Isabel dari Asturias
Manuel kemudian menikahi adinda Isabel, Maria dari Aragon, yang melahirkan putranya dan pewarisnya, João III. Portugal dan Spanyol akhirnya disatukan antara tahun 1580 dan 1640, setelah Felipe II dari Spanyol, keponakan Isabella melalui saudara perempuannya, Maria dan Juana, berhasil mendapatkan hak waris atas takhta Portugal sebagai putra Isabel dari Portugal, putri Maria dan Manuel.