Beim Agardiffusionstest wird – häufig nach der Kirby-Bauer-Methode – der zu untersuchende Mikroorganismus in geringer Menge auf der Oberfläche eines speziellen ebenflächigen Nährbodens verteilt und der Nährboden dann mit kreisförmigen Plättchen aus saugfähigem Material belegt, die verschiedene Antibiotika in definierter Menge enthalten. Die Antibiotika lösen sich im Gelnährboden und diffundieren radial nach außen. Je weiter das Antibiotikum vom Plättchen wegdiffundiert, desto geringer wird seine Konzentration. Bei einer bestimmten Entfernung vom Plättchen ist die Konzentration des Antibiotikums so niedrig, dass der Mikroorganismus trotz Vorhandensein des Antibiotikums wachsen kann. Nach einer Bebrütungszeit, die für eine Vermehrung der Mikroorganismen bis zum sichtbaren Bewuchs des Nährbodens ausreicht (bei pathogenen Bakterien meistens 16 bis 20 Stunden), werden die Radien der Hemmhöfe ausgemessen und hinsichtlich Resistenz oder Sensitivität des Mikroorganismus ausgewertet.