Bei der Mikrodilutionsmethode (lat. diluere, „verdünnen“) wird von dem zu untersuchenden Mikroorganismus eine Aufschwemmung in einem flüssigen Nährmedium (Bouillon) hergestellt. Zu dieser gibt man eine definierte Menge eines Antibiotikums. Wird dies mit verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums durchgeführt, z. B. mit einer Verdünnungsreihe (1, 2, 4, 8, 16, 32 mg/L), so kann man eine MHK-Bestimmung durchführen, welche genauer ist als die Bestimmung der Empfindlichkeit mit dem Agardiffusionstest. Die Vermehrung des Mikroorganismus ist an einer Trübung des Nährmediums zu erkennen: Bleibt es klar, so ist der untersuchte Mikroorganismus gegen dieses Antibiotikum in dieser Konzentration empfindlich (sensitiv). Die niedrigste Konzentration (höchste Verdünnung), bei der eine Hemmung erfolgt, liefert den MHK-Wert. Von Mikrodilutionsmethode spricht man, wenn das Verfahren mit kleinen Volumina, z. B. in einer Mikrotiterplatte durchgeführt wird. Werden größere Volumina, wie in Kulturröhrchen verwendet, spricht man allgemeiner vom Bouillondilutionstest.