Durch die Hemmung dieses Enzyms bremst Donepezil die hydrolytische Spaltung des Neurotransmitters Acetylcholin in Acetat und Cholin. Damit erhöht sich die Acetylcholin-Konzentration im synaptischen Spalt und Acetylcholinrezeptoren können eher aktiviert werden. Arzneimittel mit ähnlicher Wirkungsweise sind u. a. Galantamin, Rivastigmin und Tacrin. Auch das Insektizid Parathion (E605) wirkt auf die Acetylcholinesterase, es hemmt sie jedoch irreversibel.