Ein weiterer wichtiger Unterschied zur Glykolyse ist der Reaktionsort. Während diese ausschließlich im Cytosol abläuft, ist die Gluconeogenese auf drei Kompartimente verteilt. Die Umwandlung von Pyruvat in Oxalacetat erfolgt im Lumen des Mitochondriums. Oxalacetat kann die innere Membran des Mitochondriums aber nicht frei passieren und muss erst umgewandelt werden. Dafür stehen zwei Wege zur Verfügung. Entweder wird mitochondriales Oxalacetat in PEP durch eine mitochondriale PEP-Carboxykinase überführt. PEP verlässt dann das Mitochondrium durch ein spezielles Anionen-Shuttlesystem. Im Cytoplasma wird PEP infolge der Gluconeogenese in Glucose umgesetzt.