Zwei Aspartate (Asparaginsäure) befinden sich als funktionelle Aminosäuren im aktiven Zentrum. Durch diese wird die Spaltung von Eiweißen in hochmolekulare, wasserlösliche Peptone katalysiert. Pepsin spaltet bevorzugt am N-Terminus von Phenylalanin, das häufigste Muster ist P/-/-/FL + -/R/L/-, das Katalyseverhalten ist also sequenzspezifisch.