Bei der STED-Mikroskopie werden sogenannte Fluoreszenzfarbstoffe zum Markieren einzelner Bereiche eines Präparats eingesetzt. Solche Farbstoffe können durch Licht bestimmter Wellenlängen (Farben) „angeregt“ werden: Sie absorbieren ein Photon und gehen in einen energiereicheren Zustand über. Aus diesem Zustand können sie nach kurzer Zeit spontan durch Aussenden eines Photons größerer Wellenlänge (anderer Farbe) wieder in den Grundzustand zurückkehren. Diese spontane Abstrahlung von Licht nennt man Fluoreszenz. Durch geeignete Farbfilter kann das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht getrennt werden.