (LAT) detektierbar. Die Latenz-assoziierten Transkripte sind essentiell für eine effiziente Reaktivierung [START_REF] Perng | The latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is required for efficient in vivo spontaneous reactivation of HSV-1 from latency[END_REF] und spielen eine wichtige Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz, indem sie die neuronale virusinduzierte Apoptose inhibieren [START_REF] Ciacci-Zanella | The latency-related gene of bovine herpesvirus 1 inhibits programmed cell death[END_REF][START_REF] Perng | Virusinduced neuronal apoptosis blocked by the herpes simplex virus latency-associated transcript[END_REF]. Bei BHV-1 ist anders als bei HSV die Expression eines Latenz-assozierten Gen-Produktes nachweisbar [START_REF] Hossain | Identification of gene products encoded by the latency-related gene of bovine herpesvirus 1[END_REF], das nicht nur die Apoptose, sondern auch die Progression des Zellzyklus negativ zu beeinflussen scheint [START_REF] Jiang | A protein encoded by the latency-related gene of bovine herpesvirus 1 is expressed in trigeminal ganglionic neurons of latently infected cattle and interacts with cyclindependent kinase 2 during productive infection[END_REF].

Literaturübersicht ___________________________________________________________________

Abbildung 2

Replikationszyklus der Alphaherpesviren (modifiziert nach [START_REF] Mettenleiter | Aujeszky's disease (pseudorabies) virus: the virus and molecular pathogenesis -state of the art[END_REF] Literaturübersicht ___________________________________________________________________

Methoden der Herpesvirus-Mutagenese

Die zufällige Einführung von Punktmutationen in das virale Genom, unter Verwendung mutagener Chemikalien, ist seit etlichen Jahren ein probates Mittel, um eine große Zahl von Virusmutanten zu produzieren, die anschließend phänotypisiert werden können. Mit Hilfe dieser Methode gelang vor 30 Jahren die Generierung temperatursensitiver Herpesvirusmutanten [START_REF] Schaffer | Temperature-sensitive mutants of herpesviruses[END_REF]. Mag diese Methode besonders geradlinig sein, so ist sie dennoch ungeeignet für die gezielte Untersuchung bestimmter Gene und Genprodukte. In den frühen ´80er Jahren wurde für HSV-1 die Methode der zielgerichteten Mutation individueller Gene etabliert und später für viele andere Herpesviren übernommen [START_REF] Post | A generalized technique for deletion of specific genes in large genomes: alpha gene 22 of herpes simplex virus 1 is not essential for growth[END_REF]. Die Insertion eines Selektionsmarkers, unter Mithilfe des DNA-Rekombinations-und Reparationsapparates der eukaryotischen Zelle, erlaubt es seither, bestimmte virale Gene zu unterbrechen bzw. zu deletieren und die hieraus resultierende Virusnachkommenschaft zu subklonieren und aufzureinigen. Diese Schritte sind sehr arbeitsaufwendig und zuweilen unmöglich, wenn beispielsweise Virusmutanten einen deutlichen Wachstumsdefekt aufweisen. Deletionsmutanten essentieller Gene können überdies nur auf Zelllinien produziert werden, die das essentielle Genprodukt in trans komplementieren [START_REF] Deluca | Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediateearly regulatory protein ICP4[END_REF]. Beinahe zehn Jahre später wurde eine neue Methode für die Erforschung herpesviraler Genome entwickelt: Die Klonierung des gesamten viralen Genoms als eine Summe aus mehreren überlappenden Cosmidklonen, welche die direkte Manipulation klonierter Segmente in Escherichia coli (E. coli), also unabhängig von eukaryotischen Zellen erlaubt [START_REF] Van Zijl | Regeneration of herpesviruses from molecularly cloned subgenomic fragments[END_REF] [START_REF] Ramsay | Yeast artificial chromosome cloning[END_REF]. Aus neuerer Zeit stammen Vektoren, die auf bakteriellen Literaturübersicht ___________________________________________________________________ mini-F (Fertilitäts)-Faktoren bzw. Plasmiden basieren und in Analogie zu den YACs, bacterial artificial chromosomes (BACs) genannt werden [START_REF] Shizuya | Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector[END_REF]. Sie sind mittlerweile die Vektoren der Wahl bei der Klonierung sog. eukaryotischer Genom-Bibliotheken. F-Plasmide sind etwa 100 kbp große, ringförmig geschlossene genetische Elemente. Sie replizieren autonom und liegen in einfacher Kopie als sog. low copy-Plasmid in der Bakterienzelle vor. Der F-Faktor ist die Voraussetzung für die bakterielle Konjugation und für den genetischen Informationsaustausch unter Prokaryonten. Sogenannte mini-F-Plasmide sind F-Faktoren, die auf ein Minimum ihrer genetischen Information reduziert sind, ohne die Eigenschaft der autonomen Replikation zu verlieren. Vektoren mit dieser Eigenschaft bezeichnet man in der Molekularbiologie als Replikon oder Amplikon. BACs können fremde DNA-Sequenzen in einer Größe von bis zu 300 kbp aufnehmen, sind einfach zu handhaben und bemerkenswert stabil. Diese Eigenschaften haben die BAC-Technologie attraktiv für die Herpesvirusforschung werden lassen, da selbst die größten herpesviralen Genome als BAC kloniert werden können. Tatsächlich ist das Maus Cytomegalovirus (MCMV), das als erstes Herpesvirus als bacterial artificial chromosome kloniert wurde [START_REF] Messerle | Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome[END_REF], mit 230 kbp eines der größten überhaupt. Seither wurde die BAC-Technologie unter anderem für das humane Cytomegalovirus (HCMV), Herpes simplex Virus (HSV), Pseudorabies Virus (PRV), equines Herpesvirus-1 (EHV-1) und Marek's disease virus 1 (MDV-1) erfolgreich etabliert [START_REF] Borst | Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants[END_REF]Rudolph et al., 2002a;Rudolph und Osterrieder, 2002;[START_REF] Saeki | Herpes simplex virus type 1 DNA amplified as bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: rescue of replicationcompetent virus progeny and packaging of amplicon vectors[END_REF][START_REF] Schumacher | Reconstitution of Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1 mutant[END_REF][START_REF] Smith | A self-recombining bacterial artificial chromosome and its application for analysis of herpesvirus pathogenesis[END_REF]. [START_REF] Shizuya | Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector[END_REF]. Für die Mutagenese sollte die Funktion des Rekombinationsystems aber restauriert werden. Das wird Literaturübersicht ___________________________________________________________________ erreicht, indem man als BAC-Wirtszelle einen Bakterienstamm verwendet, der die Proteine RecA [START_REF] Messerle | Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome[END_REF]) oder Redα/β (Yu et al., 2000) konditional exprimiert. Eine weitere Alternative ist die unter einen induzierbaren Promotor gestellte, transiente Expression der Rekombinationsgene recA, recE/T oder redα/β durch einen Vektor [START_REF] Datsenko | One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[END_REF][START_REF] Zhang | A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli[END_REF] [START_REF] Zhang | A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli[END_REF]. In der Folge wurde das E/Tcloning auch bei der Manipulation viraler BACs erfolgreich eingesetzt (Rudolph und Osterrieder, 2002;[START_REF] Schumacher | Reconstitution of Marek's disease virus serotype 1 (MDV-1) from DNA cloned as a bacterial artificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1 mutant[END_REF][START_REF] Schumacher | Glycoproteins E and I of Marek's disease virus serotype 1 are essential for virus growth in cultured cells[END_REF]Tischer et al., 2002b). Informationen über die Biologie der Herpesviren [START_REF] Brune | Forward with BACs: new tools for herpesvirus genomics[END_REF]. Durch ihre günstigen

Eigenschaften haben sich Herpesvirus-BACs aber auch als Vektoren für die Gentherapie empfohlen. Unter anderem wurden hierfür HSV-BACs konstruiert, die die Verpackung defektiver HSV-Vektoren komplettieren konnten [START_REF] Saeki | Herpes simplex virus type 1 DNA amplified as bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: rescue of replicationcompetent virus progeny and packaging of amplicon vectors[END_REF][START_REF] Stavropoulos | der die Deletion restauriert und die BAC-Kassette entfernt wurde (BHV-1rev), exprimierte gE ebenso wie der Wildtyp. Die Wachstumseigenschaften der BHV-1∆gE-Mutante wurden durch Plaquegrößen-Bestimmung und die Analyse von Wachstumskinetiken ermittelt (siehe Kapitel 4.1.6) Genetische Analysen der BHV-1∆gE-DNA durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen und durch Southern Blotting haben schließlich eine spezifische Insertion der BAC-Kassette in den gE-ORF belegt[END_REF]. Human artificial episomal chromosomes (HAECs) präsentieren eine weitere Anwendungsmöglichkeit der BAC-Technologie für die Gentherapie [START_REF] Narayanan | Efficient and precise engineering of a 200 kb beta-globin human/bacterial artificial chromosome in E. coli DH10B using an inducible homologous recombination system[END_REF]Literaturübersicht ___________________________________________________________________ Sun et al., 1994). Hierbei werden definierte virale Elemente, wie der sog. origin of replication und verpackungsrelevante Sequenzen in humangenomische BACs inseriert. Inzwischen haben als BAC klonierte Herpesviren darüber hinaus auch ihren Platz in der Entwicklung von Vakzinen für die aktive Immunisierung von Mensch und Tier gefunden [START_REF] Tischer | Die Rekonstituierung der Doppelmutante demonstriert den außerordentlichen Nutzen der homologen Rekombination in Bakterien für die Herpesvirus-Mutagenese. Für die ___________________________________________________________________________ Konstruktion einer BHV-1-Mutante mit einer singulären Deletion des gG wurde in der Doppelmutante BHV-1∆gE-gG die gE-Deletion konventionell, d. h. durch homologe Rekombination in eukaryotischen Zellen, restauriert und so die Mutante BHV-1∆gG generiert[END_REF](Suter et al., 1999). 

___________________________________________________________________________

Virusstämme

• BHV-1 Stamm Schönböken [START_REF] Matheka | Weitere Untersuchungen zur Differenzierung des Virus der Rhinotracheitis (IBR) vom Virus des Bläschenausschlages (IPV) durch die trägerfreie Zonenelektrophorese in einem Glukose-Dichtegradienten[END_REF]; Virusbank BFAV Insel Riems)

Bakterien und Plasmide

Bakterien

• E. coli-Stamm DH10B (One Shot  Electrocomp ™ Gene-Hogs  , Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

• E. coli-Stamm TOP10F´ (TOP10F´One Shot  , Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

Plasmide

• pACYC177 (MBI Fermentas, Hanover, USA)

• pCR  2.1-TOPO  (Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

• pHA2 [START_REF] Adler | Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus 68 genome as an infectious bacterial artificial chromosome[END_REF]; freundlicherweise von M. Messerle, Halle/Saale zur Verfügung gestellt) • pKD46 [START_REF] Datsenko | One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products[END_REF]freundlicherweise von Barry Wanner, West Lafayette, USA zur Verfügung gestellt) • pTZ18R (Fa. Pharmacia, Uppsala, Schweden)

Antikörper

Monoklonale Antikörper (mAk)

• mAk antiBHV1gG (anti-BHV-1-gG; freundlicherweise von C. Schelp, Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Schweiz zur Verfügung gestellt) • mAk d3 (anti-BHV-1-gE; freundlicherweise von von C. Schelp, Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Schweiz zur Verfügung gestellt) • mAk 2-1 (anti-BHV-1-gE; freundlicherweise von W. Fuchs und B. Köllner, Insel Riems zur Verfügung gestellt)

Material und Methoden ___________________________________________________________________________

• mAk 4d7 (anti-BHV-1-gE; freundlicherweise von von C. Schelp, Dr. Bommeli AG, Liebefeld, Schweiz zur Verfügung gestellt) • mAk 72/14/6 (anti-BHV-1-gB; freundlicherweise von G. M. Keil, Insel Riems zur Verfügung gestellt)

Sekundäre Antikörper

• anti-mouse IgG, Fluoreszenz-markiert (Alexa  Fluor  488, Fa. Molecular Probes, Eugene, USA) • anti-mouse IgG, POD-markiert (Fa. Dianova, Hamburg)

Chemikalien

• Aceton (Fa. Roth, Karlsruhe)

• Acrylamid (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Agarose (Fa. Gibco BRL, Eggenstein) 0,7-1,5 % (w/v) in 1 x TAE-Puffer • Ammoniumpersulfat (APS; Fa. Sigma, Deisenhofen) 10 % (w/v) in A. dest. (Stammlösung) • Ammoniumsulfat (Fa. Merck, Darmstadt)
• Antibiotika für Zell-bzw. Bakterienkulturmedien 100 µg/ml Ampicillin (Endkonzentration; Fa. Sigma, Deisenhofen) 30 µg/ml Chloramphenicol (Endkonzentration; Fa. Sigma, Deisenhofen)) 50 µg/ml Kanamycin (Endkonzentration; Fa. Sigma, Deisenhofen) 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin Lsg. (Endkonzentration; Fa. Sigma, Deisenhofen) • Aprotinin (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• L-Arabinose (Fa. Sigma, Deisenhofen) • N,N-Methylenbisacrylamid (Fa. Serva, Heidelberg) • Blockierungsreagenz (Fa. Roche, Mannheim) • Calciumchlorid, CaCl 2 x H 2 O (Fa. Fluka, Buchs, Schweiz) • Citronensäure (Fa. Roth, Karlsruhe) • Coomassie Brilliant Blue R 250 (Fa. Sigma, Deisenhofen) • CSPD  (3-(4-methoxyspiro[1,2-dioxethan-3,2´-(5´chloro)Tricyclo{3.3.1.1 3,7 }Decan]-4-yl)
Phenylphosphat; Fa. Roche, Mannheim) • Cycloheximid (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Desoxyribonukleosid-5`-Triphosphate (dNTPs; Fa. Promega, Mannheim)

• DIG Easy Hyb (Fa. Roche, Mannheim)

Material und Methoden ___________________________________________________________________________

• DIG High Prime (Fa. Roche, Mannheim)

• DNA molecular weight marker II, digoxigenin-labeled (Fa. Boehringer, Mannheim)

• DMF (Dimethylformamid; Fa. Sigma, Deisenhofen)

• DMSO (Dimethylsulfoxid; Fa. Merck, Darmstadt)

• DOCA (Na-Desoxycholat; Fa. Sigma, Deisenhofen)

• DTT (Dithiothreitol; Fa. Promega, Mannheim)

• Essigsäure (Fa. Riedel-de Haen, Seelze)

• Ethidiumbromid (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Ethanol, absolut (Fa. Roth, Karlsruhe)

• EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure; Fa. Serva, Heidelberg)

• FKS (Fötales Kälberserum; Fa. Gibco BRL, Eggenstein)

• Formaldehyd, 37% (Fa. Roth, Karlsruhe)

• D-(+)-Glucose (Fa. Sigma, Deisenhofen) • L-Glutamin (Fa. Sigma, Deisenhofen) • Glycerin (Fa. Roth, Karlsruhe) • Glycin (Fa. Roth, Karlsruhe) • HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N`-2-ethansulfonsäure; Fa. Serva, Heidelberg) • IPTG (Isopropylthio-β-D-Galaktosid; Fa. Sigma, Deisenhofen) 100 mM in A. dest. (Gebrauchslösung) • Isopropanol (2-Propanol; Fa. Roth, Karlsruhe) • Kaliumacetat, C 2 H 3 KO 2 (Fa. Roth, Karlsruhe) • Kaliumchlorid, KCl (Fa. Merck, Darmstadt) • Kaliumdihydrogenphosphat, KH 2 PO 4 (Fa. Serva, Heidelberg) • Kaliumhydroxid, KOH (Fa. Merck, Darmstadt) • Kaliumhydrogenphosphat, K 2 HPO 4 (Fa. Merck, Darmstadt)
• 1 kbp DNA Ladder + DNA Ladepuffer (6 x; Fa. Promega, Mannheim)

• Kodak GBX Entwickler (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Kodak GBX Fixierer (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Kristallviolett (Fa. Merck, Darmstadt)

• N-Lauroylsarkosin (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• LB (Luria-Bertani) BROTH (Lennox L broth), Bouillon (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• LB AGAR (Lennox L Agar; Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Lipofectin  Transfektions-Reagenz (Fa. Gibco BRL, Eggenstein) ___________________________________________________________________________ • Lithiumchlorid, LiCl (Fa. Merck, Darmstadt)
• Maleinsäure (Fa. Sigma, Deisenhofen)

• Magermilchpulver (Fa. Saliter, Obergünzburg)

• Magnesiumchlorid, MgCl 2 (Fa. Merck, Darmstadt)

• Magnesiumsulfat, MgSO 4 (Fa. Merck, Darmstadt)

• MEM (Minimal Essential Medium, mit Earle`s Salzen und Glutamin; Fa. Biochrom, Berlin) • β-Mercaptoethanol (Fa. Serva, Heidelberg)

• Methanol, absolut (Fa. Roth, Karlsruhe)

• Methocel MC (Fa. Fluka, Buchs, Schweiz)

• MOPS (3-Morpholinopropansulfonsäure; Fa. Fluka, Buchs, Schweiz) • Natriumacetat-Trihydrat, C 2 H 3 NaO 2 3H 2 O (Fa. Roth, Karlsruhe) • Natriumazid, NaN 3 (Fa. Sigma, Deisenhofen) • Natriumchlorid, NaCl (Fa. Roth, Karlsruhe) • Natriumcitrat-Dihydrat, C 6 H 5 Na 3 O 7 2H 2 O (Fa. Roth, Karlsruhe) • Natriumdihydrogenphosphat, NaH 2 PO 4 (Fa. Merck, Darmstadt) • Natriumhydrogencarbonat, NaHCO3 (Fa. Merck, Darmstadt)
• Natriumhydrogenphosphat, Na 2 HPO 4 (Fa. Merck, Darmstadt)

• Natriumhydroxid, NaOH (Fa. Scharlau, Barcelona, Spanien)

• Puregene  DNA Isolation Kit (Fa. Gentra Systems, Minneapolis, USA)

• QIAquick  Gel-Extraktions Kit (Fa. Qiagen, Hilden)

• QIAfilter  Midi oder Maxi Kit (Fa. Qiagen, Hilden)

• ReddyMix ™ PCR Master Mix (Fa. Abgene, Surrey, Großbritannien)

• Roti ® -Phenol (pH 8,0; Fa. Roth, Karlsruhe)

• Salzsäure, HCl (Fa. Roth, Karlsruhe)

• SOB Broth, Bouillon (Fa. Fluka, Buchs, Schweiz)

• SDS (Sodium-Dodecylsulfat; Fa. Merck, Darmstadt)

• Sucrose (Fa. Serva, Heidelberg)

• SuperSignal  Chemolumineszenz-Substrat (Fa. Pierce, Rockford, USA)

• NNN`N`-TEMED (Tetramethylethylendiamin; Fa. Sigma, Deisenhofen)

• TOPO TA Cloning  Kit (Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

• Tris(2-amino-hydroxymethyl-1,3-propandiol; Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

• Triton X-100 (Fa. Serva, Heidelberg)

Material und Methoden ___________________________________________________________________________

• Tween 20 (Fa. Serva, Heidelberg)

• X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid; Fa. Sigma, Deisenhofen) 40 mg/ml DMF (Gebrauchslösung)

Enzyme

• CIP (calfi intestine phosphatase; Fa. Boehringer, Mannheim)

• DNA-Polymerase Ι, Large Fragment (Klenow-Enzym; Fa. Boehringer, Mannheim)

• Lysozym (Fa. Serva, Heidelberg) 10 mg/ml Tris-Cl (10mM, pH 8,0; Stammlösung) • Platinum  Pfx-DNA-Polymerase + 10 x Amplifikationspuffer (Fa. Invitrogen, Karlsruhe) • CO 2 -Brutschrank QMI300VBA (Fa. Nunc, Wiesbaden)

• Proteinase K (Fa.
• Digitalkamera CAMEDIA C-3040ZOOM (3,3 Megapixel; Fa. Olympus, Hamburg)

• EasyjecT ™ Elektroporationssystem (Fa. EquiBio, Middleessex, Großbritannien)

• E.coli Pulser  Elektroporationsküvetten (Fa. Biorad, München)

• Fluoreszenzeinrichtung IX-RFAC (Fa. Olympus, Hamburg)

• Fluoreszenz Mikroskop IX50 (Fa.Olympus, Hamburg)

• Gel-Blotting-Papier (Fa. Schleicher und Schuell, Dassel)

• Gel-Dokumentationssystem ICU-1 (Fa. Herolab, Wiesloch)

• Geltrockner SE II 50 (Fa. Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA)

• Hybond ™ -N+, Nylonmembran (Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)

• Inkubationsschüttler C25KC (Fa. New Brunswick Scientific, Nürtingen)

• Inversionsmikroskop (Fa. Nikon, Düsseldorf)

• Laborwaage Scout ™ (Fa. Ohaus, Florham Park, USA)

• Magnetrührer RCT basic (Fa. IKA, Staufen)

• Messokular (Fa. Carl Zeiss, Jena)

• Mini Hybridisation Ofen (Fa. Biometra, Göttingen)

• Mini-PROTEAN  3 Cell, Elektrophorese-Zelle (Fa. Biorad, München)

• Mini Trans-Blot  Elektrophorese-Transfer-Zelle (Fa. Biorad, München)

• Multipette  plus (Fa. Eppendorf, Hamburg)

• pH-Meter 766 Calimatic (Fa. Knick, Berlin)

• Pipette Reference  (0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl; 50-200 µl; 100-1000 µl; Fa.

Eppendorf, Hamburg) • Pipette Research  (0,5-10 µl; 2-20 µl; 10-100 µl; 100-1000 µl; Fa. Eppendorf, Hamburg)

• Pipettierhelfer accu jet  (Fa. Brand, Wertheim)

• PowerPac 200 Power Supply (Fa. Biorad, München)

• Primer Analysis Software Oligo 4.1 (Fa. Biosciences, Plymouth, USA)

• Protran  Nitrocellulose Transfermembran (Fa. Schleicher und Schuell, Dassel)

• Röntgenfilm Hyperfilm ™ MP (Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)

• Sicherheitswerkbank (Fa. Heto-Holten, Allerod, Dänemark)

• Spektralphotometer GeneQuant pro (Fa. Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg)

• Stratalinker R UV-Crosslinker (Fa. Stratagene, Heidelberg)

Material und Methoden ___________________________________________________________________________

• Sub-Cell  GT Agarosegel-Elektrophorese System (Fa. Biorad, München)

• Thermocycler Primus 96 plus (Fa. MWG-Biotech, Ebersberg)

• Thermomixer comfort (Fa. Eppendorf, Hamburg)

• Transferpette  (20-200 ml) (Fa. Brand, Wertheim)

• Ultraschallgerät Cell Disruptor B15 Branson (Fa. Heinemann, Schwäbisch-Gmünd)

• Vortex-Genie ™ (Fa. Scientific Industries, USA)

• Wasserbad (Fa.GFL, Burgwedel)

• Zellkulturplastikwaren (Fa. Costar, Cambridge, USA; Fa. Sarstedt, Nümbrecht) Zellkulturflaschen (170 cm 2 , 75 cm 2 , 25 cm 2 ) 6-, 24-und 96-Lochplatten 

Virustitration

Virustitrationen wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit MDBK-Zellen durchgeführt [START_REF] Mayr | Virologische Arbeitsmethoden Band I[END_REF]. Hierzu wurden die infektiösen Zellkulturüberstände in log10-Verdünnungsschritten auf die Zellen gegeben und für 3 Tage unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mikroskopisch auf die Ausbildung eines zpE (zytopathogener Effekt) untersucht. Der Gehalt an infektiösen Viruspartikeln wurde als KID 50 /ml (kulturinfektiöse Dosis 50 pro ml) nach der Methode von Spaerman und Kaerber [START_REF] Mayr | Virologische Arbeitsmethoden Band I[END_REF] angegeben. 

Kontroll-Zellkulturüberstände (mock)

Um

Lipofektion

Alternativ zur CaPO 4 -Transfektion wurde als biologische Transfektionsmethode die Lipofektion verwendet [START_REF] Felgner | Lipofection: a highly efficient, lipidmediated DNA-transfection procedure[END_REF]. Bei der Lipofektion komplexieren Liposomen 

Fill-in (Klenow

TOPO TA Cloning 

Die Taq-Polymerase produziert während der PCR (siehe Kapitel 3.2.5.6) DNA-Fragmente mit unspezifischen Überhängen eines Nukleotids [START_REF] Clark | Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases[END_REF], meist eines Adenins [START_REF] Hu | DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment[END_REF].

Bei der Methode des sogenannten TA-Clonings werden PCR-Produkte mit Adenin-

Material und Methoden ___________________________________________________________________________

Überhängen in einen linearisierten Vektor mit Thymin-Überhängen kloniert [START_REF] Marchuk | Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products[END_REF]. Das TOPO TA Cloning  ist eine Variante des TA-Clonings und ermöglicht eine Ligase-unabhängige Ligation eines PCR-Produktes mit einem Topoisomerase-aktivierten Vektor [START_REF] Shuman | Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase[END_REF]. PCR-Amplifikate, die von einer Polymerase mit 3' → 5'-Exonuklease (proofreading)-aktivität (Pfu-, Pfx-, Vent ™ -Polymerase) produziert wurden, eignen sich für das TA-Cloning erst nachdem ihnen ein Adenosinrest angehängt wurde (Tailing). Für die Addition von 3'-Adenin-Überhängen wurde der PCR-Reaktionsansatz, nach einer Amplifikation mit der Pfx-Polymerase mit 1 U Taq-Polymerase versetzt und 10 min bei 72°C inkubiert. Das PCR-Produkt wurde nach Angaben des Herstellers in den aktivierten pCR  2.1-TOPO  Vektor kloniert.

Amplifikation von DNA-Fragmenten mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

DNA-Fragmente lassen sich mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, Polymerase Chain Reaction) gezielt amplifizieren. Ein Zyklus einer Standard-PCR mit 30 Reaktionszyklen [START_REF] Saiki | Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[END_REF] Anschließend wurden die Bakterienzellen, wie oben beschrieben, mit Glycerin gewaschen, aliquotiert und bei -70°C gelagert. 

Transformation chemisch kompetenter Bakterien mit Plasmiden

Chemisch kompetente E. coli (TOP10F´One Shot

RecE/T-Mutagenese

Präparation von Plasmid-DNA im großen Maßstab ("Maxipräparation")

Für die Maxipräparation von Plasmid-DNA wurden 100 ml (high-copy Plasmide: pTZ18R, pCR  2.1-TOPO  ) oder 250 ml (low-copy Plasmide: BACs) LB-Selektionsmedium mit 0,5 ml ___________________________________________________________________________ einer Übernachtkultur beimpft. Nach den Angaben des Herstellers wurde mit Hilfe des QIAfilter  Maxi Kits (Fa. Qiagen, Hilden) die Plasmid-DNA nach alkalischer Bakterienlyse mittels Anionenaustauscherchromatographie aufgereinigt. Die DNA wurde mit Isopropanol aus der Lösung gefällt und durch Zentrifugation (Beckman J2-H2, JA17, 11.000 rpm, 30 min, 4°C) pelletiert. Das DNA-Pellet wurde anschließend mit Ethanol (70%) gewaschen, durch Vakuumzentrifugation getrocknet und in TE (pH 8,0) gelöst.

Anlegen einer Bakteriendauerkultur

750 µl einer frischen Übernachtkultur wurden mit der gleichen Menge Gefriermedium für Bakterien vermischt und sofort zur Lagerung bei -70°C tiefgefroren.

Proteinnachweise

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)

SDS (Natriumdodecylsulfat) ist ein Detergens, das mit Ausnahme von Disulfidbrücken alle nichtkovalenten Wechselwirkungen in einem nativen Protein zerstört. Das anionische SDS bildet mit dem denaturierten Protein einen Komplex mit einer negativen Nettoladung, so dass bei der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese Proteine nach ihrer relativen Molekülmasse, unabhängig von ihrer ursprünglichen Ladung, aufgetrennt werden können [START_REF] Laemmli | Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[END_REF]. 

Elektrotransfer und Immunodetektion von Proteinen (Western Blotting)

Beim Western Blotting werden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine (3.2.7.1) nach dem Tankblotprinzip [START_REF] Towbin | Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[END_REF] Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass eine Deletion des Glykoprotein E die Zell-zu-Zell-Ausbreitung (cell-to-cell spread, CTCS) des BHV-1 erheblich beeinträchtigt [START_REF] Rebordosa | Glycoprotein E of bovine herpesvirus type 1 is involved in virus transmission by direct cell-to-cell spread[END_REF]. Daher wurde der cell-to-cell spread der BHV-1∆gE-Mutante in einem sogenannten Ergebnisse ___________________________________________________________________________

B H V 1 p B H V 1 ∆ g E 2 p B H V 1 ∆ g E 7 ( 

BHV-1∆gE-gG Wachstumsanalyse

Plaquegrößenbestimmung

Frühere Arbeiten hatten gezeigt, dass gE und gG in die direkte Zell-zu-Zell-Ausbreitung des BHV-1 involviert sind [START_REF] Nakamichi | Bovine herpesvirus 1 glycoprotein G is required for viral growth by cell-to-cell infection[END_REF][START_REF] Rebordosa | Glycoprotein E of bovine herpesvirus type 1 is involved in virus transmission by direct cell-to-cell spread[END_REF] Die in der EU verwendeten BHV-1-Markervakzinen basieren auf einer spontanen BHV-1-Labormutante, deren genetische Information für das Glykoprotein E durch in vitro-Passagierung verloren ging [START_REF] Kaashoek | A conventionally attenuated glycoprotein E-negative strain of bovine herpesvirus type 1 is an efficacious and safe vaccine[END_REF][START_REF] Van Engelenburg | A glycoprotein E deletion mutant of bovine herpesvirus 1 is avirulent in calves[END_REF]. Der hier beschriebene BHV-1-BAC-Klon und eine BAC-Mutante auf der Basis des australischen BHV-1-Stammes V155 präsentieren die ersten publizierten infektiösen BHV-1-Gesamtklone [START_REF] Mahony | Construction and Manipulation of an Infectious Clone of the Bovine Herpesvirus 1 Genome Maintained as a Bacterial Artificial Chromosome[END_REF]Trapp et al., in press). Analysen in vitro haben gezeigt, 

B H V 1 B H V 1 ∆ g E B H V 1 ∆ g E -g M (a) (b) B H V 1 B H V 1 ∆ g E B H V 1 ∆ g E -

  Abbildung 1 Genomische Organisation des Bovinen Herpesvirus Typ 1 U L = Unique Long-Region, U S = Unique Short-Region, IR = Internal Repeat, TR = Terminal Repeat. Die Pfeile bezeichnen die alternative Leserichtung der Unique short.

  . Die intrazellulären Viren können während dieser Phase des lytischen Replikationszyklus vornehmlich von zytotoxischen (CD8 + ) T-Lymphozyten bekämpft werden. CD8 + T-Zellen üben darüber hinaus durch Interleukinfreisetzung und Induktion viele andere nichtlytische Funktionen aus. Sogenannte Literaturübersicht ___________________________________________________________________ T-Helferzellen (CD4 + ) haben eine ausschließlich immunmodulatorische Wirkung. Sie produzieren selbst oder induzieren die Produktion von Interleukinen, aktivieren dadurch Makrophagen und kooperieren mit B-Lymphozyten. Obwohl bei den meisten viralen Infektionen T-Lymphozyten das Hauptinstrument der Erregerbekämpfung darstellen, ist über ihre Rolle bei der BHV-1-Infektion bisher wenig bekannt. Es wird allerdings spekuliert, dass die spezifische zelluläre Immunität überaus wichtig ist für die Eliminierung lytischer

  . Da die Impfviren nicht mehr in der Lage sind gE zu exprimieren, können damit vakzinierte Rinder keine Antikörper gegen gE bilden. Verschiedene veterinärpharmazeutische Firmen vertreiben heute Markerimpfstoffe bestehend aus inaktivierten oder vermehrungsfähigen Impfviruspräparationen. Deletions-Markervakzinen müssen einerseits, wie herkömmliche Impfstoffe, Ansprüchen hinsichtlich Wirksamkeit und Verträglichkeit genügen, andererseits aber auch den besonderen Anforderungen an die Markereigenschaften gerecht werden. Da die Differenzierung feldvirusinfizierter und markervakzinierter Rinder auf der serologischen Untersuchung auf gE-Antikörper basiert, werden an die Leistungsfähigkeit der Markertests ebenfalls hohe Anforderungen gestellt. Bisher stehen zum Nachweis von Antikörpern gegen gE ausschließlich ELISA (enzyme linked immunoassay)-Systeme, die als sogenannte Blocking-Tests funktionieren, zur Verfügung (Van Oirschot et al., 1997). Quantifiziert wird mit diesen Systemen die Inhibition der Bindung eines gE-spezifischen monoklonalen Antikörpers (mAk) durch die zu untersuchende Serum-respektive Plasmaprobe. Im Vergleich zu markerunabhängigen BHV-1-Nachweissystemen (BHV-1-gB-Antikörper-ELISA, indirekter BHV-1-Antikörper-ELISA, Neutralisationstest) sind Sensitivität und Spezifität der gE-Serodiagonistik aber erheblich eingeschränkt (de Wit et al., 1998). Der von dem Literaturübersicht ___________________________________________________________________ Nationalen BHV-1-Referenzlabor initiierte, nationale BHV-1-Ringversuch ergab u. a., dass alle bis heute kommerziell erhältlichen gE-Blocking-ELISA-Systeme für die Tankmilchuntersuchung sogar völlig ungeeignet sind (Reichelt und Beer, 2002). Weitere Probleme des Markerkonzeptes ergeben sich aus der Tatsache, dass das Glykoprotein E im Vergleich zu gB, gC und gD bei BHV-1 nur mäßig immunogen ist. Die gE-Antikörperbildung feldvirusinfizierter Rinder fällt deshalb inhomogen und verzögert aus. Das gilt insbesondere für zuvor geimpfte Rinder, die erst spät oder teilweise gar nicht gegen gE serokonvertieren (König et al., unpublizierte Daten). In Anbetracht dieser Mängel gibt es Bestrebungen das Markerkonzept, einerseits hinsichtlich der Serodiagnostik durch Entwicklung sensitiver und spezifischer Testsysteme, andererseits hinsichtlich der Markerimpfstoffe, zu verbessern. Auf der Basis des bisher etablierten gE-Negativ-Marker-Prinzips, könnten Doppelmarkervakzinen mit einer zusätzlichen Deletion eines immunogenen Strukturproteins hierfür ein probates Mittel sein. Der Einsatz von Doppelmarkervakzinen verspricht die Möglichkeit, Serum-oder Plasmaproben, die in der serologischen Untersuchung auf gE-Antikörper kein eindeutiges Ergebnis erbracht haben, zusätzlich auf Antikörper gegen das zweite deletierte Immunogen untersuchen zu können. Dadurch würde sich die Sensitivität der Markerdiagnostik bei fraglichen Einzelproben deutlich erhöhen. Als Kandidaten für eine zusätzliche Deletion kommen notwendigerweise aber nur Proteine in Frage, die bei feldvirusinfizierten Rindern eine befriedigende Immunantwort provozieren. Darüber hinaus sollten Impfviren mit einer Doppeldeletion nach wie vor replikationsfähig sein, einerseits um sich als Lebendvakzine im Impfling vermehren zu können, andererseits um eine ausreichende Virusnachkommenschaft für die Präparation inaktivierter Vakzinen zu gewährleisten. Über die immunogenen

  . Durch Kotransfektion der linearisierten überlappenden Cosmide mit in E. coli manipulierter Cosmid-oder Plasmid-DNA werden unter günstigen Umständen komplette rekombinante und infektiöse Viren in Zellen generiert. Ein Vorteil dieses Systems ist, dass hierbei nicht gegen das Ausgangsvirus selektiert werden muss, da ausschließlich die gewünschten Virusmutanten generiert werden. Nachteilig ist, dass einige Cosmide genetisch instabil sind und viele Rekombinationsereignisse erforderlich sind, um infektiöse Virus-DNA zu rekonstruieren; beides kann die Ursache für unerwünschte Mutationen sein. In der Genetik begrenzte die geringe Größe von Plasmiden und Cosmiden deren Nutzen für die Entschlüsselung großer Säugergenome. Aus diesem Grund wurden neuere Klonierungsvektoren entwickelt, die große DNA-Fragmente aufzunehmen vermögen. Unter diesen sind die künstlichen Hefechromosomen sogenannte yeast artificial chromosomes (YACs) die größten, mit einer Kodierungskapazität von mehr als zwei Megabasenpaaren (mbp)

  Versuche, das gesamte virale Genom in BAC-Vektorplasmide zu klonieren, blieben meistens erfolglos. Dieses Problem wurde umgangen, indem man vielmehr die BAC-Kassette mit dem F-Plasmid Replikon konventionell, durch homologe Rekombination in eukaryotischen Zellen in das Virusgenom integriert hat. Das lineare doppelsträngige Genom der Herpesviren zirkularisiert während der Replikation und die Isolation ringförmiger Replikations-Intermediate der BAC-Mutanten ermöglicht es, mit dieser DNA E. coli-Zellen zu transformieren, die daraufhin das virale Genom stabil als F-Plasmid vermehren. Der prominenteste Nutzen der Virus BACs liegt allerdings nicht in der bakteriellen Vermehrung, sondern in der, von eukaryotischen Zellkultursystemen völlig unabhängigen, Manipulierbarkeit mit Hilfe des bakteriellen Rekombinationsapperates. Das Genom von Herpesviren enthält repetitive Sequenzmotive, die ein Ziel für unerwünschte Rekombinationen darstellen. Daher erfordern Herpesvirus-BACs E. coli-Stämme, in denen das recABCD Rekombinationssystem nicht funktionell ist

  . RecE ist eine 5'→ 3' Exonuklease, RecT ist ein ssDNA-(single strand DNA / DNA-Einzelstrang) bindendes Protein, das die Anlagerung, den Transfer und die Invasion der ssDNA katalysiert (Muyrers et al., 2000; Abbildung 3). Die Rekombinasen RecE/T werden von dem Prophagen Rac exprimiert, Redα und Redβ sind dem RecE/T funktionell equivalente Proteine, für die der Bakteriophage λ kodiert. 1998 wurde erstmals eine Methode beschrieben, die sich das recE/T-Rekombinationsprinzip zu Nutzen machte und E/T-cloning bezeichnet wurde

  Hierbei wurde ein lineares DNA-Fragment, dass sich aus einem Selektionsmarker und coli transferiert. Um zu gewährleisten, dass die lineare DNA in den Bakterien nicht degradiert wurde, arbeitete man mit Exonuklease-negativen Stämmen, oder verwendete Rekombinationsplasmide, die neben den oben beschriebenen Rekombinasen einen Exonuklease-Inhibitor, das Gam Protein des λ-Phagen exprimierten (Wagner et al., 2002). Durch ein doppeltes cross over-Ereignis wird der Selektionsmarker, im Regelfall ein Antibiotikumresistenz-Gen, in die Zielsequenz eingeführt. Die Methode des E/T-clonings ermöglicht so die homologe Rekombination schon ab 25 bis 50 übereinstimmenden Basenpaaren. Anschließend ist das mutagenisierte BAC-Genom in E. coli genetischen Analysen durch DNA-fingerprinting und Southern-Blot-Hybridisierung zugänglich. Die Bakterienklone, die das virale Genom mit der gewünschten Mutation beherbergen, werden für die Präparation der BAC (Plasmid)-DNA im großen Maßstab vermehrt. Durch Transfektion dieser DNA in permissive eukaryotische Zellen lässt sich das Wachstumsverhalten oder der Phänotyp der Virusmutante in vitro bestimmen. Hierdurch gewann man bereits zahlreiche

•

  Abbildung 3Schematische Darstellung der RecE/T-Mutagenese (modifiziert nach[START_REF] Muyrers | RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners[END_REF] Gezeigt ist ein Model der RecE/T-oder Redα/β-abhängigen homologen Rekombination in Bakterien. Initial produziert die 5'→ 3' Exonuklease RecE oder Redα einen 3'-ssDNA Überhang. Durch Bindung der RecT-oder Redβ-Moleküle entsteht dann ein DNA-Einzelstrang, der eine homologe Rekombination durch Einzelstrang-annealing oder Einzelstrang-Invasion erlaubt.

  Boehringer, Mannheim) 20 mg/ml Tris-Cl (50mM, pH 8,0; Stammlösung) • Restriktionsendonukleasen + 10 x Endonukleasepuffer, 100 x BSA (Bovines Serumalbumin; Fa. Boehringer, Mannheim; New England Biolabs, Schwalbach; Fa. Promega, Mannheim) • Ribonuklease A (Fa. Sigma, Deisenhofen) 10 mg/ml TE (pH 8,0; Stammlösung) 15 min bei 100°C erhitzt, zur Inaktivierung von Dnasen • Taq-DNA-Polymerase + 10 x Amplifikationspuffer (Fa. Promega, Mannheim) • T4-DNA-Ligase + 10 x Ligationspuffer (Fa. Roche, Mannheim) • Trypsin (Fa. Serva, Heidelberg) 3.1.7 Lösungen und Puffer • Acrylamidlösung (30%) für SDS-PAGE 29,2 g Acrylamid 0,8 g Bisacrylamid in 100 ml A. dest. gelöst, filtriert • Blocking-Puffer für Western Blotting 10 % Magermilchpulver in PBS-T • CBS (citrate-buffered saline) 40 mM Citronensäure 10 mM KCl 135 mM NaCl mit NaOH auf pH 3,0 eingestellt ___________________________________________________________________________ • Coomassie-Entfärbungs-Lösung 450 ml Methanol 450 ml A. dest. 100 ml Eisessig • Coomassie-Färbelösung 1,25 g Coomassie Brilliant Blue R-250 in 500 ml Coomassie-Entfärbungs-Lösung • DNA Denaturierungslösung für Southern Blotting 0,6M NaCl 0,4 M NaOH • Ethidiumbromidfärbelösung 0,5 µg/ml Ethidiumbromid in A. dest. • Gefriermedium für Bakterien 60% (v/v) SOB 40% (v/v) Glycerin 1/1 mit Bakterienkultur mischen • Glycerollösung für CaCl 2 -Transfektion 50% HBS (2 x) 15% Glycerin, sterilfiltriert • Glycerollösung für elektrokompetente Bakterien 20% Glycerin, bei 120°C autoklaviert • HBS-Puffer (2 x; pH 7mit A. dest. ad 1000 ml • Kristallviolettfixierer 5 % (v/v) Formalin in 1 x PBS • LB-Agar-Platten 35 g LB AGAR Material und Methoden ___________________________________________________________________________ in 1 l A. dest., bei 120°C autoklaviert • LB-Medium 20 g LB BROTH in 1 l A. dest., bei 120°C autoklaviert • LB-Selektions-Agar-Platten LB-Agar + 100 µg Ampicillin/ml Agar + 30 µg Chloramphenicol/ ml Agar + 50 µg Kanamycin/ ml Agar • LB-Selektions-Medium LB-Medium + 100 µg Ampicillin/ml Medium + 30 µg Chloramphenicol/ ml Medium + 50 µg Kanamycin/ ml Medium • LB-X-Gal-IPTG-Agar-Platten für Blau-Weiß Selektion 40 µl X-Gal 40 µl IPTG pro LB-Agar-Platte • Lösung mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt, sterilfiltriert ___________________________________________________________________________ • Methocel-Medium (1 x) 10 g Methocel 3,76 g MEM in 400 ml A. dest. gelöst, bei 120°C autoklaviert + 880 mg NaHCO 3 in 10 ml A. dest. gelöst, sterilfiltriert + 4 ml L-Glutamin 200 mM (Stammlösung) 1 x Methocel 1/4 mit Medium verdünnt (Gebrauchslösung) • PBS (phosphate buffered saline; pH 7,4) 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 10 mM Na 2 HPO 4 2 mM KH 2 PO 4 • PBS-T PBS mit 0,3% (v/v) Tween-20 • Probenpuffer (4x), reduzierend 4 ml SDS, 20% (w/v) 1 ml Glycerin 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 6,8) 0,1 ml Bromphenolblau 5% (v/v) β-Mercaptoethanol mit A. dest. ad 25 ml • RIPA-Puffer für Zell-Lysis 10 mM Na-Phosphatpuffer (pH 7,2) 10 mM EDTA 1% (v/v) Triton X-100 1% (w/v) Na-DOCA 40 mM NaF 0,1% (w/v) SDS 0,1% (w/v) Aprotinin (optional) • RNaseA-Lösung 20 µl RNaseA-Stammlösung in 10 ml TE (pH 8,0) • Sarkosyl-Puffer 75 mM Tris-HCl (pH 8,0) Material und Methoden ___________________________________________________________________________ 25 mM EDTA 10% (w/v) N-Lauroylsarkosin • SDS-PAGE-Elektrophorese-Puffer 250 mM Glycin 25 mM Tris (10 x PAGE-Elektrophorese-Puffer) 1/10 mit A. dest. verdünnt + 0,1% (w/v) SDS • SOC-Medium 20 mM Glucose in SOB-Medium • Southern-Blot-Puffer I 1 x Maleinsäurepuffer 0,3% (v/v) Tween-20 • Southern-Blot-Puffer II 1 x Maleinsäurepuffer 1% (w/v) Blockierungsreagenz • Southern-Blot-Puffer III 100 mM Tris-HCl 100 mM NaCl auf pH 9,5 eingestellt • SSC (standard saline citrate; 20 x) 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt • TAE-Elektrophorese-Puffer (50 x) für Agarosegel-Elektrophorese 2 M Tris 0,25 M Na-Acetat 0,05 M EDTA mit Eisessig auf pH 7,8 eingestellt • TBS (Tris-buffered saline; 10 x) 100 mM Tris-Cl (pH 7,4) • Transfer-Puffer für Western Blotting 10% (v/v) Methanol 5% (v/v) PAGE-Puffer (10 x) • Tris-Puffer für SDS-PAGE-Sammelgele 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) • Tris-Puffer für SDS-PAGE-Trenngele 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) (w/v) Trypsin • Waschlösung 1 für Southern Blotting 2x SSC 0,1% (w/v) SDS • Waschlösung 2 für Southern Blotting 0,1x SSC 0,1% (w/v) SDS Material und Methoden ___________________________________________________________________________ 3.1.8 Geräte, Laborhilfsmittel und Verbrauchsmaterialien • Brutschrank B6 (Fa. Heraeus, Hanau)

  • Zentrifugen: Kühlzentrifuge 5804R (Fa. Eppendorf, Hamburg) Megafuge 1.0 R (Fa. Heraeus, Osterode) mitteltourige Zentrifuge J2-HS (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) Spectrafuge 16M Microcentrifuge (Fa. Labnet, Nürtingen) Ultrazentrifuge L8-55 (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) Ultrazentrifuge LE 70 (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) Ultrazentrifuge Optima TL (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) Vakuumzentrifuge Univapo 150 H (Fa. Uni Equipment, Martinsried) • Zentrifugenröhrchen (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) • Zentrifugenrotoren: JA 10; JA17; JA20; SW41; TLA45; TST28.38; TST4 (Fa. Beckman, Palo Alto, USA) ___________________________________________________________________________ 3Für die Untersuchungen wurden KOP-R-, PT-und MDBK-Zellinien verwendet. Die Zellen wurden in DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium) kultiviert und mit 10% FKS (30 min bei 56°C hitzeinaktiviert) supplementiert. In regelmäßigen Abständen wurden die Zellen, nach einmaligem Waschen mit PBS-Puffer, durch Zugabe einer Trypsin-haltigen Lösung von der Kulturflasche abgelöst und in frischem Medium resuspendiert. Ein Teil der Suspension wurde in der Flasche belassen, der Rest optional auf weitere Zellkulturgefäße verteilt oder verworfen. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen bei 37°C in feuchter Atmosphäre mit einem CO 2 -Anteil von 5% inkubiert. 3.2.1.2 Vermehrung von Viren in Zellkultur Konfluent gewachsene KOP-R-Zellen wurden mit einer Virussuspension beimpft und bis zur Ablösung des Zellrasens, nach ein bis drei Tagen, unter Standardbedingungen inkubiert. Zweimal gefriergetaute (-70°C) infizierte Zellen wurden durch Zentrifugation mit 1500 rpm (Umdrehungen pro Minute) für 10 min in Zell-Debris und Überstände getrennt und letztere wurden für weitere Untersuchungen aliquotiert. Die Virusaliquots wurden bei -70°C gelagert. Nach dem Auftauen einzelner Aliquots auf Eis wurde deren Virustiter bestimmt (siehe Kapitel 3.2.1.3).

  Einflüsse auf Stimulations-und Infektionsexperimente durch Konditionierung der Medien ausschließen zu können, wurden virusfreie Kontrollüberstände bei der Bereitung der Material und Methoden ___________________________________________________________________________ Virus-Stocks gewonnen. Hierzu wurden die Überstände nicht-infizierter Kulturen nach dem gleichen Muster wie die der infizierten Zellen behandelt (siehe Kapitel 3.2.1.2). Die Virusfreiheit wurde durch Beimpfen permissiver MDBK-Zellen geprüft. Die Kontrollüberstände mit der Bezeichnung "mock" wurden bei -70°C gelagert. 3.2.1.5 Gewinnung von Zellysaten In einem Loch einer 6-Loch-Zellkultur-Schale wurden MDBK-Zellen (etwa 1 x 10 6 ) mit einer MOI (multiplicity of infection) von 5 infiziert und nach 16 h lysiert. Hierzu wurden die Zellen mit einem Zellschaber von ihrer Unterlage abgelöst und mit dem Medium in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation (10 min, 6000 rpm) wurde der Zellkulturüberstand dekantiert und das Zellpellet in 300 µl RIPA (Lysis)-Puffer aufgenommen. Die Lysate wurden, um die DNA zu fragmentieren, 2 x 10 sec mit Ultraschall behandelt. Bis zur weiteren Verwendung für die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (siehe Kapitel 3.2.7.1) wurden die Zellysate bei -70°C gelagert. viraler DNA wurden MDBK-Zellen infiziert und unter Standardbedingungen bis zur Ablösung des Zellmonolayers inkubiert. Anschließend wurde die DNA mit Hilfe des Puregene ® DNA Isolation Kits nach Herstellerangaben aufgereinigt. Um vorzugsweise zirkularisierte Replikationsstadien für die bakterielle Transformation (siehe Kapitel 3.2.6.1) zu präparieren, wurde zum Zellkulturüberstand unmittelbar nach der Beimpfung mit einer Virussuspension 100 µg Cycloheximid pro ml Medium gegeben und die virale DNA nach 6stündiger Inkubation aufgereinigt. Transfektion ist eine chemische Transfektionsmethode und wurde ursprünglich für die Steigerung der Infektiosität viraler Nukleinsäure entwickelt (Graham und van der Eb, 1974). Hierbei wird die DNA in einer CaCl 2 -Lösung vorgelegt und mit Phosphatpuffer gemischt. Die gebildeten DNA-Calciumphosphat Ko-Präzipitate werden in das Kulturmedium gegeben, adsorbieren an die Zelloberfläche und werden endozytotisch in die Zelle aufgenommen. Für die Herstellung der Präzipitate wurde die DNA in TE oder A. dest. gelöst und in 438 µl 10 mM Tris-Cl (pH 7,5) vorgelegt. Nachdem 62 µl 2M CaCl 2 Material und Methoden ___________________________________________________________________________ unter Schütteln zugetropft wurden, wurde das Gemisch über Nacht bis zur Bildung eines feinen Präzipitates bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde tropfenweise 500 µl (2 x) HBS (pH 7,0) zugegeben und 500 µl dieses Transfektionsansatzes direkt in das Medium semikonfluenter (60-70% Konfluenz) PT-Zellen, die am Tag zuvor in einer 6-Loch-Schale ausgesät worden waren, getropft. Nach drei bis vierstündiger Inkubation unter Standardbedingungen wurde der Zellmonolayer mit PBS-Puffer gewaschen und für exakt 2 min mit 1,5 ml einer 15% Glycerollösung überschichtet. Nach 2 min wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen, mit Medium (DMEM + 5% FKS) substituiert und zweimaliges Gefriertauen gewonnen, titriert und auf permissiven MDBK-Zellen passagiert. Homogene, rekombinante Viruspopulationen wurden durch Plaquereinigung (siehe Kapitel 3.2.2.3) erhalten. Das sogenannte green fluorescent protein (GFP) ist ein Quallen (Aequorea victoria)-Protein, das während UV-Licht-Anregung grün autofluoresziert (Prasher et al., 1992). EGFP (enhanced green fluorescent protein, Fa. Clontech, Heidelberg), dessen Expression unter der Kontrolle des HCMV-Immediate-Early-Promotors steht, stellt eine Variante des Wildtypproteins mit einer 35fach stärkeren Fluoreszenz dar. Die generierten rekombinanten Viren konnten fluoreszenzmikroskopisch anhand ihrer EGFP-Expression identifiziert werden.

  aus dem kationischen 1,2-Dioleyloxypropyl-3-trimethylammoniumbromid (DOTMA) und Dioleylphosphatidyl-ethanolamin (DOPE) DNA durch eine ionische Bindung. Die positivgeladenen DNA-Liposomen-Komplexe binden vermutlich negativ geladene Sialinsäurereste auf der Zelloberfläche und werden auf nicht exakt geklärte Weise in die Zelle und den Kern importiert. Mit Hilfe der Lipofectin ® -Liposomensuspension wurden semikonfluente PT-Zellen nach Herstellerangaben transfiziert. Für die Generierung rekombinanter Viren wurden 1 bis 5 µg mutagenisierte (siehe Kapitel 3.2.6.4) virale BAC-DNA in PT-Zellen transfiziert, oder 1 bis 5 µg virale Wildtyp-DNA gemeinsam mit 5 bis 10 µg Plasmid-DNA ko-transfiziert. Bis zur Ausbildung von Virusplaques wurden die Zellen unter Standardbedingungen inkubiert. Mit den Transfektionsüberständen (siehe Kapitel 3.2.2.2) infizierte MDBK-Zellen wurden eine Stunde lang unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS-Puffer gewaschen und mit semisolidem Methocel-Medium (0,25 x), einem sogenannten overlay, überschichtet, um die Verunreinigung homogener rekombinanter Virus-Plaques durch Ausgangsviren im Überstand weitgehend auszuschließen. Zellen rekombinanter Plaques wurden mit 50 µl Methocel-Medium aufgenommen und in 1 ml Medium verdünnt. 300 µl dieser infektiösen Suspension wurden auf MDBK-Zellen passagiert. Durch weitere Plaquereinigungsschritte wurde so eine homogene und rekombinante Viruspopulation subkloniert. 3.2.3 Charakterisierung rekombinanter Viren in vitro 3.2.3.1 Plaquegrößenbestimmung Konfluente MDBK-Zellen wurden mit 100 PFU (plaque forming units / plaquebildende Einheiten) pro Loch einer 6-Loch-Zellkultur-Schale infiziert, nach einer Stunde mit semisolidem Methocel-Medium (overlay) überschichtet und 48 h unter Standardbedingungen inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS-Puffer gewaschen, mit 5 % (v/v) Formalin fixiert und anschließend zur Darstellung der Virus-Plaques mit Kristallviolettlösung gefärbt. Mit Hilfe eines skalierten Messokulars (Fa. Carl Zeiss, Jena) wurde der maximale Durchmesser von mindestens 150 Plaques mikroskopisch bestimmt. Die Messwerte wurden gemittelt und die Standardabweichung berechnet. 3.2.3.2 Ein-Schritt-Wachstumskinetiken Für die Ermittlung von Ein-Schritt-Wachstumskinetiken wurden die MDBK-Zellen eines Lochs einer 24-Loch-Zellkulturschale mit einer MOI von 1 (etwa 300.000 PFU) infiziert und eine Stunde lang unter Standardbedingungen inkubiert. Anschließend wurde der infizierte Zellrasen mit PBS-Puffer gewaschen und für 2 min mit eiskaltem CBS-Puffer (pH 3,0) bedeckt, um oberflächlich adsorbierende Viruspartikel zu inaktivieren. Danach wurden die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und mit 1 ml Medium (DMEM + 5% FKS) substituiert. Für die Bestimmung der Infektiosität im Zellkulturüberstand wurde nach 0h, 4h, 8h, 12h, 16h, 24h, 48h und 72h das Medium gewonnen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Zur Bestimmung der zellgebundenen Infektiosität wurde der Zellrasen, wie oben beschrieben, mit CBS-Puffer (pH 3,0) bedeckt und mit PBS-Puffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit einer Pipettenspitze von der Kulturschale abgeschabt, in 1 ml Medium Material und Methoden ___________________________________________________________________________ aufgenommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die beiden Proben jedes Zeitwerts wurden bis zur Bestimmung der KID 50 /ml (3.2.1.3) bei -70°C gelagert. kann die Nukleinsäurekonzentration über die Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt werden. Die Konzentration errechnet sich aus der OD bei 260 nm, dem Verdünnungsfaktor und einem für DNA, RNA, oder Oligonucleotide spezifischen Multiplikationsfaktor. Aus dem Verhältnis der OD 260 nm und der OD 280 nm erhält man außerdem eine Aussage über Proteinkontaminationen in der Lösung. Der Quotient aus OD 260 nm und OD 280 nm sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen. DNA-Lösungen wurden in 1 mM Na 2 HPO 4 -Puffer (pH 8,5; Wilfinger et al., 1997) verdünnt und in eine Quarzküvette pipettiert. Anschließend wurde mit Hilfe eines Spektralphotometers (GeneQuant pro) die OD 260 nm der DNA-Lösung bestimmt und ihre Konzentration berechnet. Bei der DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen wurden 2 U (units / Einheiten) des entsprechenden Restriktionsenzyms pro 1 µg Plasmid-DNA oder 10-15 U pro 1 µg gereinigte virale DNA eingesetzt. Der Spaltungsansatz wurde mit einem Restriktionsenzympuffer (10 x) supplementiert, der nach Herstellerangaben eine optimale Aktivität (≥ 75%) des entsprechenden Restriktionsenzyms garantiert, und mit A. dest. auf ein Gesamtvolumen von mindestens 20 µl gebracht. Anschließend wurde der Spaltungsansatz für 1 bis 2 h (Plasmid-DNA) oder 3 bis 5 h (virale DNA) unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die DNA-Spaltungsprodukte wurden nach ihrer Fragmentgröße elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurde der Spaltungsansatz in DNA-Ladepuffer (6 x) verdünnt, auf ein 0,7 bis 1,5%-iges Agarosegel aufgetragen und anschließend eine Gleichspannung von 40 bis 110 Volt über 1 bis 16 h in einer Sub-Cell  GT Agarosegel-Elektrophoresekammer angelegt. 5 µl eines DNA-Markers (1 kbp DNA Ladder) wurden zum Größenvergleich neben den Proben aufgetragen. Das Agarosegel wurde nach der Elektrophorese in einer DNA/RNA-färbenden Ethidium-Bromid-Lösung inkubiert. Die DNA-Fragmente wurden unter UV-Licht (302 nm) als fluoreszierende Banden visualisiert und photographisch dokumentiert. ___________________________________________________________________________ 3des random priming (Feinberg und Vogelstein, 1983) wird die doppelsträngige DNA-Matrize denaturiert und mit Zufallshexameren (random primers) hybridisiert, die als Primer für die T7-DNA-Polymerase dienen. Die Markierung erfolgt durch den Einbau von Digoxigenin (DIG)-markiertem dUTP. Ein Mikrogramm der DNA-Matrize wurde in 16 µl A. dest. aufgenommen, 10 min bei 95°C denaturiert und sofort auf Eis gestellt. Anschließend wurden 4 µl DIG-High Prime-Lösung zugegeben und der Reaktionsansatz 12 bis 18 h bei 37°C inkubiert. Durch zehnminütiges Erhitzen auf 65°C und die Zugabe von 2 µl 0,2 M EDTA (pH 8,0) wurde die Markierung gestoppt. Die DIG-markierte DNA-Sonde wurde mit 2,5 µl 4 M LiCl und 75 µl Ethanol (absolut) gefällt und 30 min bei -70°C gelagert. Durch Zentrifugation der Probe mit 14.000 rpm für 10 min wurde die DNA pelletiert. Das DNA-Pellet wurde mit Ethanol (70%) gewaschen und in einer Univapo 150 H-Vakuumzentrifuge bei 37°C getrocknet. Die markierte DNA-Sonde wurde in 50 µl TE resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. Southern Blotting Bei der Southern-Blot-Hybridisierung werden elektrophoretisch aufgetrennte DNA-Fragmente auf einer Membran fixiert, um einzelne Fragmente durch eine spezifische Reaktion mit markierten Sonden nachweisen zu können (Southern, 1975). Nach Restriktionsenzymspaltung (siehe Kapitel 3.2.4.2) wurden die Fragmente viraler DNA in einem 1%-igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und unter UV-Licht (302 nm) zur Dokumentation photographiert. Das Agarosegel wurde anschließend zum Entfärben 30 min in A. dest. gewaschen und 10 min in 0,1 M HCl-Lösung gebadet, um die DNA-Fragmente zu depurinisieren. Beim eigentlichen Southern Blotting wird ein denaturierender Transferpuffer unter Ausnutzung von Kapillarkräften durch das Agarosegel und eine (Nylon)membran in einen Stapel Zellstoffpapier gesogen. Die denaturierten, einzelsträngigen DNA-Fragmente werden dabei auf der positiv geladenen Nylonmembran fixiert. Für das Southern Blotting wurde das Gel auf eine Filterpapier-Flüssigkeitsbrücke (Gel-Blotting-Papier) gelegt, deren Papierenden in eine denaturierende Transferlösung (0,6 M NaCl, 0,4 M NaOH) tauchten. Eine mit Transferpuffer angefeuchtete Hybond ™ -N+-Nylonmembran wurde auf die Größe des Gels zugeschnitten und luftblasenfrei auf das Agarosegel gelegt. Die Ränder des Gels wurden mit Parafilmstreifen abgedeckt um einen Kontakt des ober-und unterhalb des Gel-Membran-Komplexes befindlichen Filterpapiers zu vermeiden. Anschließend wurden nacheinander zwei Material und Methoden ___________________________________________________________________________ angefeuchtete Papierfilter, ein Stapel Zellstoffpapier, eine Glasplatte und ein 1 kg schweres Gewicht auf die Membran gelegt. Der DNA-Transfer erfolgte für 16-24 h bei Raumtemperatur (RT). Nach dem Transfer wurde die Nylonmembran bei RT zwischen zwei Papierfiltern getrocknet und in einem Stratalinker R UV-Crosslinker mit UV-Licht bestrahlt, um die DNA kovalent an die Membran zu binden. DNA-DNA Hybridisierung und Detektion In einem Hybridisierungsofen wurde die Membran mit der transferierten DNA 30 min bei 42°C mit 15 ml DIG Easy Hyb  inkubiert. Die sequenzspezifische DIG-markierte Sonde wurde 10 min auf 95°C erhitzt und sofort in 10 ml 65°C heißer DIG Easy Hyb  -Lösung verdünnt. Nach einer 12 bis 20stündigen Hybridisierung bei 42°C im Hybridisierungsofen wurde die Sonde abgekippt und bis zur erneuten Benutzung bei -20°C gelagert. Die Membran wurde zweimal 10 min bei RT mit Waschlösung 1, zweimal 15 min mit Waschlösung 2 bei 68°C gewaschen und anschließend bei RT 5 min in Southern-Puffer I gebadet. Durch eine 45minütige Inkubation bei RT in Southern-Puffer II wurden unspezifische Antikörperbindungsstellen geblockt. Nach der Blockierung wurden mit alkalischer Phosphatase gekoppelte Antikörper gegen Digoxigenin, 1/10.000 in Southern-Puffer II verdünnt und mit der Membran 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal 15 min mit Southern-Puffer I gewaschen und 5 min mit Southern-Puffer III äquilibriert. Das chemoluminiszente Substrat CSPD  wurde 1/100 in Southern-Puffer III verdünnt und 15 min bei 37°C mit der Membran inkubiert. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase bewirkt die Abspaltung einer Substratphosphatgruppe, wodurch Licht emittiert wird, das einen Röntgenfilm schwärzt. Nach der Inkubation mit dem Substrat wurden sequenzspezifische Signale durch ein-bis dreistündiges Auflegen eines Röntgenfilms detektiert. (siehe Kapitel 3.2.5.6) sowie durch Restriktionsendonukleasen gespaltene (siehe Kapitel 3.2.4.2) Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt und nach einer Ethidium-Bromid-Färbung unter UV-Licht (302 nm) visualisiert. Die entsprechende DNA-Bande wurde im Größenvergleich mit einem DNA-Marker (1 kbp DNA Ladder) identifiziert und zügig zur Vermeidung von DNA-Strangbrüchen durch UV-Licht-Exposition mit einer Skalpellklinge aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde dann mit Hilfe des QIAquick  Gel-Extraktions Kits nach den Angaben des Herstellers extrahiert und in 30 µl A. dest. gelöst.

  )-Reaktion Nach einer Spaltung mit Restriktionsendonukleasasen können DNA-Doppelstränge mit terminalen 5'-Überhängen mit Hilfe des bifunktionalen Klenow-Fragments der Escherichia coli-Polymerase Ι aufgefüllt (5' → 3'-Polymeraseaktivität) und terminale 3'-Überhänge auf die Länge des komplementären Stranges abgedaut (3' → 5'-Exonukleaseaktivität) werden (Jacobsen et al., 1974). Für die sogenannte fill-in-oder blunting-Reaktion wurde 1 µg der gespaltenen DNA mit 2,5 U Klenow-Fragment, nach Zugabe von 100 µM dNTPs, in 1 x Blunting-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch zehnminütiges Erhitzen auf 75°C und Zugabe von 1 µl EDTA (0,5 M, pH 7,5) gestoppt. 3.2.5.3 Dephosphorylierung von DNA Bei der Spaltung eines Vektors mit nur einer Restriktionsendonuklease entstehen zwei kompatible Enden, die wieder miteinander ligieren können. Durch Dephosphorylierung der Vektor-DNA kann man diese Reaktion weitgehend einschränken. Hierzu wurde der gelöste linearisierte Vektor mit CIP-Puffer (1 x) auf ein Gesamtvolumen von 270 µl gebracht und mit 2 U CIP (calf intestine alkaline phosphatase) eine Stunde bei 37°C inkubiert. Da das Enzym 3'-Überhange, und glatte DNA-Enden weniger effektiv dephosphoryliert, als 5'-Überhänge, wurde in diesen Fällen der Reaktionsansatz 30 min bei 37°C und zusätzlich 30 min bei 56°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 30 µl 0,1 mM EDTA (pH 8,0) und zehnminütiges Erhitzen bei 65°C beendet. 3.2.5.4 Ligation Für die Insertion eines DNA-Fragments (Insert) in einen Vektor wurde die T4-DNA-Ligase verwendet, die unter ATP-Verbrauch komplementäre 5'-Phosphat-und 3'-OH-Enden linearer DNA-Fragmente verbindet. Bei der Ligation wurden etwa fünfmal mehr Insert-, als Vektor-DNA eingesetzt und in Ligationspuffer mit 0,5 U T4 DNA Ligase 12 bis 18 h bei 14°C inkubiert. Der Ligationsansatz wurde nach 12 h mit ATP (1mM Endkonzentration) supplementiert.

Tabelle 5 :

 5 besteht aus drei Einzelschritten: Strangtrennung der Amplifikationsmatrize (Template) bei 95°C (Denaturierung), Hybridisierung der Primer an das einzelsträngige Template bei 54°C (Annealing), und schrittweise Addition von Desoxyribonukleotideinheiten (dNTPs) an das Primer-3'-Ende bei 72°C, durch eine hitzestabile DNA-Polymerase (Elongation). Primer mit 20 bis 30 sequenzspezifischen Basenpaaren (bp) für das Template wurden mit Hilfe der Primer Analysis Software OLIGO 4.1 abgeleitet, modifiziert und als Oligonukleotide (Fa. MWG-Biotech, Ebersberg) synthetisiert. Die Bedingungen für die PCR und die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes wurden spezifisch an die Primer und das Amplifikat angepasst (Tabelle 1 bis 6). Material und Methoden ___________________________________________________________________________ Tabelle 1: Für die gE-Deletion verwendete Primer: Den Positionsangaben liegen die Sequenzdaten von Leung-Tack et al. (1994) zugrunde. Kleine, fettgedruckte Buchstaben bezeichnen die Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen. Zusätzliche, nicht sequenzspezifische Basen sind durch kursivgedruckte Großbuchstaben gekennzeichnet. Für die Konstruktion der gE-Revertanten verwendete Primer: Den Positionsangaben liegen die Sequenzdaten von Leung-Tack et al. (1994) zugrunde. Für die gG-Deletion verwendete Primer: Den Positionsangaben liegen die Sequenzdaten von Leung-Tack et al. (1994) zugrunde. Unterstrichene Buchstaben bezeichnen pACY177-spezifische Sequenzen, die für das Kanamycinresistenz-Gen kodieren. Glykoprotein G-spezifische Sequenzen sind durch fett-und kursivgedruckte Buchstaben gekennzeichnet. Für die gM-Deletion verwendete Primer: Den Positionsangaben liegen online verfügbare BHV-1 Sequenzdaten zugrunde (NCBI Sequence, NC_001847). Unterstrichene Buchstaben bezeichnen pACY177spezifische Sequenzen, die für das Kanamycinresistenz-Gen codieren. Glykoprotein M-spezifische Sequenzen sind durch fett-und kursivgedruckte Buchstaben gekennzeichnet. Für die gK-Deletion verwendete Primer: Den Positionsangaben liegen online verfügbare BHV-1 Sequenzdaten zugrunde (NCBI Sequence, NC_001847). Unterstrichene Buchstaben bezeichnen pACY177spezifische Sequenzen, die für das Kanamycinresistenz-Gen codieren. Glykoprotein K-spezifische Sequenzen sind durch fett-und kursivgedruckte Buchstaben gekennzeichnet. Darstellung der für die PCR verwendeten Reaktionsbedingungen: A) Amplifikation der Fragmente 1 + 2 für die gE-Deletion B) Amplifikation des Fragments für die Konstruktion der gE-Revertanten C) Amplifikation des Kanamycinresistenz-Gens für die gG-, gM-, gK-elektrokompetenter Bakterien mit viraler BAC-DNA RecA-negative, elektrokompetente E. coli (Stamm DH10B)-Zellen (One Shot  Electrocomp ™ Gene-Hogs  ) wurden durch die Elektroporation mit zirkularisierten Replikationsstadien viraler BAC-DNA transformiert. Für die Transformation wurden 50 µl kompetente Zellen mit 1 µg der BAC-Virus-DNA-Präparation (siehe Kapitel 3.2.2.1) gemischt und in eine E. coli Pulser  -Elektroporationsküvette mit 1 mm Elektrodenabstand gegeben. Die Bakterien wurden in der Küvette mit Hilfe des EasyjecT ™ Elektroporationssystem bei Standardeinstellungen (1,25 kV, 200 Ω, und 25 µF) elektroporiert. Nach dem Puls wurden die Bakterien in 1ml SOC-Medium suspendiert und eine Stunde bei 37°C unter Schütteln (350 rpm) inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension auf LB-Chloramphenicol-Selektions-Agarplatten ausplattiert, und bei 37°C inkubiert. Nach 24 bis 36 h wurden Chloramphenicolresistente Kolonien selektioniert.

  photometrisch ermittelten OD 600 von 0,1 bis 0,15 (nach 60 bis 100 min) wurde die Kultur 15 min auf Eis gestellt. Anschließend wurden die Bakterienzellen zweimal hintereinander durch Zentrifugation (10 min, -4°C, 6000 rpm) pelletiert, der Überstand abgekippt und das Pellet in 200 ml eiskalter Glycerinlösung (10%) resuspendiert. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurde die Glycerinlösung dekantiert und das Pellet in der Residualflüssigkeit aufgenommen. Die Bakteriensuspension wurde in 50 µl Aliquots bei -70°C gelagert. Zur Transformation mit einem Rekombinations-Plasmid wurde ein 50 µl-Aliquot elektrokompetenter Zellen mit 100 ng einer entsprechenden Plasmidpräparation gemischt und wie unter 3.2.6.1 beschrieben elektroporiert. Nach dem elektrischen Puls wurden die Bakterien in 1 ml SOC-Medium suspendiert und eine Stunde bei 30°C unter Schütteln (350 rpm) inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension auf LB-Chloramphenicol/Ampicillin-Selektions-Agarplatten ausplattiert und bei nunmehr 30°C inkubiert. Nach 36 bis 48 h wurden doppelresistente Kolonien selektioniert. Mit 2 ml einer Übernachtkultur (LB-Chloramphenicol/Ampicillin-Medium) eines Bakterienklons, der sowohl die virale DNA als BAC als auch das Rekombinations-Plasmid pKD46 beherbergt, wurden 200 ml LB-Chloramphenicol/Ampicillin-Medium beimpft. Die Expression der Gene, die für Redα, Redβ und das Gam-Protein codieren, steht bei dem Vektor pKD46 unter einem durch Arabinose induzierbaren Promotor. Durch die Supplementierung des Mediums mit 1 mM frisch angesetzter Arabinose wurde die Rekombinationskompetenz der Bakterien induziert. Nach der Induktion wurde die Bakterienkultur bei 30°C im Inkubationsschüttler inkubiert. Bei einer photometrisch ermittelten OD 600 von 0,6 (nach 3 bis 4 h) wurde die Kultur 15 min auf Eis gestellt.

Für

  die RecE/T-Mutagenese wurde ein 50 µl-Aliquot rekombinationskompetenter Zellen mit 100 -500 ng des aufgereinigten (siehe Kapitel 3.2.5.3) PCR-Amplifikates des Kanamycinresistenz-Gens gemischt und, wie unter 3.2.6.1 beschrieben, elektroporiert. Nach dem elektrischen Puls wurden die Bakterien in 1ml SOC-Medium suspendiert und eine Stunde bei 37°C unter Schütteln (350 rpm) inkubiert. Anschließend wurde die Bakteriensuspension auf LB-Chloramphenicol/Kanamycin-Selektions-Agarplatten ausplatiert und bei 37°C inkubiert. Durch einen Temperatur-Shift von 30°C auf 37°C wurde die Weitergabe des temperatursensitiven Rekombinationsplasmids pKD46 an die bakteriellen Filialgenerationen verhindert, und doppelresistente Kolonien wurden nach 36 bis 48 h selektioniert. 3.2.6.5 Schnell ("Mini")-präparation bakterieller Plasmid-DNA Selektionierte Bakterienklone wurden mit einer Pipettenspitze von der Agarplatte gepickt, in 3 ml LB-Selektionsmedium transferiert und 12 bis 16 h bei 37°C im Inkubationsschüttler inkubiert. 1,5 ml der dicht gewachsenen Bakterienkultur wurden in einer Eppendorf Kühlzentrifuge 3 min lang bei 4°C und 7000 rpm pelletiert. Der klare Überstand wurde abgesaugt, das Bakterienpellet in 100 µl Lösung 1 resuspendiert und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Bakterienzellen durch die Zugabe von 200 µl der alkalischen Lösung 2 (alkalische Lyse) lysiert und 5 min auf Eis gestellt. Der Ansatz wurde mit 150 µl der Lösung 3 neutralisiert, 5 min auf Eis gestellt und mit 400 µl Phenol versetzt. Die wässrige Phase und die Phenolphase wurden durch starkes Vortexen für 1 min durchmischt und zur Trennung 10 min in einer Kühlzentrifuge mit 14.000 rpm bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase mit der darin gelösten Plasmid-DNA wurde mit einer Pipette vorsichtig von der Phenolphase abgesaugt und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde die Plasmid-DNA mit 1/10 Volumen 4 M LiCl und 3 Volumen Ethanol (absolut) aus der Lösung gefällt und 30 min bei -70°C gelagert. Durch 10minütige Zentrifugation der Proben mit 14.000 rpm wurde die DNA pelletiert. Die DNA-Pellets wurden mit Ethanol (70%) gewaschen, in einer Vakuumzentrifuge bei 37°C getrocknet und in 50 µl TE-RNaseA-Lösung aufgenommen.

7 :

 7 Polyacrylamidgele setzen sich aus zwei Komponenten, einem Trenn-und einem Sammelgel, zusammen. Die eigentliche Auftrennung der Proteine erfolgt in dem engporigen Trenngel, das relativ weitporige Sammelgel hat die Aufgabe das Proteingemisch vor seinem Eintritt in das Trenngel zu fokussieren. Die für die Polymerisierung der Trenn-bzw Sammelgele erforderlichen Reagenzien wurden in den in Tabelle 7 angegebenen Mengenverhältnissen miteinander vermischt. Mit Hilfe einer Mini-PROTEAN  3 Gel-Apparatur wurden Polyacrylamidgele mit einer Tiefe von 1,5 mm gegossen. Die Lysate infizierter Zellen (siehe Kapitel 3.2.1.5) wurden für die Reduktion von Disulfidbrücken mit reduzierendem Probenpuffer (4 x) vermischt, 3 min bei 95°C erhitzt und nach der Aushärtung der Trenn-und Sammelgele in die Taschen der Sammelgele pipettiert. Als Größenmarker wurde ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Die Proteine wurden 100 min durch Anlegen von 100 V Gleichspannung nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. ___________________________________________________________________________ Tabelle Zusammensetzung von Polyacrylamidgelen für die SDS-PAGE: von Proteinen durch Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung Proteinbanden können mit dem Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blau in einem Polyacrylamidgel sichtbar gemacht werden. Für die Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung wurden die Polyacrylamidgele eine Stunde in einer Coomassie-Färbelösung gebadet und anschließend 12 bis 36 h mit einer Coomassie-Entfärbelösung entfärbt. Die aufgetrennten Proteine wurden als blaue Banden identifiziert. Zur Konservierung wurden die gefärbten Gele auf einen Papierfilter gelegt und mit Hilfe eines Geltrockners 2 h bei 75°C getrocknet.

  Abbildung 4Schematische Darstellung der Konstruktion von BHV-1∆gE und BHV-1rev Gezeigt ist die Organisation des 136 kbp grossen BHV-1-Genoms und eine Hind III-Restriktionsfragmentkarte (1). Für die BHV-1∆gE-Konstruktion wurde die mini-F-pHA2-Kassette des Vektors p∆gE-pHA2 durch homologe Rekombination in den U S 8/gE-ORF inseriert (2). In der Revertante BHV-1rev wurde die gE-Deletion durch homologe Rekombination mit dem Rekombinationsplasmid pTgEr restauriert (2).

  Abbildung 5Southern-Blot-Analyse der pBHV-1∆gE-Klone 2 und 7 BHV-1-, pBHV-1∆gE 2-und pBHV-1∆gE 7-DNA wurde mit Hind III gespalten und in einem 1,2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (a). Eine 1 kbp DNA-Ladder (Fa. Promega Mannheim) wurde als Größenmarker aufgetragen. Die Größe der Marker-Banden in kbp ist am linken Rand der Abbildung angegeben. Die Proben wurden für den Nachweis BAC-spezifischer Sequenzen auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer DIG-markierten mini-F-pHA2-Sonde hybridisiert (b). Die reagierenden Banden sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Relative(

  Abbildung 7Relative Plaquegrößen der gE-negativen Mutante BHV-1∆gE 48 h p. i. wurde der maximale Durchmesser von je 150 BHV-1-, BHV-1∆gE-und BHV-1rev-spezifischen Virusplaques bestimmt. Der für BHV-1 ermittelte durchschnittliche Messwert der Plaques wurde auf 100% gesetzt. Striche über den Balken bezeichnen die Standardabweichung. BHV-1∆gE-Plaques waren im Mittel 45% kleiner als die des gE-exprimierenden BHV-1.

  Abbildung 12Relative Plaquegrößen der BHV-1∆gE-gG-und BHV-1∆gG-Mutanten 48 h p. i. wurde der maximale Durchmesser von je 150 BHV-1-, BHV-1∆gE-, BHV-1rev-, BHV-1∆gE-gG-und BHV-1∆gG-spezifischen Plaques bestimmt. Der für BHV-1 ermittelte durchschnittliche Meßwert wurde auf 100% gesetzt. Striche über den Balken bezeichnen die Standardabweichung. BHV-1∆gE-gG Plaques waren im Mittel um 55%, BHV-1∆gG-spezifische Plaques um 19% kleiner als die des Wildtyp-BHV-1.

  Abbildung 15Southern-Blot-Analyse der BHV-1∆gE-gM-Mutante DNA von BHV-1, BHV-1∆gE und BHV-1∆gE-gM wurde mit Hind III gespalten und in einem 1,2% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (a). Eine 1 kbp DNA-Ladder wurde als Größenmarker aufgetragen. Die Größe der Marker-Banden in kbp ist am linken Rand der Abbildung angegeben. Die gespaltene DNA wurde auf eine Nylonmembran transferiert und für den Nachweis kan spezifischer Sequenzen mit einer DIG-markierten kan-Sonde hybridisiert (b). Pfeile bezeichnen mit der kan-Sonde reagierende und für BHV-1∆gE-gM spezifische DNA-Banden.

  Die in dieser Arbeit beschriebene Klonierung einer gE-negativen BHV-1-BAC-Mutante ist somit eine gute Basis für die Konstruktion von Doppeldeletionsmutanten, die theoretisch als BHV-1-Doppelmarkervakzine in Frage kommen könnten. Bei einem Infektionsversuch mit Kälbern konnte von Kaashoek et al. (1998) gezeigt werden, dass eine BHV-1-Mutante mit einer gG-Deletion weniger virulent als der Wildtyp und immunogener als eine gE-negative Mutante war. Die Autoren folgerten aus den Ergebnissen dieses Tierversuchs, dass eine gGnegative BHV-1-Mutante ein vielversprechender Kandidat für die Entwicklung eines BHV-1-Lebend (Marker)-Impfstoffes sei. In der Publikation von Belknap et al. (1999) wurden die günstigen immunogenen Eigenschaften einer gE-, gG-und U S 2-deletierten BHV-1-Mutante beschrieben und ihre Eignung als Markervakzine diskutiert. Der in vitro beobachtete Phänotyp, der hier präsentierten Doppelmutante BHV-1∆gE-gG, macht sie ebenfalls zu einem aussichtsreichen Kandidaten für die Entwicklung einer BHV-1-Markervakzine. Die als BAC klonierte Mutante bietet darüber hinaus den Vorteil der relativ einfachen Manipulierbarkeit mit Hilfe der RecE/T-Mutagenese und die Möglichkeit der Applikation als DNA. Diese Form der Verabreichung von BAC-Klonen wurde bereits für ein Konstrukt des Virus der Marek´schen Krankeit (MDV-1) als wirksame Alternative zu klassischen Viruspräparationen belegt (Tischer et al., 2002a). Mit Hilfe des BHV-1-BACs können zudem in kurzer Zeit ___________________________________________________________________________ erfolgreich rekonstituiert werden (siehe Kapitel 4.2.2.1). Durch genetische Analysen wurde gezeigt, dass in der BHV-1∆gE-gM-DNA der gM (U L 10)-ORF durch ein Kanamycinresistenz-Gen ersetzt und somit erfolgreich deletiert worden war (siehe Kapitel 4.2.2.2). Daraus konnte gefolgert werden, dass der beobachtete Phänotyp der BHV-1∆gE-gM-Mutante mit hoher Sicherheit aus einer gleichzeitigen gE-und gM-Deletion resultierte. Die Wachstumseigenschaften der BHV-1∆gE-gM-Doppelmutante wurden wie bei der Phänotypisierung der BAC-Mutante BHV-1∆gE-gG durch eine Plaquegrößen-Bestimmung und die Bestimmung von Wachstumskinetiken (siehe Kapitel 4.2.1.5) ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass BHV-1∆gE-gM-spezifische Virusplaques bei der Bestimmung der Plaque-Durchmesser, verglichen mit dem Wildtyp (BHV-1-Schönböken), im Mittel um 54% reduziert waren. Dieses Ergebnis war überraschend, da Brack et al. bei einer gleichzeitigen Deletion von gE/gI und gM (1999) oder von gE und gM (2000) beim PRV eine drastischere Reduktion der Plaque-Durchmesser um 90% (RK13-Zellen) oder 65% (MDBK-Zellen) beobachtet haben. König et al. (2002) konnten zeigen, dass eine BHV-1-Mutante mit einer singulären gM-Deletion Plaques bildete, deren Durchmesser im Vergleich mit dem Wildtyp (BHV-1-Stamm Aus12) um etwa 55% reduziert waren. Dieser Wert stimmt nahezu mit der Reduktion überein, die bei der hier vorgestellten BHV-1-BAC-Mutante mit einer gE-und gM-Doppeldeletion ermittelt wurde. Bei der Analyse der Wachstumskinetiken konnte bei der gE-und gM-negativen Doppelmutante BHV-1∆gE-gM, im Vergleich mit dem Wildtyp und der gE-negativen BAC-Mutante BHV-1∆gE, keine signifikante Reduktion der extrazellulären Virustiter ermittelt werden. Die intrazellulären Virustiter waren aber 48 h und 72 h p. i. etwa 10fach reduziert. Diese Ergebnisse weichen sehr deutlich von denen von Brack et al. (2000) ab, die bei einer gE-und gM-negativen PRV-Mutante eine etwa 1000fache Reduktion der extrazellulären Virustiter beobachtet haben. König et al. (2002) haben zudem beschrieben, dass die singuläre gM-Deletion eine verzögerte Freisetzung der BHV-1-Mutante zur Folge hatte. Die phänotypische Analyse der BHV-1∆gE-gM-BAC-Mutante macht deutlich, dass eine gleichzeitige gE-und gM-Deletion das BHV-1-Viruswachstum kaum beeinträchtigt. Es wurde aber gezeigt, dass diese Doppeldeletion den BHV-1-CTCS erheblich einschränkt. Da die hier beobachtete Einschränkung des CTCS mit der übereinstimmt, die bei einer BHV-1-Mutante mit einer singulären gM-Deletion beschrieben wurde (König et al., 2002), kann bestätigt werden, dass gM neben gE eine Rolle beim BHV-1-CTCS spielt. Es darf aber spekuliert werden, dass gE das wichtigere Protein für den CTCS darstellt. Die Rolle von gM beim CTCS und ob gM dabei in einen anderen Schritt als gE involviert ist, kann erst durch die künftige Generierung und Charakterisierung einer Mutante mit einer singulären gM-Deletion ___________________________________________________________________________ Replikationsdefektes. Die Deletion ist hierbei auch, im Gegensatz zu den konventionellen Methoden, unabhängig von einer Komplementierung der essentiellen Proteine möglich. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass das gesamte Genom des BHV-1-Stammes Schönböken erstmals als ein bacterial artificial chromosome (BAC) kloniert werden konnte.

  dass die Insertion der BAC-Sequenzen in den BHV-1-gE-ORF keinen Effekt auf das Viruswachstum hatte, der nicht aus der gE-Deletion resultierte. Das RecE/T-System wurde erfolgreich für die zielgerichtete Mutagenese der BHV-1-BAC-Mutante etabliert. Durch homologe Rekombination in E. coli konnten drei unterschiedliche BHV-1-Doppelmutanten konstruiert werden. Das Viruswachstum der Mutanten mit einer gleichzeitigen Deletion des gE und gG oder gE und gM war in vitro kaum beeinträchtigt. Beide BHV-1-Doppelmutanten zeigten aber einen vergleichbar deutlichen Defekt der Zell-zu-Zell-Ausbreitung und bestätigten dadurch den Einfluss von gE, gG und gM auf den BHV-1-cell-to-cell spread. Aus einer BAC-Mutante mit einer gE-und gK-Deletion konnte kein infektiöses Virus rekonstituiert werden, was den Schluss nahe legte, dass gK allein oder gemeinsam mit gE für die BHV-1-Replikation essentiell ist. Die hier vorgestellten Ergebnisse haben zudem gezeigt, dass BAC-Klone die weitere Forschung zur Charakterisierung von BHV-1 erheblich verbessern werden. Insbesondere Studien über die Interaktion von Virusproteinen, die Mehrfach-Deletionen voraussetzen, werden erleichtert. Durch die Insertion unterschiedlicher Antibiotikumresistenz-Gene für die Deletion unterschiedlicher BHV-1-Gene und aufgrund der drastisch reduzierten Gefahr einer adaptiven Anpassung von Virusmutanten wird die Forschung auf diesem Gebiet nicht nur erleichtert, sondern es ist auch mit höherer Sicherheit davon auszugehen, dass die Untersuchungsergebnisse die tatsächlichen Verhältnisse bei der Virusreplikation widerspiegeln. plaque forming units, plaquebildende Einheiten pH potentia Hydrogenium

Ergebnisse ___________________________________________________________________________ 

Relative Plaquegrößen der gE-gM-Doppeldeletionsmutante 48 h p. i. wurde der maximale Durchmesser von je 150 BHV-1-, BHV-1∆gE-, BHV-1rev-und BHV-1∆gE-gM-spezifischen Plaques bestimmt. Der für BHV-1 ermittelte durchschnittliche Meßwert wurde auf 100% gesetzt. Striche über den Balken bezeichnen die Standardabweichung. BHV-1∆gE-gM-Plaques waren im Mittel auf 46% reduziert.

Ergebnisse ___________________________________________________________________________

Abbildung 17

Ein-Schritt-Wachstumskinetiken der gE-gM-Doppeldeletionsmutante MDBK-Zellen wurden mit BHV-1, BHV-1∆gE, BHV-1rev und BHV-1∆gE-gM (MOI 1) infiziert. 0,4,8,12,16,24,48 

Southern VZV als essentiell für die virale Replikation beschrieben [START_REF] Hutchinson | Herpes simplex virus glycoprotein K promotes egress of virus particles[END_REF][START_REF] Klupp | Pseudorabies virus glycoprotein gK is a virion structural component involved in virus release but is not required for entry[END_REF][START_REF] Mo | Characterization of Varicella-Zoster virus glycoprotein K (open reading frame 5) and its role in virus growth[END_REF]. Bei BHV-1 wurde das U L 53-Genprodukt als Glykoprotein K charakterisiert [START_REF] Khadr | Sequence and expression of a bovine herpesvirus-1 gene homologous to the glycoprotein K-encoding gene of herpes simplex virus-1[END_REF] 

Summary Cloning and mutagenesis of the bovine herpesvirus type 1 as an infectious bacterial artificial chromosome (BAC)

For the first time the complete BHV-1 Schönböken genome was cloned as an infectious bacterial artificial chromosome (BAC), by inserting mini F plasmid sequences into the glycoprotein E (gE) open reading frame (ORF). DNA of the resulting BAC clone pBHV-1∆gE was transfected into permissive bovine kidney cells and infectious BHV-1∆gE could be recovered. Using RecE/T cloning in Escherichia coli BHV-1 genomes with a deletion of either glycoprotein G (gG) or gM or gK in addition to gE (pBHV-1∆gE-gG, pBHV-1∆gE-gM and pBHV-1∆gE-gK) were generated. The recombinant viruses with a simultaneous deletion of gE and gG (BHV-1∆gE-gG) or gE and gM (BHV-1∆gE-gM), respectively, were reconstituted after transfection of manipulated BAC DNA into eukaryotic cells. However, no virus could be recovered after transfection of recombinant pBHV-1∆gE-gK DNA, suggesting that gK is likewise essential for the replication of BHV-1 as demonstrated for other alphaherpesviruses. Growth properties of the other BAC derived virus mutants BHV-1∆gE, BHV-1∆gE-gG and BHV-1∆gE-gM were analysed in vitro. The mutant viruses exhibited no markedly lowered virus titres compared to wild type strain Schönböken. However, BHV-1∆gE specific virus plaques were reduced by 45% compared to BHV-1 Schönböken as assessed by plaque size measurement. Plaques sizes of BHV-1∆gE-gG and BHV-1∆gE-gM were reduced by 56% (BHV-1∆gE-gG) and 54% (BHV-1∆gE-gM). The observations made here emphasize the influence of gE, gG and gM on the BHV-1 cell-to-cell spread. Moreover, they clearly demonstrate that viral cell-to-cell spread is slightly more inhibited by a simultaneous deletion of gE and gG or gE and gM than by a single gE deletion.

Comparing the plaque sizes of BHV-1∆gE, BHV-1∆gE-gG and BHV-1∆gG it could be shown that gE and gG function independently from each other in cell-to-cell spread, because an additive and no synergistic effect was observed in the gE-gG double deletion mutant.

These studies illustrate, that the propagation and manipulation of herpesviruses in bacterial systems provides the advantage of a more rapid and accurate generation and characterisation of BHV-1 deletion mutants over conventional cloning procedures. In conclusion the new technique will allow the fast generation of BHV-1 mutants as well as the investigation for their suitability as future (marker) vaccines.