Für die Untersuchung in einem Fluoreszenzmikroskop werden Fluoreszenzfarbstoffe an bestimmte Stellen des zu untersuchenden Präparats gebracht. Wird das Präparat nun mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet, so werden die Farbstoffe zur Fluoreszenz angeregt und man erhält ein Bild der Farbstoffverteilung im Präparat. Im Laser-Raster-Mikroskop wird nicht das ganze Präparat auf einmal beleuchtet, sondern ein Laserstrahl („Anregungsstrahl“) wird lediglich auf einen kleinen Punkt des Präparats fokussiert. Die in diesem Bereich übrig bleibende scharfe Fluoreszenz wird detektiert. Durch Bewegen (Scanning, Rastern) des Fokus über das Präparat wird punktweise ein Abbild der gefärbten Bereiche erstellt. Die Größe des Fokus bestimmt die maximale Feinheit der Details, die in dem Präparat gerade noch aufgelöst (getrennt wahrgenommen) werden können. Aufgrund der Beugung kann der Fokus nicht beliebig klein gewählt werden. Ein Laserstrahl lässt sich nicht auf einen Fleck kleiner als circa seine halbe Wellenlänge fokussieren.